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Actualización en los métodos
diagnósticos de Sífilis
Dr Leonardo Chanqueo Jefe Unidad Infectología & Laboratorio Microbiología
03 de Mayo 2016
Temario
• Introducción y epidemiología
• Test directos
• Test serológicos
• Experiencia local
• Algoritmos de estudio de Sífilis
• Conclusiones
Primary and Secondary Syphilis — Rates of Reported
Cases by Age and Sex, United States, 2014
Microbiología
• Ha sido difícil la determinación taxonómica de las espiroquetas dado que son fastidiosas y no crecen en los cultivos.
• Utilizando 16S rRNA (Paster y cols) agruparon las secuencias de las en un sólo phylum que contiene 5 cluster:
– Treponema
– Spirochaeta
– Borrelia
– Brachyspira
– Leptospira
• Los 4 miembros del género Treponema son morfologicamente identicos y pese a los avances en biología molecular su diferenciación se realiza en base a distribución geográfica, epidemiología, manifestaciones clínicas y hospedero.
– Treponema pallidum subsp pallidum causa Sífilis
– T pallidum subsp pertenue causa Yaws
– T pallidum subsp endemicum causa Sífilis Endémica
– T carateum causa Pinta
Foto Susan Lindsley, CDC
Curr Opin Infect Dis 2015, 28:53 – 60
Curso Natural de una Sífilis no tratada
11th Manual of Clinical Microbiology. Jorgensen JH et al. 2015
Etapas Clínicas de la Sífilis
Normas de Manejo y Tratamiento de las Infecciones de Transmision Sexual (ITS) Ministerio de Salud, Chile, 2008.
Diagnóstico en pacientes con úlcera o lesion (“chancro”)
Peeling et al. / Bulletin of the World Health Organization / 2004 / Vol. 82 / No. 6
Gayet et al. Emerging Infectious Diseases • Vol. 21, No. 1, January 2015
Dark field photomicrograph of
a T. pallidum bacterium CDC
Diagnóstico serológico de Sífilis
• El diagnóstico de sífilis sigue siendo la detección de Ac. no treponémicos (TNT) (cardiolipinas) y Ac. Treponémicos (TT) – Test No Treponémicos (TNT)
• Monitorización o seguimiento de la enfermedad
– Test Treponémicos (TT)
• Confirmación la prsencia de una infección
• La S y E de ambos tests varía: – Según test – Etapa de la enfermedad
Curr Opin Infect Dis 2015, 28:53 – 60
Peeling et al. / Bulletin of the World Health Organization / 2004 / Vol. 82 / No. 6
Test no treponemicos
USR
(Unheated Serum Reagin)
RPR
(Rapid Plasma Reagin)
TRUST
(Toluidine Red Unheated Serum
TEST)
VDRL
(Venereal Disease Research Laboratory)
Test no treponémicos
• Todos son test de floculación cuya interpretación es subjetiva
• Miden los niveles de Ig G/M producidos por el hospedero en respuesta al material lipoideo (ppalmente cardiolipinas) liberado desde las células dañadas
• Cardiolipinas liberadas por la espiroquetas
• Baratas y laboriosas
Muhammad G et al. Clinical and Vaccine Inmunology February 2015 Volume 22 Number 2
Comparación entre el VDRL y RPR
VDRL RPR
Significado Venereal Disease Research
Laboratories
Rapid Plasma Reagin
Antígeno Preparación diaria
Contiene: Cardiolipina-
Colesterol y Lecitina
Contiene cardiolipina,
lecitina, colesterol, 10%
choline chloride, EDTA
Incorpora partículas de
carbón
Preparación No automatizada
Operador dependiente
No automatizada
Operador dependiente
Visualización Microscopica Macroscopica
Sensibilidad
Sifilis primaria
78%
86%
Diagnóstico en LCR Si No
Test no treponémicos
• Todo lo test reactivo debiese ser informado con cuantificación
• Los títulos
– se correlacionan con la actividad de la enfermedad y son utilizados
para seguimiento
– descienden habitualmente después de una terapia exitosa
– habitualmente van descendiendo progresivamente, sin embargo en
muchos pacientes permanecen reactivos (serología residual) en
títulos bajos
• Pacientes con títulos más altos tienen una gran caída en los
controles posteriores
• La evaluación de un paciente debe ser realizada idealmente
con el mismo test y en el mismo laboratorio
Morales-Munera CE, et al. FR - Sifilis: actualizacion en el manejo diagnostico y terapeutico. Actas Dermosifiliogr. 2014
Muhammad G et al. Clinical and Vaccine Inmunology February 2015 Volume 22 Number 2
2014 European Guideline on the Management of Syphilis
Parametro VDRL USR RPR TRUST
Metodo Floculacion Floculacion
Floculacion
Floculacion
Muestras Suero / LCR Suero Suero, Plasma Suero, Plasma
Vol (ul) 50-100 50-100 50-100 50-100
Tiempo de
ejecucion
15 min 15 min 15 min 15 min
FDA Si Si Si Si
Sensibilidad (%)
Primaria 67-78 80 60-86 70-85
Secundaria 96-100 100 100 100
Terciaria 85-95 95 98 98
Especificidad 96-99 98-99 93-99 98-99
Diagnostico de Sifilis
con Test No Treponemico
11th Manual of Clinical Microbiology. Jorgensen JH et al. 2015
Efecto de prozona
• Corresponde a un “Falso Negativo” de la técnica
• Son muestras informadas como “no reactivo”, a menos que la muestra sea diluida
• Ocurre en muestras con altos títulos de Ac
• Principalmente en sífilis secundaria (alrededor de 1-2%), llegando a un 10% en pacientes VIH (+)
Arch Dermatol Vol. 116 Jan 1980
Acta Med Colomb Vol. 39 No 1 2014
South Med J 2004;97(4)
Relación Antígeno/Anticuerpo
Falsos positivos de los test no
treponémicos
• FP agudas (< 6
meses)
– Enfermedades febriles
– Inmunizaciones
– Embarazo
• FP crónicos
– Infección por VHC
– Infección por VIH/SIDA
– Enfermedades autoinmunes
– Drogadicción EV
– Cánceres
– 3ra edad
– Malaria
– Enfermedad de Chagas
– Tuberculosis
– Lepra Felman Y et al. Syphilis Serology Today. Arch Dermatol Vol 116 Jan 1980
Muhammad G et al. Clinical and Vaccine Inmunology February 2015 Volume 22 Number 2
2014 European Guideline on the Management of Syphilis
Falsos positivos : 3 - 40%
Títulos bajos < 1/8
Fig 1. Algoritmo Tradicional para el
diagnostico
TP-PA or TPPA: T. pallidum particle agglutination test
EIA: enzyme immunoassay
CIA: chemiluminescence immunoassay
Test no treponémicos
• Desventajas – Poca Especificidad
– Laborioso
– Subjetivo
– Manual / manipulacion
– Deteccion de etapas mas tardias
– Efecto de prozona
• Ventajas – Alta Sensibilidad
– Bajo costo
– Requiere poco equipamiento
– Util en la monitorizacion de los pacientes
Interpretación de resultados de un TNT reactivo
• Va a depender de la población testeada
• El VPP de un TNT incrementa con la combinación de un TT
• Un TNT realizado en una población de bajo riesgo debe ser confirmado con un TT, dado que puede ser un falso positivo
• Un TNT debe ser también interpretado de acuerdo a la etapa de sífilis sospechada
Test Treponémicos
TTHA /TPPA/ MHA -TP
FTA-ABS
Western Blot / LIA
ELISA / CIA / EIA /IC
Test Treponémicos
• Fueron desarrollados utilizando la cepa de
Nichols de T.pallidum y usando células o
Ag derivados de T.pallidum
• Detectan IgG o IgM según el kit
• Son detectados previo a la detección de
TNT y permanecen de por vida, aún con
terapia exitosa
Muhammad G et al. Clinical and Vaccine Inmunology February 2015 Volume 22 Number 2
Felman Y et al. Syphilis Serology Today. Arch Dermatol Vol 116 Jan 1980
Test de aglutinación indirecta:
TPHA y TPPA
• Los antígenos son extraidos de: – TPHA (Treponema pallidum
hemagglutination assay) • antígenos T. pallidum sobre GR
– TPPA (Treponema pallidum particle agglutination assay)
• antígenos T. Pallidum con partículas de gelatina
• La S y E no son optimas en etapas primarias
• TPPA sería mejor que TPHA, posiblemente debido a la estructura homogénea de las partículas de gel
TPHA Test Principle
Clinical Infectious Diseases 2010;51(6):700–708
MHA-TP (Micro-hemaglutinación indirecta para
Treponema pallidum)
3 4
Pocillo 3 Reactivo control
(GR no sensibilizados)
Pocillo 4 Reactivo Antígeno
(GR sensibilizados)
11th Manual of Clinical Microbiology. Jorgensen JH et al. 2015
• Es una inmunofluorescencia indirecta (IFI)
• Utiliza como Ag un liofilizado de T. pallidum (Nichol´s
strain)
• Previamente el suero del paciente ha sido absorvido
con un sorbente
• Sorbente es un extracto de un T. phagedenis no
patogenico (con el objeto de eliminar la reacción
cruzada con otros treponemas)
• Después de la remoción de los Ac no ligados, se
incuba con un conjugado fluorescente de Ac anti
globulina humana
• Test (+) visualización de espiroquetas fluorescentes al
microscopia
• Es un poco mas sensible que el TPHA y TPPA
• Examen operador dependiente
• Ocasionalmente hay FP (fluorescencia no especifica)
Fluorescent Treponemal Antibody
Absorption (FTA-ABS) test
Western Blotting (WB) & Line
immunoassay (LIA)
• Utilizan antigenos de T.pallidum sobre un gel de poliacrilamida (WB) o en una tira de nylon (LIA)
• Disponibles IgG e IgM
• IgG LIA: TpN47, TpN17, TpN15 y TmpA
• S y E > 98%
BJID 2008; 12(April)
ELISA / CIA / EIA
• Utilizan antígenos recombinantes
• CIA (quimioluminiscencia) & EIA (multiplex bead enzyme immunoassay) son los que tienen un mayor rendimiento
• El desempeño de estos ensayos para screening difiere segun plataforma
• La reproducibilidad sería mejor con la CIA
Clinical Infectious Diseases 2010;51(6):700–708
Fig 2. Algoritmo Reverso para el
diagnostico
TP-PA or TPPA: T. pallidum particle agglutination test
EIA: enzyme immunoassay
CIA: chemiluminescence immunoassay
CID 2010:51 (15 September) • Sen a et al.
• El uso de un algoritmo reverso en el estudio de sífilis podría sobre diagnosticar y además sobre tratar pacientes en algunos circunstancias
• Las recomendaciones de un algoritmo reverso podrían no ser apropiadas en países con patrones diferentes de seroreactividad, sistemas de salud y epidemiología de la enfermedad
• Es necesario realizar mayores análisis y costos asociados a esta forma alternativa de realizar tamizaje dado el incremento en el uso de TT en EEUU
Resultado
ELISA TP Reactivo
VDRL No reactivo
El uso de Las Pruebas Rapidas para Sifilis. Copyright © Organizacion Mundial de
la Salud en nombre del Programa Especial de Investigaciones y Ensenanzas sobre
Enfermedades Tropicales (TDR) 2007
*** En una poblacion de 10.000 habitantes
Fig 3. Algoritmo Reverso para el
diagnostico segun recomendaciones
del ECDC (European Centre for Disease
Prevention and Control)
TP-PA or TPPA: T. pallidum particle agglutination test
EIA: enzyme immunoassay
CIA: chemiluminescence immunoassay
2014 European Guideline on the Management of Syphilis
2014 European guideline on the management of syphilis
© 2014 European Academy of Dermatology and Venereology
(TT): T. pallidum Haemagglutination test
(TPHA), Micro-Haemagglutination Assay for T. pallidum
(MHA-TP), T. pallidum Passive Particle Agglutination test
(TPPA), Fluorescent Treponemal Antibody absorption test
(FTA-abs test), Treponemal Enzyme Immunoassay (EIA),
Chemiluminescence Immunoassay (CIA)
UK Standards for Microbiology Investigations
Syphilis Serology 2015
Historia
paciente
Test y resultado Interpretación Seguimiento
EIA/CIA/MFI RPR TP-PA
Desconocida No reactivo N/A N/A No evidencia serológica
de sífilis
Ninguno, a menos
exista indicación
clínica
Desconocida
Reactivo Reactivo N/A Sífilis no tratada o
recientemente tratada
Ver guías de
tratamiento
Desconocida
Reactivo No reactivo No reactivo
Probable Falso positivo Ninguno, a menos
exista indicación
clínica
Desconocida
Reactivo
No reactivo
Reactivo
Posible sífilis (ej: precoz
o latente) o previamente
tratada
Requiere
evaluación e
historia clínica
Historia conocida
de sífilis
Reactivo
No reactivo
Reactivo o N/A
Sífilis antigua, tratada
exitosamente
No
CIA, chemiluminescence immunoassay; EIA, enzyme immunoassay; MFI, multiplex flow immunoassay
N/A, not applicable
RPR, rapid plasma reagin
TP-PA, Treponema pallidum particle agglutination.
http://www.cdc.gov/std/treetment/2010/
Interpretación y seguimiento siguiendo flujograma reverso
de screening de sífilis
Consideraciones para seguir un
algoritmo
• Volumen de muestras recibidas
• Carga del laboratorio y recursos humanos
• Prevalencia e incidencia de sifilis en la población
• Costos
• Desempeño del test a usar
• Necesidades del clínico
• Recomendaciones locales www.aphl.org
Can J Infect Dis Med Microbiol Vol 26 Suppl A January/February 2015
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