a nimales transgenicos curso bgm 2012

BENJAMÍN PAZ ALIAGA Profesor de la UCSM

CURSO DE BIOLOGIA Y GENETICA MOLECULAR

P.P. de Medicina Humana

2012

LOS GENES ESTAN LOCALIZADOS EN LOS CROMOSOMAS ( Thomas Hunt Morgan-1901)

PEDIGRI DE LA ALCAPTONURIA

UN GEN = UNA ENZIMA

ARCHIBALD GARROD

(1905)

LOS GENES SON QUIMICAMENTE ADN

WATSON Y CRICK CUANDO DESCUBRIERON LA DOBLE HELICE

1953

TECNICA DE LA DIFRACCION DE RAYOS X PARA DETERMINAR LA ESTRUCTURA DEL DNA

1955 . Kornberg descubre la ADN polimerasa

1961 JACOB Y MONOD PUBLICAN LA TEORIA DEL RNA MENSAJERO

DNA RNA

PROTEINA

UUU

UUCFen

UCU

UCC

UCA

UCG

Ser

1966 Se dilucida el Codigo Genético

1972 Se produce la primera molécula de ADN recombinante

Paul Berg. Premio Nobel 1980

1. Las ranas fueron los primeros animales transgénicos producidos.

3. Se usaron los núcleos para la transferencia en lugar del DNA, en la forma que se indica en el esquema.

5. Se estableció la metodología de la microinyección..

1973 Es clonado el primer gen animal

En Stanford y UCSF unen un segmento de ADN de Xenopus laevis que contenía un gen con el ADN de E. coli. El ADN obtenido se regresa a la bacteria, el gen de Xenopus se copia y se transcribe en la bacteria, produciendo esta una proteína específica de Xenopus. .PNAS. 71(5) 1743-7, 1974

• Poco tiempo después se consiguió insertar fragmentos de DNA (genes) de bacterias en organismos superiores (plantas).

• También se incorporaron secuencias génicas a cultivos de tejidos para permitir la síntesis de ciertas proteínas que después se purificaban del medio de cultivo

• El uso de los animales en la investigación tuvo su origen hace varios siglos; pero la modificación de su genoma con la idea de obtener organismos transgénicos comenzó hace sólo 24 años (Palmiter y col.)

ANTECEDENTES• Gordon y col en 1980 inyectaron ADN de

ratón en uno de los pronúcleos de un huevo de la misma especie.

• Palmiter y col (1982)inyectaron en el pronúcleo de un cigoto de ratón el gen de la hormona de crecimiento de rata.

• En 1983 se hizo el mismo experimento en ratón pero usando hormona de crecimiento humana.

A comienzo de los 80’ se transfirieron genes de un animal a otroNature 294 (5836) 9-10, 1981

Science 218 (4570): 348-350, 1982

METODOLOGÍA EN LA PRODUCCION DE ANIMALES TRANSGENICOS

ANIMAL TRANSGENICO

Producción de otros animales transgénicos

• Posteriormente se comenzaron a usar otros animales, como conejos, ovejas, cerdos, vacas, etc. En estos casos también se les introdujo el gen de la hormona del crecimiento humana con la misma técnica que la usada para ratón.

• Se consiguieron los animales transgénicos correspondientes pero con algunos efectos no deseables

CREACION DE UN ANIMAL TRANSGENICO

IMPORTANCIA DEL USO DE LOS ANIMALES TRANSGENICOS

1. En la investigación:• En el estudio de la función del gen• Estudio de las enfermedades humanas

2. Desde un punto de vista general:• Modelos para el estudio de las enfermedades

humanas• Producción industrial farmacéutica de ciertas

proteínas• Producción de animales anatómica y

fisiologicamente ventajosos

MODELOS DE ANIMALES PARA ESTUDIAR ENFERMEDADES HUMANAS

• Se dispone de varios modelos de roedores transgénicos para estudiar una serie de enfermedades humanas, por ejemplo:– Enfermedades cardiovasculares– Cáncer

– SIDA– Anemia falciforme– Enfermedades neurológicas– Enfermedades metabólicas– Enfermedades genéticas

PROTEINA ANIMAL USO TERAPEUTICO

AAT (Alfa-1 anti-tripsina)

Oveja Tratar la deficiencia de α-1 anti- tripsina

tPA (Activador del plasminó-geno tisular)

Cabra Tratamiento del infarto de miocardio

Factores VIII, IX Oveja Tratamiento de la hemofilia

Hemoglobina Cerdo Sustituto de la sangre para transfusiones

Lactoferrina Vaca En los niños como fórmula aditiva

CFTR Oveja, ratón

Tratamiento de la fibrosis quística

Proteína C humana Cerdo Anticoagulante

PROTEINAS TERAPEUTICAS SINTETIZADAS POR ANIMALES TRANSGENICOS

METODOS PARA EL DESARROLLO DE ANIMALES TRANSGENICOS

1. Tranferencia de ADN clonado a oocitos fertilizados.– El procedimiento que se sigue es la

microinyección pronuclear– El animal que se obtiene será completa-

mente transgénicos, la totalidad de células, incluyendo las germinativas tendrán el transgen

– Producida la fecundación, el pronucleo macho y hembra son claramente visibles para hacer la microinyección

RATON TRANSGENICO

Los oocitos microinyectados son reimplantados en el oviducto de la nueva madre

Pronucleo hembra

Pronucleo macho

Pipeta usada para la microinyección

Solución de ADN

CONSTRUCCION DEL RATON TRANSGENICO

– La integración del transgen en el cromosoma del hospedero se da en un solo lugar pero al azar

– Se encuentran en el lugar de inserción múltiples copias del transgen ( 50 ó más)

– Las diferencias en la expresión del transgen se explican por su lugar de inserción antes que por el número de copias

– El lugar de inserción puede afectar el funcionamiento de genes endógenos

– La inserción determina un estado hemicigoto

DESVENTAJAS DEL METODO DE LA MICROINYECCION PRONUCLEAR

METODOS PARA EL DESARROLLO DE ANIMALES TRANSGENICOS

2. Transferencia a embriones

- Se aprovecha la capacidad de las células embrionarias de los primeros estadíos de ser pluripotenciales

-Generalmente se utiliza células madre embrionarias, que derivan de embriones de ratón de 3 a 4 días posteriores al coito.

-Se tomas las células de la masa celular interna del blastocisto

-Estas células se les puede cultivar in vitro y retienen su capacidad de originar todos los tejidos del ratón

AISLAMIENTO DE LAS CELULAS MADRE EMBRIONARIAS

TRANSFERENCIA A LAS CELULAS EMBRIONARIAS

1.-Células embrionarias stem

2.- Blastocistos

3.- Incorporación a la cavidad

del blastocisto

4.- Células inyectadas se incor- poran a la masa celular interna del blastocisto

5.- Introducción de tales blasto- cistos a la nueva madre

6.- Nacimiento

7.- Ratón transgénico

DESVENTAJAS DEL METODO DE TRANSFERENCIA A EMBRIONES• El embrión que se desarrolla en la

hembra receptora corresponde a una quimera, es decir tienen dos poblaciones derivadas una de las células con el transgen y la otra derivada de los blastocistos naturales.

• Se obtienen ratones parcialmente transgénicos pero a partir de ellos se pueden derivar los completamente transgénico por cruzamientos entre la progenie.

ANALISIS DE LA PROGENIE TRANSGENICA

• Generalmente se obtiene un porcentaje menor al 20% de progenie transgénica.

• Las técnicas usadas para el análisis de la progenie transgénica, son:– Southern blot– Slot o Dot blot– PCR– Análisis de los tejidos (Wester blotting,

inmunohistoquímica inmunofluorescencia

UTILIDAD DE LOS RATONES MODELO DE ENFERMEDADES HUMANAS

A. Son fisiologicamente similares a los humanos

B. Hay un gran reservorio genético de modelos potenciales que han sido generado a través de la identificación de más de 1000mutantes espontaneas generadas quimicamente o por radiación.

UTILIDAD DE LOS RATONES MODELO DE ENFERMEDADES HUMANAS

A. Los avances tecnológicos recientes han aumentado dramaticamente la habilidad para crear modelos de ratones de enfermedades humanas.

• El desarrollo del mapa físico y genético del genoma del ratón y recientemente su secuenciación total.

• Las tecnologías transgénicas como el knock-out y el knock-in

UTILIDAD DE LOS RATONES MODELO DE ENFERMEDADES HUMANAS

A. Se dispone de más de 100 ratones modelo de enfermedades humanas y en donde el gen homólogo está mutado tanto en el humano como en el ratón.

1. El fenotipo del ratón semeja muy estrechamente a los fenotipos de la enfermedad humana.

2. Es de gran valor para entender como la enfermedad se desarrolla y para prevenir y tratar la enfermedad.

Un ratón modelo knock-in de la porfiria eritropoyética congénita

A knock-in mouse model of congenital erythropoietic porphyria. Ged C. y col.

Genomics 87:64-92,2006

Caso Clínico• Un hombre de 43 años, soltero, que

desde su nacimiento tuvo piel oscura, exceso de vellos y orina oscura. Desde los 8 años sus dientes tomaron un color rojizo y aparecieron lesiones en la piel a manera de ampollas, en zonas de exposición a la luz solar, con el paso de los años estas ampollas se conviertieron en úlceras y la piel de la zona comprometida se comenzó a esclerosar..

Caso Clínico (continuación)• Los abuelos maternos eran primos

hermanos.

• El paciente tuvo 9 hermanos, uno de los cuales tenía las mismas alteraciones en la piel . El examen de piel reveló hiperqueratosis, hipopigmentación y fibrosisi en las zonas expuestas al sol.

Caso Clínico (continuación)• El recuento de hematíes, la hemoglobina

y las constantes corpusculares estaban normales, al igual que el recuento leucocitario y plaquetario. Las enzimas hepáticas estaban discretamente aumentadas en actividad en el suero (TGP,TGO y gammaGT).

Caso Clínico (continuación)• El análisis de orina demostró un marcado

aumento de las coproporfirinas y uroporfirinas. En los hematíes también se encontraron niveles altos de porfirinas.

LESIONES EN LA PIEL DEL PACIENTE DEL CASO CLINICO 1

POFRFIRIA ERITROPOYETICA CONGENITA

mitocondria

Glicina + Succinil CoA

Acido δ aminolevulí-nico (ALA)

Porfobilinógeno (PBG)

OH Metilbilano

UROPORFIRINOGENO I

UROPORFIRINÓGENO III

COPROPORFIRINOGENO III

PROTOPORFIRINOGENO III

PROTOPORFIRINA III

HEMO

citosol

(uroporfirinógeno III sintasa)

MUTACIONES EN EL GEN DE LA UROS

• Se han descrito hasta el momento 35 tipos de mutaciones que pueden causar la Porfiria Eritropoyética Congénita (PEC).

• Una de las más frecuentes es la :

C73R ,encontrada en más del 30% de pacientes con CEP

• Otra frecuente es la P248Q

CARACTERÍSTICAS DEL GEN DE LA UROS

• En 1988 Tsai y col. Clonaron el cDNA completo que codificaba para la UROS por selección de una biblioteca cDNA construída de hígado humano adulto.

• Astrin en 1991 usando el gen cDNA ubicaron el gen de la UROS en el cromosoma humano10 (10q25.2-q26.3).

LOCALIZACION DEL GEN UROS EN EL BRAZO LARGO DEL CROMOSOMA 9

GEN UROS

Localización citogenética 10q25.2- q26.3

Localización molecular del 127,467,141 bp a 127,501,756

CARACTERÍSTICAS DEL GEN DE LA UROS

• Xu y col. ( 1995) clonaron el gen de la UROS en el ratón y lo ubicaron en el cromosoma 7 de este animal.

• En el 2000 Aizenkang y col. secuenciaron los 34Kb del gen de la UROS y determinaron que tenía 10 exones

OBJETIVO DEL TRABAJO

•Obtener ratones con porfiria eritropoyética congénita humana mediante una mutación knock-in

METODOLOGÍA1. Se obtuvo un fragmento mutante de 6.22

Kb de ADN genómico de ratón y contiene los 2 últimos exones ( 9 y 10).

2. La recombinación homóloga entre el locus blanco (genomic locus) y el fragmento mutante determinó la obtención del gen modificado|.

METODOLOGÍA3. El gen modificado contiene un gen

adicional que confiere resistencia a la neomicina(NEO) y otro que corresponde al gen de la timidina quinasa del virus herpes simple (HS-TK)que confiere sensibilidad al ganciclovir.

4. La mutación que pasó el fragmento mutante es una transversión (CCA→CAA)y está en el exón 10.

RESULTADOS• Se consiguieron 205 clonas resistentes a

ambas drogas indicando que tenían el fragmento mutado en el lugar correspondiente

• Para la selección de los recombinantes homólogos se utilizó PCR, Southern blot, secuenciación del exón 10 y medida de la actividad de la UROS

RESULTADOS• Cinco clonas se identificaron como

recombinantes homólogas, pero solo dos tenían la mutación esperada (P248Q) y tenían 50% de decrecer en la actividad de la UROS.

• Después se reimplantaron los blastocistos y finalmente se obtuvieron 17 ratones heterocigotos de 63 estudiados.

RESULTADOS• Los cruzamientos entre los ratones

heterozigotos dieron 59 nacimientos procedentes de 16 camadas.

• El estudio genético determinó las siguientes frecuencias de genotipos:– 18.6% (11/59) eran UROS (P248Q-P248Q)– 44.1% ( 26/59) eran UROS (P248Q-N)

– 37.3% (22.59) eran UROS (N-N)

Cambios histológicos en hígado, bazo y riñón en un ratón con ECP y en un normal

DETERMINACION DE PORFIRINAS EN LOS ANIMALES TRANSGENICOS

PORFIRINAS

ACUMULADAS

Mut/Mut n=5

Mut/N n=6

N/N n=6

Hematíes (pmoles/mg de Hb). PORFIRINAS TOTALES Promedio

72 3.7 3.8

Orina ( umoles/litro) PORFIRINAS TOTALES. Promedio

498 ND ND

Orina (% como uroporfirina I)

88.6 ND ND