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BIO 368
ANALISIS INSTRUMENTAL
Métodos de centrifugación
CENTRIFUGACION ANALITICA: uso principal en el estudio depropiedades fisico-químicas de macromoléculas y complejossupramoleculares.
CENTRIFUGACION PREPARATIVA: uso en separación de estructuras subcelulares, vescículas de membranas, precipitadosproteicos, etc.
CENTRIFUGACION: aplicación de una fuerza superior a la de la gravedad (g = 981 cm/seg2).
TIPOS DE CENTRIFUGA
Características comunes:Un motor que hace girar un rotor donde se colocan los tubos
que contienen las muestras a centrifugar.
Diferencias:Velocidad que puede alcanzar la centrífugaPresencia o ausencia de refrigeraciónPresencia o ausencia de vacíoVolumen máximo de muestra
Tipos más usados en el laboratorio:Microfugas; utilizan tubos Eppendorf (hasta 10 000 x g)Centrífugas refrigeradas; volúmenes mayores (hasta
100 000 g)Ultracentrífugas preparativas (hasta 600 000 x g)
Tipos de rotores utilizados encentrifugación:
d) Rotor de ángulo fijo
f) Rotor de tubo vertical (menosusado).
c) Rotor “swinging bucket” (vasosbasculantes).
Como calcular la velocidad de sedimentación:
G = ω2 x r ω = 2π x (rev. x min-1)/60
G: campo centrífugo aplicado (aceleración; cm/seg2)
ω : velocidad angular (en radianes/seg)
r: distancia de la partícula al eje de rotación (cm)
G = 4 π2 (rev. x min –1)2 x r/ 3600
Fuerza centrífuga aplicada:
F = m x G = m x ω2 x r (m = masa de la partícula)
EL CAMPO CENTRIFUGO
Se expresa generalmente en en múltiplos del campo gravitacionalg (981 cm/seg2).
El campo centrífugo relativo (CCR) es la razón entre la aceleración centrífuga a un radio y velocidad especificados, y la aceleración de gravedad:
CCR = 4 π2 x (rpm)2 r/ 3600 x 981
Las unidades del CCR se expresan en “x G” y las “revoluciones porminuto” se abrevian como rpm.
Habitualmente estos cálculos se hacen con un nomograma.
VELOCIDAD DE SEDIMENTACION DE UNA ESFERA
La velocidad de sedimentación depende no sólo del campo centrífugoaplicado sino también de la densidad y radio de la partícula y de laviscosidad del medio. La relación entre estas variables está definidapor la ley de Stokes para una partícula esférica rígida:
donde: υ es la velocidad de sedimentación de la esfera 2/9 es una constante para la forma esférica r el radio de la partícula ρp la densidad de la partícula ρm la densidad del medio g el campo gravitacional η la viscosidad del medio
Así, dos partículas esféricas pueden separarse en función de su densidady/o su tamaño
EL COEFICIENTE DE SEDIMENTACION
La velocidad de sedimentación de una partícula puede tambiénexpresarse como su “coeficiente de sedimentación” s:
Estos valores se expresan habitualmente como unidades Svedberg.
Una unidad Svedberg equivale a 10-13 segundos.
Protein S value (Svedberg units) Molecular weight
Pancreatic trypsin inhibitor 1 6,520
Cytochrome c 1.83 12,310
Ribonuclease A 1.78 13,690
Myoglobin 1.97 17,800
Trypsin 2.5 23,200
Carbonic anhydrase 3.23 28,800
Concanavlin A 3.8 51,260
Malate dehydrogenase 5.76 74,900
Lactate dehydrogenase 7.54 146,200
Coeficiente de sedimentación y peso molecular de una serie de proteínas
DATOS NECESARIOS PARA DEFINIR UNA CENTRIFUGACION
- Velocidad del rotor- Distancia radial- Duración de la centrifugación
La velocidad de sedimentación de una partícula depende, ademásde la masa de la partícula, de la densidad y viscosidad del medio y elgrado de desviación de la partícula de una forma esférica.
Las partículas generan fricción, la que se opone a su movimiento, la que depende del tamaño, forma e hidratación de la partícula y de la viscosidad del medio.
Al centrifugar una partícula, pronto se llega a un equilibrio entre la fuerza centrífuga y la fuerza de fricción, con lo que la partícula avanzaa una velocidad constante.
Lo que define la separación de dos partículas diferentes es su diferencia de tamaño y de densidad. Estos son la base de la separación de macromoléculas biológicas o de organelos subcelulares. También influye la forma de las partículas. Todo esto puede expresarse matemáticamente.
La situación es aún más compleja, pues como la fuerza centrífuga depende de la distancia de la partícula al centro de rotación, a medida que avanza el proceso de centrifugación, la fuerza (y velocidad) se van haciendo mayores.
APLICACIONES DE LAS CENTRIFUGAS PREPARATIVAS
- Centrifugación diferencial. Utilizada en fraccionamiento celular ysubcelular. Se basa en la diferencia de velocidad de sedimentación departículas biológicas de diferente tamaño, forma y densidad. Se someteun homogeneizado a centrifugaciones repetidas aumentando cada vezla fuerza centrífuga. Se logra así obtener las siguientes fracciones:
NúcleosMitocondriasLisosomasMicrosomasFracción soluble
- Centrifugación en gradiente de densidad. Permite separar partículasde similar tamaño pero distinta densidad. Puede usarse sedimentación develocidad o de equilibrio. En el primer caso se utiliza un gradiente de sacarosa (separación de componentes en preparaciones de membrana).En el segundo, cloruro de cesio (purificación de DNA).
Densidad y coeficiente de sedimentación de diversos componentescelulares.
CENTRIFUGACION DIFERENCIAL
CENTRIFUGACION EN GRADIENTE DE DENSIDAD
CENTRIFUGACION ISOPICNICAY DENSIDAD DE FLOTACION
DEL DNA
Utilizado para la purificación de DNA,basado en la diferencia de densidad entreDNA, RNA y proteínas. También es útil para separar DNA de hebra simpledel de hebra doble.Se genera un gradiente de CsCl y el DNAse equilibra en el tubo según su densidadde flotación.
Esquema del fraccionamientode un homogeneizado demúsculo esquelético.
1000 g
Primero se utiliza centrifugacióndiferencial, seguido de centrifugación en gradientede densidad de sacarosa.
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