08 galarza mutaciones resistencia prueba genotype
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7/23/2019 08 Galarza Mutaciones Resistencia Prueba Genotype
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Genotype MTBDRplus
MSc Blgo. Marco A. Galarza Prez
Laboratorio de Biotecnologa y Biologa Molecular
Instituto Nacional de Saludmga arza ns.go .pe
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Genoma de Mycobacterium tuberculosis
Genoti ificacin: RFLP IS6110
Spoligotyping
MIRU
SNPs
MTBC MTBDRplus MTBDRslAS
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as cac n enera e genes e yco acter um tu ercu os s
Funcin N de
genes
% del
total
% del total con
capacidad codificante
Metabolismo de lpidos 225 5.7 9.3
Informacin de Vas 207 5.2 6.1
Pared celular rocesos celulares 517 13.0 15.5
RNAs estables 50 1.3 0.2
Elementos IS y bacterifagos 137 3.4 2.5. .
Metabolismo intermediario y respiracin 877 22.0 24.6
Protenas reguladoras 188 4.7 4.0
Virulencia, detoxificacin y adaptacin 91 2.3 2.4
Funcin hipottica conservada 911 22.9 18.4
Protenas de funcin desconocida 607 15.3 9.9
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Bases genticas de resistencia a drogas
Los estudios genticos han determinado que en el Complejo de,
antituberculosas es la consecuencias de mutaciones espontneasen genes codificantes de blancos de la droga o enzimas envueltas
.
La resistencia asociada a mutaciones cromosomales al azar han
sido descritas para todas las drogas de primera lnea. Sin embargolas alteraciones genticas en fenotipos MDR y poliresistentes anno han sido descri tas completamente, debido a que sonconsecuencia de adquisiciones secuenciales de mutaciones en
mltiples loci. Desafortunadamente las mltiples localizaciones delas mutaciones para cada droga pueden envolver ms de un gen odistintos locide un mismo gen.
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Esquema de los mecanismos moleculares de resistencia a drogas
de 1ra y 2da lnea
A: RNA polimerasa
B: gyrasa
2008.Tesis: Tello, C.
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Regiones genmicas asociadas con resistencia a drogas de 1era y 2da lnea
Antibitico Gen Producto Frecuencia de mutacin %
Estreptomicina rpsL
rrs
Prot. Ribosomal S12
RNAr 16S
60
< 10
Rifam icina r o Subunidad RNA ol > 95
Isoniacida
katGoxyR-ahpC
inhA
Catalasa-peroxidasaAlkilhidroxireductasa
Enoyl ACP reductasa
60-70 20
< 10
kasA
ndh
ketoacil ACP sintetasa
NADH deshidrogenasa
< 10
NA
Etambutol embCAB Arabinosiltransferasas70
Pyrazinamida pncA Amidasa 70-100
Etionamida inhA
ethA
Enoyl ACP reductasa
Flavoprot. monooxigenasa
< 10
NA
Kanamicina rrs RNAr 16S 65
Fluoroquinolonas gyrA
gyrB
Subunidad DNA girasa
Subunidad DNA girasa
> 90
NA
Capreomicina tlyA
rrs
RNAr metiltransferasa
RNAr 16S
NA
NAAcido para-aminosalicilico thyA Timidilato sintetasa NA
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Mutaciones en el gen rpo asociados con resistencia a Rifampicina en
81pb
*M.tuberculosisrpo genecodonsarenumberedaccordingtotherpo geneofE.coli
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Mutaciones en el gen gyrA asociadas con resistencia a
fluoroquinolonas en M. tuberculosis
pb
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RIF: 98.7%
INH: 92.0%
FLQ: 90.6%
CM: 88.4%AM: 86.7%
EM: 69.2%
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Tecnologa DNASTRIP
Extraccin DNA ResultadosDeteccinPCR
Rpido: los resultados de muestras pulmonares, extra pulmonares o decult ivo se pueden obtener en 48h.
ene c os e ra a ar con os s s emas e prue as -
Seguro: los controles internos documentan la validez de los resultados yaseguran los procedimientos de la prueba.
Fiable: combinacin de amplificacin especfica y la hibridacin garantizanla fiabilidad del dia nstico.
Fcil de usar: fcil de realizar la tcnica, adecuada para los laboratorio dereferencia.
Alta sensibilidad y especificidad: comprobado por varias publicaciones.
Rentable: un mnimo de equipos slo es necesario, lo que permite a todoslos laboratorios de una aplicacin rentable.
Disponibles de automatizacin: los laboratorios de alto flujo de muestraspue en aumen ar su e c enc a me an e e uso spos vos eautomatizacin de Hain Lifesciences.
.
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Etapas de la prueba molecular Genotype MTBDRplus
1.Extraccin de DNA:
Cualquiermtodode
extraccindeDNApuede
serutilizado
Cultivos con crecimientoen medio lquido o slido.
MezcladePNMque
2. Mltiplex PCR:
primers marcados con
contienenlaszonaswild
typeydemutacinparalos
genesrespectivos.
3. Hibridacin reversa:
Controldeconjugado,
controldeamplificacin,
esna ura zac n qu m ca Hibridacin
Lavado astringente
Reaccin de tincin mediada
,
gen,sondaswildtypey
sondasdemutacin
por AP (fosfatasa alcalina).
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Caractersticas del Genotype MTBDRplus
El Genotype MTBDRplus esta basado en
la Tecnologa DNA-STRIP y permite la
simultanea identi ficacin gentico
molecular de:
1. El complejo Mycobacterium tuberculosis
2. Resistencia a la rifampicina por la
deteccin de las mutaciones ms
comunes en el gen rpo.
3. Resistencia a la isoniacida por la
deteccin de las mutaciones ms
comunes en los genes katGe inhA.
A partir de muestras clnicas con
baciloscopa positiva o cultivos.
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Indicaciones para el uso de Genotype MTBDRplus
agn st co e pac entes
Despus de fracaso al tratamiento y recada.
Con anamnesis (signos y sntomas de la enfermedad) y que procedan de
zonas de alta prevalencia de MDR-TB.
En pases con alta prevalencia de tuberculosis y de alta carga de TB-MDR.
Para fines de seleccin en el desarrollo de lanes de accin es ecfica contra
la TB.
Beneficios venta as del uso de Genot e MTBDR lus
Permite el tratamiento temprano adecuado, lo que reduce la transmisin y
propagacin de la TB-MDR.
Se puede realizar a partir de un frotis positivo de muestra pulmonar depacientes y de cultivos.
Los resultados se obtienen en 48h en com aracin con los mtodos
convencionales que demoran de 1 a 2 meses.
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Caractersticas del Genotype MTBDRsl
El Genotype MTBDRsl permite lasimultanea identificacion geneticomolecular de:
1. El com le o M cobacteriumtuberculosis.
2. Resistencia a las Fluoroquinolonas,como ofloxacina y moxifloxacina por la
comunes en el gen gyrA.
3. Resistencia a los antibiticos
inyectables (viomicina, kanamicina,
deteccin de las ms comunesmutaciones en el gen rrs.
4. Resistencia al medicamento de primera
nea am u o por a e ecc n e asmutaciones ms comunes en el gen
embB.
A partir de muestras clinicas con
baciloscopia positiva o cultivos.
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Indicaciones para el uso de Genotype MTBDRsl
Diagnstico de pacientes
con TB-MDR, para recibir informacin sobre nuevas resistencias a
antibiticos.
Despus de fracaso al tratamiento y recada. En pases con un elevado uso de los medicamentos.
n as reg ones e a a carga - .
Beneficios y ventajas del uso de Genotype MTBDRsl Deteccin de TB-XDR en pacientes previamente diagnosticados como TB-
MDR.
Confirmacin de resultados or ruebas de susce tibilidad a dro as.
Minimizar los efectos secundarios extremos a travs de un esquema de
tratamiento adecuado.
, .
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Principio de la prueba molecular Genotype
Primersmarcados
conbiotina
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Extraccin DNA re aracin Mix PCR
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PCR e Hibridacin
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Resistencia a Rifampicina y/o
Isoniacida usando el Genotype
MTBDRplus
Interpretacin de resultados:
Resistencia a Fluoroquinolonas,
cclicos y Etambutol usando elGenotype MTBDRsl
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R
sl
Experiencia en el INS del uso de la metodologa Genotype
FLUJO DE TRABAJO: FASE 1
108 Mx Biolgicas:40 MDR/XDR
plus
31 MDR
9 XDRKitMTBD
80 cepas (24 LJ-OMS / 56 APP)
28 M. clnicas (Back ups)65 MDR
17 Monoresistentes10 XDR, 29 MDR
15 Monoresistentes
14 Monoresistentes(10 INH,4 RIF)Ki
tM
TBD
18 pansensibles(12 INH,3 RIF)
54 Pansensibles 54 Pansensibles
:
DRplus
67 MDR100 Mx Biolgicas:
Kit
MT
B
13 Monoresistentes
a INH
15 cultivos APP65 MDR
17 Monoresistentes
18 ansensibles
65 MDR
17 Monoresistentes
20 Pansensibles
,
18 pansensibles
Galarza et.al. datos no publicados
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Experiencia en el INS del uso de la metodologa Genotype
MTBDRplus
MTBDRsl
.
especificidad 95.0% de la pruebamolecular Genotype MTBDRplus
con res ecto a Rifam icina.
100.0% para las Fluoroquinolonas. Sensibilidad 87.5% y especificidad
Sensibilidad (97.0%) y
especif ic idad (98.7%) de la
rueba molecular Genot e
. .
Sensibilidad 81.3% y especificidad
100.0% para Kanamicina.
MTBDRplus para Isoniacida.
Se encontraron valores de
sensibilidad 97.1%
.
84.6% para Etambutol.
Se encontraron valores de
especif ic idad (94.2%) de laprueba Genotype MTBDRplus
para la condicin MDR.
.
especif icidad (100.0%) de la
prueba Genotype MTBDRslpara la
.
Galarza et.al. datos no publicados
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Realizar estudios en campo, con un mayor nmero de
muestras clnicas y evaluar los kits Genotype MTBDRplus y
Genotype MTBDRsl.
,
guiada por la situacin epidemiolgica y la identificacin de
los grupos de pacientes prevalentes o numerosos para losque es tcnicamente posible agilizar o mejorar el diagnstico
de TB.
mejorar la utilizacin de las herramientas ya introducidas y
guiar la racional incorporacin y aplicacin de nuevos
m o os mo ecu ares.
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Algoritmo bsico de Dx. de TB con uso de mtodos moleculares
Genotype MTBDRplus
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