06_ microscopía

EL MICROSCOPIO

Tema 06 del Programa

Unidad 1 del libroPágina 3

IES Miguel de Cervantes. MurciaHematología. Profesores:Sánchez Moreno, A. Pina Alburquerque, J.A.

HISTORIA: EL INVENTO

• Se inventó, hacia 1610, por Galileo, según los italianos, o por Jansen, en opinión de los holandeses

(http://personales.mundivia.es/mggalvez/micro2.htm )

EL NOMBRE

• La palabra microscopio fue utilizada por primera vez por los componentes de la "Accademia dei Lincei“

• Micro=pequeño• Scopein=ver

GALILEO GALILEI

• 1609:Desarrolla un occhiolino o microscopio compuesto de una lente convexa y una cóncava.

• La “Accademia dei Linceii” era una sociedad científica a la que pertenecía Galileo y publicaron un trabajo sobre la observación microscópica del aspecto de una abeja

MALPIGHI

• Las primeras publicaciones importantes aparecen en 1660 y 1665 cuando Malpighi observa los capilares sanguíneos y Hooke publica su obra Micrographia

ANTONY VAN LEENWENHOEK  (1632-1723) En el siglo XVII un

comerciante holandés, utilizando microscopios simples de fabricación propia describió por primera vez protozoos, bacterias, espermatozoides y glóbulos rojos

MICROSCOPIO DE LEEUWENHOEK

CARACTERÍSTICAS DEL MICROSCOPIO DE LEEUWENHOEK

• El primitivo microscopio de Leeuwenhoek tenía dos lupas combinadas con las que llegó a alcanzar 260 aumentos, lo cual le permitió visualizar algunos protozoos e infusorios

MICROSCOPIOS DEL SIGLO XVIII

ERNST ABBE

• Las mejoras mas importantes de la óptica surgieron en 1877 cuando Abbe publica su teoría del microscopio

CALR ZEISS

• Mejora la microscopía de inmersión sustituyendo el agua por aceite de cedro lo que permite obtener 2000 aumentos

FUNDAMENTO DE LA MICROSCOPÍA

• Cuando el observador se acerca el objeto se agranda

• Pero a menos de 25 cm no se ve con claridad

• Si se aumenta el ángulo visual se ve con claridad

EVOLUCIÓN DEL MICROSCOPIO

EVOLUCIÓN DEL MICROSCOPIO

1751 Actual

ESQUEMA DEL MICROSCOPIO

• Un tubo cilíndrico aloja el sistema óptico ocular/objetivo. Una platina de original diseño permite observar las preparaciones, que son iluminadas por un espejo cóncavo que concentra la luz sobre el objeto a estudiar (actualmente una bombilla).

ESQUEMA DEL MICROSCOPIO

PARÁMETROS ÓPTICOS

• Aumento• Poder de

resolución• Nº de campo• Profundidad de

foco• Contraste

AUMENTO

• Se calcula multiplicando el aumento del objetivo por el aumento del ocular

PODER DE RESOLUCIÓN

• Distancia si dos puntos se distinguen

• Mayor, cuando menor es la longitud de onda

• Mayor, cuanto mas grande es la apertura numérica

• Mayor, con aceite de inmersión

Apertura numérica (A.N.) de un objetivo

• El producto de n sen a• constituye una las características más

importantes de la lente.• Los fabricantes marcan el número de la

apertura numérica en la montura del objetivo junto con el aumento.

• La calidad de un objetivo es tanto mayor cuanto más elevada es su apertura numérica.

• Es aconsejable situar el aumento total entre 500 y 1000 veces el valor de A.N.

Ejemplo: Para un objetivo de aumento 40X  y A.N. 0,65  debemos usar un ocular que logre valores comprendidos entre los siguientes aumentos:500· 0,65=325 aumentos1000·0,65=650 aumentosDebemos por tanto emplear oculares de 10X y 15XUn ocular x20 producirá imágenes de mayor aumento (800) pero serán poco nítidas

Número de campo• Es el diámetro

de la imagen observada a través del ocular, expresado en milímetros

•Campo de visión real = Número de campo / Aumento del objetivo.

PROFUNDIDAD DE CAMPO

Es inversamente proporcional al cuadrado de la apertura numérica (A.N.)Cuanta mayor sea la Profundidad de campo, tanto menor será el Poder de resolución.

CONTRASTE

• Diferencia de absorción de luz entre el objeto y el medio

• Puede aumentarse con las tinciones

BUENOS PARÁMETROS

MICROSCOPIO ÓPTICO COMPUESTO

PARTE MECÁNICA QUE SE PUEDE DESMONTAR

Estativo

Oculares

ObjetivosCondensador

Cabezal

Tornillos de la

platina

SISTEMA DE SOPORTE O ESTATIVO

Píe

Brazo

Tubo

Platina

SISTEMA DE AJUSTE (1)

Anillo de ajuste de los

oculares

Tornillo que permite mover el cabezal

Tornillos reguladores de la platina

Tornillos del condensador

Palanca de cierre del diafragma

SISTEMA DE ENFOQUE

Tornillo micrométrico

Tornillo macrométrico

Freno

PLATINA

Escala

Pinza

PARTE ÓPTICA• Sistema de

iluminación: fuente de luz, condensador y diafragma

• Lentes: objetivos y oculares

SISTEMA DE ILUMINACIÓN: FUENTE DE LUZ

• Suele ser una lámpara halógena de intensidad graduable

• Se enciende y apaga con un interruptor

• En el exterior puede tener un filtro

Interruptor y graduación de la luz

Lámpara

Filtro

CONDENSADOR Y DIAFRAGMA

• Condensador: concentra la luz de la lámpara en un punto de la preparación

• Diafragma o iris (está dentro del condensador):si se cierra mejora el contraste, pero empeora la resolución

LENTES: OBJETIVOS

• Están colocados en el revolver

• Tienen un sistema de amortiguación

• Un anillo coloreado indica los aumentos

• Son de 4, 10, 40 y 100 (inmersión) aumentos

OBJETIVOS

Azul40x

Amarillo10x

Rojo4x

Blanco100x

Amortiguación

Tipos de objetivos.(a) Objetivo acromático que contiene una lente frontal y dos pares

internos(b) (b) objetivo semi-apocromático, con cuatro pares de lentes(c) (c) objetivo apocromático que contiene un triplete, dos pares, un

menisco y una lente esférica frontal.

LENTES: OCULARES

Ajuste de la distancia interpupilar

Oculares

OCULARES: 10x; 15x; 20x

TETRAOCULARES

MATERIAL NECESARIO: PORTAS Y CUBRES

ACEITE DE INMERSIÓN

• Hoy no son de madera de cedro, sino sintéticos

• Los hay de baja, media y alta viscosidad

• Su empleo es imprescindible con el objetivo de inmersión (100x)

MANEJO DEL MICROSCOPIO

• No poner la preparación al revés

• Regular la luz a intensidad media

• Ajustar condensador y diafragma al medio

• Empezar por poco aumento

• Mirando por fuera subir la platina

• Enfocar y ajustar• Pasar al siguiente

aumento y enfocar• Al acabar retirar la

preparación• Apagar la luz

CONSERVACIÓN DEL MICROSCOPIO

• Ponerle su funda al guardarlo

• Limpieza de lentes con papel de gafas

• El exceso de disolvente al limpiar las lentes desgasta el cemento de unión.

• Usar pincel y pera de aire

TIPOS DE MICROSCOPIOS

Tipos demicroscopios

Microscopioóptico

Microscopioelectrónico

•Microscopio óptico Simple

•Microscopio óptico Compuesto

•M.O. Normal•Campo oscuro•Contraste de fases•Fluorescencia

•Transmisión (TEM)•Barrido (SEM)

Lupa

Otros Microscopios•De Fuerza Atómica

•Confocal

Lupa y microscopio optico

PODER DE OBSERVACIÓN DEL MICROSCOPIO

MICROSCOPÍA DE CAMPO OSCURO

Treponema pallidum

MICROSCOPÍA DE CONTRASTE DE FASES

Células epiteliales 20 x

MICROSCOPIA DE FLUORESCENCIA

Células epiteliales 200 x

Microscopio electrónico.

ERNST RUSKA

• El microscopio electrónico de transmisión (T.E.M.) consiguió aumentos de 100.000 X. Fue desarrollado por Max Knoll y Ernst Ruska en Alemania en 1931

PRIMER MICROSCOPIO ELECTRONICO

• Utilizó un haz de electrones en lugar de luz para enfocar la muestra.

• Posteriormente, en 1942 se desarrolla el microscopio electrónico de barrido (SEM).

PRIMER M.E. EN ESPAÑA (1949)

MICROSCOPIO ELECTRÓNICO

MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE BARRIDO

Otros microscopiosOtros microscopios

• Microscopio de Fuerza Microscopio de Fuerza AtómicaAtómica (AFM, de sus siglas en inglés Atomic Force Microscope): Es de tipo mecano-optico.

• Microscopio confocal: De tipo optico.

Otros microscopiosOtros microscopios

Microscopio de Fuerza AtómicaMicroscopio de Fuerza Atómica (AFM, de sus siglas en inglés Atomic Force Microscope):

• Es un instrumento mecano-óptico capaz de detectar fuerzas del orden de los piconewtons. Al rastrear una muestra, es capaz de registrar continuamente su topografía mediante una sonda o punta afilada de forma piramidal o cónica. La sonda va acoplada a un listón o palanca microscópica muy flexible de sólo unos 200 µm

• Es similar al Microscopio de Efecto Túnel, pero a diferencia de aquel, las muestras pueden ser materiales no conductores (muestras biológicas).

MICROSCOPIA DE FUERZA ATOMICA (AFM)

- Para saber más: http://es.wikipedia.org/wiki/Microscopio_de_fuerza_at%C3%B3mica

MICROSCOPIA DE FUERZA ATOMICA (AFM)

Microscopio óptico confocal:

Microscopio confocal:

• Utiliza iluminación puntual y un "pinhole" espacial (colimador de orificio delimitante) en un plano óptico conjugado frente al detector para eliminar la información que está fuera del plano focal.

• La muestra debe ser fluorescente.

- Es un microscopio que emplea una técnica óptica de imagen para incrementar el contraste y/o reconstruir imágenes tridimensionales.

Microscopio confocal:

• Puesto que sólo se ilumina un punto cada vez en el microscopio confocal, se requiere una exploración (scanning) en el espécimen para obtener imágenes bi o tridimensionales.

• Se impone la “Microscopía Confocal Laser de Barrido”.

-Sólo la luz que está dentro de este plano puede ser detectada, de modo que la calidad de imagen es mucho mejor que las de campo amplio.

Microscopio confocal:• (a) grano de polen• (b) muestra de hígado de

ratón• (c) corte grueso de

corteza cerebral de rata.Se emplearon varios marcadores

fluorescentes.• (d) auto fluorescencia de

una porción de raíz de helecho.

• Tomado de Claxton N, Fellers T, Davidson M. (2008). Laser Scanning Confocal Microscopy (119). En http://www.medic.ula.ve/histologia/anexos/microscopweb/MONOWEB/capitulo6_7.htm

Microscopio confocal:• Micrografías comparativas entre las técnicas de fluorescencia con

iluminación convencional o de campo amplio (serie superior, a, c, e) y la iluminación en microscopía confocal (serie inferior b, d, f).

Izquierda: hipotálamo de ratón

Centro: músculo liso de rata.

(marcadas con diversos fluorocromos)

Derecha: Grano de polen de girasol, autofluorescente

Microscopia confocal en dermatología y oftalmología.

http://www.grupodedermatologia.es/web/detalleCV/116/6/microscopia_confocal_laser_examen_lunares_cancer.aspxhttp://www.dermatolarg.org.ar/index.php/dermatolarg/article/viewArticle/632http://www.actasdermo.org/es/aplicaciones-clinicas-microscopia-confocal-reflectancia/articulo/13125016/

http://www.oftalmo.com/sco/revista-22/22sco03.htm

Microscopio de fuerza atómica:

Imagen tomada con microscopio de fuerza atómica:

Antibióticos sobre la superficie de células sanguíneas humanas (glóbulos rojos).

M.E DE BARRIDO

Glóbulo rojo

M.E. DE BARRIDO

Glóbulo blanco

M.E. DE TRASMISIÓN

Bacilos en división

Microscopio óptico

Extensión sanguínea: Hematíes y leucocitos

FINFIN

Para saber más:

http://www.medic.ula.ve/histologia/anexos/microscopweb/MONOWEB/capitulo6_7.htm