01 cin tica multisustrato
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11/03/2013
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Cinética enzimática de reacciones multisustratos
2013
Curva de progreso de una reacción enzimática
Vi o Vo; estado estacionario; equilibrio
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Gráfico de Michaelis-MentenLineweaver-Burk
Vm; Km; eficiencia catalítica
Reacción enzimática es una caja negra
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Ecuaciones cinéticas
f:forward, r: reverse
Clasificación de las reacciones según W.W. Cleland
1.- Reacción Ordenada o secuencial
Formación de complejo ternario
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Clasificación de las reacciones según W.W. Cleland
Formación de complejo ternario2.- Reacción al azar o desordenada
Clasificación de las reacciones según W.W. Cleland
Formación de un intermediarioReacción ping pong o con doble desplazamiento
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Objetivo de estas clases es distinguir cinéticamente los tres tipos de esquemas cinéticos
1.- Reacción Ordenada o secuencial
Formación de un intermediarioReacción ping pong o con desplazamiento
2.- Reacción al azar o desordenada
Formación de complejo ternario
¿Cómo distinguir si la catálisis de la enzima en estudio transcurre con la unión primero de todos los sustratos para formar un complejo ternario o
cuaternario o bien se forma un intermediario entre la enzima y uno
de los sustratos?
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Ecuaciones que representa una reacción ordenada con dos Sustratos
(a y b) y dos Productos (p y q)
vi
Trabajando en vi, poco producto ¿simplificación?
Ecuación simplificada de una reacción ordenada
Reordenación a curva hiperbólica
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Ecuación simplificada de una reacción ordenada
Graficación de 1/Vapp(intercepto) vs 1/B
Kmapp/ Vapp(pendiente) vs 1/B
Gráfico de Lineweaver-Burk a distintas concentraciones de sustrato B
Líneas que se cruzan en 2° o 3er cuadrante o eje X al varias sustrato fijo
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Graficos representativos de una reacción ordenada o al azar
Igual patrón de líneas que se cruzan al variar uno u otro de los S
Gráficos secundarios
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Clasificación de las reacciones según W.W. Cleland
Formación de un intermediarioReacción ping pong o con desplazamiento
Grafico Lineweaver-Burk de una reacción ping pong o de doble desplazamiento
Líneas paralelas al varias el sustrato fijo
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Reacción ping-pong
Sólo gráfico secundario Intercepto vs 1/B o 1/A
Gráfico secundario para una reacción ping pong: Intercepto vs 1/B
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RESUMEN DE ESTUDIOS EN VELOCIDADES INICIALES
Líneas que se cruzan: ⇒ Reacciones que transcurrencon la formación de un complejo ternario (Reacción Ordenada y Reacción al azar)
En gráfico de 1/vi en función de 1/S se pueden distinguir:
Líneas paralelas: ⇒ Reacciones que transcurren con la formación de un intermediario (Covalente)
Reacción Ping Pong
¿Cómo distinguir entre una reacción ordenada de una al azar?
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Estudios de inhibición por producto: secuencia entrada de sustrato y salida de productos
En ausencia de P y adicionando Q
Estudios de inhibición por producto: secuencia entrada de sustrato y salida de productos
En ausencia de Q y adicionando P
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Efecto de la adición de productos sobre los parámetros cinéticos
• Si Producto y Sustrato se unen a la misma forma enzimática se espera que sea inhibidor competitivo
• Si Producto y Sustrato se unen a formas enzimáticas distintas se espera que sea un inhibidor no competitivo mixto (Inh Mixto)
Inhibidor competitivo
Inhibidor (I) se une a la misma forma enzimática que el S (sustrato), pero no implica necesariamente que la unión sea en el sitio activo. Hay competencia por la misma forma enzimática E (enzima libre)
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Inhibidor competitivo
A conc altas de sustrato se alcanza la misma Vm, pero aumenta Km (mayor cantidad de S para semisaturar a la E)
Inhibidor no competitivo mixto
El inhibidor (I) se une a la E libre y al complejo ES
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Inhibidor no competitivo mixto
Tipos de inhibición esperables por presencia de producto: Reacción ordenada
Inhibidor competitivo:Competencia por la misma forma enzimática que el S (último P con primer S)
Inhibidor no competitivo mixto:Se une a una distinta formaEnzimática que el S
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Tipos de inhibición por productoReacción ordenada
Producto S variableP AP BQ AQ B
Tipo inhibiciónMixtaMixtaCompetitivaMixta
Tipos de inhibición por producto:Reacción al azar/desordenada
Sustrato var Sustrato Fijo Prod adicionado Tipo Inhibición
Todas las inhibiciones son competitivas
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Tipos de inhibición por producto:Reacción ping pong/intermediario covalente
Producto S variableP AP BQ AQ B
Tipo inhibiciónMixtaCompetitivaCompetitivaMixta
RESUMEN DE ESTUDIOS EN PRESENCIA DE UNO DE LOS PRODUCTOS
- Siempre se observa inhibición competitiva entre elprimer Sustrato (A) y último producto (Q).
- Hay inhibición competitiva cuando el Producto compite por la misma forma enzimàtica.
- Hay inhibición no competitiva mixta cuando elProducto y el Sustrato se unen a distintas formas enzimáticas.
- Patrón de inhibición característico de cada tipo de mecanismo cinético.
- Permite demostrar secuencia de entrada de Sustratosy salida de Productos.
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Graficaciones lineales de la Hipérbola equiláteraGráfico de Hanes-Woolf
Graficaciones lineales de la Hipérbola equilátera: Grafico de Eadie-Hofstee
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Tarea para Laboratorio de Cinética multisustratos
• Traer individualmente para este jueves 14 los cambios en los lugares donde se determinan Km y Vm al graficar según
• Hanes-Woolf• Eadie-Hofstee
al agregar a) un inhibidor competitivo y b) un no competitivo mixto
BIBLIOGRAFIA• Voet y Voet. Bioquimica
• A. Cornish-Bowden. Fundamentals of Enzyme kinetics
• Cleland, W. W. (1963) The kinetics of enzyme-catalyzed reactions with two or more substrates or products. Biochim. Biophys. Acta 67, 104–137.
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