aloina
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Determinacion de aloinaTRANSCRIPT
IDENTIFICACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE ANTRAQUINONAS Y CROMONAS
EN PLANTAS DE Aloe vera CULTIVADAS EN MUNICIPIOS DE RISARALDA
POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA EFICIENCIA
MARIA FERLLEY VÉLEZ SERNA
NATHALY VILLA PULGARÍN
UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE PEREIRA
FACULTAD DE TECNOLOGÍA
QUÍMICA INDUSTRIAL
PEREIRA
2012
12
RESUMEN
Se realizó la identificación de antraquinonas y cromonas presentes en acíbar y gel
de Aloe vera en las fincas La Magdalena en Mistrató, Pite tierra en Santuario, La
Esperanza en Belén de Umbría, La Aurora en Marsella y La Palma en Pereira en
el corregimiento de La Florida ubicados en el departamento de Risaralda. Se
implemento un método de secado del gel con el fin de concentrar el contenido total
de antraquinonas y cromonas. La identificación y cuantificación se llevo a cabo
mediante la técnica de Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia (CLAE) en fase
reversa usando detector UV-Vis y para la obtención de espectros UV se usó
detector DAD; el método empleado para el análisis de las antraquinonas y
cromonas es precisa, exacta, reproducible y adecuada para el análisis de
muestras de Aloe vera.
Se encontraron diferencias significativas en cuanto al contenido de antraquinonas
y cromonas haciendo uso del software InfoStat mediante el análisis de varianza
ANOVA y el análisis de conglomerados. El mayor contenido de estos metabolitos
se encontró en la finca La Palma en La Florida en acíbar y gel, las fincas La
Magdalena en Mistrató y La Aurora en Marsella presentaron contenidos similares
e intermedios, mientras que en la finca Pite tierra en Santuario se encontró el
menor contenido de antraquinonas y cromonas, estos resultados aporta a los
productores de Aloe vera en el departamento información para darle uso comercial
a sus plantas de acuerdo al contenido de estos metabolitos.
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1. JUSTIFICACIÓN
Durante los últimos treinta años se han emprendido en diferentes partes del
mundo programas dedicados a la investigación de Aloe vera, debido a sus
propiedades terapéuticas, nutricionales y cosméticas. A nivel mundial el mercado
crece continuamente, debido a que el mucílago y el acíbar extraídos de este
vegetal son productos cada vez mas apetecidos por la industria alimenticia,
farmacéutica y cosmética [1].
En Estados Unidos, la mayor parte de Aloe vera es cultivada en el Valle de Río
Grande al sur de Texas, en Florida y al sur de California. Internacionalmente, el
aloe se puede encontrar en México, en los países a lo largo del pacífico, la India,
América del sur, América central, el Caribe, África y Australia. Los mercados más
atractivos para productos de Aloe vera son los Estados Unidos, Francia, Reino
Unido, Alemania, Italia, Canadá, Japón, España, Suecia y Corea [2].
En Latinoamérica la gran producción de cultivos de Aloe vera se da en México,
seguido por República Dominica y Venezuela. En Colombia los cultivos de Aloe
vera, se encuentran repartidos en diferentes departamentos, siendo de mayor
participación los departamentos de atlántico y magdalena, El eje cafetero no tiene
una participación considerable dentro de las estadísticas nacionales ya que sus
cultivos son menores al 5%; esto debido a que la planta se introdujo a la región en
el 2004 [3].
En la región cafetera con el ánimo de aprovechar las bondades del clima y la
excelente calidad de sus suelos y a su vez como un fin social para dar una nueva
alternativa a los cultivadores se ha implementado el cultivo del Aloe vera en los
departamentos de Risaralda y Quindío [4].
En la planta de Aloe vera se pueden encontrar diversos componentes como agua,
enzimas, vitaminas, minerales, aminoácidos, azúcares y antraquinonas [5]. Las
antraquinonas son muy estudiadas debido a que otorgan propiedades curativas,
laxantes, entre otras, a las plantas en las que se encuentran presentes. Estos
metabolitos secundarios son de gran importancia debido a que actúan en la planta
como mecanismo de defensa; es decir, son una respuesta al medio, el cual incide
en su contenido tanto en el gel como en el acíbar.
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En la región se han realizado diversos estudios de caracterización del Aloe vera;
en cuanto a antraquinonas se desarrollo un trabajo para dar cumplimiento a lo
exigido por el INVIMA quien es el ente dedicado al control y vigilancia en la calidad
y seguridad de los productos farmacéuticos y alimenticios; el cual pide que el
análisis sea realizado por medio de la técnica fotométrica; sin embargo con este
método solo se conoce el contenido total de antraquinonas. Teniendo en cuenta la
importancia de estos compuestos en la planta y por sus diferentes aplicaciones, se
considera necesario realizar un estudio que permita cualificar y cuantificar los
diferentes isómeros de antraquinonas mediante técnica cromatográfica que brinde
mayor información y permita establecer diferencias entre los cultivos de las zonas
de la región cafetera y su posible aplicación.
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2. OBJETIVOS
2.1. OBJETIVO GENERAL
Realizar el estudio comparativo del contenido de antraquinonas y cromonas
presentes en las hojas de Aloe vera procedentes de diferentes municipios del
departamento de Risaralda, mediante la técnica de cromatografía líquida de alta
eficiencia, con el fin de ampliar la información de los cultivos en la región.
2.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS
Desarrollar una técnica de cromatografía líquida de alta eficiencia para
cualificar y cuantificar isómeros de antraquinonas y cromonas.
Cualificar los principales isómeros de antraquinonas y cromonas presentes en
hojas de Aloe vera cultivados en diferentes municipios de Risaralda.
Cuantificar los principales isómeros de antraquinonas y cromonas presentes
en hojas de Aloe vera cultivados en diferentes municipios de Risaralda.
Determinar el contenido de antraquinonas totales en plantas de Aloe vera
procedentes de uno de los municipios de estudio empleando la técnica
espectrofotométrica según el requerimiento de INVIMA y compararlo con el
establecido por la técnica de cromatografía liquida de alta eficiencia en este
estudio.
16
3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
En Colombia, existen cultivos de Aloe vera localizados en varios departamentos.
En la región cafetera se inició el cultivo en el 2004, sin embargo se importa
materia prima para la elaboración de productos a base de Aloe vera. Desde su
establecimiento en la región se han realizado diferentes estudios sobre su
adaptación, plagas y suelos, pero no sobre sus características químicas
generando esto una carencia de soporte técnico para productores y procesadores
de Aloe vera.
Se plantea el estudio comparativo del contenido de antraquinonas y cromonas
presentes en los cultivos de Aloe vera en el departamento de Risaralda, por el
método de cromatografía líquida de alta eficiencia (CLAE), para ampliar el
conocimiento de la composición química del Aloe vera cultivado en Risaralda.
¿Será posible mediante el análisis cualitativo y cuantitativo de antraquinonas por
CLAE establecer diferencias o similitudes entre plantas de Aloe vera cultivadas en
diferentes municipios de Risaralda y así contribuir al mejor aprovechamiento de
esta materia prima?
29
Tabla 8. Composición química del mucilago de Aloe vera
COMPONENTES CARACTERISTICAS
Vitaminas
Vitamina A, B1, B2, B5, trazas de B12, C, E, ácido fólico, colina Niacina [5].
Al igual que otros vegetales, el Aloe vera es rico en vitaminas y tiene un bajo contenido de grasa y alto en fibra, que son responsables de sus usos terapéuticos y propiedades funcionales como antioxidante [37].
Enzimas
Lipasa, amilasa, catalasa, oxidasa, fosfatasa alcalina [5].
La catalasa integra parte del sistema antioxidante y es importante ya que su función es destruir el H2O2 generado durante el metabolismo celular [28].
Minerales
Calcio, potasio, cloro, hierro, zinc, cobre, azufre, sodio, cromo, manganeso, aluminio, magnesio y germanio [38].
Actúan como biocatalizadores que permiten la transformación química de sustratos, a partir de los cuales se producen los diferentes componentes necesarios para los procesos vitales [39].
Azú
ca
res
Polisacáridos
Fructosa, aloérido, celulosa, glucomananos neutros, galactogalacturonanos, glucogalactomananos, arabinosa, entre otros.
Se ha demostrado que los polisacáridos, contribuyen a la actividad farmacológica en la estimulación de la proliferación celular y en actividades biológicas como anti -inflamatorias, antivirales, inmunomoduladoras, anti-ulcerativas, desinfectante, cicatrizante y como anti-oxidadante [25, 33, 40, 41]
Monosacáridos
Glucosa, manosa, xilosa, galactosa, ramnosa, arabinosa y ácidos urónicos.
Aminoácidos
Lisina, valina, cisteína, glicina, fenilalanina, metionina, leucina, ácido aspártico, ácido glutámico, arginina y serina [5]
El Aloe vera proporciona 20 de los 22 aminoácidos requeridos por el cuerpo humano y 7 de los 8 aminoácidos esenciales que el cuerpo no sintetiza [5, 13]
Co
mp
ue
sto
s f
en
óli
co
s
Derivados hidroxiantracénicos
Aloína, aloe emodina, 4-Hidroxialoína, 5-hidroxialoína, aloinósidos A y B.
Ejercen una amplia gama de actividades biológicas como: antifúngico, antimicrobiano, anticancerígeno y antioxidante [42]. Funcionan como analgésicos y poseen potentes propiedades antibióticas, tanto para virus como para bacterias [5]
Derivados cromónicos
Aloesina, aloeninas A y B, aloeresina A y B, 8-C-glucosil-7-o-metil-(s)aloesil.
5.1.7. Estudios sobre diferentes aplicaciones del Aloe vera. Debido a la gran
cantidad de metabolitos secundarios que posee la planta y a sus múltiples
aplicaciones se han realizado diversos estudios a nivel nacional e internacional,
algunos de estos estudios se presentan en las tablas 9 y 10.
30
Tabla 9. Estudios sobre diversas aplicaciones del Aloe vera
PAÍS ESTUDIO OBJETIVO RESULTADOS
Co
lom
bia
20
11 Estabilización del gel de
Aloe barbadensis Miller y disminución de su
concentración.
Disminución de la concentración de aloina y aloe-emodina por adsorción en columna con carbón activado
Se evidencia la poca influencia del proceso de estabilización en el contenido de aloe-emodina en el gel de Aloe, como si ocurre en el caso de la aloína. Se muestra la eficacia de la técnica propuesta para la estabilización del gel de Aloe barbadensis Miller, con concentraciones de aloína en solución permitdas por el Aloe Science Council [43].
Tu
rqu
ía
20
11 Composición química y
aplicaciones del Aloe vera
Revisar la historia, sus productos químicos, el uso medico, morfología vegetal, extractos y agronomía de Aloe vera.
Los extractos de Aloe vera son ampliamente utilizados en alimentos, cosméticos, salud, cuidado de la piel e industria medica. La administración de alimentos y fármacos de EE.UU. ha aprobado el estudio del desarrollo de Aloe vera en el tratamiento del
cáncer y el SIDA. En el futuro se requieren estudios controlados para probar la eficacia del Aloe vera en distintas condiciones [44].
Co
lom
bia
20
09
Conservacion de fresa (fragaria x ananassa duch cv. camarosa)
mediante la aplicación de recubrimientos
comestibles de mucílago de Aloe barbadensis
Miller.
Obtener un recubrimiento comestible a partir del gel de Aloe vera para
prolongar la vida útil de las fresas.
Se logro aumentar la vida útil de las fresas frescas en 10 días, disminuyendo las pérdidas de humedad [45].
Su
dá
fric
a
20
08 Composición y
aplicaciones del gel de la hoja de Aloe vera
Resaltar los efectos descubiertos recientemente y aplicaciones del gel de la hoja.
Las diferencias en la composición de la planta debido a la ubicación geográfica, así como las diferencias en los métodos de extracción de gel y técnicas de preparación de muestras, han contribuido a las discrepancias en los resultados obtenidos en numerosos estudios en términos de la composición química y la actividad biológica del gel de Aloe vera [46].
Ve
ne
zu
el
a 2
008 Antraquinonas en Aloe
vera barbadensis Miller de zonas semiáridas de
Falcón Venezuela, como inhibidores de corrosión
Aislar la resina del Aloe vera, y determinar su acción inhibidora de corrosión en el acero.
Se aislaron y caracterizaron tres grupos de compuestos de antraquinonas responsables de la actividad inhibidora [47].
Pe
rú 2
007
Efecto protector del Aloe
vera (sábila) en lesiones
gástricas inducidas con
etanol en ratas.
Determinar el efecto
citoprotector del gel de
Aloe vera sobre la
mucosa gástrica y
compararla con la del
sucralfato en animales
de experimentación.
El tratamiento con Aloe vera redujo
significativamente el porcentaje de
área hemorrágica con respecto al
grupo control. Respecto a la
profundidad de lesión, no existen
diferencias significativas entre los
valores promedios del grupo
sucralfato y el grupo Aloe vera [48].
31
Tabla 10. Estudios sobre diversas aplicaciones del Aloe vera
PAÍS ESTUDIO OBJETIVO RESULTADOS
Cu
ba
200
6
Gel de Aloe vera (L). N.L. Burm. y harina de Sagú como soporte sólido de medio de cultivo para plantas medicinales
Estudiar el comportamiento del gel de Aloe vera y harina de sagú, como soporte solido del medio de cultivo de plantas medicinales
Se demostró que es posible la sustitución total o parcial del agar empleado tradicionalmente, se logra un beneficio económico[49]
Ko
rea
20
03
Revisión de la relación entre los componentes
del Aloe vera y sus efectos biológicos
Establecer la relación entre los componentes del Aloe vera y sus
efectos sobre la base de los informes publicados y otros hallazgos recientes.
A la luz de muchas actividades farmacológicas de los componentes de Aloe vera, cada componente
activo tiene varios factores de interacción, cada uno de los cuales puede ser afectado por otra sustancia [5].
5.2. COMPUESTOS FENÓLICOS
5.2.1. Definición. Los compuestos fenólicos constituyen una de las familias más
numerosas y ampliamente distribuidas en el reino vegetal, con más de 8000
estructuras actualmente conocidas. Estos compuestos han sido de interés porque
son esenciales para la fisiología y la morfología de las plantas. Están involucrados
en el crecimiento y la reproducción, y confieren resistencia a las plantas frente a
agentes patógenos y depredadores [50].
Tienen un anillo aromático en común con uno o más grupos hidroxilos. Estos
compuestos pueden ser divididos en varios grupos de acuerdo con su estructura
química básica [50].
5.2.2. Clasificación de los compuestos fenólicos. En la tabla 11 se puede
observar la clasificación de los principales compuestos fenólicos de acuerdo con
su estructura química.
Tabla 11. Clasificación de los compuestos fenólicos [50]
Estructura carbonada Clasificación
C6 Fenoles simples, benzoquinonas
C6-C1 Acidos fenólicos
C6-C2 Acido feniacetico, acetofenoles
C6-C3 Acido hidroxicinamico, polipropano, cumarina, isocumarina
C6-C4 Naftoquinona
C6-C1-C6 Xantanos
C6-C2-C6 Antraquinona, estilbeno
C6-C3-C6 Flavonoides, isoflavonas
(C6-C3)2 Lignanos, neolignano
(C6-C3-C6)2 Bioflavonoides
(C6-C3)n Ligninas
(C6)n Melanoidinas
(C6-C3-C6)n Taninos
32
5.2.3. Antraquinonas. Entre los compuestos fenólicos caben destacar las
antraquinonas, que son por mucho el grupo más amplio de las quinonas naturales
y son la base y fuente de una importante cantidad de colorantes [51]; además son
una clase de metabolitos secundarios vegetales con una funcionalidad p-quinoide
en un núcleo antracénico [52].
5.2.3.1. Definición y estructura. Las antraquinonas tienen dos grupos ceto-, su
mayoría en posición 9,10 (ver figura 5). La antraquinona basal (9,10
dioxoantraceno), puede ser sustituida de varias formas, resultando en una gran
diversidad de estructuras [53]. Exhibiendo numerosas actividades biológicas que
los hacen buenos candidatos para nuevas investigaciones biológicas o
farmacológicas, entre otras aplicaciones [54].
O
O
21
345
6
8
97
10
Figura 5. Estructura general de las antraquinonas
5.2.3.2. Propiedades generales de las antraquinonas
Las agliconas antraquinónicas son compuestos sólidos, cuyo color va desde el
amarillo al pardo rojizo.
Son solubles en solventes orgánicos: Éter, cloroformo, alcohol caliente,
benceno.
Los glucósidos antraquinónicos son cristalizados, estas tienen un color más
pálido que la aglicona correspondiente y son solubles en agua caliente y
soluciones hidroalcohólicas.
5.2.3.3. Funciones de las antraquinonas. Se ha reportado que las antraquinonas
ejercen una amplia gama de actividades biológicas incluyendo antifúngico,
antimicrobiano, anticancerígeno y antioxidante [42]. Funcionan como analgésicos
y poseen potentes propiedades antibióticas, tanto para virus como para bacterias
[55].
5.2.3.4. Fuentes de las antraquinonas. Las antraquinonas están ampliamente
distribuidas en microorganismos, plantas, equinodermos e insectos. Las familias
vegetales más ricas en compuestos antracénicos son las rubiáceas, las
33
ramnáceas y las poligonáceas; y en una menor proporción las liliáceas,
leguminosas, bignoniáceas, melastomatáceas, droseráceas, vismiáceas, etc.
En las plantas inferiores como los líquenes se conoce una gran variedad de
antraquinonas, incluyendo antraquinonas halogenadas. Estas sustancias pueden
encontrarse en diferentes partes de la planta como hojas, tallos, madera y frutos;
se les encuentra principalmente en forma de glicósidos y en menor proporción en
forma libre o agliconas.
Sus componentes más importantes y activos son los derivados hidroxiantracénicos
(15 – 40%) como la antraquinona glicosidada aloína A y B; aloinósido A y B y 5-
hidroxialoína [13].
5.2.4. Aloína. Es un liquido amarillo de sabor amargo, considerada el compuesto
antraquinónico más importante del Aloe vera, es una antrona-C-glucósido con
nombre IUPAC 10-glucopiranosil-1,8-dihidroxi-3-(hidroximethil)-9(10H)-
antracenona, también conocida como barbaloína, está presente en las hojas de
especies de aloe, su contenido varía desde la estación, la especie y la edad de la
hoja. Varios estudios indican un contenido entre 10 - 25% del peso seco de
exudado de las hojas [56].
La aloína se produce de forma natural como una mezcla de diastereisómeros,
aloína A (Ajuste a C10, C1,: S, S) y aloína B (en la configuración C10, C1,: R, S)
como se observa en la figura 6; que difieren unos de otros solamente en la
configuración en el carbono 10 (C-10) en la molécula de antrona aloe-emodina
[56].
O
H
HH
H
OH
OH
H OH
OH
O OHOH
OHH
O
H
HH
H
OH
OH
H OH
OH
O OHOH
OHH
Aloína A Aloína B
Figura 6. Estructura de la Aloína A y B
34
5.2.4.1. Funciones de la aloína. La aloína es el principal componente de una
sustancia amarilla que la planta de Aloe vera secreta como defensa para alejar a
posibles depredadores por su olor y sabor desagradables. También parece
intervenir en el proceso de control de la evapotranspiración en condiciones de
elevada insolación y sequía. Esta antraquinona es un veneno, laxante y abortivo
[57]. Con efecto catártico, además tiene aplicaciones dermatológicas, ya que es un
potente compuesto anti-malarico, antifungico, con propiedades antibacterianas y
antivirales [58]. Se utiliza en preparados farmacéuticos produciendo en ocasiones
alergias a personas sensibles y en la legislación europea se admite como máximo
un 0,1 % y Está completamente prohibida la presencia de aloína en productos
alimentarios [57].
5.2.5. Cromonas
5.2.5.1. Definición y estructura general. Las cromonas son un grupo de
compuestos de origen natural muy abundantes; especialmente en las plantas. Son
compuestos heterocíclicos que contienen oxigeno con un anillo benzo-γ-pirona
como se observa en la figura 7 [59]. Dentro de ellas podemos encontrar la
aloesina, también denominada aloeresina B y la aloeresina A [56].
O
O
Figura 7. Estructura general de las cromonas
5.2.5.2. Funciones. Las moléculas que tiene estructura de cromona tienen un
amplio rango de actividades biológicas; son componentes bio-activos en fuentes
naturales, se utilizan como anti-inflamatorios y antibióticos [28].
5.2.5.3. Fuentes. Como se había mencionado anteriormente las cromonas se
encuentran en la naturaleza distribuida en hongos como: Aspergillus, nigers,
líquenes como: Roccella fuciformis D.C. y plantas superiores como: Cassia
obtusifolia y Aloe vera [60].
5.2.6. Aloeresina A. Segundo componente del Aloe vera Similar a la aloína, la
aloeresina tiene un azúcar C-glicosídico como se aprecia en la figura 8. El enlace
carbono-carbono que une al azúcar aglicona es muy fuerte. La cromona se
35
distribuye a lo largo del género, se presenta en aproximadamente el 40% de las
especies ya examinadas [56].
Figura 8. Estructura de la Aloeresina A
5.2.6.1. Actividad biológica. Tiene propiedades antioxidantes y propiedades anti-
inflamatorias, tópicamente puede absorber la luz ultravioleta [38].
Este compuesto tiene actividad inhibidora sobre la enzima tirosinasa. que cataliza
la conversión de tirosina en dopaquinona, y la cual es una subsecuente
polimerización a la melanina; por lo tanto, reduce la formación de melanina y
cualquier tendencia a la hiperpigmentación [56].
5.2.7. Extracción de antraquinonas. Existen varios métodos de extracción para
antraquinonas, los procedimientos usados para el aislamiento de estas sustancias
dependen del tipo de núcleo de interés, es decir si se desea obtener las agliconas,
los glicósidos, las formas reducidas o las formas oxidadas. La agliconas presentes
en la muestra vegetal se extraen con solventes poco polares como éter etílico o
benceno. Los compuestos glicosídicos se extraen ya sea con etanol, agua o
mezclas de etanol-agua [52].
Los métodos de extracción empleados son los siguientes:
Extracción Soxhlet. Esta extracción se lleva a cabo usando un disolvente
orgánico, el cual refluye a través de la muestra contenida en un dedal poroso de
celulosa o vidrio. Las ventajas mas importantes son el contacto continuo de la
muestra con disolvente fresco, simplicidad, bajo coste de adquisición y la
posibilidad de procesar grandes cantidades de muestra; sus limitaciones son: el
tiempo necesario para la extracción, y los volúmenes de disolvente, en general
36
muy elevados frente a la extracción con otras técnicas lo que implica la necesidad
de concentrar los extractos orgánicos obtenidos [61].
Extracción por ultrasonido. Es una técnica sencilla de extracción sólido-
líquido, en donde la muestra se pone en contacto con un disolvente adecuado y se
somete a los ultrasonidos generados en un baño de agua o por una sonda de
ultrasonidos. De este modo, se produce la agitación continua de la matriz con el
disolvente orgánico. El efecto mecánico de los ultrasonidos provoca una mayor
penetración del disolvente en los materiales sólidos, facilitando la transferencia de
los analitos de la matriz al disolvente. La elección del disolvente es esencial para
que el método permita obtener elevadas recuperaciones de los analitos de interés
[61].
5.3. TÉCNICA DE ANÁLISIS
Para la cuantificación de antraquinonas se han utilizado diferentes métodos
instrumentales, entre ellos el espectrofotométrico, esta es una técnica que permite
cuantificar las antraquinonas totales presentes en la matriz a analizar. Los
métodos cromatográficos permiten una identificación más específica de estos
analitos, como por ejemplo los isómeros A y B de la Aloína, en esta técnica no se
requiere la preparación de derivados como en la espectrofotométrica, permitiendo
así la lectura de los compuestos en la región ultravioleta (UV) [42].
Existen otros métodos que han sido reportados para la identificación y
cuantificación de derivados de antraquinonas en extractos de plantas como
cromatografía en contracorriente de alta velocidad (HSCCC), cromatografía
electrocinética micelar (MEC), electroforesis capilar de zona, cromatografía en
capa fina de alto rendimiento (HPTLC) [62].
5.3.1. Cromatografía. La cromatografía es un procedimiento de separación de
los constituyentes de una mezcla. Se ha convertido en un método analítico de
primer orden para identificar y cuantificar los compuestos de una fase liquida o
gaseosa homogénea. Se fundamenta en los equilibrios de concentración de los
compuestos presentes entre dos fases no miscibles de la que una llamada
estacionaria, esta inmovilizada en una columna o fija sobre un soporte y la otra,
llamada móvil, se desplaza al contacto de la primera. La elución a velocidades
diferentes de los compuestos presentes conduce a su separación [63].
5.3.2. Clasificación de las técnicas cromatográficas. Las técnicas
cromatográficas pueden clasificarse según la naturaleza física de las fases, el
37
procedimiento utilizado o el fenómeno físico-químico. A continuación se realiza
una breve descripción de las diferentes técnicas según la naturaleza de las fases
involucradas [63]
Cromatografía plana.
Cromatografía en capa delgada. Es una técnica de adsorción sólido-líquido
que cuenta con la capacidad de separar varias muestras simultáneamente
en una sola placa de vidrio revestida con una capa delgada adherente de
partículas finamente divididas. La fase móvil se desplaza por la fase
estacionar por acción capilar [64, 65].
Cromatografía en papel. El papel cromatográfico se fabrica de celulosa
pura y con un estricto control de porosidad y grosor. El papel contiene
suficiente agua adsorbida para que constituya la fase estacionaria acuosa.
La fase móvil es un solvente orgánico saturado en agua [65].
Cromatografía en columna. Como fase estacionaria (adsorbente) se usa,
generalmente, sílice o alúmina contenida en una columna y la fase móvil pasa a
través de la columna por medio de los espacios abiertos entre las partículas del
material de relleno. La elución implica la purificación de una especie por lavado
mediante adición continua de solvente nuevo [65].
Cromatografía gaseosa. Es una técnica donde el analito se hace pasar en
forma gaseosa a través de la columna, arrastrado por una fase móvil
gaseosa, llamado gas portador [66].
Cromatografía de adsorción gas-solido. Se basa en una fase estacionaria
sólida en la cual la retención de los analitos ocurre por adsorción, es útil para
la separación de especies que no se retienen en columnas de gas-líquido;
esta cromatografía se lleva a cabo tanto en columnas de relleno como en
columnas tubulares abiertas [65].
Cromatografía de partición gas-liquido. En esta técnica el analito se divide entre una fase móvil gaseosa y una fase estacionaria líquida sobre la superficie de una relleno sólido inerte o en las paredes de un tubo capilar [65].
En la figura 9 se observa un esquema de las técnicas cromatográficas existentes.
38
Figura 9. Esquema de clasificación de las técnicas cromatográficas
5.3.3. Cromatografía líquida de alta eficiencia (CLAE)
La cromatografía liquida se basa en la combinación de un alto intervalo de
posibles propiedades de la fase móvil, junto con la elección de numerosos tipos de
fases estacionarias, significativamente diferentes, así como una amplia variedad
de detectores [67]. En la CLAE el compuesto pasa por la columna cromatográfica
a través de la fase estacionaria mediante el bombeo de líquido a alta presión a
través de la columna. La muestra a analizar se inyecta en pequeñas cantidades y
sus componentes eluyen diferencialmente dependiendo de las interacciones
químicas o físicas con la fase estacionaria a medida que pasan por la columna. El
grado de retención de los componentes de la muestra depende de su naturaleza,
afinidad hacia la fase estacionaria y fase móvil; y la composición de las mismas
[67, 68]
5.3.3.1. Tipos de separación por cromatografía liquida. En CLAE el método
dominante es la cromatografía de fase ligada que puede clasificarse en fase
normal (NP-BPC) y fase reversa de acuerdo a la polaridad relativa de la fase móvil
y de los grupos funcionales químicamente ligados a la matriz [69].
Clasificación técnicas
cormatogáficas
Cromatografía Plana
Cromatografía Capa delgada
Cromatografía de papel
Cromatografía en Columna
Cromatografía de Gases
F.M: Gaseosa
Gas-Sólido
Gas-Líquida
Cromatografía Líquida
F.M: Líquida
Líquida-Sólida
Líquida-LíquidaCromatografía líquida de alta
eficiencia
Intercambio Iónico
Exclusión Molecular
39
Cromatografía de fase normal. En esta cromatografía la fase estacionaria es
polar, utilizándose rellenos en los que R en la estructura del siloxano puede ser un
grupo ciano (-C2H4CN), diol (-C3H6OCH2CHOHCH2OH), AMINO (-C3H6NH2) y
dimetilamino (-C3H6N(CH3)2); La elución se lleva a cabo con solventes no polares
como etiléter, cloroformo o n-hexano. El componente menos polar eluye primero,
debido a que es el más soluble en la fase móvil, y un aumento de la polaridad de
ésta hace disminuir el tiempo de elución [70].
Cromatografía en fase reversa. En esta técnica la fase estacionaria es menos
polar que la fase móvil. La columna esta rellena de partículas de sílicagel unidas a
cadenas C18 como Octadecilsilano (fase estacionaria más utilizada); a cadenas
C8 octilsilano, ciclohexilo y grupos fenilo [71]; los componentes más polares
aparecen primero y al aumentar la polaridad de la fase móvil aumenta el tiempo de
retención de los componentes [70].
La fase móvil está constituida por un solvente polar, mezcla de agua y un
modificador orgánico, a los que se les puede agregar aditivos, sales o buffers. A
mayor modificador orgánico, menor retención y a mayor proporción de agua,
mayor retención. Los solventes de mayor empleo además de agua son: metanol,
acetonitrilo, isopropanol y tetrahidrofurano [69]. Estos solventes se pueden
clasificar en términos de polaridad de la siguiente manera:
Agua > MeOH > AcCN > IsoPOH > THF
A medida que disminuye la polaridad en los solventes, aumenta su poder de
elución; en la tabla 12 se mostraran algunas de sus propiedades.
Solvente Índice de polaridad
Fuerza dispersiva
Donador de protones
Aceptor de protones
Momento dipolar
Agua 9.0 0.40 0.34 0.26
Metanol 6.6 0.03 0.51 0.19 0.30
Acetonitrilo 6.2 0.04 0.33 0.26 0.41
Isopropanol 4.3 -0.10 0.28 0.39 0.33
Tetrahidrofurano 4.2 -0.15 0.41 0.19 0.40
Tabla 12. Propiedades de los solventes en CLAE
La cromatografía en fase reversa puede clasificarse según su forma operativa
como se observa en la tabla 13.
40
Tabla 13. Clasificación de la cromatografía en fase reversa según su forma operativa
Cromatografía Descripción
Supresión iónica
Los solutos ionizables dan picos con baja retención y fuerte asimetría; en fase reversa solo se retendrá favorablemente la especie no iónica. Así, los factores que modifican ese equilibrio, ya sean pH o fuerza iónica, modificaran la retención [69].
Par iónico
En esta cromatografía la fase móvil contiene un par-ión, es decir, una especie química de carga opuesta al analito; estos forman un complejo “neutro” que se transporta dentro de la columna, particionándose entre la fase móvil y la fase estacionaria. Se trata de mantener el analito en su forma iónica [69].
Complejación con iones metálicos
Esta modalidad se conocía como cromatografía de intercambio de ligandos, por el intercambio del soluto (ligando) con iones metálicos inmovilizados en la fase estacionaria [69].
RP en medio no acuoso
El soluto puede ser insoluble en AcCN, MeOH o THF, y sus mezclas con agua. Estas muestras altamente lipofílicas pueden ser resueltas en fase normal; pero la fase reversa con fase móvil de baja polaridad, sin agua agregada tiene muchas veces la suficiente selectividad y poder de retención para permitir su resolución[69]
De reparto
Para este tipo de cromatografía se emplea como fase móvil una mezcla de agua y un modificador orgánico MeOH, AcCN o THF, en mezclas binarias, terciarias y en casos complejos, aún cuaternarias [69].
5.4. INSTRUMENTACIÓN PARA CORMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA
EFICIENCIA
5.4.1. Bomba. las bombas de CLAE impulsan la fase móvil proveniente del
reservorio de solvente hacia el inyector, y desde allí hacia la columna.
Básicamente existen dos tipos de bomba: las de pistón y las de desplazamiento
[69].
5.4.2. Inyector. Es el dispositivo que permite introducir la muestra en solución sin
interrumpir el caudal de solvente a través del sistema. Actualmente la totalidad de
los inyectores de CLAE son válvulas que orientan el caudal hacia la columna, las
válvulas pueden accionarse manual o automáticamente [69].
5.4.3. Columna. Consta de un soporte rígido, más una fase estacionaria adjunto
[64]. La fase estacionaria está contenida en un tubo que debe ser capaz de
contener la presión generada en su interior durante su uso [72].
41
5.4.4. Detectores. El detector es un transductor que convierte una característica
física o química de un analito eluido en una señal eléctrica que puede estar
relacionada con la concentración del analito [64], y luego transmitir la señal
eléctrica a la pantalla donde se muestra como una desviación de la línea [71].
Los detectores pueden clasificarse en generales y selectivos. Los detectores
generales miden el cambio en alguna propiedad física de la fase móvil que
contiene el analito, como el detector de índice de refracción y de conductividad;
los detectores selectivos son aquellos sensibles a alguna propiedad propia del
soluto como el detector UV, de arreglo de diodos (DAD), de fluorescencia,
índice de refracción y el electroquímico [69, 71].
5.4.4.1. Detector de adsorción UV-visible. Los detectores más utilizados en la
HPLC moderna son fotómetros basados en rayos ultravioleta (UV) y la absorción
de luz visible. Estos detectores tienen una alta sensibilidad para muchos solutos,
pero las muestras deben absorber en la región UV (o visible). La concentración de
la muestra es linealmente proporcional a la absorbancia, de luz transmitida a
través de la celda.
5.4.4.2. Detector de arreglo de diodos. Puede ser operado para recopilar datos
en una o más longitudes de onda a través de un cromatograma, o para recoger
espectros completos de uno o más analitos en una corrida. Si dos picos eluidos
estrechamente tienen espectros suficientemente diferentes, puede ser posible
distinguir los dos picos espectralmente con este detector [64]
5.3.3. Espectroscopia ultravioleta visible. La absorción en el UV-VIS se debe a
las vibraciones de los electrones, con cambio de su nivel energético, se da más
fácilmente en los compuestos que tienen enlaces dobles y triples conjugados y
electrones no compartidos y esta favorecida por la resonancia. Esta técnica da
información sobre la distribución de electrones en la molécula (espectros
electrónicos) y de ella se obtienen algunos datos sobre la estructura molecular
[73].
La región UV-Vis del espectro electromagnético, que se extiende de unos 200 a
unos 800 nm, es la región espectral más utilizada en análisis químico. Los
instrumentos que se utilizan en el visible y el ultravioleta son comunes,
relativamente sencillos y bien adaptados al análisis cuantitativo. Existen dos
clases generales de compuestos químicos que absorben en la región ultravioleta-
42
visible y que se pueden determinar cuantitativamente midiendo esta absorción. Se
trata de los compuestos orgánicos que poseen dobles enlaces conjugados o
anillos aromáticos, y los iones de los metales de transición.
Los equipos destinados a la medición de la absorción de radiación contienen una
fuente de radiación continua. Para la luz visible, esta fuente o foco es una lámpara
de filamento de wolframio [74].
5.5. ANÁLISIS CUALITATIVO Y CUANTITATIVO
5.5.1. Análisis cualitativo. Las mediciones cualitativas son las que identifican o
ayudan a identificar la estructura de un analito. En general, la cromatografía es
una débil herramienta para el análisis cualitativo, pero un sistema CLAE de buen
comportamiento acoplado a un detector apropiado puede hacer que sea mucho
más adecuado. Existen tres métodos comunes para el análisis cualitativo por
CLAE:
Tiempo de retención: La técnica más común para el análisis cualitativo por
HPLC es comparar el (tR) tiempo de retención del analito a la de un patrón de
referencia.
Análisis en línea: La elucidación estructural de analitos desconocidos se
puede realizar con la ayuda de detectores de CLAE, pero rara vez esta detección
es tan eficaz como los procedimientos cualitativos off-line. Varios detectores de
como UV, RMN, o IR proporcionan información cualitativa espectral sobre la
muestra; mientras que otros detectores, como dispersión láser de luz, MS o
detectores quirales generan información más específica y cuantitativa sobre el
analito.
● Análisis fuera de línea: Si se recogen fracciones de la corriente de efluente en
CLAE en modo semipreparativa o preparativa, una cantidad suficiente de analito
puro puede ser recogido para permitir el análisis fuera de línea para la
determinación estructural [64].
5.5.2. Análisis cuantitativo.
5.5.2.1. Calibración. La calibración es el proceso mediante el cual se determina
la respuesta del detector por unidad de concentración (o masa) del analito. La
43
calibración puede realizarse con tres métodos diferentes: estándar externo,
estándar interno y adición de estándar [64].
5.5.2.1.1. Estándar externo. Se preparan estándares de concentración
semejante al analito en la muestra y en el ensayo cromatográfico de ambas,
muestra y estándar, en las mismas condiciones operativas. La concentración de
analito en la mezcla se determina comparando el área del pico en cuestión con el
área correspondiente al estándar de referencia. Como se observa en la ecuación
1.
Ecuación 1
Donde P es el porcentaje de analito en la muestra, Am y As son las áreas de la
muestra y el estándar respectivamente, Cs es la concentración del estándar y D es
un factor de dilución.
Este método requiere, obviamente, la utilización de un estándar de referencia y su
exactitud dependerá ampliamente de la calidad del estándar utilizado. La precisión
de los datos que se obtienen depende tanto de la preparación de la muestra y el
estándar como de la inyección de ambos [69].
5.5.2.1.2. Estándar interno. Consiste en agregar cantidades exactamente
medidas de una sustancia así denominada, tanto a la muestra como a un estándar
que contiene al analito, preparado con la misma concentración que la muestra.
Para determinar la concentración de analito en la muestra se calcula la relación de
áreas de analito a estándar interno tanto en la muestra y como en el estándar y se
efectúa el cociente entre amabas como se observa en la ecuación 2:
Ecuación 2
Donde P es el porcentaje de analito en la muestra, Rm y Rs son las relaciones de
área de analito a estándar interno en la muestra y el estándar respectivamente, Cs
es la concentración del estándar y D es un factor de dilución [69].
5.5.2.1.3. Adición de estándar: Esta técnica es utilizada cuando una muestra en
blanco no está disponible, y la matriz de la muestra puede afectar el tiempo de
retención y la respuesta o área del pico del analito [64]. Consiste en inyectar dos
muestras para realizar un análisis, una de ellas es la muestra original y la otra es
la muestra a la que se le agrega una cantidad conocida de estándar de referencia.
44
Esta segunda muestra se usa como estándar. La concentración del analito en la
muestra se calcula con la ecuación 3.
Ecuación 3
Donde P es el porcentaje de analito en la muestra Am y Ams son las areas del
analito en la muestra tal cual y la muestra a la que se le ha agregado estándar
respectivamente, Cs es la concentración del estándar y D es un factor de dilución
[69].
Debido al gran número de determinaciones realizadas en un análisis químico se
hace necesario el empleo de parámetros estadísticos que simplifican el análisis de
los resultados obtenidos [69]. Estos parámetros son:
5.5.2.1.4. Linealidad. Se refiere a la proporcionalidad entre la concentración del
analito y su respuesta. Conjuntamente se determina el rango lineal o sea el
intervalo comprendido en la concentración mínima y máxima de analito para el
cual el método y dentro del cual se puede efectuar el cálculo por interpolación en
una curva estándar [69].
Para su determinación se prepara una serie de al menos cinco patrones de un
estándar, se determina la curva de regresión por el método de los
mínimos cuadrados [69].
5.5.2.1.5. Precisión. Está relacionada con la dispersión de las medidas alrededor
de su valor medio y corresponde al grado de concordancia entre ensayos
individuales cuando el método se aplica repetidamente a múltiples alícuotas de
una muestra homogénea. Se expresa matemáticamente como la desviación
estándar ( ), como la desviación estándar relativa ( ) o coeficiente de variación
( ) el cual tiene un criterio de aceptación no mayor al 2 %. Estos estimadores
permiten evaluar la incertidumbre en la estimación de la medida [69].
La precisión debe medirse en condiciones repetitivas (mismo analista, mismo día,
mismo instrumento) y en condiciones reproducibles (diferente analista, diferente
día, diferente instrumento). El cociente repetibilidad/reproducibilidad es un
parámetro muy útil para evaluar la precisión de un método analítico. Su valor esta
normalmente comprendido entre 1.5 y 2 [69].
45
5.5.2.1.6. Exactitud. Se conoce también como error sistemático o tendencia y
corresponde a la diferencia entre la media de los valores obtenidos y el valor
verdadero. Se puede expresar de los siguientes modos: desviación, desviación
relativa y recuperación. La exactitud debe ser tan pequeña para que sea posible
que el valor medido se aproxime al de referencia [69] .
5.5.2.1.7. Sensibilidad. Corresponde a la mínima cantidad de analito que puede
producir un resultado significativo. Se debe diferenciar claramente entre dos tipos
[69]:
Sensibilidad de calibración: Correspondiente a la curva de calibración.
Sensibilidad analítica: Correspondiente al cociente entre la sensibilidad de
calibración y la desviación estándar de la medida.
Al evaluar la sensibilidad se debe tener en cuenta los siguientes parámetros:
Limite de detección: Es la menor concentración de analito que puede
detectarse, pero no necesariamente cuantificarse en una muestra, en las
condiciones establecidas; se expresa en unidades de concentración. Se
calcula como la señal del blanco, más tres veces la desviación estándar
del blanco, [69], como se observa en la ecuación 4:
Ecuación 4
Limite de cuantificación: Es la menor concentración de analito que puede
determinarse con precisión y exactitud en las condiciones establecidas y se
expresa en unidades de concentración. Se calcula como la señal del blanco,
más diez veces la desviación estándar del blanco, [69], como se puede
observar en la ecuación 5:
Ecuación 5
5.6. ANÁLISIS ESTADÍSTICO
5.6.1. Análisis de varianza y paquete estadístico. El análisis de varianza
ANOVA de una vía es una herramienta estadística, de gran utilidad para el
control de procesos y métodos analíticos [75], cuando el número de medias
obtenidas es mayor de dos. Cuando se varían factores como métodos,
laboratorios, analista etc., siempre existen dos fuentes de error, la primera, el
46
error aleatorio de medida y la segunda, los errores debidos al cambio de los
factores anteriormente mencionados. Mediante el ANOVA se puede controlar el
error introducido por esta segunda fuente, por lo que se habla de ANOVA de un
factor [76]. El objetivo del ANOVA es comparar los diversos valores medios para
determinar si alguno de ellos difiere significativamente del resto.
5.6.2. Análisis de conglomerados. Es una técnica estadística que permite
organizar la información de las variables para formar grupos homogéneos,
denominados clusters (grupos, clases). Los grupos que se obtienen se forman
por ser internamente homogéneos (todos los miembros del grupo son parecidos)
y externamente heterogéneos (los miembros de un grupo son muy diferentes de
los otros grupos). Es decir, con el método de cluster se pueden incluir objetos en
grupos según su grado de asociación, que será máximo si pertenecen al mismo
grupo o mínimo si son de grupos diferentes [77].
47
6. METODOLOGÍA
6.1. INSTRUMENTACIÓN Y REACTIVOS
Los equipos utilizados para este análisis fueron: estufa BINDER, ultrasonido
marca BRANSON 3510, cromatógrafos HITACHI LaChrom y Jasco; y micro-
jeringa HAMILTON de 100µL. Los reactivos fueron acetonitrilo grado CLAE,
metanol grado CLAE, agua destilada y desionizada, aloína A de pureza >97% de
hojas de Aloe barbadensis Miller, y estándar de Aloe curaçao.
6.2. LUGAR DE ANÁLISIS
El análisis se llevo a cabo en el laboratorio de Oleoquímica de la Universidad
Tecnológica de Pereira ubicada a una latitud norte 04° 48’ N, longitud oeste de 75°
41’ O, altitud de 1411 msnm con una temperatura promedio de 22 °C y una
precipitación de 2700 mm/año.
6.3. MUESTRAS DE ANÁLISIS
Para el análisis se utilizaron hojas adultas no menores a 3 años recolectadas de la
parte baja de la planta de Aloe vera; frescas y de aspecto sano, cultivadas en
cinco fincas del departamento de Risaralda las cuales se mencionan en la tabla
14.
Tabla 14. Lugares de recolección de las hojas de Aloe vera
MUNICIPIO FINCA
Marsella La Aurora
Mistrató La Magdalena
Belén de Umbría La Esperanza
Santuario Pite Tierra
Pereira - Corregimiento de La Florida La Palma
6.3.1. Recolección y transporte de las muestras de Aloe vera. Se tomaron
hojas de plantas adultas, realizando un recorrido en forma de zig-zag o diagonal,
según la topografía y el tamaño del terreno. Se recolectaron las hojas en bolsas
negras de polietileno y se trasladaron hasta la Universidad Tecnológica de Pereira
en el menor tiempo posible.
6.3.2. Pre-tratamiento. Las hojas de Aloe vera se llevaron al laboratorio de
Oleoquímica de la Universidad Tecnológica de Pereira, se dejaron a temperatura
ambiente por un día, se lavaron con agua de la llave y jabón TEGO 51 para
alimentos y se conservaron a 4°C para posterior análisis.
48
6.3.2.1. Obtención del acíbar. Se realizó una incisión sobre el extremo inferior de
la hoja empleando un cuchillo plástico, para obtener el acíbar por gravedad y
recolectarlo en un vaso de precipitados protegido de la luz (ver figura 10). Este
procedimiento se realizo con dos hojas de cada zona, y cada hoja se analizo por
triplicado.
Figura 10. Obtención de acíbar
6.3.2.2. Obtención y secado del gel de Aloe vera. Se pesó la hoja entera,
posteriormente se realizó un corte alrededor del borde de la hoja que permitió la
remoción de la corteza para obtener el mucílago; se peso y corto en láminas
delgadas que fueron dispuestas en bandejas forradas con papel vinilo (ver figura
11), las cuales se colocaron en una estufa BINDER a 40°C durante dos días. Para
concentrar los analitos de interés. Este procedimiento fue realizado con dos hojas
de cada zona, las cuales se analizaron por triplicado.
Figura 11. Obtención del mucílago de la hoja de Aloe vera en base húmeda
(a) y en base seca (b)
(a) (b)
49
6.4. EXTRACCIÓN DE ANTRAQUINONAS Y CROMONAS PARA ANÁLISIS
POR CLAE
Se emplearon muestras de mucilago seco y acíbar. La extracción se realizo en
ultrasonido marca BRANSON referencia 3510 usando metanol grado CLAE como
solvente de extracción con una relación muestra solvente 1:10 (0.5g de muestra y
5mL de metanol) durante 10 minutos a temperatura ambiente [2, 13].
6.5. EXTRACCIÓN DE ANTRAQUINONAS PARA ANALISIS POR
ESPECTROSCOPIA UV-VIS
Se empleo mucilago seco. La extracción se realizo en ultrasonido marca
BRANSON referencia 3510 usando una mezcla agua:etanol 1:1 como solvente de
extracción con una relación muestra solvente 1:2,5 (1 g de muestra y 2.5 mL de
mezcla) durante 40 minutos a temperatura ambiente [2].
6.5.1. Obtención de derivados. A los extractos obtenidos por ultrasonido se les
adiciona ácido clorhídrico 0,1M y tricloruro férrico (ver figura 12); se realiza
ultrasonido durante 30 minutos. Posteriormente se le realizaron 4 extracciones
sucesivas con éter de petróleo. Los extractos etéreos fueron concentrados por
rotaevaporación, los residuos obtenidos se redisolvieron con solución metanólica
de acetato de magnesio al 1%. La solución se sometió a reflujo a una temperatura
de 40ºC durante 10 min para propiciar el desarrollo del color rosado o rojo, se dejó
reposar hasta alcanzar temperatura ambiente y se aforó a 10 mL con solución
metanólica de acetato de magnesio al 1% para su posterior análisis por
espectrofotometría [2]
Figura 12. Reacción de hidrólisis de la aloína
50
6.6. ANÁLISIS DE ANTRAQUINONAS Y CROMONAS POR CLAE
Para el análisis de antraquinonas y cromonas por CLAE se trabajo bajo las
condiciones descritas en la tabla 15.
Tabla 15. Condiciones de análisis por CLAE para antraquinonas y cromonas
Condiciones de análisis
Cromatógrafo
HITACHI LaChrom Jasco* Bomba
Horno
Detector
L – 2130
L – 2300
L – 2420
PU – 2089
CO – 2065
MD – 2015
Columna Symmetry C18, 100Å, 5 µm, 4,6 x 250 mm Fase móvil Agua (A) : Acetonitrilo (B)
Gradiente
Después de cada
corrida se realizaba
una re-equilibración
de 15 minutos.
Tiempo
0 min
12 min
37 min
50 min 60 min
Proporción
84% A
84% A
67% A
40% A 100% B
Detector UV DAD
Longitud de onda 296 nm Flujo 1 mL/min
Temperatura 45 ºC Volumen de
Inyección 20 µL
Software EZChrom Elite® Data System
* Este equipo fue utilizado para el análisis cualitativo.
6.6.1. Análisis cualitativo de las antraquinonas y cromonas presentes en el
Aloe vera. Para establecer la identificación de antraquinonas y cromonas, se
realizó la comparación con los tiempos de retención (tr); preparando un patrón del
estándar de Aloe curaçao Sigma-Aldrich; y una muestra de acíbar; los cuales se
inyectaron bajo las condiciones previamente establecidas (ver tabla 15).
Además se realiza un análisis en un cromatógrafo equipado con detector de
arreglo de diodos (DAD), para la obtención de los espectros UV de cada pico,
determinar su naturaleza y establecer la identidad de las antraquinonas y
cromonas presentes en la muestra de análisis.
6.6.2. Análisis cuantitativo de las antraquinonas y cromonas presentes en el
Aloe vera. La cuantificación se realizó empleando las condiciones de separación
descritas en la tabla 16 y por el método de estándar externo, realizando una curva
51
de calibración de 5 puntos utilizando el estándar de aloína al 97% Sigma-Aldrich
(ver tabla 16), cada patrón se preparo en balón aforado de 5 mL, protegidos de la
luz con papel aluminio.
Tabla 16. Concentración de los patrones de aloína al 97%
Patrón Concentración
1 20 ppm
2 40 ppm
3 60 ppm
4 80 ppm
5 100 ppm
Para la curva de calibración se evaluaron los parámetros de linealidad, precisión,
sensibilidad (LD y LC) y exactitud para determinar que el método utilizado en el
análisis sea el adecuado.
6.7. ANÁLISIS DE ANTRAQUINONAS TOTALES POR LA TÉCNICA
ESPECTROFOTOMETRÍCA
La cuantificación de los derivados antraquinónicos se realizó por
espectrofotometría UV-Visible, empleando un espectrofotómetro Marca
ThermoScientific Evolution 60. Las muestras fueron analizadas a una longitud de
onda de 495 nm en el espectrofotómetro y la cuantificación se realizó utilizando
una curva de calibración realizada con un estándar de Aloe curaçao Sigma-Aldrich
(ver tabla 17) [2]
Tabla 17. Concentración de los patrones de Aloe curaçao
Patrón Concentración Absorbancia
1 10 ppm 0,000
2 20 ppm 0,003
3 40 ppm 0,005
4 60 ppm 0,006
5 80 ppm 0,0091
6 100 ppm 0,011
7 200 ppm 0,021
8 312 ppm 0,034
6.8. TOMA DE DATOS Y ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Se realizó un análisis de varianza ANOVA y un análisis de conglomerados
mediante el Software InfoStat versión 2011e para contribuir con el establecimiento
52
de diferencias y/o similitudes en cuanto al contenido de las antraquinonas y
cromonas en las diferentes zonas de estudio.
Se realizó una comparación de las medias para determinar la homogeneidad de
las muestras a través del nivel de significancia de los datos con un criterio del 5%
y los valores críticos de la distribución F (0,05); tanto para las muestras de gel
como para las muestras de acíbar. Para esto se plantearon dos hipótesis:
H0= hipótesis nula: la cual sugiere que las concentraciones de las muestras son
iguales en todas las zonas de cultivo.
H1= hipótesis alterna: sugiere que las concentraciones de al menos dos zonas
sean diferentes.
97
Anexo 3. Curva de calibración de aloína por CLAE
y = 66893,864x + 4.590,00R² = 0,99996
0
1000000
2000000
3000000
4000000
5000000
6000000
7000000
0 20 40 60 80 100
Áre
a
Concentración (mg/L)
Curva de aloína por CLAE
100
Anexo 6. Curva de calibración de aloína por espectrofotometría
0
0,005
0,01
0,015
0,02
0,025
0,03
0,035
0,04
0 50 100 150 200 250 300 350
Ab
so
rba
nc
ia
Concentración (mg/L)
Curva de aloína por espectrofotometría
y = 0,000106x + 0,000407
R2 = 0,9978