ALIMENTO

VOLATIL POR SECADO(HUMEDAD) MATERIA SECA

ORGANICA INORGANICA(CENIZAS)

CON NITROGENO(PROTEINAS)

SOLUBLE EN DISOLVENTESORGANICOS

(GRASA O LIPIDOS)

NO GRASO SIN NITROGENO(CARBOHIDRATOS)

NO DIGERIBLES(FIBRA)DIGERIBLES

ANÁLISIS DE PROTEÍNAS

- Composición química compleja- Nitrógeno elemento común.- Interacción con otros componentes.- Diversas características físicas y químicas.- Ampliamente distribuidas.

CONSIDERACIONES PARA LA CUANTIFICACION

Necesidades específicas• Proteína cruda • Proteína verdadera• Proteína soluble• Fracciones específicas• a.a. libres

Niveles de detección requeridos

Naturaleza de la muestra• Complejidad de la matriz• Homogeneidad de la muestra• Presencia de otros componentes nitrogenados

CUANTIFICACION DE PROTEÍNAS.

CLASIFICACIÓN DE MÉTODOS

1. Contenido de nitrógeno.2. Contenido enlaces peptídicos.3. Cuantificación grupos amino primarios.4. Cuantificación amino ácidos específicos.5. Contenido de proteína cruda seca.

DETERMINACIÓN DE NITRÓGENO TOTAL

Fundamento:Considerando que el nitrógeno sólo proviene de las proteínas se puede tener un estimado de su concentración, ya que se encuentra en una proporción constante para cada una de ellas.

La mayoría de las proteínas tienen una cantidad aproximada de 16% de nitrógeno.

100 g proteína-------------------------- = factor = 6.2516g de nitrógeno

% proteína cruda = % N2 x factor

FACTORES DE CONVERSIÓN

TRIGOHARINA ENTERA 5.83HARINA REFINADA 5.70PASTAS 5.70SALVADO 6.31

ARROZ 5.95CEBADA, AVENA, CENTENO 5.83MAÍZ 6.25SOYA 5.71NUECESCACAHUATES, NUECES DE BRASIL 5.41ALMENDRAS 5.18OTRAS NUECES 5.30

LECHE Y PROD. LÁCTEOS 6.38GELATINA 5.55TODOS LOS OTROS 6.25

CUANTIFICACION DE NITRÓGENO

Método de KjeldhalDigestión húmeda de la materia orgánica y cuantificación del amoniaco producido a partir del nitrógeno.

Método de DumasCombustión (seca) de la materia orgánica y cuantificación de nitrógeno o compuestos nitrogenados gaseosos.

Digestión.-Oxidación de proteínas y compuestos orgánicos por H2SO4-Fijación del nitrógeno como sulfato de amonio

n - C -NH2 + mH2SO4 catalizadores CO2 + (NH4)2 SO4 + SO2

proteína calor

A. MÉTODO DE KJELDAHL (Desarrollado en 1883.)

Destilación.

Desprendimiento de amoniaco por una base fuerte

(NH4)2SO4 + NaOH NH3 + Na2SO4 + H2O

Recuperación del amoniaco en:

•Agua H2O (neutro) + NH3 (NH4)2OH (alcalino)•Un ácido fuerte (HCl, H2SO4) en exceso

HAexceso (ácido) + NH3 NH4A + HAremanente (ácido) •Un anfótero (Ác. Bórico)

H3BO3 (ácido) + NH3 (NH4)H2BO3 (alcalino)

Titulación.

Ácido – base

(NH4)22+ -OH + H+ -A (NH4)A + H2O

H+ -Aremanente + B+ -OH BA + H2O

(NH4)+ H2BO3- + H+ -A H3BO3 + (NH4)A

OTRAS ALTERNATIVAS PARA MEDIR EL AMONIACO

A)Nesslerización

4NH4OH + 2HgI2 + 4KI + 3KOH NH2Hg2IO + 7KI + 2 H2O

Rojo-naranja, 440nm

B. Azul de indofenol (Berthelot)

NH3 + fenol + hipoclorito Indofenol (Azul, 630nm)-OH

C.Cambio de pH del destilado

D.Cromatografía iónica

E. Detección potenciométrica con electrodos específicos

Causas de pérdida de nitrógeno.

- Tiempo prolongado de digestión.

- Muestras con baja concentración de nitrógeno y mayores proporciones de carbohidratos y grasas aumenta la dificultad en la digestión.

- Cantidad de ácido

- Cantidad de muestra

- Velocidad de calentamiento

FACTORES QUE PUEDEN AFECTAR LA DETERMINACIÓN

Efecto de la temperatura en la digestión.

Temperatura óptima de digestión 360°C

Adición de sales para elevar el punto de ebullición.

Influencia de catalizador.

Aumenta la eficiencia en la descomposición.

- Mayor eficiencia con óxido de mercurio.

- Causa menor pérdida que selenio o cobre.

El oxido de titanio puede sustituir al oxido de mercurio (no tóxico y menos costo).

VENTAJAS

• Muy común. Oficial (comparación).

• El nitrógeno no proteico puede eliminarse después de precipitar la proteína con TCA.

• Puede ser automatizado• Det. colorimétrica del NH3

DESVENTAJAS

• Puede establecerse pérdida de nitrógeno.

• El contenido de nitrógeno puede variar entre las proteínas.

• Baja especificidad.

B. MÉTODO DUMAS. (Desarrollado en 1831)

-Combustión 700 - 1000°C.

-Uso de catalizador metálico.

-Cuantificación Volumétrica N2 gas.

Acoplamiento a equipos de CG incrementan exactitud

-Conductividad térmica

-Quimiluminiscencia

QUIMILUMINESCENCIA

1000ºC

Compuestos con N NO + Productos de combustión

NO + O3 NO2* + O2 NO2 + hλ

La emisión de luz es específica para el oxido nítrico y se mide a 650-900nm

La determinación completa se realiza en 30 seg.

FACTORES QUE PUEDEN AFECTAR LA DETERMINACIÓN

- Formación de compuestos refractarios (ej. nitruros).

- Influencia del catalizador

VENTAJAS

-Automatización del método

DESVENTAJAS

-Costos

-Sensibilidad

DETECCIÓN CUALITATIVA DE PROTEÍNAS EN SOLUCIÓN1. Reacción de Millon

Grupos fenólicos (tirosina)Color rojo ladrillo con nitratos de mercurio

2. Reacción Xantoprotéica.a.a. aromáticos.Precipitado blanco con Ac. nítrico ------ amarillo

3. Reacción de Biuret.Enlaces peptidicos.Color violeta con sales de cobre

4. Reacción con ninhidrinaGrupos amino libres (a.a. y peptidos)Color azul con ninhidrina

5. Ident. de cisteina y cistinaColor rojo con nitroprusiato de sodio

CUANTIFICACION DE PROTEÍNA SOLUBLE

A. Métodos Físicos1. Espectrofotométricos U.V2. Fluorescencia3. Infrarrojo cercano (NIRA)

B. Métodos Químicos1.- Biuret2.- Lowry3.- Unión a colorantes4.- Turbidimétricos5.- Titulación

1. ABSORCIÓN ULTRAVIOLETA-Fuerte absorción a.a. aromáticos tirosina, triptofano, histidina y fenilalanina (entre 260 y 280 nm).

-Presenta interferencias por compuestos aromáticos (ac. nucleicos).

Coeficientes de absorción (K) de algunas proteínas utilizadas comúnmente como patrón.

• Albúmina Bovina Sérica (BSA): 63

• Inmunoglobulina bovina, humana, o de conejo (IgG): 138

• Ovoalbúmina de pollo: 70

Abs = K C

AbsK = --------------

C

•Sensibilidad del método 0.1 a 3 mg/ml.•No requiere uso de reactivos•No destructivo.

Curva de

calibración de

Albúmina Bovina

Sérica (BSA)

Coeficiente de

correlación

0.99911.

2. FLUORESCENCIA

•Los compuestos aromáticos potencialmente presentan fluorescencia.

•Absorción a una longitud de onda y reemisión de la radiación.

•Alta sensibilidad (ng/ml)

•No destructivo.

•Diferencias en contenido de aa aromáticos

•Costo del equipo

Existe la alternativa de unir químicamente compuestos fluorescentes (ejm. derivados del naftaleno u otros compuestos aromáticos).

•Sensibilidad 10-500 ng/mL

3. INFRARROJO CERCANO (NIRA)

•Absorción de energía por enlaces produciendo cambios vibracionales u oscilatorios de las moléculas.

•Enlaces involucrados C-N, N-H y O-H, C-H, C=O

•Permite analizar proteínas y otros componentes (agua y lípidos).

•Alta sensibilidad y precisión.

•No destructivo

•Requiere Calibración para cada producto

•Puede ser usado con muestras íntegras (reflactancia)

Figura 3. Espectro infrarrojo de muestras de ensilaje de maíz (línea punteada) y desviación estándar de los espectros (línea entera).

COZZOLINO, Daniel, FASSIO, Alberto y FERNANDEZ, Enrique. USO DE LA ESPECTROSCOPÍA DE REFLECTANCIA EN EL INFRARROJO CERCANO PARA EL ANÁLISIS DE CALIDAD DE ENSILAJE DE MAÍZ. Agric. Téc. [online]. oct. 2003, vol.63, no.4 [citado 01 Octubre 2007], p.387-393.

Non-Destructive Analysis of Whole Grain Soy Beans by Near Infrared Spectroscopic Method

ReferenceM.Takahashi, M.Hajika, K.Igita, and T.Sato, "Rapid Estimation of Protein, Oil and Moisture Contents in Whole Grain Soybean Seeds by Near Infrared Reflectance Spectroscopy." Proceedings of NIR 95

MÉTODOS QUÍMICOS

1.MÉTODO DE BIURET. (1940).Principio: Formación de un complejo colorido entre enlaces peptídicos y ión cúprico en medio alcalino

H-N: :N-H/ \

O=C C=O\ /

R-CH Cu2+ CH-R/ \

H-N: :N-H\ /

O=C C=O/ \

R-CH CH-R

CARACTERÍSTICAS DEL MÉTODO

- Sensibilidad 1 - 10 mg/ml.

- Rápido (20-30 mins)

- Poco específico

- Interferencias con iones amonio

- Cambios de color por el tamaño de la proteína

2. MÉTODO DE LOWRY (1951).

Principio: Formación de complejo (cobre-proteína) en medio alcalino y Reducción del reactivo de Folín (Folin-Ciocalteureagent: Na2MoO4 + Na2WoO4 + H3PO4) por el complejo.

Especies reducidas de Coloración azul (745-750 nm)

CARACTERÍSTICAS DEL MÉTODO

- Participación de enlace peptídico y grupos aromáticos

(tirosina, triptofano). Mayor especificidad que Biuret.

- Sensibilidad 10-2000 µg/ml.

DESVENTAJAS

- Diferente respuesta de las proteínas

- Bajas velocidades de reacción.

- Inestabilidad del reactivo.

Lowry. Variación entre proteínas

Albumin, bovine serum 1.00Aldolase, rabbit muscle 0.94α-Chymotrypsinogen, bovine 1.17Cytochrome C, horse heart 0.94Gamma globulin, bovine 1.14IgG, bovine 1.29IgG, human 1.13IgG, mouse 1.20IgG, rabbit 1.19IgG, sheep 1.28Insulin, bovine pancreas 1.12Myoglobin, horse heart 0.90Ovalbumin 1.02Transferrin, human 0.92

3. UNIÓN A COLORANTES.

a) Bradford (Azul de Coomasie)b) Colorantes aniónicos (Amidoschwarz, Orange G)

Principio:Formación de complejos estables proteína-colorante.

a) BRADFORD (1976).

Principio:Unión no covalente de la proteína al colorante azul de Coomassie que cambia de rojo a azul.

CARACTERÍSTICAS DEL MÉTODO

El colorante presenta diferencias en color en función de la carga.

ProteinaRojo Verde Azul Azul-Proteina

(470 nm) (650 nm) (590 nm) (590 nm) H+ H+

- Forma aniónica interacción con las proteínas (grupos

básicos y aromáticos).

- Sensibilidad 0.001 a 0.1 mg/ml.

- Presenta inestabilidad del color en función del pH.

Concentraciones crecientes de proteína

Unión a colorantes. Reacción de Bradford

b) Colorantes aniónicos (Amidoschwarz o amido black, Naranja 12, Naranja G)

Principio:Unión no covalente de la proteína precipitable a loscolorantes (Negro Amido 10B, Naranja 5, Naranja ácida 12, etc.)

Amido black 10B Orange G

CARACTERÍSTICAS DEL MÉTODO

- Unión a grupos catiónicos de los aa básicos

- Precipitación de la proteína con TCA (Antes o después

de teñir)

- Medición espectrofotométrica (Colorante no unido o

después de solubilización del complejo)

- Presenta mayor especificidad.

- Problemas con proteínas de bajo peso molecular

(insulina).

- Sensibilidad 0.5 mg/ml.

- Rápido (menos de 15 mins)

4. MÉTODOS TURBIDIMETRICOS.

a) Ac. tricloroacético (1952)b) Ferrocianuro de potasio en medio ácido (1951)c) Ac. sulfosalicílico (1951)

Principio:Medición de la turbidez por precipitación de proteínas en condiciones controladas.

a) TCA 3-10%b) Ferrocianuro 0.75%c) Ac. Sulfosalicílico 2.5%

CARACTERÍSTICAS DE LOS MÉTODOS

- Rápidos (15 mins)- Sensibilidad 0.5 - 1.5 mg/ml.- Poco específico

- Presencia de compuestos insolubles en ácido- Diferencias en precipitación de las proteínas

5. MÉTODOS POR TITULACIÓN (60’s).

a) Medio acuosob) Medio no acuosoc) En presencia de Formol

Principio:

Estimación de la proteína por la presencia de grupos ionizables en las cadenas laterales.

a) TITULACIÓN EN MEDIO ACUOSO

- Grupos involucrados, amino y carboxilo.

- Generalmente potenciométricas.

- Reacciones ácido-base.

- Poca especificidad.

b) TITULACIONES NO ACUOSAS

- Disminución de la constante dieléctrica del medio

con solventes.

- Aumento del pK de los grupos carbóxilo y

disminución pK de los grupos amino.

- Facilita la titulación ácido-base.

- Generalmente se utilizan alcohol y acetona.

- Baja especificidad

c) TITULACIÓN EN PRESENCIA DE FORMOL

- El formaldehído reemplaza al grupo -NH2 por un

grupo imino -N=CH2

- Posterior titulación del grupo carboxilo libre

- La reacción se realiza con formaldehído neutroCOOH COOH| |

R-CH-NH2 + H2C=0 ⇒ H2O + R-CH-N=CH2