aislamiento y selecciÓn de microorganismos productores de enzimas (amilasas)

INFORME PRÁCTICO DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL-2014

Universidad Nacional “San Luis Gonzaga” de Ica Facultad de Ciencias Biológicas

PRÁCTICA N° 1

AISLAMIENTO Y SELECCIÓN DE MICROORGANISMOS PRODUCTORES DE ENZIMAS (AMILASAS)

I. INTRODUCCIÓN:

Las enzimas son proteínas que actúan como aceleradores de las reacciones

químicas, de síntesis y degradación de compuestos, éstas se encuentran en

todos los seres vivos y son piezas esenciales en su funcionamiento. Èstas tienen

muchas aplicaciones en diversos tipos de industrias, entre las que se destaca la

alimenticia, por ejemplo en la obtención de yogurt, o la producción de cerveza o

de vino, ya que el proceso de fermentación se debe a las enzimas presentes en

los microorganismos que intervienen en su producción. Sin embargo, para

mejorar los procesos de producción, pueden utilizarse enzimas aisladas, sin

incluir a los microorganismos que las producen. Desde hace unas décadas se

dispone de enzimas relativamente puras extraídas industrialmente de bacterias,

hongos, plantas y animales, con una gran variedad de actividades (1).

Las amilasas son enzimas que catalizan las reacciones hidrolíticas del almidón,

dando origen a diversos productos que poseen una gran relevancia para algunas

operaciones y procesos industriales. Las amilasas son comúnmente halladas en

animales y plantas; sin embargo, para fines industriales, las más utilizadas son

aquellas de origen bacteriano o fúngico. Las amilasas poseen una gran

importancia en la producción de alimentos y de biocombustibles. También

presentan gran utilidad en la industria textil. Se han utilizados amilasas para la

obtención de jarabes fructosados. La producción de dichas enzimas se ha hecho

a partir de Bacillus sp .Por lo aún se siguen buscando microorganismos

específicos que reporten mejores rendimientos para optimizar los procesos

industriales (2).



Objetivos:

- Aislar y seleccionar microorganismos productores de amilasas a partir de 3

muestras: compost, humus y larvas muertas de Heliothis zea.

-Medir los halos generados por la degradación del almidón por efecto de las

amilasas.

-Seleccionar la cepa con mayor halo producido.

II. ANTECEDENTES:

1. VARGAS, 2002. En Lima Perú ,se aislaron 120 microorganismos de suelos de

cítricos de la localidad de Huaral, de las cuales se identificaron 46 cepas con

capacidad de hidrólisis sobre el almidón que representan el 38.33%, existiendo un

predominio de B. circulans, con 28.33%; B. Firmus, 23.91%; Faenibacillus

spp.17.39%; B. coagulns , 15.22%,; B. megaterium, 8.70%; B. alvei, 4.35%; B.

Lentus, 2.17%. Reportando como mayor productor a Bacillus megaterium con

16.10 U/ml (3).

2. CASTRO Y col. 2008. En Bogotá – Colombia, aislaron microorganismos

productores de amilasas para producir enzimas hidrolíticas del almidón. El agente

productor detectado fue una cepa del género Aspergillus sp. Los resultados

indican que las amilasas presentes en el complejo enzimático obtenido del cultivo

de Aspergillus sp., sobre salvado de trigo, fueron activas en el desdoblamiento de

la molécula de almidón a pH 5.0 y temperatura de 37ºC demostrando su carácter

débilmente ácido y su proveniencia mesófila. El equivalente de dextrosa como

medida cuantitativa de la hidrólisis del polisacárido fue de 6.5, evidenciando la

capacidad enzimática amilolítica del complejo enzimático obtenido (2).

III. MATERIALES Y MÉTODOS:

1. Materiales (por muestra):

MATERIALES CANTIDAD

Bolsas de primer uso 1

Muestra 1 g. de compost o humus.



Tubos con s.s.f. (0,85%) estéril. 2 (10 ml y 9ml)

Placas Petri con Agar almidón 1% 5

Placas Petri con Agar Nutritivo 2

2.Métodos:

A) OBSERVACIÓN DE LA MUESTRA:

MUESTRA CARACTERÍSTICAS

Humus Color oscuro, húmedo, olor sui generis.

Compost Color marrón oscuro, con pajas.

Larvas muertas de Heliothis zea Larvas color verde oscuro.

B) AISLAMIENTO:

a. A partir de Humus y/o Compost:

Se colocó 1g de suelo y/o humus en 10 ml de SSF estéril (10 -1) y se realizó

diluciones hasta 10-2 utilizando tubos con 9 ml de SSF estéril. Se sembró una

asada de las dos últimas diluciones en Agar Almidón al 1% por estría y

agotamiento y se Incubó a 37ºC por 24 horas.

A B

C D

Fig.1. Aislamiento de

microorganismos productores

de amilasas a partir de humus

y/o compost: A. Muestras de

Humus y Compost. B. Diluciones

de las muestras. C y D .Siembra

por estría y agotamiento en agar

almidón 1%.



b. A partir de Larvas muertas de Heliothis zea:

Se realizó el aislamiento a partir de la muestra preparada de larvas para

aislamiento de entomopatógenos y se sembró por estría y agotamiento en placas

con agar almidón al 1%. Se Incubó a 37ºC por 24 horas.

c. Identificación macroscópica y microscópica:

Se realizó un estudio macroscópico y microscópico de las colonias presentes en

el medio almidón.

Fig.2. Aislamiento de microorganismos productores de amilasas a partir de larvas muertas de

Heliothis zea: A. Macerado de larvas. B. Macerado en baño maría (80°C por 10 min.). C.

Macerado en refrigeración. D .Siembra por estría y agotamiento en agar almidón 1% a partir

del macerado.



C) SELECCIÓN:

1. Se sembró de manera ordenada y por puntura cada cepa desarrollada en

placas con agar almidón 1% y en placas con agar nutritivo del mismo modo, de

manera que se obtuvo una réplica de las cepas en agar nutritivo.

Fig.4. Selección de microorganismos productores de

amilasas: A. Siembra por puntura de las cepas

desarrolladas. B y C. Cepas crecidas en agar almidón 1%

y en agar nutritivo respectivamente.

Fig.3. Identificación macroscópica y

microscópica: A. Estudio macroscópico

de las colonias aisladas. B. Observación

microscópica de las colonias aisladas

.En este caso son bacilos gram

positivos.



Se incubó a 37 °C durante 18-24 horas. Se adicionó lugol en la placa de agar

almidón 1% y se observó las colonias con halos generados por la degradación del

almidón por efecto de las amilasas (D).

2. Se repicó las cepas que producieron halos (presentes en agar nutritivo) en

placas de agar almidón al 1% esta vez separadas para poder medir bien los halos

producidos.

3. Se debe repicar por estría en tubos con agar nutritivo aquella cepa (s) que

generaron el halo de mayor diámetro, y se incubar a 37°C por 18-24 horas Luego

conservar a 4 °C en refrigeración.

Fig.6. Selección de microorganismos productores de

amilasas: A. Cepas desarrolladas en agar almidón 1%.

B Medida de halos producidos por degradación por

amilasas producidas.

Fig. 5. Cepas en agar almidón con lugol adicionado (derecha) y las

mismas cepas en agar nutritivo (izquierda).



IV. RESULTADOS:

Se analizaron las medidas de los diámetros de halos de degradación de almidón

de todas las mesas de trabajo tal como se muestra en la tabla N° 1.

TABLA N° 1. Cepas con sus respectivas medidas de halos de producción de amilasas.

V. DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES:

En la práctica se aislaron microorganismos productores de amilasa,

generalmente bacterias del género Bacillus sp. Este género es ampliamente

reportado como productor de amilasas (3).

Las cepas con mayor halo (9.5 mm; 10.5 mm y 11 mm) de producción de

amilasas pertenecen a la MESA 1 las cuales fueron aisladas de muestras

de humus.

La cepa mayor productora de amilasa es la cepa HMI01 con 11 mm aislada

de muestra de humus.

Ninguna de las cepas obtenidas fue considerada como buenas productoras

de amilasas, puesto que las medidas de los halos debieron ser mayores

para ser consideradas como tal.

MESA CEPAS HALO (mm)

CEPAS CON MAYOR PRODUCCION DE AMILASA.

1

HMI01 11 HMI01

HMI02 9.5

HMI03 10.5

2

HMI01 5.5

CMI02 4.5

LBMI04 5.5

3 MIH03 7

4 MIH01 6

MIC01 7



VI. BIBLIOGRAFÍA:

1. PEÑATE, M. 2008. Producción de enzimas a partir de microorganismos. (En

línea). Fecha de acceso: (12-octubre-2014) .Disponible en:

http://enzimamicro.blogspot.com/

2. CASTRO, C.; NAVAS, C.; CARO, O; PIÑEROS, Y. 2008. Obtención de

amilasas fúngicas a partir de Aspergillus sp. aislado de semillas de lentejas.

Consultado en página oficial de Universidad Jorge Tadeo Lozano, Bogotá –

Colombia. www.utadeo.edu.co. Fecha de consulta: (12 -octubre -2014).

http://avalon.utadeo.edu.co/dependencias/publicaciones/alimentica3/amilasas.pdf.

3. VARGAS, J. (2002).Selección y evaluación de bacterias del genero Bacillus

productoras de amilasa en cultivo sumergido. Universidad Nacional Mayor de San

Marcos .Lima –Perú.

http://enzimamicro.blogspot.com/

http://avalon.utadeo.edu.co/dependencias/publicaciones/alimentica3/amilasas.pdf



ANEXOS:

FLUJOGRAMA N° 1. AISLAMIENTO DE ORGANISMOS PRODUCTORES DE

ENZIMAS

PESAR 1 GR

DE MUESTRA

MUESTRA DE

SUELO O HUMUS

AGAR

ALMIDÓN 1%

AGAR

NUTRITIVO

INCUBAR A 37 °C POR 24 H

AGAR

NUTRITIVO

INCUBAR A 37 °C POR 24 H

[SE SIEMBRAN LAS MEJORES COLONIAS]

[PRE-SELECCIÓN M.O]

REPLICAR EN PLACA

AGAR

ALMIDÓN 1%

AGAR

NUTRITIVO



FLUIJOGRAMA N° 2. SELECCIÓN DE MICROOGANISMOS PRODUCTORES DE ENZIMAS

AGAR

ALMIDÓN 1%

AGAR

NUTRITIVO

[NO SE AGREGA

LUGOL]

[SE LE AGREGA

LUGOL PARA

OBSERVAR LOS

HALOS]

REPLICAR LAS CEPAS

CON MAYOR HALO.

[LOS M.O SE

REPLICAN A

PARTIR DE LA

PLACA A.N]

INCUBAR A 37 ºC POR 24 H.

AGREGAR

LUGOL GUARDAR

CONSERVAR A 4° C.

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