“aislamiento, purificación e identificación de metabolitos bioactivos
TRANSCRIPT
METABOLITOS BIOACTIVOS DE LA BIODIVERSIDAD YUCATECA
Luis Manuel Peña Rodríguez
Laboratorios de Química Orgánica
Unidad de Biotecnología
Centro de Investigación Científica de Yucatán
Mérida, Yucatán, México
Metabolitos Bioactivos
• Productos naturalesobtenidos de diferentesfuentes naturales, terrestres y marinas, con aplicaciones en la medicina, la agriculturay la industriaalimenticia.
Microorganismos (6000 bacterias y 1.5 millones de hongos)
Organismos marinos (10 millones)
Insectos (30 millones)
Plantas (300,000 especies)
(Müller et al., 2000)
Fuentes naturales de metabolitosbioactivos
LAS PLANTAS EN LA MEDICINA
• Fuente de cura para el 80% de la población mundial
Salicina Salix sp.
Acido acetilsalicílico
Fármacos de origen vegetal
Catharanthus roseus (vicaria)
Vinblastina R=CH3
Vincristina R=CHO
Fármacos de origen vegetal
De 1981 a 2006 se reportaron 1184 nuevos fármacos5% productos naturales23% derivados de productos naturales10% modelados a partir de productos naturales4% productos naturales de síntesis química
(Newman & Cragg, 2007)
Productos naturales como fármacos
Vinblastina R=CH3
Vincristina R=CHO
Catharanthus roseus
Taxol
Taxus brevifolia
• De los 119 fármacos derivados de plantas, el 74% son constituyentes activos de plantas
VALOR COMERCIAL DE ALGUNOS PRODUCTOS NATURALES
• Taxol (Paclitaxel) 15.80 USD (1 mg)
• Vincristina 39.50 USD (1 mg)
• Vinblastina 10.38 USD (1 mg)
• Progesterona 2.66 USD (1 mg)
Fuente: Sigma-Aldrich
Existen aproximadamente 300,000especies de plantas superiores en elmundo
10% han sido estudiadas desdeun punto de vista fitoquímico ofarmacológico
Se calcula que existen 1 millónde metabolitos pendientes deidentificar
(Hostettmann et al., 2006)
Las plantas como fuente de nuevos fármacos
25 zonas de mayor biodiversidad44% de todas las especies vegetales1.4% del área terrestre
• 138,000 km2 (12% protegido)• 24,000 especies de plantas• 5,000 endémicas
Cada año México deforesta más de un millón de hectáreas
“La pérdida del conocimiento de los curanderos sobre losusos medicinales de las plantas, conforme desaparecensus culturas, ha sido comparada con la pérdida de labiblioteca en Alejandría. Pero para aquellos de nosotrosque estamos empezando a entender como leer lasmoléculas en los seres vivos, la pérdida de biodiversidadrepresenta también la pérdida de una biblioteca, unabiblioteca que contiene las respuestas a las preguntas quetodavía no hemos aprendido a formular.”
Lynn Helen Caporale in “Chemical Ecology: A View from thePharmaceutical Industry”
El total de la flora fanerógama de México se calcula en forma aproximada en
• 22,000 especies• 220 familias
• 2,410 géneros
• Mas de 7000 especies se utilizan como plantas medicinales (800 especies se emplean en la medicina tradicional yucateca
•Menos del 5% han sido estudiadas
•Factores económicos y sociales están llevando a la destrucción de estos recursos
• El estudio de los recursos puede contribuir a su protección
Número total de especies endémicas y nativas en la
Península deYucatán:
168
(Durán et al., 1998; Espadas et al., 2003)
Área de distribución de especies endémicas y nativas de la península de Yucatán
Selección del material vegetal
Elección del bioensayo
Extracción y purificación
Identificación de la estructura
Modificación química
Identificación de metabolitos bioactivos
(Claeson y Bohlin, 1997)
Plantas de interés
• Pentalinon andrieuxii (leishmanicida)
• Colubrina greggii (antiprotozoaria)
• Lonchocarpus xuul (citotóxica)
• Byrsonima bucidaefolia (antioxidante)
• Jacquinia flammea (antifùngica)
Urechites andrieuxii Muell. Arg.(APOCYNACEAE)
Planta trepadora conocida comobejuco guaco, cantibteac ocontrayerba.
Contra mordeduras de serpientes(raíz y hojas)
Disturbios nerviosos (látex)
Leishmaniasis cutánea localizada(raíz y hojas)
Pech-López. Tesis de Licenciatura-UADY, 2002.
ESTUDIOS DE RAYOS X
Urechitol A
Extracto crudo de hojas de P. andrieuxii
PA-1 (54.5g, 14.9%)
Polaridad baja
PA-2A
Obtención del ácido betulínico y derivados
Gravedad
Partición L-L (Hx)
Ácido betulínico (1)
(62.7 mg, 0.1%)
Maceración
Hojas de
Pentalinon andrieuxii
(365g)
Antiprotozoal Activity of Betulinic Acid Derivatives
Sample Leishmanicidal Trypanocidal Antiplasmodial
LA M2903 TULA F32
Betulinic acid (1) >200 >200 50.0 22.5
Betulinic acid acetate (2) 44.9 >200 154.4 11.8
Betulonic acid (3) 51.2 >200 161.4 >20
Betulinic acid methyl esther (4) >200 69.9 93.3 >20
Betulin (5) >200 >200 173.0 >20
Amphotericin B 0.6 0.2 0.2
Benznidazol 384.4
Chloroquine 0.2
LA: Leishmania amazonensis; M2903: L. braziliensis; TULA: Trypanosoma cruzi tulahuen; F32: Plasmodium falciparum.
Table 1. IC50 (µM) values of antiprotozoal activity of betulinic acid and derivates
TripanocidaLeishmanicida
Antiplasmódica
Ácido betulínico (1)
Betulinato de metilo (4)
Lonchocarpus xuul Lundell
Nombre común:Se le conoce como xuul, kan-xuul ó yaax-xuul.
Características generales:Árbol endémico de la Península de Yucatán.10m de alto, flor rojo-morado, fruto café, cortezaparda clara.
Usos locales:Su madera es usada localmente para la construcción
Distribución:Península de Yucatán, Chiapas (salto de agua),Belice (corozal, Orange walk) y Guatemala (Petén).
Phytochemistry ( 2002 ) 60 :533-540
LeishmaniaDonovani
IC50= 40μg/mL
LeishmaniaBrazilensis
IC50= 10μg/mL
TripanosomaCruzi
IC50= 26.7μg/mL
LeishmaniaAmazonensis
IC50= 26.7 μg/mL
P-388
IC50= 57μg/mL OVCA 433
IC50= 1.2 μMAnti-Cancer Drug Design ( 1995), 10, 482-490
Borges-Argaez et al. Phytomedicine (2007)
Actividad Biológica de Isocordoína
INHIBICIÓN DE LA IkBa CINASA (PROTEASA VIRAL EN EL VIH) DE ISOCORDOINA Y SUS DERIVADOS, NATURALES Y SEMISINTETICOS
Actividad analgésica de chalconas naturales y semisintéticas en el modelo de contorsiones abdominales inducidas por ácido acético
(0.6 %) administrado via intraperitoneal.
Byrsonima bucidaefolia Standl.
• Localizada principalmente en mesoaméricaNombres comunes: “craboo”, “nancenagria”, “zacpah”
• Actividad antioxidante en su extracto metanólico
BBH-16B(11.18 g)
BBH-17C(94.8 mg)
BBH-19K(5.6 mg)
CPG: 2 x 20 cmDCM/MeOH 1:1Sephadex LH-20
CLV7 x 5cmDCM/Hx/MeOH
BBH-19J(32.2 mg)BBH-19L(1.4 mg)
BBH-19H(4.9 mg)BBH-19I(35.8 mg)
Aislamiento del metabolito BBH-19K
Table 1. Antioxidant activity of metabolites 1-6 in the DPPH free-radical test.
Methyl gallate trimeric ester from gallotanins in B.
bucidaefolia
Castillo-Avila et al., Nat.Prod.Comm., 2009
Comparación de la composición de los extractos de B. bucidaefolia por CCD
1. Ext. MeOH
2. Ext. EtOAc
3. Ext. BBH
4. Ext. DCM
5. Ext. EtOH
6. Ext. An
7. Infusión
8. EtOAc (inf.)
9. C+ (vit. C)
Jacquinia flammea Millispaugh (Teophrastaceae)
Purificación de la fracción metanólicade J. flammea por VLC
Bioensayo antifúngico contraColletotrichum gloesporioides
9 fracciones JF16(A.H)
CHCl3:MeOH:H2O (14:7:1)CHCl3:MeOH:H2O (10:10:1)
Ext MeOH
Hidrólisis del producto mayoritario del extracto metanólico de J. flammea.
Sakurososaponina Primulagenina A (SL-11pp)
HCl 2N
1.- Extracto metanólico
2.- Producto de hidrólisis del extracto metanólico
pp.- Primulagenina A ( SL-11pp)
9.- Producto de acetilación de SL-11pp
A →L .- Fracciones de VLC (SL-7)
SK.- Sakurososaponina
(-).- Control negativo
(+).- Control positivo
Actividad antifúngica del extracto crudo hidrolizado de J. flammea
Cepa: Collectotrichum gloeosporoidesMedio: PDAControl (+) : Neomicol® ,10µg (5µl - 0.2%)Control(-) : CH2Cl2/MeOH (9:1)Concentración de muestras: 500µg (10µl - 5%) Sergio L. Medina Ruiz
Colubrina greggii S. Watson
Familia: Rhamnaceae
Sinonimia:Común: (china may, guayol, guayul,manzanita, pimiento ché, tatuán, trampillo,trompillo o vara prieta).
Descripción:Arbusto de 1 a 5 m de alturaHojas alternas, lanceoladas, ápice acuminadoInflorescencias en tirsos, de 15 a 40 flores,sépalos verdosos deltados.Frutos casi esféricos con semillas negras
Uso etnobotánico:Abscesos y granulaciones de párpadosAntitusivo y asmaTuberculosisDisenteríaEnfermedades del hígadoUlceraciones y emoliente
(Fernández, 1986)
Purificación de la fracción CG-2B
Extracto crudo
CG-1
Polaridad media
CG-2B
Partición L-LAcOEt
CG-5A
CG-5B
CG-5N
CG-5E
CG-6C
Crisofaneína (9)
FlashHx/An 8:2
CG-6F
Actividad antiprotozoaria
CG-6IGravedadEter/Hx (1:1)
VLCCH2Cl2/An (99:1-94:6)CHCl3/Hx/MeOH (70:25:5)
CG-7C
CG-7I
CG-8D-J
CG-8J-LVLCCH2Cl2/Hx/MeOH (70:20:1-89:1:10)CH2Cl2/MeOH (90:10)
CG-9E
CG-10DGravedad CHCl3/Hx/MeOH (50:40:10-70:20:10)
Ácido Betulínico (1)
|
H HMBC
3.66 (3H, s) 174.27
3.68 (3H, s) 176.64
51.52
51.32
Corrección de la estructura de DCG-6F
HSQC de DCG-25
7 CH38 CH28 CH9 Cm/z 529 (M+ + H+) C32H47O6
m/z 511 (M+ ‐ H2O) C32H46O5
C34H52O6
9 CH39 CH27 CH9 C
m/z 557 (M+ + H+) C34H53O6
Metilacíón
CH3I /K2CO3
Acetato de ácido ceanótico
DCG-6H
Drug Dicovery Today, 10, 2005Cortesía: Dr. Fernando Echeverri
LOS COSTOS DE UN PRODUCTO FARMOQUIMICO
Taxus brevifolia
HISTORIA DEL TAXOL• 1963 Detección de actividad antitumoral en
extractos de Taxus brevifolia• 1971 Identificación de la estructura del Taxol• 1979 Establecimiento del modo de acción del Taxol • 1983 Inicio de las pruebas de Fase Clínica I• 1985 Inicio de las pruebas de Fase Clínica II• 1992 Se licencia la producción de Taxol a Bristol-Myers• 1992 Taxol es aprobado para tratar cáncer de ovario • 1993 Inicio de la búsqueda de fuentes alternas de Taxol• 1993 El uso de Taxol se aprueba en Europa y
Latinoamérica• 1994 Taxol es aprobado para tratar el cáncer de seno• 1995 Se aprueba el uso de Taxol semisintético• 1997 Taxol es aprobado para tratar el sarcoma de Kaposi• 1998 Aparece el Taxol genérico
DATOS SOBRE EL TAXOL• Rendimiento de taxol en Taxus brevifolia: < 0.02%.
• Un árbol de 100 años produce aprox. 5 Kg de corteza.
•12.5 ton. de corteza (2500 árboles) producen 1 Kg de taxol.
• Para las fases clínica y preclínica de taxol se colectaron entre 2.5 y 7.5 ton. de corteza (500-1500 árboles).
• 12,500 mujeres (casos por año en EU) requieren 90,000 árboles para su tratamiento de cáncer de ovario.
Arthur Barclay
Taxus baccata
Robert Holton
Preparación de Taxol semisintético
Economía del Taxol
Fuentes alternas de Taxol
Pestalotiopsis microspora
CTV’s Taxus baccata
Taxomyces adrenae
FUTURO
Cultivo de tejidos vegetales
Ingeniería metabólica
Biotransformación
Síntesis
Plantas transgénicas
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE Capraria biflora
Proyectos: estudiantes
Claudia-DDMAntioxidantes en bromelias
Dafne-DDLeishmanicidas de plantas
Chucho-MBiosíntesis de terpenoides
Carlos-DDMFitotoxinas de M. fijiensis
Glendy-MTripanocidas de plantas
AgradecimientosNACIONALES• Dr. Salvador Said Fernández. CIBIN-IMSS, Monterrey, NL• Dra. Gloria M. Molina Salinas. CIBIN-IMSS, Monterrey, NL• MC Manuel J. Chan Bacab, Universidad Autónoma de Campeche• Dra. María Luisa Villarreal. Universidad Autónoma del Estado de Morelos
INTERNASQBB Karlina García Sosa-Técnico AcadémicoQBB Fabiola Escalante Erosa-Técnico Académico• Dr. Germán Carnevalli Fernández Concha. URN• Dr. Rafael Durán García. URN• Dra. M. Marcela Gamboa Angulo. UBT• Dra. Rocío de Lourdes Borges Argáez. UBT• Paulino Simá Polanco. URN• Filogonio May Pat. URN
AgradecimientosINTERNACIONALES
• Dra. Susana Zacchino. UNRosario, Argentina• Dr. Alberto Giménez Turba. IIFB-UMSA, Bolivia• Dr. Alberto Loyola Morales. UAntofagasta, Chile• Dr. Valdir Cechinel Filho. UNIVALI, Brasil• Dr. Alberto Sánchez. UELondon, UK• Dra. Giulia Getti. UELondon, UK• Dr. Solomon Habtemariam, UGreennwich, UK• Dr. Peter Waterman. SCU, Australia• Dra. Linda Balbury. SCU, Australia• Dr. Andrew Flowers. SCU, Australia• Dr. Olov Sterner. Lund University, Suecia• Dr. Jean-Luc Galzi. UStrasbourg, Francia• Dr. Eduardo Muñoz. UCórdoba, España• Dr. Gordon Cragg. NCI, USA• Dr. Scott Franzblau. LSU, USA
-International Foundation for Science
-Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnología para el Desarrollo (CYTED, Proyectos X.5, X.7, X.11, RIBIOFAR)
-Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología
-Red Alfa-Comunidad Europea
-FOMIX-Yucatán
-Consejo Británico
-Centro de Investigación Científica de Yucatán
FINANCIAMIENTO