TITULO : Aislamiento de RhizobiumOBJETIVO: Reconocer ndulos en races de leguminosas Preparar medio de cultivo Extracto Levadura Manitol Realizar la tcnica de Squash para aislar bacterias Aislar microorganismosFUNDAMENTO TEORICOA. FIJACION BIOLOGICA DEL NITROGENOEl nitrgeno es uno de los elementos qumicos esenciales para todos los seres vivos ya que forma parte de los cidos nucleicos y de las protenas y, por lo tanto, es fundamental en la estructura y el metabolismo celular (Paerl, 1998). Las plantas toman el nitgeno directamente desde el suelo en forma de nitratos (NO3-) o amonio (NH4+), algo que no pueden hacer los animales, que precisan tomarlo en forma de compuestos orgnicos. Slo algunosprocariotas pueden tomar el nitrgeno directamente desde la atmsfera, via fijacin de nitrgeno, convirtiendo el nitrgeno molecular en nitrgeno asimilable por otros seres vivos.Teniendo en cuenta que este elemento es muy abundante en la atmsfera, la obtencin denitrgeno directamente desde sta es una de las vas ms importantes para el mantenimiento del ciclo del nitrgeno, del que forman parte las bacterias fijadoras de nitrgeno, junto con otros grupos de bacterias que llevan a cabo procesos intermedios de transformacin de compuestos nitrogenados y de desnitrificacin, que devuelve finalmente el nitrgeno a la atmsfera. Por lo tanto, la existencia de un equilibrio en el ciclo del nitrgeno es fundamental para la vida en la tierra y esto conlleva el mantenimiento de los ecosistemas microbianos presentes en los medios terrestres y acuticos.

B. SIMBIOSIS RHIZOBIUM LEGUMINOSA

La asociacin mutualista de rhizobia y leguminosas ha sido desde siempre la ms estudiada por la importancia agronmica, econmica y social que tiene el cultivo de estas plantas a escala mundial. Ambos partcipes son capaces de vivir independientemente, sin embargo, los dos se benefician mutuamente de la interaccin que se caracteriza por la formacin de ndulos fijadores de nitrgeno que, en la mayora de las leguminosas, se forman en la raz. Los ndulos son rganos especializados que se desarrollan como resultado de un dilogo molecular por parte de los rhizobia y de las plantas.El establecimento de una simbiosis rhizobia-leguminosa eficiente conlleva una serie de etapas que comienzan con un intercambio de seales entre ambos organismos: las races de la planta liberan a la rizosfera flavonoides molculas de naturaleza fenlica que promueven la expresin en las bacterias de los genes nod, lo cual origina la sntesis y secrecin de lipo-oligoquitinas llamadas factores nod.En las leguminosas en las que la infeccin se produce a travs de pelos radicales seproduce una deformacin de los mismos que origina un cambio en la direccin del crecimiento, producindose en el extremo apical la morfologa tpica denominada cayado de pastor, de modo que algunas de las bacterias quedan recluidas en el interior de la curvatura de la misma. Los rhizobia, una vez invadidas las clulas de la planta, proliferan y se diferencian a bacteroides, responsables de la fijacin de nitrgeno, que estn rodeados por una membrana peribacteroidea de origen vegetal y constituyen un nuevo orgnulo enominado simbiosoma.

C. TAXONOMIA DE LA RHIZOBIALa identificacin consiste en determinar la identidad de un aislado como miembro de un taxn establecido, teniendo en cuenta que el grupo taxonmico bsico en taxonoma bacteriana es la especie.La especie es un grupo de cepas que comparten caractersticas fenotpicas y genotpicas que son diferentes significativamente de otros grupos de cepas.La caracterizacin fenotpica de los rhizobia, al igual que la de otras bacterias, debe incluir fundamentalmente la descripcin morfolgica de clulas y colonias, la velocidad de crecimiento y las condiciones de cultivo en las que se produce, la asimilacin de diferentes fuentes de carbono y nitrgeno, la produccin de exoenzimas y la resistencia natural a antibiticos. No obstante, este tipo de clasificacin (fentica) no est muy desarrollada en el caso de los rhizobia puesto que no se han estudiado este tipo de caractersticas de manera uniforme en todas las cepas por lo que su utilidad est prcticamente limitada, por el momento, a la descripcin de nuevas especies.MATERIALES Y METODOS

A. MATERIALES

Matraz Balanza Agua Destilada Material biolgico : Rhizobium Obtenido a partir de la raz de alfalfa ( Medicago sativa)

B. METODOLOGIA

PRIMERO : Se procede a preparar el medio YMA, que en este caso ser Agar Levadura Manitol o tambin llamado Rojo de Congo , para empezar pesamos una cantidad determinada de Agar Levadura Manitol . Aqu se presenta la composicin del medio YMA.Agua Destilada 1LManitol10.0 gK2HPo40 .5 gMgSO4.7H2O0.2 gNaCl 0.1 gExtracto de Levadura 0.2 gSEGUNDO : Procedencia de los ndulosLos ndulos fueron extraidos de plantaciones de alfalfa silvestre en algunos casos en estado fenologico de floracin como en algunas zonas de plantacin en el distrito de Pocollay y Miculla ; por otro lado se pudo encontrar plntaciones de alfalfa con ausencia de flores como es el caso de las zonas de Ilabaya , Pachia de la Region Tacna .La obtencin de los ndulos se realizo de manera aleatoria , por cada rea de 16 m2 se tomaron 3 plantones de manera aleatoria ,es decir al azar bien separadas una de otras y de cada planta se tomaron 2 a 7 nodulos , tmando en cuenta que algunos plantones posean pocos ndulos a diferencia de otros que carecan de ndulos ; cada uno posea diferentes caractersticas .Los ndulos eran de aproximadamente 2 mm , por falta de materiales se extrajo el plantn completo (tallo y raz ) para poder conservarlo hasta la fecha de laboratorio ; la manera correcta hubiera sido cortar 1 cm de raz para luego ser introducidos en frascos conteniendo el desecante (cloruro clcico anhdrido cubierto con algodn hidrfilo).Los ndulos se mantuvieron en sombra hasta su traslado a laboratorio.TERCERO :Los ndulos deben ser lavados cuidadosamente con agua destilada y secados con papel celulosa para eliminar restos de sueloTERCERO:Los ndulos se esterilizaron en superficie sumergindolos en una solucin de HgCl2 al 1,0% durante 4,5-6,0 minutos. Despus, en condiciones aspticas, se lavaron diez veces con agua estril para eliminar los restos de HgCl2.

CUARTO : Posteriormente se trituraron uno a uno con ayuda de una varilla de vidrio estril y se sembraron en placas con medio de cultivo YMA

DISCUSIONLa ausencia de Rhizobium en las races de Medicago sativa , puede ser ocasionado por algunas condiciones adversas que impiden la infeccin y la actividad benfica de Rhizobium en alfalfa , por concentraciones de metales pesados , pesticidas ,etc.