Características de Agentes de Enfermedades Cardiacas: HSMI, CMS y PD.

Margarita González Gómez.Modulo de Sustentabilidad: Unidad de Enfermedades de Peces.

Programa de Doctorado en Ciencias de la Acuicultura.

Piscine Reovirus (PRV): Agente del Síndrome del músculo esquelético del corazón (HSMI).

Distribución del patógeno. Se detectó la enfermedad en Noruega y posteriormente en el reino Unido (Palacios et al. 2010). Actualmente en Chile, se está realizando un chequeo sobre la identificación de la presencia de este patógeno. A la fecha se han encontrado 10 centros positivos a PRV, sin presentan signos clínicos de la enfermedad. Esta investigación a aún se encuentra en curso (Sernapesca 2011).

Taxonomía. Los primeros indicios del patógeno sugerían que HSMI correspondía a una enfermedad infecciosa (Kongtorp et al. 2004). Watanabe et al. 2006 sugiere que existen partículas tipo virus asociadas a la enfermedad. Posteriormente, Palacios et al. 2010, describe a Piscine Reovirus (PRV) de la familia Reoviridae, producto del análisis de piro-secuenciación de alto rendimiento de suero y tejido del corazón. El árbol filogenético construido por estos autores, indica que PRV representa un linaje distinto de los géneros aquareovirus y orthoreovirus, los cuales son los virus de peces y crustáceos, reptiles, pájaros y mamíferos.

Morfología. Consistente con la organización del genoma característico para los miembros de la familia Reoviridae, el genoma de PRV comprende por lo menos 10 segmentos de RNA. Son virus icosaédricos no envueltos (Kontorp 2009 describe insensibilidad a cloroformo) con RNA de cadena doble con 10 a 12 segmentos. Se separa de los aquareovirus y de los orthoreovirus, debido a que los nucleótidos de extremo 5” son únicos (5’- GAUAAA/U), aunque comparte los mismo nucleótidos del extremo 3’ (UCAUC-39) (Palacios et al. 2010). Eliassen et al. 2005, indicaron que las partículas virales son de aproximadamente 80 nm.

Fisiología. Este aspecto aún no se encuentra ampliamente descrito. Kongtorp et al. 2006 indican que la temperatura del agua puede afectar la producción y liberación del virus. También se ha descrito que este agente, puede presentar enfermedad en Salmón del Atlántico en estados tanto en agua dulce, como en agua salada (Kongtorp 2009), por lo que se sugiere que puede sobrevivir en ambos ambientes. Por otra parte, como se mencionó anteriormente, este agente es insensible al cloroformo (Kongtorp 2009). Estudios en reovirus del turbot, Novoa et al. 1992 describieron que la sobrevivencia de este patógeno disminuye en primavera, en aguas de 30% de salinidad (Graham et al. 2007).

Transmisión. En la actualidad se describe que el tipo de transmisión es horizontal. Reovirus están altamente implicado en las enfermedades del cultivo de aves, incluyendo enteritis, miocarditis y hepatitis, teniendo muchas semejanzas con la acuicultura, en que se encuentran muchas animales confinados en un espacio, lo cual conlleva a la transmisión de los agentes infecciosos (Palacios et al. 2010). Las vías de transmisión del HSMI tienden a sugerir que hay una fuente externa de infección involucrada. Kongtorp et al. 2006, indica que el agua de mar puede estar actuando como un reservorio del agente causal. Otra fuente de infección pueden ser los smolts infectados en agua dulce, que posteriormente son trasladados a balsas de agua de mar (Murray 2006; Ruane et al. 2009 fide Aldrin et al. 2010), lo cual coincide con lo observado por Kongtorp et al. 2006 que indica que esta enfermedad se presenta en smolts. Watanabe et al. 2006 observaron que al presentarse mortalidad en una jaula, posteriormente se extiende a las jaulas vecinas. También se ha observado la presencia del virus tanto en peces sanos como en enfermos (Løvoll et al.

2010), sugiriendo transmisión horizontal entre peces. Rimstad 2011, identifica como un factor de riesgo el movimiento en la fase de agua salado de los peces en la dispersión y transmisión de HSMI.

Entrada del patógeno. Las rutas más naturales para la infección y dispersión son el epitelio de las agallas, intestino o epidermis, también se espera que un cierto número de partículas virales se encuentren en la sangre periférica durante la infección, en su camino hacia las cercanías del miocardio (Kongtrop 2009). Son requeridos más estudios sobre este aspecto.

Diseminación e Incubación. Mediante experimentos de inyección virales, se ha descrito que este patógeno se disemina desde el lugar de la inyección hasta alojarse en el miocardio en algún estado de la patenogénesis (Kongtorp et al. 2004), ya que el corazón es el órgano objetivo de este patógeno (Kongtrop et al. 2006). Por otro lado, una alta concentración de partículas infectivas en el plasma de la sangre, indica que las partículas están siendo liberadas desde las células infectadas del tejido del hospedador (Murphy, Gibbs, Horiznek & Studdert 1999 fide Kongtorp 2009). A su vez, el tiempo que toma un brote de la enfermedad en experimentos de cohabitación indican que posiblemente el virus se dispersa a las 4 semanas post-inyección, según Kongtrop et al. 2004. Además, se describe un período de 6 - 8 semanas de incubación antes de que aparezcan las lesiones cardiacas en una temperatura de 10 a 12 º C (Kongtrop et al. 2006).

Totivirus: Agente del Síndrome Cardiomiopático (CMS).

Distribución del patógeno. Se ha reportado que la enfermedad CMS afecta al salmón del atlántico de Noruega, Islas Faroe, Escocia y Canadá (Løvoll et al. 2010). En Chile, el laboratorio ADL se encuentra estudiando la presencia/ausencia de este patógeno (SERNAPESCA, 2011).

Taxonomía. Haugland et al. 2011 realizaron análisis filogenéticos basados en la RNA-dependiente, RNA polimerasa (RdRp), obteniendo que el agente causal de la enfermedad CMS se agrupa con el virus de la infección mionecrótica del camarón y el virus de Gardia lamblia (GLV), un miembro de la familia Totiviridae. Es por esto, que propusieron que este agente sea llamado Piscine Miocarditis Virus (PMCV). Además, indican que comparte rasgos con Infectious Myonecrosis virus (IMNV), el cual aún no es asignado a esta familia de virus. Ambas enfermedades, PMCV y IMNV, tiene distintos rangos de hospederos, junto con una estructura de cubierta más compleja, la cual puede estar involucrada en la transmisibilidad, rasgo que no es común entre los miembros de los totivirus. Este seria el primer miembro putativo de la familia totiviridae en infectar a hospederos vertebrados. Así, los totivirus son primariamente conocidos por infectar organismos unicelulares como Saccharomyces cerevisiae y protozoos como Leishmania y Giardia spp. (Knipe et al. 2010), pero en estudios recientes este rango se ha ampliado incluyendo al camarones, insectos e incluso, algunos totivirus pueden crecer en cultivos de células humanas (Zhai et al. 2010 fide Løvoll et al. 2010). Se diferencia de otros totivirus en que dentro de la organización de los ORF que codifican las proteínas virales en el genoma de PMCV, presenta 3 ORFs (Stuart et al 1992), desde los cuales se codifica la producción de genes(Ghabrial et al. 2009 fide Haugland et al. 2011).

Morfología. Previamente, Grotmol et al. 1997, encontró partículas tipo virus de 25 nm y Watanabe et al. 1995 describe un gran numero de partículas virales icosaédricas de 39.8 nm ± 1.5 en peces con CMS. Nylund (2001) encontró partículas que median alrededor de 40 nm idénticas a un nodavirus (Kongtorp et al. 2005). Posteriormente, Haugland et al. 2011 describe al agente causal de CMS como un virus de RNA de doble cadena (dsRNA) con un genoma de 6688 pares de bases. Los genomas de los Totiviridae están compuestos por un molécula simple de 4,6 a 6,7 kbp de dsRNA conteniendo 2 ORFs codificados para la proteína de la envoltura y un RdRp. En estudios de IMNV de

microscopia electrónica y una imagen en 3D demostró que el virion posee protrusiones parecidas a fibras, lo cual es un rasgo nuevo en la familia Totiviridae. Se sugiere que estas protrusiones participan en la transmisión extracelular de los virus y que juegan un rol en la patogénesis viral (Tang et al. 2008). Lamentablemente, Haugland et al. 2011 en sus estudios no obtuvieron imágenes TEM nítidas de PMCV, como para observar las protrusiones de la superficie del virus.

Fisiología. De la literatura revisada, se pudo rescatar que este patógeno resiste temperaturas de congelamiento. Bruno & Noguera (2009), señalan que tejidos congelados son infectivos y que es capaz de sobrevivir por lo menos 1 semana en congelamiento a -80 ºC. Faltan más estudios para conocer los rasgos fisiológicos de este patógeno en particular.

Transmisión. Se ha descrito para el IMNV del camarón que puede ser transmitido horizontalmente a través de la liberación del virus desde células/hospedadores infectados, así mecanismos similares deben estar actuando para las infecciones de PMCV. En los estudios in vivo de Haugland et al. 2011 apoyan la transferencia horizontal desde peces enfermos a peces sanos, a través de experimentos de cohabitancia entre peces, los cuales desarrollados cambios coronarios típicos de CMS. Por otro lado, Poppe & Seierstad 2003, indicaron que peces silvestres presentaron lesiones características de CMS, sugiriendo que ellos podrían actuar como posibles reservorios, los cuales transmitirían la enfermedad. No se ha descrito transmisión vertical para este patógeno.

Entrada del patógeno. Haugland et al. 2011, sugiere que al dispersarse el patógeno en el agua e infectar a un pez, lo haga probablemente vía superficies mucosas como las branquias, estómago, intestino o incluso la piel, aunque estos aspectos aún no se conocen y que son necesarios mas estudios.

Diseminación e Incubación. La diseminación se ha descrito que parte desde el sitio de la inyección intramuscular hacia el corazón. Se ha observado que el virus se disemina en las estructuras del tejido esponjoso del corazón, en el citoplasma del epi, mio y endocardio (Kongtrop et al. 2005), donde los miocitos infectados están cubiertos con endotelio, sugiriendo que éste sería la vía de infección de los miocitos (Haugland et al. 2011). En cuanto al período de incubación, los genomas son detectados a través de RT-PCR a las 2 semanas post inyección con virus de PMCV alcanzando un peak a las 6 semanas, observándose cambios en el corazón a las 2 semanas (Haugland et al. 2011). A su vez, Fritsvold et al. 2009 señala que las lesiones en el atrio del corazón aparecieron a las 6 semanas post-inyección viral y a las 9 semanas las lesiones de la capa esponjosa.

Alfavirus (Togaviridae): Agente de la Enfermedad del Páncreas (PD).

Distribución del patógeno. De acuerdo a la ocurrencia de brotes de la enfermedad del sueño en aguas dulces en trucha arcoiris han sido descritas en el norte de Francia, Inglaterra y Escocia, y los brotes de la enfermedad del páncreas (PD) en salmón del atlántico has sido descritas para la Europa occidental y norteamérica (Kent & Elston 1987, Poppe et al. 1989, Boucher et al. 1994, Castric et al. 1997, Christie et al. 1998, Rowley et al. 1998, Graham et al. 2003b fide Weston et al. 2005), por lo que se puede inferir que el patógeno se distribuye en esos países.

Taxonomía. El agente responsable de PD es un tipo de Togavirus, el cual fue aislado por primera vez en Irlanda por Nelson y su equipo (Nelson et al. 1995). Más tarde fue identificado como un alfavirus de la familia Togaviridae (Weston et al. 1999), los cuales son RNA virus con una amplia distribución mundial con la excepción de la Antártica (Strauss & Strauss 1994 fide Herath 2010). Los Alfavirus han sido

aislados y identificados desde vertebrados e invertebrados (Herath 2010), siendo el SAV (Salmonid alphavirus) el único alfavirus hasta el momento reportado que causa enfermedad en peces y es considerado como atípico (McLoughlin & Graham 2007). Se han clasificados en 6 genotipos distintos: los subtipos SAV1, 4, 5 y 6 que son responsables por causar la enfermedad del páncreas (PD) en el salmón del Atlántico, mientras que SAV2 causa la enfermedad del sueño (SD) en truchas de agua dulce y en salmón atlántico de agua de mar en Escocia, y SAV3 causa la enfermedad del páncreas noruega (NSPD) en salmón del atlántico y en la trucha arcoiris de Noruega (Fringuelli et al. 2008; Graham et al. 2010 fide Herath 2010). Weston et al. (2005), indican que existen 3 subgrupos de acuerdo a la ocurrencia geográfica: el SAV 1 de Irlanda y Escocia, SAV2 Escocia, Inglaterra y Francia, y SAV3 de Noruega.

Morfología. La secuencia genómica de SAV posee una secuencia típica de alfavirus (Weston et al. 1999). Posee viriones maduros son esféricos de diámetro de 65.5 ± 4.3 nm en promedio (Nelson et al. 1995), con un genoma positivo compuesto de una cadena de RNA (+ssRNA) empaquetada dentro de una cápside proteica, el nucleocápside del virus, la cual está dispuesta en pentámeros y hexámeros, formando simetría icosaédrica t=4 (Strauss & Strauss, 1994; Cann, 2005 fide Herart 2010). El nucleocápside del virus, está envuelto por una bi-capa de fosfolípidos, asemejándose a la membrana plasmática del hospedador, la cual presenta glicoproteínas, que aparentan puntas. Esta envoltura se reflejó en la sensibilidad del patógeno al cloroformo, indicando que posee envoltura (Nelson et al. 1995). El genoma posee alrededor de 11900 nucleótidos, con el extremo 5” que codifica las 4 proteínas no estructurales (nsP1 – nsP4) esenciales para la replicación del virus, y el extremo 3” del genoma que codifica para las 5 proteínas estructurales (E1, 6K, E2, E3) y la proteína de la cápside (Firth et al. 2008 fide Herath 2010).

Fisiología: Es sensible al cloroformo, ácido fórmico y HCl (Graham et al. 2007) y sensible al pH 3,0 (Nelson et al. 1995). Toranzo & Hetrick (1982) citan que la materia orgánica produce un impacto negativo en la sobrevivencia del patógeno, como también en ambientes no estériles (Graham et al. 2007). Soporta condiciones de ambientes acuáticos. Soporta temperaturas de almacenamiento en un rango de – 20ºC y -80ºC a largo plazo (Graham et al. 2007). La temperatura óptima de dispersión de la enfermedad es alrededor de los 14 ºC (Nelson et al. 1995). Graham et al. 2008, indica que temperaturas de 15ºC favorece a cadenas virulentas y 10ºC favorece infecciones subclínicas.

Transmisión: ocurre en forma horizontal desde peces enfermos a peces sanos usando homogeneizados de riñón (McVicar, 1990; Raynard & Houghton, 1993; Wheatley et al., 1994 fide Herath 2010), independiente de la existencia de vectores (McLoughlin & Graham 2007). Graham et al. 2007 indican que se puede transmitir desde peces enfermos (ensilaje necesario), como también que sobrevive en ambientes acuáticos, con transmisión horizontal entre granjas y por movimiento de wellboats. McLoughlin & Graham (2007), indican que el patógeno puede sobrevivir más de 2 meses en agua de mar estéril, así Rimstad 2011 sugiere que estos ambientes son reservorios de la enfermedad. Por otra parte, se sugiere que el piojo de mar puede constituir un vector de transmisión (McLoughlin & Graham 2007). Snow et al. 2010, indica que los especies silvestres no salmónidas presentaron el virus, pero se necesitan más estudios para averiguar si son reservorios-portadores.

Entrada del patógeno: A la fecha este aspecto del patógeno no ha sido muy descrito. La membrana mucosa de las branquias y la piel del salmón debe jugar un rol significativo en la entrada del virus, usándolas como portal de entrada, lo que se refleja en la respuesta inmune innata del pez, mediante la producción de la proteína Mx la cual provee la acción de envolvimiento contra el patógeno (Herath 2010).

Replicación, Diseminación e Incubación: estos virus se replican en el citoplasma de las células hospedadoras (Strauss & Strauss, 1994; Kujala et al., 2001) usando varias membranas celulares para la síntesis de RNA (Herath 2010). Se cuantificó de manera experimental que el copias del genoma del

patógenos alcanza un rango de 2.8306 x 1012- 2.8306 x 105. Por otra parte, se ha observado que este patógeno crece en líneas celulares CHH-1, siendo interesante ya que estas células son de corazón, el cual es uno de los órganos objetivo del patógeno. Además, Graham et al. 2008, indica que los leucocitos son células objetivo, además, Houghton (1995) encontró que el plasma, los leucocitos del bazo y células de riñón poseen el patógeno, por los cuales se disemina. En cuanto a la incubación, McLoughlin & Graham 2007 señalan que es de 7 a 10 días en agua de mar a temperaturas de 12 – 15 ºC y Nelson et al. 1995, señala que las lesiones aparecen 2 semanas posterior a la inoculación del virus.

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