PRACTICA N 1

TEMA: Extraccin de cidos nucleicos de procariotas.

OBJETIVO GENERAL: Extraer ADN genmico de procariotas.

OBJETIVOS ESPECFICOS:1. Extraer el cido nucleico de ADN genmico mediante dos mtodos de extraccin.2. Conocer la funcin de los diferentes reactivos utilizados en la extraccin del ADN.

MARCO TERICOLa informacin gentica, representada como una secuencia de cidos nucleicos de un organismo est representada en su fenotipo, donde la suma total de esta secuencia es lo que conforma su genoma.El procedimiento bsico y del que dependen muchas tcnicas de biologa molecular es la purificacin de cidos nucleicos en forma de ADN o ARN. Por lo que se requieren mtodos seguros para la separacin de estos componentes de las clulas. En las clulas procariotas, el ADN es una nica molcula larga, generalmente circular y de doble filamento, compactado y plegado, que se encuentra ubicada en un sector de la clula que se conoce con el nombre de Nucleoide.Las bacterias pueden contener adems del cromosoma, molculas de DNA doble pequeas y circulares, denominadas plsmidos. Esas molculas son elementos genticos extracromosmicos, no esenciales para la supervivencia bacteriana, y poseen mecanismos de replicacin independientes del DNA cromosmico. La ventaja de poseer un plsmido es que puede contener genes de resistencia a los antibiticos, tolerancia a los metales txicos, sntesis de enzimas, etcRECURSOS UTILIZADOSMATERIALES (TODO EL MATERIAL PARA EL LABORATORIO DE BIOLOGA MOLECULAR DEBE SER AUTOCLAVADO)DESCRIPCINCANTIDAD

POR CURSOPOR GRUPO

Vaso de precipitacin con cloro para desechos1

Vaso de precipitacin con agua hirviendo1

Tubos eppendor de 1.5 ml autoclavados4

Caja de puntas para micropipetas de (pequeas, medianas y grandes)1de cada una

Varillas de vidrio (pescar ADN)2

Parafilm (tiritas)2

Micropipetas (0,5-10; 10-100;100-1000)1de cada una

Frascos boeco para preparar soluciones de 50 y 100ml5

REACTIVOSDESCRIPCINCANTIDAD

POR CURSOPOR GRUPO

Cultivo bacteriano1.5ml

TE650ul

SDS30ul

Proteinasa K (20mg/ml)3ul

CTAB4,1gr

Cloruro de sodio10 gr

Agua ultra pura500ml

Cloroformo 48ml

Alcohol isoamlico2 ml

Cloruro de sodio 5M100ul

Fenol25ml

Isopropanol2ml

Etanol1ml

RNasa (10mg/ml)3ul

Gel de agarosa/syber safe1

STEET: sucrosa 8% EDTA 0,5% TRIS-Cl 1M0.8gr0.05gr0.5ml

Hielo o escarcha1 posuelo

Lysozima200ug

EQUIPOSDESCRIPCINCANTIDAD

POR CURSOPOR GRUPO

Incubadora 651

Microcentrfuba1

Termobloque a 371

Cmara de electroforesis1

Cmara de luz azul (visualizador de geles)1

PROCEDIMIENTOMini extraccin y purificacin de ADN genmico de bacterias.1. Micro-centrifugue 1,5ml de cultivo bacteriano durante 40 seg. A Vmax y elimine el medio de cultivo.2. Resuspenda el sedimento en 567ul de TE. Aada 30ul de SDS 10% y 3ul de proteinasa K (20mg/ml), mezcle e incube 1h a 37C.3. Aada 100ul de NaCl 5M y mezcle completamente. Aada 80ul de CTAB/NaCl (previamente calentado a 65C), mezcle e incube 10 min a 65.4. Aada un volumen igual de cloroformo/alcohol isoamlico (24:1) mezcle 2 minutos para formar una emulsin. Invertir el tubo varias veces, apretando la tapa. Microcentrifugue 5 minutos a 12000 rpm.5. Transfiera la fase superior a un nuevo tubo (no aspire contaminante de interfase).6. Aada un volumen igual al colectado de fenol cloroformo/alcohol isoamlico 25:24:1, mezcle dos minutos para formar la emulsin y micro centrifugue 5 minutos a 12000rpm. Transfiera la fase superior a un nuevo tubo (no aspire contaminantes de interfase).7. Aada 0,6 volmenes de isopropanol y mezcle suavemente hasta precipitacin el ADN, transfiera el ADN precipitado con una pipeta pasteur sellada a otro tubo que contenga 1ml de Etanol 70%, si no se puede recuperar el ADN de esta manera centrifugue a 12000rpm por 5 minutos, elimine el isopropanol y lave con 1ml de etanol al 70%.8. Centrifugue 5 minutos a 12000rpm, elimine el Etanol y deje secar.9. Resuspenda el ADN en 20-50 ul de TE, guardar a -20C.10. Trate el ADN con 1ul de RNasa A (10mg/ml) e incube una hora a 37C 0 15 min a 65C. Mtodo de extraccin del ADN genmico de bacterias por ebullicin.1. Microcentrifugue 1,5ml de cultivo por 40 seg. A velocidad mxima, resupenda la bacteria con el vortex en 300 ul de STEET que contenga 200ug de lysozima, incube el tubo durante 30 segundos a 10 min en hielo.2. Coloque en agua llevada a ebullicin de uno a 2 minutos. Microcentrifugue 20 minutos a 10000 revoluciones por minuto y transfiera el sobrenadante en un nuevo tubo.3. Mezcle con 200ul de isopropanol helado y deje 25 minutos a -20C.4. Microcentrifugue 5 minutos, remueva el sobrenadante y deje secar al ambiente.5. Resuspenda en 20 a 50ul de TE. Guardar a -20C.6. Trate al ADN con 1ul de solucin de RNasa A (10ug /ml) e incube una hora 37C o a 65C por 15 minutos.REGISTRO DE RESULTADOS ESPERADOSREPORTAR: la concentracin y calidad del ADN mediante migracin electrofortica en agarosa.PRACTICA N 2

TEMA: Extraccin de ADN genmico eucariote.OBJETIVO GENERAL: Extraer ADN eucaritico.OBJETIVOS ESPECFICOS: Realizar la extraccin de ADN genmico en tejidos animales y vegetales. Conocer diferentes protocolos de extraccin.MARCO TERICOLa extraccin y purificacin de cidos nucleicos constituye la primera etapa de la mayora de los estudios de biologa molecular y de todas las tcnicas de recombinacin de ADN. En este caso, los mtodos de extraccin permiten obtener cidos nucleicos purificados a partir de diversas fuentes para despus realizar anlisis especficos de modificaciones genticas. La calidad y la pureza de los cidos nucleicos son dos de los elementos ms importantes en ese tipo de anlisis. Si se desea obtener cidos nucleicos muy purificados, que no contengan contaminantes inhibidores, es preciso aplicar mtodos de extraccin adecuados.

RECURSOS UTILIZADOSMATERIALES (TODO EL MATERIAL PARA EL LABORATORIO DE BIOLOGA MOLECULAR DEBE SER AUTOCLAVADO)DESCRIPCINCANTIDAD

POR CURSOPOR GRUPO

Vaso de precipitacin1

Tubos eppendor de 1.5 ml autoclavados5

Caja de puntas para micropipetas de (pequeas, medianas y grandes)1de cada una

Micro pipetas (0,5-10; 10-100;100-1000ul)1de cada una

Mortero con pistilo1

Frasco Boeco 25ml2

REACTIVOSDESCRIPCINCANTIDAD

POR CURSOPOR GRUPO

Hielo seco (proporcionado por los estudiantes).Pedazo pequeo

NaCl5M 6 ml

Sucrosa1.71gr

Tris 1M1ml

EDTA 0,5M1ml

SDS 10%0,5ml

Acetato de potasio 8M35ul

TE40ul

Rnasa1ul

Etanol 100%4ml

Etanol al 70%3ml

Isopropanol1ml

Tris-Cl 0.2M pH 7,42ml

EDTA 25Mm0.5ml

SDS 0.5%0.05gr

NaCl 250mM0.05ml

Cloroformo/alcohol isoamlico500ul

EQUIPOSDESCRIPCINCANTIDAD

POR CURSOPOR GRUPO

Bao mara1

Centrfuga refrigerado1

Termobloque1

Refrigerador o hielo1

Cmara de electroforesis1

Cmara de luz azul (visualizador de geles)1

PROCEDIMIENTOExtraccin ADN genmico de tejido animal.1. Macere el tejido en 125ul de griding buffer y luego lavar el macerado con 125ul adicionales de grinding buffer.2. Incube a 65C durante 30 min.3. Aada 35ul de acetato de potasio 8M, mientras los tubos estn tibios mezclar.4. Mantenga en hielo durante 30 min.5. Micro centrifugue 15 min a Vmax y transfiera 260ul del sobrenadante a un tubo nuevo.6. Aada 600ul de etanol al 100% helado, mezcle e incube a temperatura ambiente 5 min.7. Micro centrifugue 15 min a Vmax y trasfiera 260ul del sobrenadante a un tubo nuevo.8. Aada 1ml de etanol al 70% para lavar el sedimento, microcentrifugue 2 min; elimine el etanol y deje secar.9. Resuspenda el ADN en 40ul de TE. Guardar a -20C.10. Trate el ADN con 1ul de solucin de Rnasa A 20mg-mL, e incube 10 min a 65C.Protocolo de extraccin de ADN genmico de planta1. Macere el tejido de hoja en un mortero con nitrgeno lquido o con la presencia de hielo seco.2. Coloque 0.15g de hoja triturada en un microtubo y macere nuevamente en presencia de 400ul de buffer de maceracin.3. Microcentrifugue a 13000rpm por 2 min.4. Agregue 1 volumen de cloroformo alcohol isoamlico (24:1) y mezcle por 2 min. por inversin del tubo. Deje reposar a temperatura ambiente y centrifugue a 12000 rpm por 5 min.5. Recupere el sobrenadante en un nuevo tubo (300ul) y precipite con 0,1volmen de NaCl 5M (mezclar) mas 0,6 volumen de alcohol isoproplico o 2 volmenes de Etanol absoluto.6. Deje reposar a temperatura ambiente por 5 minutos y microcentrifugue 5 min a 13000 rpm.7. Elimine el alcohol y lave con 1ml de Etanol al 70%, secar al ambiente.8. Resuspenda en 50ul de TE.

REPORTAR: la concentracin y calidad del ADN mediante migracin electrofortica en agarosa y en el qubit.