ANÁLISIS PROSPECTIVO DE ADN MITOCONDRIAL Y ADN NUCLEAR EN MUESTRAS HUMANAS DEL SITIO FORMATIVO CEMENTERIO

REGIMIENTO CHORRILLOS DE CALAMA1.

Mauricio Moraga2, Juan Venegas3, Catherine Westfall4 y Carlos González5

RESUMEN

Se presentan los resultados de estudios preliminares de biología molecular, específicamente de ADN Mitocondrial y ADN Nuclear, realizados en dientes y huesos de una acotada muestra de individuos pertenecientes a poblaciones formativas (850-190 AC) del Cementerio Regimiento Chorrillos de Calama, en la Región de Antofagasta. Palabras claves: ADN Mitocondrial, ADN Nuclear, sitio funerario, período Formativo, región de Antofagasta.

ABSTRACT The results of preliminary molecular biology research –specifically Mitochondrial DNA and Nuclear DNA- carried out on small, pre-Columbian bone and teeth samples of individuals pertaining to the Formatives periods’ Cementerio Regimiento Chorrillos site (800-200 BC) in Calama, are presented. Keys words: Mitochondrial DNA, Nuclear DNA, funerary site, Formative Period, Northern Chile.

Introducción El rescate arqueológico el año 2005 del Cementerio Regimiento Chorrillos de Calama (ver figuras 1 y 2), dentro de un terreno de la División Codelco Norte, permitió recuperar 353 individuos de 256 fosas, implementándose variados registros y estudios (González y Westfall 2006, Westfall y González 2005); entre los últimos un análisis bioantropológico de los restos esqueletizados (Reyes 2005). Junto con documentar las características antropológico-físicas de los individuos, posibilitando a futuro comparaciones y distinciones respecto a poblaciones cercanas (eg. Chiu-Chiu, San Pedro de Atacama), se efectuó un análisis preliminar de biología molecular sobre una acotada muestra del universo osteológico y dental del sitio, ya que este tipo de estudios están escasamente representados en la Región de Antofagasta6. De esta manera, y con el objeto de conocer las características filogenéticas y posibles relaciones de parentesco entre algunos individuos del cementerio, fechado por C14 AMS entre 850-190 AC, dentro del Período Formativo, se procedió al análisis de DNA mitocondrial y nuclear de muestras óseas y piezas dentales de 11 individuos del sitio. Asimismo, otro de los

1 Proyecto de Rescate Arqueológico inserto en el Sistema de Evaluación de Impacto Ambiental (SEIA), financiado por División Codelco Norte, de la Corporación Nacional del Cobre (Codelco). 2 Doctor en Ciencias, Programa de Genética, Fac. Medicina, Universidad de Chile, Stgo; mmoraga@med.uchile.cl 3 Doctor en Ciencias, Programa de Biol. Cel. Mol., ICBM, Lab. Parasitología Básico-Clínico, Fac. Medicina, Universidad de Chile, Stgo.; jvenega@med.uchile.cl 4 Arqueóloga-Taguatagua Consultores, Casilla 234, Correo de Paine, Paine, Región Metropolitana; catiwestfall@yahoo.es 5 Arqueólogo-Taguatagua Consultores, Casilla 234, Correo de Paine, Paine, Región Metropolitana; inkacarlitos@yahoo.es 6 Sólo se tiene referencia de trabajos recientes sobre Leishmariasis en poblaciones prehispánicas de San Pedro de Atacama, realizados por M. A. Costa y colaboradores (Barrera com. pers. 2007).

objetivos del análisis fue comparar el rendimiento obtenido de huesos en excelente estado de conservación versus muestras de dientes de los individuos.

Metodología

Análisis de DNA mitocondrial (mtDNA). Para llevar a cabo este tipo de estudios, se procedió a la pulverización de las muestras mediante un molino especial y posterior extracción del DNA, de acuerdo a protocolos anteriormente descritos en la literatura (Moraga et al. 2005). Una vez purificado el DNA, se procedió a la amplificación mediante PCR de distintos segmentos del DNA mitocondrial, usando partidores específicos ya descritos (Moraga et al. op. cit.). Luego de obtenidos los productos de PCR, se procedió a la digestión de cada uno de ellos, mediante enzimas de restricción. Digestión con la enzima HaeIII define el haplogrupo A. Ausencia de digestión con las enzimas HincII y AluI, definen la pertenencia a los haplogrupos C y D, respectivamente. Por su parte, El haplogrupo B está definido por la presencia de una deleción de 9 pb en la región intergénica V del mtDNA, la que se detecta directamente mediante PCR (Ibíd.).

Análisis de marcadores nucleares (microsatélites) en muestras de DNA antiguo. Los microsatélites son secuencias repetitivas cortas del DNA nuclear, la mayoría de ellas ubicadas en regiones no codificantes, cuyos largos pueden oscilar entre 10 y 300 nucleótidos, y altamente polimórficos (Weber y May 1989, Bowcook et al. 1994). Dado el alto polimorfismo de los microsatélites, es decir, que para un determinado microsatélite pueden existir un alto número de alelos dentro de una misma especie, permite que estos marcadores sean muy útiles para establecer relaciones de parentesco, entre individuos de una misma población. En otras palabras, el estudio de microsatélites permite con una alta probabilidad definir sí un determinado individuo es hijo o no de otro individuo. También, por el alto grado de polimorfismo, son muy útiles en estudios filogenéticos de poblaciones genéticamente muy cercanas, pertenecientes a una misma especie (Bowcook et al. op. cit.). Sin embargo, debido al hecho que estos marcadores son monocopias en el genoma, son menos sensibles que la detección de DNA mitocondrial. Otros problemas que presentan los microsatélites son las "stutter bands" o "bandas tartamudas", que se originan por deslizamiento de la DNA polimerasa cuando está produciendo la amplificación de los DNA en la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Weber y May op. cit., Hagelberg y Clegg 1991). Estas bandas "tartamudas" pueden en ocasiones dificultar la identificación de una señal verdadera, pues aparecen como varias bandas de un tamaño similar a la banda real (Hagelberg y Clegg op. cit.). Por tal motivo, para identificar claramente la señal verdadera es necesario realizar varias repeticiones a distintas temperaturas de "annealing" para optimizar la señal real. Otro problema, que puede originar falsos positivos u ocultar la señal real, es la síntesis de DNA independiente de DNA molde o templado (Clark 1988). Esto también se puede superar, realizando varias repeticiones a distintas temperaturas de "annealing". Es importante destacar que la gran mayoría de los estudios de DNA antiguo usando microsatélites, se han realizado en poblaciones europeas (Weber y May op. cit.; Bowcook et al. op. cit., Zierdt et al. 1996, Burger et al. 1999, Schemerer et al. 1999). En la actualidad existe muy poca información de análisis de restos arqueológicos humanos de poblaciones precolombinas, mediante el uso de microsatélites. Según nuestras informaciones, hasta hoy el único artículo en el cual se han usado estos

marcadores nucleares, para determinar relaciones de parentesco entre una posible madre y un posible hijo en muestras arqueológicas latinoamericanas, corresponde al trabajo de Lleonart y colaboradores (1999), quienes de los nueve marcadores usados, obtuvieron escasos resultados reproducibles y varios de ellos con productos de pequeño tamaño. Lamentablemente, estos investigadores no proporcionan ninguna foto de los resultados. Para la detección de microsatélites en muestras de DNA antiguo del sitio Chorrillos, se eligieron los marcadores VWA y LPL, pues de acuerdo a la literatura estos marcadores han presentado un mejor rendimiento (Zierdt et al. op. cit., Takahashi et al. 1997). Se seleccionaron dichos marcadores, pues datos de la literatura han demostrado que existe una buena correlación entre el largo de los marcadores y la sensibilidad (Hoff-Olsen et al. 2001, Takahashi et al. op. cit.). Es decir, a mayor largo de los marcadores, menor sensibilidad. Por tal motivo, se seleccionaron dos marcadores cuyo producto de amplificación no superara los 200 pares de bases (pb). La extracción y purificación de DNA antiguo total se realizó tal como fue descrito anteriormente para el análisis de mtDNA (Moraga et al. 2005). Las amplificaciones mediante PCR se realizaron con 2l de cada muestra, usando condiciones similares a las publicadas en la literatura (Takahashi et al. op. cit.), y de acuerdo al siguiente protocolo: a) Pre-PCR 94 oC/5min; b) 32 ciclos a 94 oC/1 min, 60 oC/1min y 72 oC/1 min; y c) post-PCR 72 oC/10 min. Lo único que se modificó en estos protocolos, fue la temperatura de hibridización de los partidores, "temperatura de annealing", indicada en la Tabla 2. Una vez amplificadas las muestras, fueron analizadas en geles de poliacrilamida al 15%, teñidos con nitrato de plata, de acuerdo a condiciones descritas (Takahashi et al. op. cit).

Resultados Análisis de DNA mitocondrial (mtDNA) Como se observa en la Tabla 1, de los 11 individuos analizados, sólo en 4 de ellos se pudo obtener amplificación de las muestras y realizar una posible clasificación a partir de los cuatro grupos descritos para las poblaciones indoamericanas (Horai et al. 1993, Torroni et al. 1993, Easton et al. 1996, Santos et al. 1996, Moraga et al. op. cit.). Debido a la deficiente calidad y cantidad de las muestras de DNA aislados, sólo uno de estos individuos fue claramente identificado como perteneciente al haplogrupo B (muestra 0503). A pesar que las otras tres muestras no pudieron ser totalmente clasificadas, los análisis permitieron establecer que: una de ellas no pertenece al haplogrupo B ni D (muestra 0203); otra no pertenece al haplogrupo B (muestra 1101); y la tercera no pertenece al haplogrupo D (muestra 0301). Aunque la no pertenencia sugiere la probabilidad que el individuo de la muestra 0203 podría corresponder al haplogrupo A o C, no se puede descartar que este individuo pudiera pertenecer a otros grupos minoritarios, también descritos en poblaciones indoamericanas antiguas (Torroni et al. op. cit., Baillet et al. 1994, Easton et al. op. cit.); aunque en la mayoría de los casos, estos otros grupos corresponderían a poblaciones aborígenes de Norteamérica (Smith et al. 1999). De acuerdo a los datos de antigüedad de los restos arqueológicos aquí analizados, 850-190 años antes de Cristo, sumado a su ubicación geográfica, se estima que un porcentaje superior al 30% de la población pertenecería al haplogrupo B, sobre la base de lo descrito anteriormente en la literatura (Santos et al. op. cit., Moraga et al. 2000, Moraga et al. 2005). Por lo tanto, resulta extremadamente interesante que nuestros resultados

preliminares muestran un individuo de cuatro perteneciente al haplogrupo B (25%), pudiendo ser mayor en el caso que el individuo 0301 fuese B. Debe destacarse que el rendimiento en la extracción y amplificación de DNA desde muestras antiguas es extremadamente variable, dependiendo entre otros factores de las condiciones de temperatura y humedad del lugar de las inhumaciones, así como de la salinidad, acidez y permeabilidad del suelo. De todas formas, los restos conservados por desecación, como es el caso de estas muestras, generalmente tienen rendimientos cercanos al 20% para DNA mitocondrial y raras veces rinden amplificados para secuencias nucleares. Por lo mismo, para haber accedido en mayor detalle al conocimiento de las relaciones filogenéticas de esta población, habría sido necesario analizar un mayor número de muestras, aumentado la probabilidad de obtener extractos de DNA amplificables. Sin embargo, a pesar de dichas limitaciones, es significativo que este Proyecto permitió una fructífera interacción multidisciplinaría, avanzando desde una perspectiva científica integrativa en un mayor conocimiento de estas poblaciones prehispánicas. Análisis de marcadores nucleares (microsatélites) en muestras de DNA antiguo La Tabla 2 muestra el resumen de todos los análisis del marcador microsatélite VWA de los restos de los once individuos procedentes del rescate arqueológico del Cementerio Chorrillos de Calama. Como se puede observar en dicha Tabla, sólo una muestra fue consistentemente amplificada en los cinco experimentos realizados (0701). Esta muestra procede de un molar, que no arrojó amplificación de mtDNA. No obstante, la amplificación por PCR originó un conjunto de productos, los cuales no son fácilmente adjudicables a alguno de los alelos previamente descritos en la literatura (ver Fig. 3, carril 5), cuyos tamaños oscilaron entre 126 y 170 pares de bases (Zierdt et al. 1996, Goodwin et al. 1999), y como se aprecia para el DNA moderno en esta misma figura (carril 9). Este hecho, y la situación que se hayan originado varios productos de amplificación, no permiten descartar que dichos perfiles sean productos de amplificaciones artefactuales, siendo muy común en este tipo de muestras originadas por una extensiva degradación y modificación química del DNA durante el tiempo que los restos permanecieron enterrados, tal como ha sido descrito para otros casos (Höss et al. 1996, Lindahl 1997, Burger et al. 1999). Sin embargo, el hecho que sostenidamente esta muestra haya originado productos de amplificación, sugiere fuertemente que existen trazas de DNA nuclear antiguo susceptibles de ser amplificados en forma específica. Empero, para cumplir este objetivo, se requeriría buscar nuevas condiciones de amplificación que lograran aumentar los productos específicos por sobre los productos artefactuales, situación que demandaría una mayor cantidad de muestra disponible actualmente7. Los productos de pequeño tamaño observado en todos los ensayos, incluso en la reacción sin DNA (carril 2), corresponderían a oligomeros generados por los mismos partidores. Las otras muestras que presentaron dos o más amplificaciones (ver Tabla 2), provienen tanto de tejido óseo como de piezas dentales (0401, 0501, 0503, 0601, 0801,0803 y 1101). Esto sugiere que dichos productos de amplificación serían artefactuales, debido a causas anteriormente mencionadas (Höss et al. op. cit., Burger et al. op. cit.).

7 La replicación sostenida del proceso de amplificación va gastando la muestra original, haciendo necesario contar con nuevas porciones de la misma para cada ensayo realizado.

Finalmente, para dilucidar todas estas interrogantes, y determinar si realmente podemos amplificar alguno de estos marcadores nucleares en esta población prehispánica, indoamericana, de Calama, sería necesario analizar un mayor número de muestras, especialmente derivadas de piezas dentales, debido a que tanto nuestros resultados como estudios anteriores, comprueban que el DNA antiguo se preserva en mejores condiciones en dichos tejidos (Zierdt et al. op. cit)8. Todas las muestras descritas en la Tabla 1, fueron también analizadas con el marcador LPL (Takahashi et al. 1997), aunque los resultados fueron muy poco reproducibles, no utilizándose en el posterior análisis de las muestras.

Conclusiones En términos arqueológicos y sobre la base de los análisis realizados, podemos señalar que, a pesar del reducido número de muestras, se obtuvieron interesantes resultados para ADN mitocondrial, que permitirán en el futuro realizar comparaciones con áreas cercanas. Posiblemente, la baja frecuencia del haplogrupo B esté vinculado a lo que Rothhammer y colaboradores (1989: 405; Rothhammer y Silva 1989, 1992, Rothhammer et al. 2002, citados en Moraga et al 2005), llaman una “tercera corriente migracional”, proveniente del altiplano meridional (Bolivia), la que habría tenido lugar entre 1000 y 500 años AC. Por el momento, existe una carencia de estudios de ADN mitocondrial en otros sitios funerarios formativos de la localidad de Calama (Topater, Villa Chuquicamata), Loa Medio (Chiu-Chiu), Loa Inferior (Quillagua) y oasis circumpuneños (San Pedro de Atacama), lo que impide contar con contextos comparativos provenientes de la biología molecular. Asimismo, la mayoría de los estudios antropológico-físicos de la Región de Antofagasta, están referidos a contextos cronológico-culturales anteriores, del Período Arcaico (Cocilovo et al. 2005), como posteriores de los períodos Medio e Intermedio Tardío (Costa 1988, Costa y Llagostera 1994, Torres-Rouff et al. 2005). Por lo tanto, nuestro trabajo representa un primer esfuerzo para conocer la constitución genética y el modo de vida de las poblaciones formativas del Loa Medio, usando este tipo de metodologías, siendo además el segundo intento a nivel sudamericano de análisis de ADN nuclear antiguo, después del trabajo de Lleonart y colaboradores (1999) en Cuba. Por otra parte, los resultados preliminares del análisis de ADN nuclear son extremadamente importantes, debido a la probabilidad que la muestra 0701, proveniente de un infante encontrado con dos colgantes laminares de oro, realmente posea ADN nuclear amplificable. Esto permitiría conocer algunos marcadores de microsatélites, con el objetivo de establecer posibles relaciones de parentesco entre distintos individuos del sitio arqueológico y, de esta manera, conocer más sobre su origen. En esta dirección, se requerirán más estudios de las mismas muestras y de otros individuos del sitio arqueológico, sobre todo de piezas dentales, que preservan mejor el ADN antiguo. Justamente, la escasez de estudios de ADN nuclear en muestras arqueológicas y la dificultad en poder obtener ADN nuclear amplificable, por la multiplicidad de factores que degradan a esta molécula durante el largo tiempo que permanece en el ambiente, reviste al estudio realizado en el presente Proyecto de una gran relevancia, marcando un precedente genético y arqueológico. En consecuencia, y aún siendo pequeña la muestra del Cementerio Regimiento Chorrillos, permite vislumbrar interesantes resultados en el 8 Sin embargo, no tenemos explicación del por qué se conservó mejor el material genético en un diente de leche, de menor tamaño, que en uno permanente de un individuo adulto.

marco de futuros estudios genéticos de ADN mitocondrial y nuclear en diversas poblaciones prehispánicas formativas de la Región de Antofagasta.

Bibliografía Bailliet, G., F. Rothhammer, F. Carnese, C. Bravi y N.O. Bianchi 1994. Founder mitochondrial haplogroups in Amerindian populations. American Journal of Human Genetics 55: 27 –33. Bowcook, A.M., A. Ruiz-Linares, J. Tomfohrde, E. Minch, J. R. Kidd y L. L. Cavalli-Sforza 1994. High resolution of human evolutionary trees with polymorphic microsatellites, Nature 368: 455–457. Burger, J., S. Hummel, B. Herrmann y W. Henke 1999. DNA preservation: a microsatellite-DNA study on ancient skeletal remains. Electrophoresis 20: 1722-1728. Clark, J. M. 1988. Novel non-templated nucleotide addition reactions catalyzed by procaryotic and eucaryotic DNA polymerases. Nucleic Acids Research 16: 9677-9686. Cocilovo, J., H. Varela, M. A. Costa-Junqueira y S. Quevedo 2005. Los Pescadores Arcaicos de la Desembocadura del Río Loa (Norte de Chile): El Sitio Caleta Huelén 42. Chungara 37 (1): 5-20. Costa, M. A. 1988. Reconstitución física y cultural de la población tardía del cementerio de Quitor 6 (San Pedro de Atacama). Estudios Atacameños 9: 99-126. Costa, M. A. y A. Llagostera 1994. Coyo 3: Momentos finales del Período Medio en San Pedro de Atacama. Estudios Atacameños 11: 73-107. Easton, R., D. A. Merriwether, D. Crews y R. Ferrell 1996. MtDNA variation in the Yanomami: evidence for aditional New World founding lineages. American Journal of Human Genetics 59: 213–225. González, C. y C. Westfall 2006 En prensa. Cementerio Regimiento Chorrillos de Calama: Testimonios Funerarios Formativos en el Loa Medio, Región de Antofagasta. Actas del XVII Congreso Nacional de Arqueología Chilena, Valdivia. Goodwin, W., A. Linacre y P. Vanezis 1999. The use of mitochondrial DNA and short tandem repeat typing in the identification of air crash victims. Electrophoresis 20: 1707-1711. Hagelberg, E. y J.B. Clegg 1991. Isolation and characterization of DNA from archaeological bone. Proc. R. Soc. Lond. B. 244: 45-50. Hoff-Olsen, P., S. Jacobsen, B. Mevag y B. Olaisen 2001. Microsatellite stability in human post-mortem tissues. Forensic Sci. Inter. 119: 273–278 Horai, S., R. Kondo, Y. Nakagawa-Hattori, S. Hayashi, S. Sonoda y K. Tajima 1993. Peopling of the Americas, founded by four major lineages of mitochondrial DNA. Molecular Biological Evolution 10: 23 –47. Höss, M., P. Jaruga, T. H. Zastawny, M. Dizdaroglu y S. Pääbo 1996. DNA damage and DNA sequence retrieval from ancient tissues. Nucleic Acids Research 24: 1304-1307. Lindahl, T.

1997. Facts and artifacts of ancient DNA. Cell 98: 1-3. Lleonart, R., E. Riego, R. Rodríguez, R. Travieso y J. de la Fuente 1999. Analyses of DNA from ancient bones of a pre-columbian Cuban woman and a child. Genetic Molecular Biology 22: 285-289. Moraga, M., E. Aspillaga, P. Carvallo y F. Rothhammer 2000. Analyses of Mitochondrial DNA Polymorphisms in skeletal remains and extant populations of Northern Chile. Chungara 32(2): 263-264. Moraga, M., C. Santoro, V. Standen, P. Carvallo y F. Rothhammer 2005. Microevolution in prehistoric Andean populations: Chronologic mtDNA variation in the desert valleys of northern Chile. American Journal of Physical Anthropology 127: 170 –181. Reyes, O. 2005. Informe Bioantropológico sitio Cementerio Regimiento Chorrillos. Manuscrito. Rothhammer, F. y C. Silva 1989. Peopling Andean South America. American Journal of Physical Anthropology 78: 403-410. 1992. Gene geography of South America: testing models of populations displacement based on archaeological evidence. American Journal of Physical Anthropology 89: 441-446. Rothhammer, F., J. Cocilovo, E. Llop y S. Quevedo 1989. Orígenes y Microevolución de la Población Chilena. Culturas de Chile, Prehistoria: 403-413. Editorial Andrés Bello, Santiago. Santos, S. E., A. K. Ribeiro-dos-Santos, D. Meyer y M. A. Zago 1996. Multiple founder haplotypes of mitochondrial DNA in Amerindians revealed by RFLP and sequencing. Annals of Human Genetics 60: 305 –319. Schmerer, W.M., S. Hummel y B. Herrmann 1999. Optimized DNA extraction to improve reproducibility of short tandem repeat genotyping with highly degraded DNA as target. Electrophoresis 20: 1712-1716. Smith, D. G., R. S. Malhi, J. Eshleman, J. G. Lorenz y F. A. Kaestle 1999. Distribution of mtDNA haplogroup X among Native North Americans. American Journal of Physical Anthropology 110: 271 –284. Takahashi, M., Y. Kato, H. Mukoyama, H. Kanaya y S. Kamiyama 1997. Evaluation of five polymorphic microsatellite markers for typing DNA from decomposed human tissues –Correlation between the size of the alleles and that of the template DNA. Forensic Science International 90: 1–9 Torres-Rouff, C., M. A. Costa-Junqueira y A. Llagostera 2005. Violence in Times of Change: The Late Intermediate Period in San Pedro de Atacama. Chungara 37 (1): 75-84. Torroni, A., T. G. Schurr, M. F. Cabell, M. D. Brown, J. V. Neel, M. Larsen, D. G. Smith, C. M. Vullo y D. C. Wallace 1993. Asian afinities and continental radiation of the four founding Native American mtDNAs. American Journal of Human Genetics 53: 563 –590. Weber, J.L. y P.E. May 1989. Abundant class of human DNA polymorphisms which can be typed using the polymerase chain reaction. American Journal of Human Genetics 44: 388–396. Westfall, C. y C. González 2005. Informe Final. Proyecto Rescate Arqueológico Cementerio Regimiento Chorrillos. Tomo I: Arqueología. División Codelco Norte-CODELCO Chile, Calama. Manuscrito. Zierdt, H., S. Hummel y B. Herrmann

1996. Amplification of human short tandem repeats from medieval teeth and bone samples. Human Biology 68: 185-189.

Figura 1. Calama en la Región de Antofagasta. Figura 2. Ubicación en Calama

Tabla 1 Tabla 2 Figura 3 (fotografía de bandas de ADN mitocondriales).