Aquaporinas, canales de membrana para el agua. Disregulación en los trastornos del balance de agua

Las membranas plasmáticas de las células de todos los mamíferos son permeables al agua, pero el grado de permeabilidad varía mucho de unos tejidos a otros. El movimiento de agua a través de la bicapa lipídica de las membranas celulares se produce de forma pasiva como respuesta al gradiente osmótico generado por el transporte activo de iones o solutos neutros. Probablemente la mayoría de las membranas celulares tienen una permeabilidad más bien escasa al agua, pero suficiente para permitir la regulación de su volumen y otras funciones propias. Sin embargo, existen algunas membranas, como las de los epitelios secretores o absortivos y las células endoteliales, que requieren no sólo una elevada permeabilidad al agua, sino también que ésta pueda regularse para facilitar el transporte de fluidos como respuesta a pequeños cambios osmóticos. La observación de que la permeabilidad al agua de algunos tejidos era excesivamente alta para ser explicada únicamente por simple difusión a través de la membrana lipídica fue fundamental para el desarrollo del concepto de un canal específico para el transporte de agua. Actualmente se ha demostrado la existencia de una familia de canales proteicos específicos de agua que facilitan su movimiento transcelular, denominados aquaporinas. Las aquaporinas son, por tanto, una familia de proteínas intrínsecas de membrana que funcionan como canales selectivos de agua en la membrana plasmática de las células de distintos tejidos transportadores de la misma1.

La primera aquaporina identificada, CHIP 28 (channel-forming integral membrane protein of 28 kDa), posteriormente denominada aquaporina-CHIP o simplemente aquaporina-1, fue purificada por Agre et al2 en eritrocitos humanos en la década de los ochenta. La secuencia de su ADN complementario fue descubierta en 19913. Un año más tarde se estableció el papel funcional de la aquaporina-1 como un canal proteico de agua4. La reconstitución de la aquaporina-1 en proteoliposomas aumenta 100 veces la permeabilidad al agua sin modificar la permeabilidad a protones, urea u otros solutos más pequeños4. Hasta el momento actual se han identificado 11 canales proteicos de agua en los tejidos de mamíferos, que se han denominado, consecutivamente, aquaporina-0 a aquaporina-10. En los últimos años el desarrollo de ratones deficientes en genes que codifican para los canales de agua ha permitido profundizar en el papel fisiológico de las aquaporinas5.

ESTRUCTURA MOLECULAR DE LAS AQUAPORINAS

La estructura general de las aquaporinas fue descubierta por Agre et al2 en la aquaporina-1. Se trata de una cadena polipeptídica sencilla con un peso molecular aproximado de 28 kDa. La cadena atraviesa la membrana seis veces, formando cinco asas y quedando los extremos N y C en el interior de la célula. De las cinco asas, tres son extracelulares

(denominadas A, C, y E) y dos son intracelulares (B y D) (fig. 1). Las asas B y E contienen la secuencia Asp-Pro-Ala (NPA), que es característica de las proteínas intrínsecas de membrana (MIP, major intrinsic protein), de las cuales las aquaporinas son miembros. Recientemente, se ha determinado la estructura tridimensional de la aquaporina-1 y se ha observado que se agrupa en homotetrámeros en la membrana plasmática y que cada subunidad monomérica forma un canal de agua6. La gran homología en la estructura primaria de las aquaporinas hizo pensar que todas tendrían una estructura tridimensional similar; sin embargo, se ha observado que esto no se cumple en todas ellas. Así, recientemente se ha comprobado que la aquaporina-4 presenta una estructura

ortogonal7.

PATRON DE EXPRESION Y PAPEL FISIOLOGICO DE LAS AQUAPORINAS

Aquaporina-0 o MIP26

Corresponde a la major intrinsic protein de 26 kDa que se expresa únicamente en las lentes oculares. Parece que ésta, además de ser permeable al agua puede favorecer la incorporación de glicerol a la membrana plasmática8. Se ha descrito en el ratón una mutación en la aquaporina-0 que favorece el desarrollo de cataratas9.

Aquaporina-1

La aquaporina-1 abunda en la membrana apical y basolateral de los túbulos proximales renales y en la rama descendente del asa de Henle. También se ha encontrado, en menor cuantía, en otros tejidos extrarenales: membrana plasmática de los eritrocitos, distintos epitelios (plexos coroideo del cerebro, ciliar no pigmentado y lentes oculares, hepatobiliar, vesícula biliar, glándulas sudoríparas ecrinas) y en ciertos endotelios (corneal, capilares peribronquiales). La distribución renal de la aquaporina-1 podría explicar el papel de los segmentos renales proximales en la conservación del agua, donde se reabsorbe cerca del 80% del componente acuoso del filtrado glomerular. El estudio de los ratones deficientes

en el gen de la aquaporina-1 (aquaporin-1-knockout mice) ha puesto de manifiesto el importante papel de este canal de agua en el mantenimiento del balance hídrico. Así, se ha demostrado que estos ratones deficientes en aquaporina-1 presentan un severo deterioro en la capacidad de concentrar la orina10. El papel fisiológico de la presencia de aquaporina-1 en la membrana de los eritrocitos no se conoce bien. Se ha postulado que podría desempeñar un papel en la supervivencia de los eritrocitos durante su paso a través de la médula renal, donde la osmolaridad intersticial es muy elevada2. Se ha demostrado que los glucocorticoides inducen la expresión pulmonar de la aquaporina-1, lo que podría explicar, al menos en parte, el papel beneficioso de la administración de corticoides en la disfunción pulmonar de los recién nacidos prematuros y en el asma bronquial11. En los colangiocitos se ha observado que la activación de la proteincinasa A (PKA) favorece la traslocación de la aquaporina-1, de la localización intracelular a la membrana apical. Sin embargo, este efecto no se ha observado en otros tejidos12.

Aquaporina-2 o aquaporina-CD (aquaporin-collecting duct)

Se encuentra en los túbulos colectores. La habilidad de concentrar la orina ha sido un escalón esencial en la adaptación de los animales a la vida terrestre. Únicamente los mamíferos y los pájaros son capaces de producir una orina hipertónica en relación al plasma. Esta capacidad de concentrar la orina reside en la respuesta de los túbulos colectores renales a la vasopresina. La principal característica del transporte de agua en el túbulo colector es el rápido e intenso cambio de permeabilidad inducido por la vasopresina, que es capaz de aumentar 10 veces la permeabilidad al agua de los túbulos colectores en menos de 30 s13.

En la actualidad existen numerosas evidencias que demuestran que la aquaporina-2 es el canal de agua regulado por la vasopresina15. En el túbulo colector hay dos tipos celulares, las células principales responsables de la reabsorción de agua a favor del gradiente osmótico del intersticio renal, y las células intercaladas ligadas al transporte ácido-base. La aquaporina-2 se localiza en la membrana apical y en ciertas vesículas intracelulares, que sirven como reservorio de la aquaporina-2, de las células principales de los túbulos colectores. La unión de la vasopresina a su receptor V2 de la membrana basal de la célula principal pone en marcha un mecanismo dependiente del adenosín monofosfato (AMP) cíclico (AMPc) que tiene como resultado final el aumento de la reabsorción de agua gracias a la translocación y posterior fusión de las vesículas intracitoplasmáticas que contienen aquaporina-2 a la membrana apical. Este aumento en el número de canales de agua funcionales aumenta la permeabilidad a la misma. Posteriormente, al disminuir los niveles de vasopresina, se produce un mecanismo de endocitosis de los canales de agua de la membrana apical que conduce a una disminución de la permeabilidad de los túbulos colectores. Se ha observado también, que el contenido celular de esta aquaporina-2 aumenta en respuesta a la restricción hídrica en ratas normales o en respuesta a la infusión de vasopresina en las ratas Brattleboro (que carecen de vasopresina endógena circulante). Asimismo, se ha demostrado un aumento en el ARN mensajero (ARNm) de la aquaporina-2 contenida en la médula renal tras la restricción hídrica, mientras que no se

observa aumento en el contenido de otros canales de agua. Estos hechos apoyan la idea de que la aquaporina-2 es una proteína regulada y que su respuesta representa un cambio adaptativo de los túbulos colectores para conseguir una mayor eficacia en la conservación renal del agua15.

Aquaporina-3

La aquaporina-3 se expresa en la membrana basolateral de las células principales de los túbulos colectores, en el tracto gastrointestinal, en el pulmón, en el ojo y en el sistema nervioso16. A diferencia de los otros miembros de esta familia, la aquaporina-3 posee permeabilidad tanto al agua como a la urea. Se ha postulado que ésta pudiera facilitar la salida de urea de las células de los túbulos colectores, cuyo transporte a través de las mismas en la médula interna renal es crítica para el mecanismo de contracorriente16. Se ha demostrado, en una línea de células epiteliales de pulmón, que los corticoides aumentan la expresión de aquaporina-317 y se ha sugerido que este canal de agua puede favorecer la reabsorción de las secreciones bronquiales en diversas afecciones pulmonares. Sin embargo, la ausencia de esta respuesta a los corticoides en el tejido pulmonar durante las diversas fases de desarrollo embrionario plantea dudas sobre este posible papel fisiológico de la aquaporina-317.

Aquaporina-4

Abunda en las células gliales y ependimales del cerebro y en menor cuantía en la retina, el epitelio de las vias aéreas, el tracto gastrointestinal y la membrana basolateral de las células principales de los túbulos colectores18. Se ha observado que los ratones deficientes en el gen de la aquaporina-4 presentan un menor edema cerebral como respuesta a distintas lesiones cerebrales. Esto plantea su posible papel en la regulación del transporte de agua en el cerebro y abre las puertas a un nuevo enfoque en el tratamiento del edema cerebral19. Se ha observado también que estos ratones presentan un defecto en la capacidad de concentrar la orina cuando se les somete a una prueba de restricción hídrica durante 36 h20.

Otras aquaporinas

La aquaporina-5 se ha encontrado expresada en las glándulas salivales, en las glándulas lacrimales y en el tejido pulmonar y parece que puede tener un importante papel en la producción de saliva, lágrimas y fluido pulmonar21. La aquaporina-6, a diferencia de las otras, se localiza exclusivamente en las membranas intracelulares de los podocitos glomerulares, de las células del túbulo proximal y de las células intercaladas del túbulo colector. Esta distribución intracelular en diversos tipos de células del epitelio renal plantea su posible papel en otros procesos celulares diferentes del transporte transcelular de fluidos como por ejemplo en la regulación del equilibrio ácido-base22. La aquaporina-7 se expresa en el esperma y en menor cuantía en el riñón (membrana apical del túbulo proximal) y en el corazón23. La aquaporina-8 se expresa en los hepatocitos, en el páncreas

y en los testículos y en menor cuantía en el colon y en las glándulas salivales24,25. La aquaporina-9 se ha encontrado expresada en los adipocitos y en menor cuantía en el corazón, en el riñón y en el intestino delgado26. Recientemente, se ha clonado la aquaporina-10, encontrándose su expresión en el testículo y en menor cuantía en el timo, en el riñón y en el intestino. Este canal de agua se diferencia de la estructura general de los aquaporinas en que sólo presenta una secuencia NPA27.

REGULACION DE LA PERMEABILIDAD AL AGUA DE LOS TUBULOS COLECTORES POR LA VASOPRESINA

La tonicidad del fluido corporal se regula en gran medida a través de la regulación de la excreción renal de agua. La conservación renal de agua se produce como resultado de la función combinada del asa de Henle y del túbulo colector, ambos segmentos están regulados por la vasopresina. El asa de Henle genera un intersticio medular hipertónico mediante el mecanismo de multiplicación a contracorriente. El túbulo colector permite, en presencia de vasopresina, que se produzca un equilibrio osmótico entre la orina y el intersticio medular hipertónico gracias a un aumento en la permeabilidad al agua de este segmento13. La vasopresina regula la permeabilidad al agua del túbulo colector por dos mecanismos asociados a la regulación de la aquaporina-2, un mecanismo de regulación a corto plazo y otro mecanismo de regulación a largo plazo.

Regulación a corto plazo de la permeabilidad al agua del túbulo colector

Ocurre como respuesta a la vasopresina, que produce un incremento de la permeabilidad al agua de los túbulos colectores en segundos o minutos. Esta respuesta es el resultado de la redistribución de la aquaporina-2 dentro de la célula. Las vesículas intracelulares que contienen aquaporina-2 se fusionan con la membrana plasmática apical de las células principales produciendo un aumento en el número de canales de agua en la membrana plasmática apical. La disminución en la concentración de vasopresina induce una disminución del número de canales de agua en la membrana plasmática apical asociado a la reaparición de la aquaporina-2 en las vesículas citoplasmáticas. Este cambio en la distribución celular de la aquaporina-2 es paralelo a cambios en la permeabilidad al agua del epitelio tubular28. El mecanismo molecular de este proceso se realiza mediante la unión de la vasopresina al receptor V2 presente en la membrana basolateral de las células principales del túbulo colector. Este receptor es un receptor proteico unido a la proteína G (GTP-binding protein). La unión de la vasopresina con el receptor V2 activa la adenilciclasa que acelera la producción de AMPc a partir de adenosín trifosfato14. Posteriormente, el AMPc se une a la subunidad reguladora de la PKA produciendo un disociación de la subunidad reguladora de la catalítica. La subunidad catalítica de la PKA se activa al disociarse y fosforila diversas proteínas, entre ellas la aquaporina-2; esta fosforilación produce una translocación de las vesículas intracitoplasmáticas, que contienen la aquaporina-2 fosforilada, a la membrana plasmática apical. El resultado final es un aumento de la permeabilidad al agua de los túbulos colectores28. Se ha demostrado que la

fosforilación de la serina 256 de la aquaporina-2 es crítica para que se produzca la translocación de esta proteína29.

Regulación a largo plazo de la permeabilidad al agua del túbulo colector

Es un aumento mantenido de la permeabilidad al agua de los túbulos colectores como respuesta a concentraciones prolongadamente elevadas (24 h o más) de vasopresina circulante. A diferencia de la regulación a corto plazo, este proceso no se revierte rápidamente, ya que no se asocia con cambios en la distribución celular de la aquaporina-2 sino con un aumento en el número total de canales de agua debido probablemente a un aumento en la síntesis de la proteína30. Esta respuesta esta mediada por la regulación de la transcripción del gen de la aquaporina-2 a través de un mecanismo dependiente de AMPc. El extremo 5' del gen de la aquaporina-2 presenta una secuencia de respuesta al AMPc denominada cAMP responsive element (CRE). La unión de una proteína previamente fosforilada (CRE-binding protein) a esta zona del gen favorece la transcripción del mismo y, por tanto, un aumento en su ARNm y finalmente de la proteína31. Recientemente, se ha observado en ratones transgénicos (DI +/+) que presentan genéticamente niveles elevados de actividad AMPc fosfodiesterasa y, por tanto, valores celulares bajos de AMPc, una poliuria grave y una marcada disminución en la expresión renal de aquaporina-232.

DISREGULACION DE LAS AQUAPORINAS EN TRASTORNOS DEL BALANCE DE AGUA

Diabetes insípida central

Esta entidad se caracteriza por la presencia de una poliuria masiva y una osmolaridad urinaria baja que se acompaña de unos valores muy bajos o indetectables de vasopresina circulante. La poliuria y el aumento en la osmolaridad urinaria se puede revertir mediante la administración exógena de vasopresina. Estudios en ratas Brattleboro que carecen de vasopresina endógena circulante y que, por tanto, manifiestan una diabetes insípida central han demostrado una cantidad muy disminuida de aquaporina-2 en el riñón30. La importancia clínica de esta observación radica en el concepto de que hasta que no se restauren los valores renales de aquaporina-2 no se normalizará el mecanismo de concentración urinario.

Diabetes insípida nefrogénica

Esta entidad se caracteriza por la presencia de una poliuria masiva y una osmolaridad urinaria baja que se acompaña, sin embargo, de concentraciones elevadas de vasopresina circulante. En este caso, el riñón no es capaz de responder a la acción antidiurética de la vasopresina debido a un trastorno intrarrenal en el mecanismo de concentración urinaria. Se distinguen dos formas: congénita y adquirida. La forma más común es la adquirida que, por lo general, no presenta una clínica tan grave como la forma congénita. La diabetes insípida nefrogénica adquirida se observa asociada a diversas afecciones, siendo la más frecuente la secundaria a la administración prolongada de litio. Se ha observado que la

regulación a largo plazo de la aquaporina-2 está alterada en diversos modelos experimentales de diabetes insípida nefrogénica adquirida secundaria, por ejemplo, al tratamiento prolongado con litio33, a la hipocalemia34, a la hipercalcemia35, o a la obstrucción ureteral36. Así, en estos modelos animales de diabetes insípida nefrogénica se ha observado una disminución en la expresión de la aquaporina-2 en el riñón que se cree que contribuye al trastorno en el mecanismo de concentración urinaria. Se ha demostrado que el litio inhibe la adenilciclasa en diferentes tipos celulares, incluidas las células del epitelio renal. Sin embargo, es importante destacar que la disminución renal de aquaporina-2 no es necesariamente el único factor determinante en el trastorno del mecanismo de concentración urinaria. Ya se ha comentado, en otro apartado de esta revisión, que el mecanismo de concentración urinaria no sólo depende de la permeabilidad al agua del túbulo colector sino también de la acumulación de solutos en la médula renal.

La diabetes insípida nefrogénica congénita es una entidad más rara que las anteriores. Presenta una clínica más grave que la forma adquirida y se caracteriza por la presencia de hipernatremia, hipertermia, retraso mental e insuficiencia renal. La importancia de un diagnóstico precoz es fundamental porque se pueden prevenir las complicaciones de la enfermedad con la administración de agua. En la mayoría de las familias esta enfermedad presenta un patrón de herencia recesiva ligada al sexo causada por una mutación en el gen del receptor V2 de la vasopresina37. Se han descrito pacientes con un patrón de herencia diferente, en los que se ha demostrado una mutación en el gen de la aquoporina-215. Aunque hasta el momento no se han observado diferencias clínicas entre estos dos grupos de pacientes, desde el punto de vista bioquímico se pueden distinguir mediante la administración de dDAVP (agonista selectivo del receptor V2 de la vasopresina). Los pacientes con mutaciones en el gen de la aquaporina-2 presentan vasodilatación y liberación de factores de la coagulación y fibrinolíticos. Sin embargo, esta respuesta está ausente en los pacientes con diabetes insípida nefrogénica secundaria a una mutación en el gen del receptor V2 de la vasopresina38. Hasta el momento, se han descrito más de 100 mutaciones en el gen del receptor V2 de la vasopresina en pacientes con diabetes insípida nefrogénica congénita. Estas mutaciones consisten en deleciones, inserciones y cambios en la secuencia de nucleótidos lo largo de la secuencia del gen, con excepción de la parte que codifica el fragmento intracelular del receptor37. El significado funcional de estas mutaciones esta aún por determinar por lo que no se conoce todavía en qué zona está situado el trastorno: a) en el procesamiento del receptor intracelular; b) en la inserción del receptor a la membrana plasmática, c) en la unión del ligando con el receptor, y/o d) en la transducción de la señal.

Hasta el momento, se han descrito diversas mutaciones en el gen de la aquaporina-2 en individuos con una diabetes insípida nefrogénica con un patrón de herencia autosómico recesivo. Parece ser que la mayoría de estas mutaciones se asocian con un defecto en la salida de la proteína del retículo endoplasmático, por lo que la aquaporina no puede llegar a la membrana plasmática apical39. En una forma dominante de diabetes insípida nefrogénica se ha descrito una mutación en el residuo 258 de la aquaporina-2 (Glu258 *

Lys). En este caso se ha observado que la aquaporina-2 mutada se queda almacenada en el aparato de Golgi40. Se ha especulado que en los individuos heterocigotos los homotetrámeros de aquaporina-2 estarían formados por proteína mutada y no mutada, pero que los tetrámeros se quedarían almacenados en el aparato de Golgi. Esto explicaría el patrón de herencia dominante en esta familia con diabetes insípida nefrogénica. Se ha observado que las mutaciones de la aquaporina-2 con un patrón de herencia recesivo se localizan entre el primer y el último dominio transmembrana y que las mutaciones con un patrón de herencia dominante se localizan en el extremo carboxilo de la proteína.

SINDROME DE SECRECION INAPROPIADA DE ADH (SIADH)

Esta entidad se caracteriza por una liberación mantenida de vasopresina u otras sustancias con efecto antidiurético independiente de los mecanismos reguladores de la osmolaridad. El SIADH se ha encontrado asociado a diversos procesos patológicos y en especial a tumores malignos. Se ha demostrado en un modelo animal que la administración prolongada de dADVP se acompaña de un aumento en la expresión renal de aquaporina-241. Se ha descrito un fenómeno de escape a la acción antidiurética de la vasopresina en un modelo de ratas sometidas a la administración simultánea de vasopresina y agua. En este modelo se observa inicialmente una elevación en la expresión renal de aquaporina-2 seguida posteriormente de una disminución en la expresión renal de este canal de agua, a pesar de mantener unos valores elevados de vasopresina circulantes42. Clínicamente, las ratas muestran a los 2 días de mantener una ingesta hídrica elevada, y coincidiendo con la disminución en la expresión renal de aquaporina-2, un aumento de la diuresis y una disminución en la osmolaridad urinaria.

INSUFICIENCIA CARDÍACA CONGESTIVA, CIRROSIS HEPATICA Y SINDROME NEFROTICO

Existen diversas entidades patológicas que se acompañan de una expansión del volumen del fluido del espacio extracelular debido a una retención renal de sodio y agua como son la insuficiencia cardíaca congestiva, la cirrosis hepática o el síndrome nefrótico. Se ha observado en algunos de estos procesos la presencia de un trastorno en la regulación de los canales de agua que podría explicar, al menos en parte, la excesiva retención hídrica.

Se ha observado en un modelo de rata con insuficiencia cardíaca congestiva secundaria a la ligadura de la arteria coronaria que las ratas con insuficiencia cardíaca descompensada e hiponatremia presentan un aumento en la expresión renal de aquaporina-243,44. Esta respuesta se ha atribuido a una concentración elevada de vasopresina circulante secundaria a una estimulación no osmótica de la liberación de la misma.

En ratas con un síndrome nefrótico inducido por la administración del aminonucleósido puromicina (PAN) se ha observado una disminución de la expresión renal de aquaporina-2 a pesar de valores elevados de vasopresina circulante45. Esta falta de aumento en las concentraciones de aquaporina-2 se ha confirmado en otro modelo experimental de síndrome nefrótico inducido por la administración de adriamicina46,47. En estos modelos de

síndrome nefrótico las ratas presentaban expansión del volumen del espacio extracelular manifestado en forma de ascitis, pero no presentaban hiponatremia. Se ha postulado que la disminución en la expresión renal de aquaporina-2 sería una respuesta fisiológica adecuada para compensar el aumento del volumen fluido del espacio extracelular.

En el caso de la cirrosis hepática, se han realizado distintos modelos experimentales obteniéndose diversos resultados. Asahina et al, en un modelo de cirrosis hepática inducido por la administración intraperitoneal de tetracloruro de carbono, observaron un discreto aumento en la expresión renal de aquaporina-2 tanto del ARN como de la proteína48. En este modelo, el tetracloruro de carbono se disolvió en aceite de oliva, pero las ratas control recibieron intraperitonealmente suero salino. Fujita et al observaron tras la administración subcutánea de tetracloruro de carbono y aceite de oliva un aumento en la expresión del ARN de la aquaporina-2. Esta respuesta se bloqueaba con la administración de un antagonista del receptor de la vasopresina (OPC-31260)41. Sin embargo, y a diferencia de estos dos estudios, en un modelo de cirrosis inducido por la inhalación crónica de tetracloruro de carbono no se ha confirmado el aumento en la expresión renal de aquaporina-2. En este trabajo las ratas cirróticas presentaban ascitis, además de un retraso en la excreción renal de agua tras la administración de una sobrecarga de agua49. En otro modelo animal de cirrosis inducido por la ligadura del conducto biliar diferentes grupos han observado también una disminución en la expresión de la aquaporina-2 en el riñón50,51. En resumen, en situaciones de expansión del volumen del fluido del espacio extracelular se puede producir una excesiva retención de agua en ausencia de un aumento en la expresión renal de aquaporina-2. Estos resultados ponen de manifiesto que la expresión renal de aquaporina-2 no es uniforme en diferentes situaciones patológicas, ni siquiera dentro de modelos experimentales que mimetizan el mismo proceso patológico.

ADDENDUM

Mientras este artículo estaba en fase de publicación, se ha publicado una excelente revisión sobre el tema: Agre P. Aquaporin water channels in kidney. J Am Soc Nephrol 2000; 11: 764-777.

AGRADECIMIENTO

Patricia Fernández-Llama tiene un contrato de incorporación del Ministerio de Educación y cultura-SEVID (SAF 99/0016).