actividad sinÁptica en el circuito del hipocampo …
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UNIVERSIDAD PABLO DE OLAVIDE Facultad de Ciencias Experimentales
Departamento de Fisiología, Anatomía y Biología Celular División de Neurociencias
Mauricio Valenzuela Harrington
ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL
HIPOCAMPO DURANTE APRENDIZAJE
ASOCIATIVO Y POTENCIACIÓN Y DEPRESIÓN
EXPERIMENTAL EN RATAS.
Tesis Doctoral co-dirigida por el Dr. José María Delgado García la Dra. y la
Dra. Agnès Gruart i Massó
Sevilla, 2009
D. José María Delgado García, Catedrático del Departamento de Fisiología, Anatomía y
Biología Celular de la Facultad de Ciencias Experimentales de la Universidad Pablo de
Olavide, y Dña. Agnès Gruart i Massó, Profesora titular del Departamento de Fisiología,
Anatomía y Biología Celular de la Facultad de Ciencias Experimentales de la Universidad
Pablo de Olavide.
CERTIFICAN:
que el presente trabajo titulado “ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL
HIPOCAMPO DURANTE APRENDIZAJE ASOCIATIVO Y POTENCIACIÓN Y DEPRESIÓN
EXPERIMENTAL EN RATAS” ha sido realizado bajo su dirección y supervisión por Don
Mauricio Valenzuela Harrington, Licenciado en Biología y Ciencias por la Universidad de
Playa Ancha de Ciencias de la Educación (Chile), y consideran que reúne las condiciones de
calidad y rigor científico para ser presentado y defendido como Tesis Doctoral.
Sevilla, 13 de Marzo de 2009
Fdo.: José María Delgado García Fdo.: Agnès Gruart i Massó
DEDICATORIA
A Ricardo y Ricky
A Vania y Nelly, mis dos amores
AGRADECIMIENTOS
Difícil es encontrar las palabras que expresen con mediana aproximación los
sentimientos que se generan cuando se desea dar gracias a tantas personas que de una u otra
forma me ha ayudado a concluir esta etapa en mi formación académica. En este pequeño
espacio de mi tesis, quisiera dejar expresados mis más profundos y sinceros agradecimientos a
quienes estuvieron junto a mi en todos los años que duró esta etapa:
A mis familias
Mis hermanos Patricia, Verónica y Esteban, en los años de lejanía,
saber que ustedes estaban junto a los viejitos me hizo más llevadera la distancia. Gracias por el
apoyo y la energía que me enviaron en todo momento, este logro es también vuestro.
Mis suegros, cuñados y con cuñados, por brindarnos su cariño
incondicional y acompañarnos a la distancia, siempre preocupados y dispuestos a ayudarnos.
A los amigos...
Marcos, juntos hemos recorrido el mismo camino, por eso tus cartas y
tu apoyo siempre me llegaron en el momento preciso. Gracias por estar...
Christian, Cristian y Natalia, sus cartas a la distancia me mantuvieron
cerca de mi amado puerto, gracias por acompañarme en los momentos difíciles.
A la Universidad de Playa Ancha...
Gracias a las diferentes autoridades y colegas de mi universidad
quienes me depositaron su confianza y apoyo para realizar este doctorado.
A la División de Neurociencias de la Universidad Pablo de Olavide...
Aquí tuve la suerte de conocer a personas increíbles que me brindaron
siempre su calidez y compañía. En especial quisiera agradecer a José María Delgado y Agnés
Gruart quienes me guiaron en esta tesis doctoral con total entrega y preocupación, siempre
dispuestos a darme el consejo oportuno y la guía adecuada, por todo lo vivido muchísimas
gracias.
También quisiera agradecer de forma muy especial a Antonio y Sabina
quienes hicieron de Sevilla y Europa lo mejor que he vivido. Finalmente entregar mis
agradecimientos a todos los compañeros de la división de neurociencias y con especial cariño
a Raudel, con quien compartí fantásticos años junto a su alegre compañía.
A mis compañeros del doctorado, Julieta, William, Oscar, Vicente, David, José Luis,
Elena, Rocío, con quienes compartí gratas tardes de estudio y de intercambios culturales,
llevaré por siempre vuestros recuerdos
Por último quisiera agradecer a Nelly, mi hermosa compañera, amiga, confidente y
esposa, todo lo vivido a tu lado fue increíble, porque cada día que pasa doy gracias por haberte
conocido y por poder disfrutar cada momento a tu lado, porque tu risa contagiosa, tu empuje
en los momentos difíciles, tu paciencia para resistir las largas sesiones de trabajo en el
laboratorio, tu comprensión por los fines de semana en casa, tu amor incondicional, fueron mi
mejor compañía. Te amo cada día mas.
ÍNDICE
Índice ii
Índice iii
1. INTRODUCCIÓN 1
1.1 Planteamiento general 3
1.2 Aproximación histórica a los estudios sobre el hipocampo 5
1.3 Anatomía y fisiología del hipocampo 7
1.3.1 La formación hipocampal 7
1.3.2 Citoarquitectura de la formación hipocampal 7
1.3.3 Corteza Entorrinal 8
1.3.4 Giro Dentado 9
1.3.4.1 Aferencias al giro dentado 12
1.3.4.2 Eferencias del giro dentado 13
1.3.5 Hipocampo propio 13
1.3.5.1 Interneuronas en el hipocampo propio 17
1.3.5.2 Citoarquitectura hipocampal 18
1.3.5.3 Complejo subicular 20
1.4.5.4 Principales aferencias y eferencias de la formación hipocampal 22
1.4 Plasticidad sináptica en el hipocampo 22
1.5 Memoria y Aprendizaje 28
1.5.1 Parámetros analizados en pruebas de aprendizaje asociativo 33
1.5.2 Estructuras nerviosas implicadas en el condicionamiento clásico del reflejo palpebral.
34
2. OBJETIVOS 37
2.1 Objetivo General 39
2.2 Objetivos Específicos 39
3. MATERIALES Y MÉTODOS 40
3.1 Sujetos Experimentales 42
3.2. Procedimiento quirúrgico en animal agudo 42
Índice iv
3.3 Registro de la actividad electroencefalográfica y calibración de los
estímulos eléctricos 45
3.3.1 Protocolo experimental en animales agudos 45
3.3.1.1 Registro de la actividad basal 46
3.3.1.2 Perfil de intensidades 46
3.3.1.3 Prueba de pulsos pareados 46
3.4 Procedimiento quirúrgico para animales crónicos 47
3.4.1 Recuperación, cuidados post-operatorios y habituación a las
condiciones de registro 49
3.5 Registro de las actividades electromiográficas y electroencefalográficas y
calibración de los estímulos eléctricos 50
3.5.1 Registro de la actividad poblacional en la capa piramidal del área CA3
y CA1 del hipocampo 51
3.5.2 Registro de la actividad poblacional en la capa granular del giro
dentado del hipocampo 51
3.5.3 Protocolo experimental en animales crónicos 51
3.6 Grupos experimentales crónicos 52
3.6.1 Condiciones generales para las sesiones de condicionamiento 53
3.6.2 Estructura general de los programas de condicionamiento 53
3.6.3 Paradigmas de condicionamiento empleados 54
3.6.3.1 Paradigma de traza: Tono – choque eléctrico 54
3.6.3.2 Paradigma de seudocondicionamiento 54
3.7 Pruebas electrofisiológicas y farmacológicas 54
3.7.1 Protocolo empleado para inducir una potenciación a largo plazo (LTP) 55
3.7.2 Protocolo empleado para inducir una depresión a largo plazo (LTD) 55
3.7.3 Pruebas farmacológicas y condicionamiento 55
3.8 Análisis de datos 56
Índice v
3.8.1 Generalidades 56
3.8.2 Parámetros analizados de la actividad del músculo orbicular de los
párpados 56
3.8.2.1 Parámetros de las respuestas condicionadas 56
3.8.2.1.1 Porcentaje de respuestas condicionadas 56
3.8.2.1.2 Latencia al pico máximo de la respuesta condicionada 57
3.8.2.1.3 Latencia al inicio de la respuesta condicionada 57
3.8.2.1.4 Amplitud máxima relativa de la respuesta condicionada 58
3.8.2.2.5 Área relativa de la respuesta condicionada 58
3.8.3 Cálculo de la variación de la pendiente en los registros de potenciales
de campo sinápticos en el hipocampo 58
3.8.4 Análisis Estadístico 60
3.8.4.1 Experimentos de estimulación en hipocampo 60
3.8.4.2 Experimentos de condicionamiento 60
3.9 Histología 61
4. RESULTADOS 62
4.1 Caracterización de los potenciales de campo evocados en tres sitios de
relevo sináptico del hipocampo 64
4.2 Caracterización de las respuestas condicionadas durante las pruebas de
aprendizaje asociativo y de pseudocondicionamiento 65
4.2.1 Porcentaje de respuestas condicionadas ejecutadas por sesión 65
4.2.2 Área bajo la curva de las respuestas condicionadas 67
4.2.3 Amplitud máxima de las respuestas condicionadas 67
4.2.4 Latencia de inicio y al pico máximo de las respuestas condicionadas 70
4.2.5 Características electromiográficas de las respuestas condicionadas 71
4.3 Cálculo de la variación de la pendiente en los registros de potenciales de 73
Índice vi
campo sinápticos en el hipocampo, durante el condicionamiento clásico del
reflejo palpebral
4.4 Efecto del fármaco Ro 25-6981 en animales sometidos a la prueba de
condicionamiento clásico del reflejo palpebral 74
4.5 Efecto del fármaco Ro 25-6981 en la prueba electrofisiológica de
potenciación a largo plazo 80
4.6 Efecto del fármaco Ro 25-6981 en la prueba electrofisiológica de
depresión a largo plazo 81
4.7 Inducción de potenciación y depresión a largo plazo en tres sitios de
relevo sináptico del hipocampo al estimular la vía perforante homolateral 82
4.8 Prueba de pulsos pareados 85
4.9 Comprobación histológica de la localización final de los electrodos de
estimulación y registro 87
5. DISCUSION 89
5.1 Diseño de un modelo para el registro de la actividad hipocampal durante
pruebas de aprendizaje asociativo y de potenciación y depresión sináptica 91
5.2 Patrones de actividad hipocampal durante pruebas de aprendizaje
asociativo 93
5.3 Proceso de aprendizaje motor por condicionamiento clásico del reflejo
palpebral 99
5.4 Participación de los receptores de glutamato del tipo NMDA en la
generación de un aprendizaje asociativo 100
5.5 Participación de los receptores de glutamato del tipo NMDA en los
mecanismos de plasticidad sináptica como la potenciación y depresión a
largo plazo
103
5.6 Efecto de una estimulación en vía perforante y registro simultáneo en tres
sitios del hipocampo en los mecanismos de plasticidad sináptica como la
potenciación y depresión a largo plazo
105
5.7 Efecto de la prueba de pulsos pareados en las sinapsis del hipocampo 106
Índice vii
6. CONCLUSIONES 110
7. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 114
8. ANEXOS 115
Introducción 1
1. INTRODUCCIÓN
Introducción 2
Introducción 3
1.1 PLANTEAMIENTO GENERAL
El hipocampo es una estructura implicada en procesos de aprendizaje y memoria
(Thompson y Kim, 1996; Blaise y Bronzino, 2003; O’Keefe y Nadel, 1978), en el control
conductual de la ingesta de alimentos (Tracy y col., 2001) y en la conducta emocional
(Papez, 1937). La presencia de numerosas aferencias de muy diverso origen permite que la
transmisión a través del hipocampo presente un alto grado de modulación sináptica,
haciendo a esta estructura un excelente modelo para el estudio de estas interacciones
(Herreras y col., 1988).
La mayoría de los estudios electrofisiológicos realizados en el hipocampo se han
realizado en preparaciones in vitro, en las que el hipocampo está aislado de conexiones
externas. En estas preparaciones se pueden evaluar las propiedades electrofisiológicas de
las células del hipocampo de manera independiente de la llegada de otras aferencias de
distintas regiones del cerebro, de modo que se pueden estudiar cambios localizados en el
hipocampo (Moyer y col., 1996). En contraste, el empleo de un animal completo, como en
modelos experimentales in vivo, asegura la llegada de aferencias tónicas al hipocampo
provenientes de regiones subcorticales como el septum, el tálamo, las fibras comisuras del
hipocampo contralateral, el hipotálamo y varios núcleos del tronco encefálico como el
locus coeruleus, el área tegmental ventral y el núcleo del rafe medial. Muchas de estas
aferencias proyectan a la formación hipocampal haciendo sinapsis en interneuronas
inhibitorias (Buzsaki, 1984; Shepherd, 1990; Herreras y col., 1988). Este es un aspecto muy
importante a considerar, puesto que se ha demostrado que estas influencias extrínsecas
controlan la excitabilidad de los circuitos locales, lo cual es esencial para la inducción de
plasticidad sináptica en la formación hipocampal (Buzsaki, 1984; Shepherd, 1990; Tóth y
col., 1997).
El sistema motor del párpado constituye un excelente modelo experimental para el
estudio de cómo los circuitos neuronales centrales generan una respuesta motora
(Gormezano et al., 1983; Pellegrini, 1995). Dentro de los tipos de aprendizaje que se
pueden estudiar en este sistema motor se encuentra el condicionamiento clásico del reflejo
palpebral, que a sido ampliamente utilizado como modelo (Gormezano et al., 1983;
McCormick y col., 1982; Thompson, 1986 y 1990; Delgado-García, 2000; Gruart y
Delgado-García, 1994; Domingo et al., 1997; Gruart , 2000; Gruart et al., 2000; Servatius,
Introducción 4
2000; Delgado-García y Gruart, 2002; Delgado-García et al., 2003; Medina y col., 2002;
Lee y Kim, 2004; Valenzuela-Harrington y col., 2007). Este tipo de aprendizaje asociativo
es de especial interés porque presenta una serie de características que lo hacen muy
apropiado para estos estudios: a) Suponen la presencia de solo dos estímulos, el estímulo
condicionado y el incondicionado, los cuales pueden ser controlados con mucha precisión,
b) Ambos estímulos inducen respuestas conductuales discretas, que pueden ser medidas con
mucha precisión y de manera repetida en y entre cada sesión de prueba, c) Los efectos de
los estímulos condicionado e incondicionado pueden ser disociables anatómica y
conductualmente, d) El hipocampo ha sido mencionado por numerosos autores como una
estructura importante en la generación de la denominada respuesta condicionada (Lee y
Kim, 2004; Tseng y col., 2004).
Los estudios de los mecanismos del condicionamiento clásico se han realizado
mayoritariamente en conejos (Gormezano y col., 1962, Ryou y col., 2001; Leal-
Campanario y col., 2007), ratones (Dominguez-del-Toro y col., 2004; Rodriguez-Moreno y
col., 2004; Gruart y col., 2006), gatos (Múnera y col.,2001) y ratas (Stanton y col., 1992;
Weiss y col., 1999; Nicholson y col., 2003; Lee y Kim, 2004; Valenzuela-Harrington y col.,
2007). Los últimos modelos animales descritos a la fecha contemplan el implante crónico
de electrodos en regiones del hipocampo para registrar su actividad, estimulando en sitios
de fibras aferentes al hipocampo o en el hipocampo mismo. En estos modelos se busca
establecer patrones de actividad hipocampal durante pruebas de aprendizaje asociativo. En
la mayoría de estos estudios se registran uno (Moyer y col., 1996; Múnera y col., 2001;
Valenzuela-Harrington y col., 2007; Gruart y col., 2006) ó dos estructuras neuronales
(Gilmartin y McEchron, 2005). Lo mismo ocurre cuando se desea estudiar fenómenos de
eficacia sináptica en el hipocampo, donde las posibilidades pueden ser: a) estimular en vía
perforante y registrar en giro dentado (Davis y col., 1997; Blaise y Bronzino, 2003;
Valenzuela-Harrington y col., 2007). b) estimular las colaterales de Schaffer y registrar en
CA1 (Gruart y col., 2006, Madroñal y col., 2007). c) estimular en la vía perforante y
registrar en giro dentado y CA3 (Krug y col., 2001; Yackel y Berger, 1998); ó d) estimular
en vía perforante y registrar en giro dentado y CA1 (Gilmartin y McEchron, 2005).
Sin embargo, no basta con conocer qué sucede en la entrada (giro dentado) y salida
(CA1) del hipocampo, ya que hay numerosas evidencias que señalan que las neuronas de
Introducción 5
CA3 son claves en la memorización adaptativa del tiempo de respuesta condicionada, en un
paradigma de traza. (Kishimoto y col., 2006).
Nuestro interés se centró en conocer la actividad electroencefalográfica de los
principales sitios de relevo sináptico en el hipocampo, en dos situaciones experimentales:
a) pruebas de aprendizaje asociativo (condicionamiento clásico del reflejo palpebral) y b)
pruebas de eficacia sináptica como la potenciación a largo plazo (LTP, del inglés long term
potentiation) y depresión a largo plazo (LTD, del inglés long term depression). Para ello se
diseño un modelo experimental en rata con implantes crónicos de electrodos en tres sitios
del hipocampo: giro dentado, CA3 y CA1. Para determinar la magnitud de los cambios
sinápticos en cada sitio se estimuló, con pulsos de baja intensidad, en el borde angular, una
región donde convergen los axones que forman la vía perforante y desde donde proyectan a
las tres regiones antes mencionadas.
Para este estudio, seleccionamos una variante del condicionamiento clásico del
reflejo palpebral denominada: “condicionamiento de traza”. En este paradigma, el estímulo
condicionado se presenta antes del estímulo incondicionado, quedando entre ellos un
intervalo libre de estímulos. Este tipo de aprendizaje requiere de un hipocampo intacto
(Solomon y col., 1986; Moyer y col., 1990; Kim y col., 1995; Weiss y col., 1999; Takehara
y col., 2002; Tseng y col., 2004). La participación del hipocampo en este tipo de
aprendizaje asociativo se basara en los resultados acumulados por estudios
electrofisiológicos, farmacológicos e histológicos que en su conjunto permitirán hacer una
aproximación al funcionamiento del hipocampo en este tipo particular de aprendizaje.
Para comprender de qué manera el hipocampo participa en este tipo de aprendizaje,
es necesario conocer: a) La anatomía del hipocampo, sus principales tipos neuronas y el
establecimiento de circuitos internos. b) Las aferencias y eferencias que conectan al
hipocampo con otras estructuras corticales y subcorticales. c) Los tipos de
neurotransmisores que se encuentran en los diferentes tipos de neuronas e interneuronas, así
como también la distribución funcional de los subtipos de receptores.
1.2 APROXIMACIÓN HISTÓRICA A LOS ESTUDIOS SOBRE EL HIPOCAMPO
Desde el punto de vista histórico, el término hipocampo fue mencionado por vez
primera por Arantius (Giulio Cesare Aranzi, 1530-1589) quien describe en su libro “De
Introducción 6
Humano Foetu” una estructura localiza a los costados de los ventrículos laterales, con la
forma de un hipocampo (Caballito de mar) o de un gusano de seda blanco (Bombycinus
vermis candidus) (Sano, 1997; Walther, 2002; El Falougy y Benuska, 2006). Sólo el primer
término se mantuvo en el tiempo. La palabra hipocampo proviene del griego: hippos
(caballo) y Kampos (Monstruo marino) (El Falougy y Benuska, 2006).
Los términos “hipocampo” y “arquicorteza” son comúnmente empleados en la
literatura científica como sinónimos (Schwerdtfeger, 1984; Lopes da Silva y col., 1990). La
nomenclatura anatómica de esta estructura ha sufrido varios cambios desde los estudios de
Santiago Ramón y Cajal, de modo que es posible encontrar al menos tres tipos diferentes de
nomenclaturas. Según Santiago Ramón y Cajal, el hipocampo se divide en dos regiones: a)
la región superior corresponde a la región próxima a la corteza entorrinal, también
denominada giro parahipocampal y b) la región inferior, la cual corresponde a la región
cercana al giro dentado. Para esta región Cajal empleó el termino de fascia dentata. De
acuerdo con la nomenclatura que utilizó Rose (1926) divide al hipocampo en 5 regiones
(H1-H5) que comprenden desde el subiculum hasta el giro dentado. Lorente de Nó,
destacado discípulo de Santiago Ramón y Cajal, también elaboró una nomenclatura para el
hipocampo. En ella empleó el término cuerno de Ammón (CA) para el hipocampo propio.
Aunque Walther (2002) señala que este término fue introducido por Gakengeot en 1742,
refiriéndose al dios egipcio Amun-Re. En su organización, Lorente de Nó reconoce 4
regiones en el cuerno de Ammón: a) CA1 es la región próxima a la corteza entorrinal, b)
CA2 es una estrecha franja entre CA1 y CA3, c) CA3, esta zona se continúa hasta el hilius
de la fascia dentata, y d) CA4 es la región entre los brazos de la fascia dentata. Finalmente,
la terminología anatómica (1998) es la nueva nomenclatura que se emplea en la actualidad.
Esta divide al hipocampo propio en 4 regiones (CA1 – CA4) o regiones I – IV. Además
cambia el término fascia dentata por giro dentado. El subiculum es la región de transición
entre el hipocampo propio y la corteza entorrinal. El subiculum se divide a su vez desde la
corteza entorrinal hacia CA1 en: parasubiculum, presubiculum y subiculum propio. Esta
última será la terminología que se empleará en este estudio para la descripción anatómica
de la formación hipocampal y regiones corticales relacionadas.
Introducción 7
1.3 ANATOMIA Y FISIOLOGIA DEL HIPOCAMPO
En la búsqueda del sustrato biológico de los procesos de memoria y aprendizaje, el
hipocampo a emergido como una de las estructuras más estudiadas en los últimos años.
Los motivos principales por los cuales es una estructura preferida por los científicos
son: a) sus características anatómicas son fácilmente identificables tanto a nivel macro y
microscópico. Esto se ve facilitado por la existencia de una naturaleza laminar que facilita
los registros electrofisiológicos, unido a una baja densidad celular en las capas ubicadas por
encima y debajo de la principal capa, la piramidal. Y, b) los numerosos estudios que
señalan su rol en el establecimiento de diversas formas de aprendizaje y memoria, su
vulnerabilidad a los efectos de la isquemia e hipoxia, como también la susceptibilidad de
generar focos epilépticos, al ser una región de bajo umbral de excitabilidad (Johnston y
Amaral, 2004).
1.3.1 La formación hipocampal
El término “formación hipocampal” considera un complejo de 6 estructuras: Giro
dentado, hipocampo propio, subiculum propio, presubiculum, parasubiculum y corteza
entorrinal (Bayer, 1985; Yeckel y Berger, 1990; Eichenbaum y col., 1996; Witter y col.,
2000; Johnston y Amaral, 2004).
Desde el punto de vista macroscópico la formación hipocampal origina un repliegue
de la corteza cerebral cuyo eje antero-posterior se extiende en forma de C, teniendo como
límite rostral los núcleos septales y extendiéndose en su parte caudal hasta el lóbulo
temporal, envolviendo el tálamo y girando ventralmente en regiones posteriores. La corteza
entorrinal está situada ventralmente en la porción más caudal y el complejo subicular se
hace más patente en regiones temporales (Figura 1).
1.3.2 Citoarquitectura de la formación hipocampal
La formación hipocampal está constituida por 6 estructuras claramente definidas.
Como estas estructuras conforman un circuito con propiedades reverberantes comenzaré la
descripción del mismo desde la entrada de aferencias corticales hasta la región de salida.
Introducción 8
Subiculum
Corteza Entorrinal
Giro dentado
Figura 1. Esquema del hipocampo, donde se señalan los principales sitios de relevo sináptico. En azul se
muestra la proyección desde la corteza entorrinal al giro dentado, denominada vía perforante.
1.3.3 Corteza entorrinal
Numerosos estudios señalan que el hipocampo desempeña un papel fundamental en la
formación de nuevas memorias, lo que hace particularmente importante a la corteza entorrinal,
que por su estratégica ubicación, puede regular la interacción entre el hipocampo y la corteza
prefrontal (Eichenbaum y col., 1996; Loren y Brown, 2003).
La corteza entorrinal recibe la mayor parte de entradas corticales, las cuales envía al
hipocampo y subiculum, un aspecto que Cajal describió y sobre el cual propuso que podría
estar implicados en procesos de memoria. La corteza entorrinal se encuentra dividida en 6
capas bien definidas, (I - VI). Las capas II y III reciben aferencias sensoriales, muchas de ellas
provenientes de cortezas adyacentes (Witter y col., 2000; Van Haeften y col., 2003). Los
axones de las células de las capas II, III y en menor medida IV y V, forman la vía perforante
proyectando al giro dentado, al hipocampo propio y al subiculum (Amaral y Witter, 1995;
Deng y col., 2007). Las neuronas de la capa II envían sus axones a los 2/3 externos de la capa
molecular del giro dentado mientras que las neuronas de la capa III proyectan bilateralmente al
estrato lacunosum moleculare del hipocampo (Van Groen y col., 2003; Bartesaghi y col.,
2005; Deng y col., 2007). Las capas V y VI están pobladas por una elevada densidad de
neuronas de proyección que envían sus axones hacia fuera de la formación hipocampal,
además de por otros tipos celulares que engrosan la proyección al giro dentado y al hipocampo
Introducción 9
propio (Amaral y Witter, 1995) (Figura 2). Además estas capas profundas reciben aferencias
desde el hipocampo originadas tanto en CA1 como en el subiculum. Desde estas dos
estructuras la información puede ser enviada a la corteza prefrontal medial para un
almacenamiento a largo plazo (Buzsaki, 1996; Thierry y col., 2000) o puede ser enviada a las
capas superficiales de la corteza entorrinal, formado un circuito reverberante (Dolorfo y
Amaral, 1998). Esta es una importante característica a considerar cuando se tratan de
establecer los mecanismos de almacenamiento de la información en las redes neuronales
(Lopes da Silva y col., 1990). En esta misma línea, el estudio de Egorov y col. demostró que
las neuronas de la capa V de la corteza entorrinal tienen una actividad persistente,
manteniendo una constante tasa de disparo por varios minutos, aún en ausencia de estímulos.
Esto puede sugerir que las neuronas de esta capa pueden participar en la formación de
asociaciones entre estímulos que ocurren a diferentes tiempos. (Egorov y col., 2002; Frank y
Brown 2003)
Varios estudios han determinado que las aferencias de la corteza entorrinal, a través de
la vía perforante al giro dentado, son principalmente excitatorias, mientras que en CA1 la
estimulación de la corteza entorrinal tiene un efecto dual, ya que pueden generar excitación o
una fuerte inhibición (Empson y Heinemann, 1995). Este último efecto se ve respaldado por
estudios que señalan la fuerte influencia que reciben las dendritas apicales de CA1 por parte de
interneuronas GABAérgicas, una acción que se concentra principalmente en la dendrita apical
principal, disminuyendo su efecto hacia las dendritas de segundo y tercer orden (Papp y col.,
2001).
En el esquema de la Figura 2 se detallan las principales aferencias y eferencias de la
corteza entorrinal.
1.3.4 Giro dentado
En el giro dentado es posible diferenciar tres capas. La más próxima a la fisura se
denomina estrato moleculare (sm) y en ella se encuentran mayoritariamente las dendritas
apicales de las células granulares. El soma de estas células se localiza en la siguiente capa, el
estrato granulare (sg). Ambos estratos sufren un giro que deja en su interior la capa más
profunda, la zona polimórfica o hilus (h), que contiene una amplia variedad de tipos celulares,
siendo el más común las células musgosas (Figura 3). Finalmente, entre la región hilar y la
Introducción 10
capa molecular podemos diferenciar una estrecha lámina: la zona subgranular donde residen
células madre que proliferan durante la vida adulta del animal (Ribak y col., 2004).
I
II
III
IV
V
VI
CE
GD
CA 3
CA 1
Sub
Pr S
Pa S
C. Frontal
HipocampoC. Peririnal
C. Postrinal
C. Asociación
Figura 2. Esquema de la corteza entorrinal, donde se detallan las principales aferencias y eferencias, GD: giro
dentado; CE: corteza entorrinal; PaS: parasubiculum; PrS: presubiculum; Sub: subiculum (modificado de
Johnston y Amaral, 2004).
En el giro dentado las neuronas principales son las células granulares. Estas células
son de pequeño tamaño (en el rango de los 10 µm de diámetro) y se ubican en la capa del
mismo nombre. Las células de los granos tienen glutamato como neurotransmisor, su soma
suele ser esférico y proyectan a las dendritas apicales situadas en la capa molecular externa.
En la rata, la capa granular, vista en cortes coronales y dependiendo del nivel antero-
posterior, tiene forma de V (más anterior) o de U (más posterior).
Los axones de las células granulares se denominan fibras musgosas (mossy fiber, en
inglés). Las fibras musgosas se originan en la región basal del soma y se extienden a la capa
polimórfica, también denominada hilus. Estos axones emiten colaterales a los poco milímetros
Introducción 11
de su origen, haciendo sinapsis con células musgosas (en el orden de 7 a 12 por cada fibra
musgosa), con células en cesto y otras células de la capa polimórfica.
Existen numerosas interneuronas en el giro dentado, destacando las células en cesto,
que se ubican próximas a la capa granular. Las células en cesto son principalmente inhibitorias
de las células granulares. Su importancia radica en que ejercen influencia sobre un gran
número de células granulares.
Otra de las células inhibidoras presentes en el giro dentado son las células en
candelabro, ubicadas en la capa molecular, las cuales que ejercen su influencia en el segmento
inicial de las células granulares (Kosaka, 1983). Además, existe una población de células
inmunoreactivas a somatostatina que proyectan a las dendritas distales de las células
granulares y ejerciendo otro control inhibitorio sobre las mismas (Freund y Buzsáki, 1996).
A diferencia de las células antes señaladas, las células musgosas localizadas en la capa
polimórfica ejercen una influencia excitatoria sobre las células granulares, formando un
circuito de retroalimentación constante. Estas células presentan somas triangulares de gran
tamaño y dendritas proximales cubiertas de largas espinas (Amaral 1978; Ribak y col., 1985;
Amaral y Witer, 1995) (Ver Figura 3). Este efecto excitador, no es solo local, sino que
también se extiende a regiones más apartadas, tanto a nivel septal como temporal.
Capa Molecular
Capa Granular
Hilus
1
2
3 4
5
6
Figura 3. Esquema del giro dentado, en el que se detallan las interneuronas y sus efectos sobre las células
granulares. La numeración corresponde a: (1) Célula granular, (2) Interneurona inmunoreactiva a somatostatina,
(3) Célula en cesto, (4) Célula en candelabro, (5) Célula musgosa, (6) Fibra musgosa. Los colores señalan el
efecto que ejercen sobre la célula blanco, rojo = inhibición, verde = excitación.
Introducción 12
Los axones de las células granulosas del giro dentado (ver el número (6) en la Figura
3) tiene la particularidad que inerva a las células piramidales de CA3 e interneuronas a través
de tres tipos de sinapsis anatómicamente diferentes (Acsady y col., 1998; Lawrence y McBain,
2003).
Las sinapsis que se forman entre las fibras musgosas y las células piramidales de
CA3 han sido descritas como largos y complejos terminales musgosos que contienen
numerosos sitios de liberación, alrededor de 35 zonas activas (Henze y col., 2000). En
cambio, las sinapsis que se establecen con las interneuronas del estrato lucidum son sinapsis
pequeñas del tipo en passant. Además existen extensiones filopodiales de los terminales
musgosos (Acsady y col., 1998). Desde el punto de vista anatómico, estas interneuronas se
encuentran en una posición privilegiada para ejercer un control inhibitorio sobre las células
piramidales, ya que contactan con cientos de células piramidales (Claiborne y col., 1986;
Amaral y Witter, 1989; Chicurel y Harris, 1992; Acsady y col., 1998; Lawrence y McBain,
2003).
1.3.4.1 Aferencias al giro dentado
Como se ha señalado anteriormente, el giro dentado recibe su mayor entrada desde la
corteza entorrinal, principalmente de las células estrelladas de la capa II (Schwartz y Coleman
1981). En esta capa II existe una amplia variedad de células denominadas estrelladas,
piramidales, fusiformes, horizontales y bipolares (Schwartz y Coleman, 1981; Klink y Alonso,
1997). De todas ellas, las células estrelladas se localizan preferentemente en la corteza
entorrinal medial. Existe además una pequeña proyección desde las capas profundas de la
corteza entorrinal (IV y VI) a la capa II (Köler, 1985).
La vía perforante es principalmente glutamatérgica, aunque los terminales que
provienen de vía perforante lateral son también inmunoreactivos a encefalinas, mientras que
los terminales de la vía perforante medial son inmunoreactivos a la colecistoquinina (Fredens
y col., 1984).
Algunos autores señalan que el giro dentado recibe aferencias desde la corteza
perirrinal (Liu y Bilkey, 1996); sin embargo, otros investigadores señalan que las proyecciones
de la corteza perirrinal terminarían en las dendritas de las células piramidales de CA1 y no se
Introducción 13
proyectarían al giro dentado (Amaral y Witer, 1995; Witter y col., 1999; Dolorfo y Amaral,
1998).
Otras regiones que envían proyecciones al giro dentado tienen una localización
subcortical y corresponden a los núcleos septales, la región supramamilar del hipotálamo
posterior, el locus coeruleus, el área tegmental ventral y los núcleos del rafe (Amaral y Witter,
1995; Johnston y Amaral, 2004). El núcleo septal medial y el núcleo de la banda diagonal de
Broca inervan preferencialmente la capa polimórfica (Johnston y Amaral, 2004). La
proyección de la región supramamilar termina principalmente en la capa molecular y en menor
medida en la zona polimórfica (Pan y McNaughton, 2004).
El núcleo locus coeruleus emite importantes proyecciones noradrenérgicas, las cuales
finalizan principalmente en la capa polimorfica (Swanson y Hartman, 1975). Desde el área
tegmental ventral y el núcleo del rafe medial se envían al giro dentado aferencias
dopaminérgicas y serotoninérgicas, respectivamente, las cuales terminan preferentemente en la
capa polimorfica.
1.3.4.2 Eferencias del giro dentado
El giro dentado no proyecta a otras regiones cerebrales, sólo emite proyecciones a las
células piramidales de CA3, a través de las fibras musgosas. Aunque estas fibras tienen como
principal neurotransmisor el glutamato, se ha descrito que muchas de ellas liberan péptidos
opiáceos de tipo dinorfina y encefalinas, así como GABA (Sloviter y col., 1996).
1.3.5 Hipocampo propio
En el cuerno de Ammón es posible distinguir tres regiones: una región próxima al giro
dentado, donde se localizan células piramidales de gran tamaño, las cuales se conocen como
piramidales de CA3. A continuación se ubica una estrecha región de no más de 250 µm,
donde se localizan las células piramidales de CA2. Finalmente hay una porción más distal
respecto del cuerno de Ammón que contiene células piramidales pequeñas, conocidas como
CA1 (Ribak y col., 1985). A lo largo de todas estas regiones es posible distinguir una bien
definida organización laminar (ver Figura 4).
La superficie de los ventrículos está recubierta por una fina capa de fibras, denominado
alveus (a) o sustancia blanca del hipocampo. Justo por encima se encuentra el estrato oriens
Introducción 14
(so), una capa estrecha con baja densidad neuronal que contiene fundamentalmente las
dendritas basales de las células piramidales, cuyos somas definen la siguiente capa, el estrato
piramidale (sp), donde se ordenan de 3 a 6 células en profundidad. Si consideramos la
ubicación anatómica de las células piramidales de CA3, sus árboles dendríticos apicales se
extienden perpendicularmente atravesando tres estratos: el estrato lucidum (sl), el estrato
radiatum (sr) y el estrato lacunosum-moleculare (slm). Estos árboles dendríticos se expanden
en ambas direcciones y por eso, estas células son consideradas multipolares. De los tres
estratos antes mencionados el primero es un estrato acelular estrecho que contiene la región
proximal de las dendritas apicales de las pirámides de CA3, donde contactan los terminales
sinápticos de las fibras musgosas procedentes del giro dentado. El segundo está ocupado por
las dendritas apicales de las células pirámides. Y, finalmente el tercer estrato es la capa más
próxima a la fisura hipocámpica conteniendo las ramificaciones más distales de las dendritas
apicales de las células piramidales. La superficie más externa del hipocampo propio recibe el
nombre de fisura hipocámpica. Esta fisura lo separa del giro dentado y es donde se encuentran
las meninges (Amaral y Witer, 1995; Johnston y Amaral, 2004). En la Figura 4 se muestran en
detalle estos circuitos.
Las células piramidales de CA3 emiten colaterales en dirección a las células
piramidales de CA1, conocidas como colaterales de Schaffer , las cuales proyectan a través de
los estratos radiatum y oriens (Amaral y Witter, 1995). De modo que tanto las dendritas
apicales y basales de CA1 están bajo la fuerte influencia de las piramidales de CA3, se ha
estimado que una célula piramidal de CA1 puede ser inervada por más de 5.000 células
piramidales de CA3 (Amaral y col., 1990). En la rata, las proyecciones comisurales desde
CA3 se envían a las regiones contralateral e ipsilateral, finalizando preferentemente en los dos
estratos antes mencionados. La única proyección fuera del hipocampo de las piramidales de
CA3 es al núcleo septal lateral (Swanson y Cowan, 1977). Este núcleo septal es también el
origen de la principal aferencia subcortical que reciben las células piramidales de CA3, junto
con núcleo de la banda diagonal de Broca; en ambos casos, sus aferencias finalizan en las
interneuronas inhibitorias del estrato oriens (Gaykema y col., 1990). Uno de los aspectos
estructurales más importantes de las células piramidales de CA3 es la existencia de colaterales
que inervan a las propias piramidales de CA3, formando un circuito de retroalimentación, en
el que las terminales sinápticas finalizan en los estratos oriens y radiatum, principalmente.
Introducción 15
Figura 4. Citoarquitectura de la formación hipocámpica. ab: haz angular; DG: giro dentado; EC: córtex
entorrinal; fi: fimbria; GL: capa granular; ML: capa molecular; PaS: parasubiculum; pcl: stratum piramidale;
PoDG: capa polimórfica; PrS: presubiculum; S: subiculum; sl: stratum lucidum; slm: stratum lacunosum
moleculare; sr: stratum radiatum (modificado del Amaral y Witter, 1995).
Introducción 16
Estas células piramidales reciben también aferencias subcorticales, desde el locus
coeruleus, cuyas fibras finalizan preferentemente en el estrato lucidum y en la región más
superficial del estrato lacunosum-moleculare.
El campo de CA2 ha sido materia de controversia, tiene características que lo asemejan
a los campos de CA3 y CA1. Tiene somas neuronales grandes como en CA3, pero no recibe
inervación de las fibras musgosas, como las células piramidales de CA1. Este campo de
células piramidales de CA2 parece ser más resistente a la muerte celular por epilepsia respecto
de CA3 y CA1 y algunas veces a sido referido como el “sector resistente” (Corsellis y Bruton,
1983). Al igual que las neuronas de CA3, las piramidales de CA2 envían proyecciones a las
piramidales de CA1 (Ishizuka y col., 1990).
En general, las dendritas de las neuronas piramidales están cubiertas con espinas a las
cuales llegan muchas terminales sinápticas excitatorias. El análisis cuantitativo de la
organización dendrítica de las células piramidales del hipocampo indica que las neuronas de
CA3 tiene dendritas de una extensión variable (Ishizuka y col., 1995). Aquellas localizadas
cerca del giro dentado tienden a ser más cortas sus dendritas que aquellas localizadas cerca de
CA1. Megias y col. (2001) calcularon que una típica neurona piramidal de CA1 puede tener
cerca de 30.000 aferencias excitatorias y 1.700 aferencias inhibitorias; en particular, estas
últimas se concentran en la porción proximal de la dendrítica apical (Papp y col., 2001).
Finalmente podemos señalar que las células piramidales de CA1 reciben aferencias de
las neuronas de la capa III de la corteza entorrinal, las cuales se activan a frecuencias de
estimulación diferenciadas (Bartesaghi y Gessi, 2003) y también desde las piramidales de CA3
a través de las colaterales de Schaffer.
Desde el punto de vista electrofisiológico, cuando se activan simultáneamente las
colaterales de Schaffer y la vía perforante se pueden generar diferentes patrones de respuesta
en las piramidales de CA1. El efecto excitatorio de las colaterales de Schaffer sobre las
piramidales de CA1 puede verse muy atenuado cuando es precedido por la estimulación de la
vía perforante, dentro de una bien definida ventana temporal (Dvorak y Schuman, 1999;
Pissadaki y Poirazi, 2007).
De manera que el registro de potenciales de campo extracelulares en CA1, luego de
una estimulación en el borde angular, es muy diferente del que se registra en CA1 cuando se
estimulan las colaterales de Schaffer. Algunos estudios señalan que los registros extracelulares
Introducción 17
obtenidos en CA1 serían producto de una transmisión por volumen desde el giro dentado
(Stringer y Colbert, 1994). Otros investigadores han registrado respuestas en CA1 estimulando
a baja frecuencia en la corteza entorrinal, proponiendo que el sistema vía perforante –> CA1
responde a patrones específicos de entrada (Bartesaghi y Gessi, 2003).
Respecto de sus aferencias, las piramidales de CA1 reciben importantes proyecciones
del núcleo reuniens (tálamo) y del núcleo basolateral (complejo amigdaloide), las cuales
proyectan al estrato lacunosum –moleculare. También reciben aferencias noradrenérgicas y
dopaminérgicas de terminación difusa.
Numerosos autores consideran a las células piramidales de CA1 como la vía de salida
del hipocampo. Sus axones emiten dos importantes proyecciones dentro del hipocampo: La
primera es al subiculum (Amaral y col., 1991) y la segunda es hacia las capas profundas de la
corteza entorrinal (Naber y col., 2001). Las proyecciones de las piramidales de CA1 fuera del
hipocampo incluyen varias regiones: la corteza retrosplenial y perirrinal, el área infrarradiata
de la corteza frontal medial, el núcleo olfatorio anterior y el bulbo olfatorio, el núcleo
accumbens, los núcleos basales de la amígdala, distintas áreas hipotalámicas y el área lateral
septal y la banda diagonal de Broca (Amaral y Witer, 1995; Johnston y Amaral, 2004).
1.3.5.1 Interneuronas en el hipocampo propio
Las interneuronas propias del hipocampo han sido generalmente definidas como
neuronas con una influencia restringida a espacios locales que no tiene espinas y liberan
GABA (Buckmaster y Soltesz, 1996).
Las interneuronas hipocampales con sus cuerpos celulares cercanos a las capas de
células piramidales pueden ser clasificadas en tres grupos, en base de sus destinos sinápticos:
Células axo-axónicas, células en cesta y células biestratificadas. Como el nombre indica, las
primeras células hacen sinapsis en el segmento inicial de las neuronas piramidales y pueden
ejercer un fuerte control sobre la iniciación de los potenciales de acción. Las células en cesto
hacen sinapsis con el soma neuronal de las piramidales y, finalmente, las células
biestratificadas hacen contacto sináptico con las dendritas apicales y basales de las neuronas
piramidales.
Aunque hay muy poco solapamiento en sus regiones de destino, las dendritas de los
tres tipos celulares proyectan a los estratos oriens y radiatum y pueden recibir entradas
Introducción 18
excitatorias desde las colaterales de Schaffer, fibras de asociación comisural y colaterales
desde las mismas piramidales que están ubicadas próximas a las interneuronas.
Hay también conexiones inhibitorias mutuas entre estas interneuronas. Se piensa que
estas conexiones inhibitorias permitirían sincronizar a las interneuronas para producir
oscilaciones a varias frecuencias, incluyendo los ritmos theta y gamma.
Un nuevo grupo celular descrito recientemente (Price y col., 2005) lo constituyen
interneuronas con forma de neuroglia, las cuales tiene dendritas cortas y estrelladas que
proyectan al estrato lacunosum-moleculare. Estas interneuronas responden a la llegada de
aferencias de la vía perforante, originada en la capa III de la corteza entorrinal. Además, existe
un alto grado de conectividad entre ellas, lo que permitiría su activación sincrónica (Pissadaki
y Poirazi, 2007).
El efecto de la actividad de las interneuronas no debe restringirse al hipocampo en
exclusiva, debido a que existen poblaciones de interneuronas GABAérgicas que proyectan
fuera del hipocampo (por ejemplo, neuronas inhibidoras del hipocampo a los núcleos septales)
(Freund y Buzsáki, 1996; Maccaferri y Lacaille, 2003).
1.3.5.2. Citoarquitectura hipocampal
Andersen y colaboradores (1971) acuñaron el término “circuito trisináptico”
enfatizando la progresión unidireccional de las entradas excitadoras al hipocampo (Andersen y
col., 1971). Sin embargo en los estudios de Berger y col., se amplía esta visión de un circuito
trisináptico, describiendo la existencia de aferencias que son mono-di- y trisinápticas desde la
corteza entorrinal al hipocampo propio.
De modo simplificado podemos señalar que la corteza entorrinal se considera el punto
de partida del circuito, debido a que mucha de la información sensorial que recibe el
hipocampo entra a través de la corteza entorrinal. Gran parte de las aferencias sensoriales que
recibe la formación hipocampal se origina en dos áreas corticales adyacentes: las cortezas
peririnal y postrinal (parahipocampal, en el primate), las cuales reciben importantes aferencias
desde cortezas asociativas. Estas entradas a la corteza entorrinal son generalmente excitatorias
(Martina et al., 2001). Para este punto ver Figura 2.
Introducción 19
Figura 5. Esquema de la ubicación de las principales interneuronas presentes en el hipocampo, en relación con: a)
la posición de la célula piramidal y los distintos estratos, y b) los diferentes tipos de neurotransmisores. (Tomado
de McBain y Fisahn, 2001).
Como se indica más arriba, en la organización citoarquitectónica del hipocampo se ha
podido establecer que existen proyecciones bien delimitadas, las cuales forman un circuito
trisináptico, en el que básicamente se consideran las relaciones que se establecen entre las
células del giro dentado y las piramidales de CA3 y CA1.
Como señalamos anteriormente, la corteza entorrinal constituye el punto de partida de
la información que ingresa al hipocampo, originándose principalmente de las capas II y III,
desde donde las células estrelladas y piramidales de proyección allí localizadas envían sus
axones, los cuales formarán la vía perforante (Chrobak y col., 2000). Un aspecto interesante es
que estás neuronas de proyección de la corteza entorrinal tienen potenciales de membrana
oscilantes, lo cual les permite generar patrones rítmicos (Chrobak y col., 2000).
Introducción 20
La vía perforante hace sinapsis con las células granulares del giro dentado y los axones
de ellas se proyectan a la región de CA3 del hipocampo propio, haciendo contacto sináptico
principalmente con las dendritas basales localizadas en el stratum lúcidum. El circuito
continúa con las proyecciones de las colaterales de Schaffer que van a conectar con las
dendritas de las células piramidales de CA1.
El cierre del circuito lo constituyen los axones de las células piramidales de CA1 que
proyectan principalmente a las capas profundas de la corteza entorrinal, en la misma zona
donde se originó la aferencia- También pueden hacerlo de manera indirecta a través del
subiculum. Este circuito por lo tanto permitiría la integración en serie de la información que
llega al hipocampo (Iijima et al., 1996).
El circuito adquiere mayor complejidad cuando consideramos que la corteza entorrinal
puede enviar proyecciones que activan directamente las neuronas del campo CA1 (Bartesaghi
y Gessi, 2003)
La capacidad de constituir un circuito reverberante entre la corteza entorrinal y el
hipocampo podría contribuir a la construcción de memorias a largo plazo.
1.3.5.3 Complejo subicular
El complejo subicular es un importante componente de salida de la formación
hipocampal. Se divide usualmente en tres regiones corticales citoarquitectónicamente
diferentes situadas entre el hipocampo y la corteza entorrinal: el subiculum propio, el
presubiculum y parasubiculum. El subiculum es el más próximo al hipocampo y se considera
generalmente como la principal estructura de salida de la formación hipocámpica. El
presubiculum y parasubiculum, situados a continuación, se consideran las principales entradas
de información desde el tálamo (Amaral y Witter, 1995; O’Mara y col., 2001; O’Mara 2006).
El subiculum propio está constituido por tres capas: una capa molecular, una capa que
es la continuación del estrato lacunosum moleculare y radiatum y una extensa capa de células
piramidales. Estas células piramidales forman un denso plexo local, que conforma una
organización columnar. Rodeando a estas células hay una alta densidad de pequeñas células
que se consideran como interneuronas subiculares. (Harris y col., 2001; O’Mara 2006).
Dentro de la columna, las células profundas emiten axones colaterales que proyectan a las
dendritas apicales, conformando un patrón de activación columnar. Por otro lado, las células
Introducción 21
superficiales emiten axones que recorren largas distancias permitiendo la organización a través
de columnas (Harris y col., 2001). Desde el punto de vista de su actividad eléctrica, las células
piramidales de las capas profundas, tienden a descargar en ráfagas de potenciales de acción, en
cambio las piramidales superficiales lo hacen en espigas (Harris y col., 2001; O’Mara 2006).
Las principales aferencias al subiculum provienen de las células piramidales de CA1,
corteza entorrinal, corteza perirrinal y prefrontal. El subículum recibe también importantes
aferencias de cortezas secundarias y terciarias (O’Mara 2006). Desde el punto de vista de sus
conexiones subcorticales, el subiculum establece contactos recíprocos con el núcleo
premamilar ventral, el núcleo del septum medial, el núcleo de la banda diagonal de Broca, los
núcleos talámicos anteroventral y anteromedial y el núcleo del rafe medial.
Str. Oriens
Str. Pyr
Str. Radiatum
Str. Lac-Mol
Subiculum
C A1
C A 2
Col. Schaffer
NMDAR 2A y 2B
Mossy Fiber
IV
V
VI
Inner Outer
C A 3
Hilus
Perforant Path
Str. Gr
Str. Molec
NMDAR 2A y 2B
NMDAR 2A y 2B D.G.
Figura 6. Esquema de las interconexiones del hipocampo. Se ilustran básicamente las aferencias a través de
la vía perforante, los diversos tipos celulares en giro dentado (DG) y en las áreas piramidales de CA3 y CA1 y
la organización laminar del hipocampo.
Introducción 22
1.3.5.4 Principales aferencias y eferencias de la formación hipocampal
Las eferencias del hipocampo proyectan por el alveus constituyendo la fimbria del
fornix, la cual asciende en su región posterior para proyectarse hacia adelante y hacia abajo,
conformando las columnas del fornix. En su trayecto envía eferencias a los núcleos septales
para finalizar en los cuerpos mamilares del hipotálamo. Por otra parte, existen fibras que se
cruzan al hemisferio contralateral en una posición caudal respecto del área septal formando la
comisura ventral hipocámpica (Amaral y Witter, 1995). Además hay una segunda comisura,
denominada comisura dorsal del hipocampo, la cual envía fibras a las regiones de
presubiculum y parasubículum, además de la corteza entorrinal. Estas fibras comisurales se
unen con las fibras de la vía perforante ipsilateral formando en conjunto el denominado haz
angular (Amaral y Witter, 1995). Entre las aferencias que recibe el hipocampo están las fibras
originadas desde los núcleos del septum medial y la banda diagonal de Broca, también recibe
aferencias desde la corteza perirrinal, aunque es escasa y de baja importancia (Witter y col.,
1999).
1.4 PLASTICIDAD SINÁPTICA EN EL HIPOCAMPO
Como he señalado en apartados anteriores, el hipocampo es una de las estructuras más
estudiadas en los últimos años. Esto se debe, en parte, a su participación en la formación de
nuevas memorias episódicas y en el almacenamiento de recuerdos a largo plazo (Neves y col.,
2008).
Esta formación de nuevas memorias está en intima relación con la propiedad del tejido
nervioso de experimentar plasticidad sináptica, concebida como la capacidad de modificar la
actividad neural de un circuito neuronal por acción de una experiencia y que conduce a
modificaciones en los pensamientos, sensaciones y finalmente en la conducta (Citri y
Malenka, 2008).
La plasticidad neuronal se refiere específicamente a un cambio, dependiente de la
actividad, en la fuerza o eficacia de la transmisión sináptica (Citri y Malenka, 2008). De
manera que es posible identificar diferentes tipos de plasticidades sinápticas, desde aquellas
que se expresan en aumentos o descensos en la actividad expresados en milisegundos a horas,
días o semanas, a aquellas que implican cambios mucho más duraderos (Citri y Malenka,
2008).
Introducción 23
En el hipocampo se han podido estudiar muchos de estos tipos de plasticidad sináptica,
empleando técnicas de registro intracelular (Skrede y Westgaard, 1971), cultivos celulares de
neuronas del hipocampo (Banker y Cowan, 1977; Gahwiler, 1981), o registros de su actividad
in vivo durante pruebas de aprendizaje (Gruart y col., 2006; Whitlock y col., 2006; Valenzuela
y col., 2007). Como señalan en su revisión Citri y Malenka, 2008, por definición la plasticidad
sináptica es un fenómeno electrofisiológico y sólo con el registro de las respuestas
electrofisiológicas se puede determinar si una sinapsis se ha modificado.
Aunque existen numerosas formas de plasticidad sináptica en el cerebro de los
mamíferos, centraremos nuestra descripción en aquellas que son consideradas como
plasticidades sinápticas de corto y largo plazo.
En el primer caso, la plasticidad de corto plazo contempla cambios en el rango de
milisegundos a minutos y desempeñarían un papel en adaptaciones rápidas, formas de
memoria de corto plazo y cambio transitorios de conducta (Citri y Malenka, 2008). Los
protocolos más utilizados consisten en breves descargas que incrementan las concentraciones
de Ca++ intracelular, en el terminal presináptico, el cual aumenta la probabilidad de libración
de las vesículas. En la prueba de facilitación o depresión por pares de pulsos, se observa que a
intervalos cortos (20 ms) el efecto en la segunda respuesta es de depresión, básicamente por la
desactivación de canales de sodio y/o calcio del tipo voltaje dependientes, lo cual afecta la
sumación temporo-espacial para el segundo estímulo. Si, en cambio, el intervalo
interestímulos se incrementa (20 – 500 ms), se observa una facilitación en la segunda
respuesta. La explicación estaría en la cantidad de Ca++ residual que se mantiene en el terminal
y que se sumarían al ingreso de Ca++ en el segundo estímulo, produciendo una mayor
liberación de vesículas.
Para el caso de plasticidad sináptica de larga duración, dos son los ejemplos más
conocidos desde el punto de vista molecular y electrofisiológico. El primero de ellos fue
descubierto en 1973 es una forma de plasticidad sináptica llamada potenciación a largo plazo
(LTP, del inglés Long Term Potentiation) y consiste en un aumento en la potencia sináptica
que puede durar horas o incluso días por la acción de una estimulación repetitiva previa (Bliss
y Lømø, 1973; Bliss y Gardner-Medwin, 1973). Existen en el hipocampo dos formas distintas
de LTP, una de ellas contempla la participación de receptores de glutamato del tipo NMDA
(N-metil-D-aspartato) y la otra es una LTP independiente del receptor de NMDA y que se
Introducción 24
presenta en las sinapsis de giro dentado con las células piramidales de CA3 (Nicoll y Malenka,
1995).
En términos generales, los tipos de receptores de glutamato se pueden dividir en dos
grandes grupos: los ionotrópicos y los metabotrópicos. En el primer grupo encontramos
aquellos que son activados por NMDA y los que son activados por α-amino-3-hidroxi-5-metil-
4-isoxazolepropionato (AMPA) también denominados receptores de quisqualato/kainato.
Estos dos tipos de receptores presentan diferencias en sus características electrofisiológicas y
farmacológicas y en lo que respecta a su participación en la LTP (Dingledine y col., 1999).
En el segundo grupo, encontramos los receptores metabotrópicos (mGluRs). Estos
receptores modulan los estados de excitación e inhibición en la transmisión sináptica a
través de la interacción con canales operados por voltaje por la vía de segundos mensajeros
(Ben-Ari y Aniksztejn, 1995; Anwyl, R. 2006).
La LTP dependiente de los receptores de NMDA se ha estudiado profusamente en las
células piramidales de CA1. En ella se pudo determinar que tiene tres características muy
importantes: es asociativa, cooperativa y tiene especificidad (Nicoll y col., 1988). La
asociatividad se refiere a la capacidad de potenciar una aferencia débil cuando es activada en
asociación con una aferencia fuerte. La cooperatividad se refiere a que la LTP puede ser
inducida cuando se activa coincidentemente un número crítico de sinapsis. Finalmente la
especificidad se refiere a que sólo aquella sinapsis estimulada, y no las adyacentes, es la que
experimenta la LTP.
En el caso de la LTP que es dependiente de los receptores de glutamato del tipo
NMDA, se ha visto que co-localiza con receptores glutamatérgicos del tipo AMPA. Estos
últimos son receptores/canales permeables a cationes (Na+ y K
+) y con baja conductancia
iónica (4-5 pS), siendo los principales responsables de las corrientes de entrada que generan
las respuestas sinápticas excitatorias. En cambio, los receptores NMDA en condiciones de
reposo de la célula, están bloqueados por iones extracelulares de magnesio, de modo que
contribuyen muy poco a la respuesta postsináptica durante el estado basal. Sin embargo,
cuando la célula se despolariza, el magnesio es liberado de la escotadura del canal y permite
que por la acción conjunta del ligando endógeno, glutamato, más el agonista glicina, el canal
se abra y permita el ingreso inespecífico de iones de Na+, Ca
++ y la salida de K
+. Como es un
canal que posee una elevada conductancia iónica (50 pS) su efecto sobre la despolarización
Introducción 25
postsináptica es muy importante (Nowak y col., 1984; Mayer y col., 1984; Luo y col. 1997;
Mayer, 2005; Bartlett y col., 2007).
Los mecanismos moleculares que subyacen a la inducción de la LTP consideran la
participación de receptores sinápticos. Numerosa evidencias señalan que el glutamato es el
principal neurotransmisor excitatorio presente en el hipocampo y que varios tipos de
receptores de glutamato han sido relacionados con el fenómeno de la LTP (Eichenbaum y
Cohen, 2004). Durante los últimos años ha existido dos puntos de vista, el primero señala que
el mecanismo responsable sería un cambio en la expresión y propiedades de receptores de tipo
AMPA postsinápticos y el segundo postula que habrían cambios en la probabilidad de
liberación del neurotransmisor (Citri y Malenka, 2008). La aparición de la hipótesis de
sinapsis silenciosas inclinó las preferencias a la primera opción, de modo que durante la LTP
hay cambios en las densidades postsinapticas que corresponderían a tráfico de receptores del
tipo AMPA (Bredt y Nicoll, 2003; Kauer y Malenka, 2006; Derkach y col., 2007; Citri y
Malenka, 2008)
Figura 7. Modelo del tráfico de receptores del tipo AMPA durante los procesos de LTP y LTD. Durante el estado
basal, los receptores de NMDA y AMPA se van reciclando en las regiones adyacentes a la zona activa. Cuando se
induce la LTP (izquierda de la figura) hay un aumento de receptores modulado por la acción de la CaMKII y la
proteínas Rab 11a. Para el caso de la LTD (derecha de la figura) hay un aumento de la endocitosis de receptores
del tipo AMPA, donde participan la calcineurina, clatrina y la proteína fosfatas 1 (Tomado de Citri y Malenka,
2008).
Introducción 26
De esta manera, el efecto inicial de la aplicación de trenes de alta frecuencia es activar
los receptores AMPA, los cuales despolarizan la membrana y eso permite el desbloqueo de los
receptores NMDA, aumentando los niveles de Ca++ intracelular (Raymond, 2007). Esta
activación de los receptores de NMDA requiere, por tanto, que exista simultáneamente
liberación de glutamato desde el terminal presináptico y una despolarización postsináptica, así
pues, el receptor de NMDA sirve como un detector de coincidencias que correlaciona las
actividades pre y post sinápticas (Poncer, 2003).
Las concentraciones elevadas de Ca++ intracelular constituyen una etapa importante en
la generación de la LTP, debido a la presencia de enzimas como la calmodulina, que en
presencia de Ca++ forma un complejo denominado calcio-calmodulin-kinasa II (CaMKII) el
cual posee propiedades de autofosforilación con lo cual puede promover cambios en la
densidad postsináptica favoreciendo la inserción de receptores AMPA y/o incrementando la
conductancia de canales iónicos, o fosforilando proteínas importantes en la plasticidad
sináptica (Izquierdo y Medina, 1997; Nicoll y Malenka, 1999; Bayer y col., 2001; Pittenger y
Duman, 2008).
Para la LTD (LTD, del inglés Long Term Depression), también existen diversos tipos,
algunas pueden ser inducidas farmacológicamente ó eléctricamente. En el caso de las
primeras, se realiza por intermedio de receptores metabotrópicos de glutamato (Malenka y
Bear, 2004) y en las segundas, se generan por estimulación a baja frecuencia en períodos de 5
a 15 minutos (Braunewell y Manahan-Vaughan, 2001). El efecto de dicha estimulación se
observa de inmediato en la sinapsis y puede persistir de días a semanas en animales in vivo
(Manahan-Vaughan y Braunewell, 1999; Kemp y Manahan-Vaughan, 2004).
En la región de CA1 del hipocampo la LTD que se genera es dependiente de
receptores de NMDA y de la síntesis de nuevas proteínas, es además una LTD homosinaptica,
lo cual significa que se expresa en la sinapsis que recibe la estimulación tetanizadas (Dudek y
Bear, 1992). En el giro dentado, en cambio, la LTD es independiente de la presencia de
receptores de NMDA y de la síntesis de nuevas proteínas, además se puede ser del tipo homo
y heterosináptica (Doyere y col., 1997; Abraham y col., 2006; Poschel y col., 2007), en el
último caso, la LTD se desencadena en aferentes que convergen sobre una población neuronal
postsináptica tetanizada, pero en ausencia de tétanos.
Introducción 27
Los protocolos para generar una LTD varían dependiendo de la región cerebral que se
estudie, algunas veces es necesario aplicar estímulos del alta frecuencia (HFS, del inglés high
frequency stimulation) (Lee y col., 2000). Sin embargo en el hipocampo el protocolo más
utilizado considera una tetanización a baja frecuencia (600 – 900 pulsos) (O’Keefe y Nadel,
1978), el cual produce una reducción persistente de la eficacia sináptica. El hipocampo varía
su umbral de inducción a la LTD en función de la edad, siendo más difícil producir una LTD
en animales adultos que en los juveniles. En la Figura 8 se detallan algunos de los mecanismos
aceptados respecto del efecto de los distintos protocolos de estimulación y el mecanismo
molecular implicado.
Figura 8. La aplicación de una protocolo de estímulos de alta frecuencia activa la CaMKII el cual fosforila a
la Serina 831 del receptor AMPA, produciendo una LTP. Si se aplica un protocolo de baja frecuencia de
estimulación, se activa las proteínas fosfatasas 1/2ªA, las cuales desfosforilan la Serina 845 y se produce una
LTD (tomado de Lee y col., 2000).
En resumen, tanto la LTP como la LTD son dependientes de incrementos
postsinapticos de calcio regulados por receptores de NMDA (Mulkey y Malenka, 1992). La
hipótesis más aceptada es que las propiedades cuantitativas de las señales de calcio dentro de
la espina dendrítica, determinan si se genera una LTP o una LTD: si la concentración de calcio
es mínima, se genera una LTD, en cambio si las concentraciones sobrepasan valores críticos se
produce una LTP (Cummings y col., 1996; Malenka y Nicoll, 1993; Bliss y Schoepfer, 2004),
de modo que al conocer estas interrelaciones con el calcio, numerosos estudios han tratado de
Introducción 28
establecer la relación entre las propiedades de la LTP/LTD y las de la memoria (Morris, 1989;
Poncer, 2003; Wang y col., 2006).
1.5 MEMORIA Y APRENDIZAJE
Los procesos de memoria y aprendizaje están íntimamente relacionados. Cuando se
somete al sistema nervioso a experiencias, hay modificaciones en la fisiología e incluso
morfología de las neuronas que se reflejan en conductas, muchas de ellas adaptativas.
Podemos señalar por tanto que el aprendizaje es el proceso por el cual el individuo adquiere
nueva información y la memoria sería el proceso que permite que dicha información sea
almacenada, recuperada y utilizada por períodos variables de tiempo (Thorpe, 1963; Navarick
D.J., 1979; Squire, 1987; Gazzaniga y col., 1998; Kandel y col., 2000; Carlson N., 2006). Si
dicha información se mantiene por períodos breves de tiempo se considera como memoria de
corto plazo, en cambio si es almacenada por intervalos más prolongados se denomina
memoria a largo plazo (Squire, 1987; Gazzaniga y col., 1998; Saavedra, 1999; Tranel y
Damasio, 2000; Kandel y col., 2000).
El desarrollo de las actuales teorías del aprendizaje tienen una fuerte influencia de la
filosofía empirista británica y de las teorías asociacionistas. Básicamente, dichos filósofos
postulaban que la mente del hombre era “una tabla rasa” sobre la cual la experiencia dejaría su
legado. Los asociacionistas consideraban dos condiciones para establecer una asociación. Una,
que si las sensaciones se dan en cortos períodos de tiempo y son contiguos, tienden a
asociarse. Por otro lado está la frecuencia, entendida como el número de eventos por unidad de
tiempo. Así al ser más alta la frecuencia, más consistente es la asociación.
Para entender los postulados del asociacionismo, el condicionamiento clásico surge
como una herramienta de extraordinaria utilidad, haciendo una clasificación de los
aprendizajes en: a) No asociativos: Habituación y sensibilización (o
seudocondicionamiento). Son las dos formas menos complejas de aprendizaje. En la
habituación el animal se expone repetidamente a un estímulo inocuo, lo que conlleva una
disminución progresiva de su respuesta refleja. Por otro lado, en la sensibilización ocurre el
proceso inverso: hay un incremento de la respuesta refleja como resultado de la
presentación de estímulos de diferente naturaleza, que sean precedidos por otros estímulos
Introducción 29
intensos o nocivos (Navarick D.J., 1979; Morgado, 1998; Saavedra 1999; Kandel et al.,
2000) b) Asociativas: Dentro de ellas encontramos el condicionamiento operante o
instrumental, donde se produce la asociación en una respuesta conductual específica y una
consecuencia reforzadora. Aquí el animal realiza actos que le permiten reforzar o atenuar la
probabilidad de expresar una conducta. También se encuentra bajo esta clasificación el
condicionamiento clásico o Pavloviano, en 1904 Iván Petrovich Pavlov (1849 –1936)
investigó y describió los reflejos condicionados, un fenómeno que centró todo su interés ,
realizando fructíferos aportes a lo largo de su vida. En este tipo de condicionamiento se
busca formar una asociación entre un estímulo inicialmente neutral y un evento. Pavlov
descubrió que un perro podía presentar el condicionamiento de salivación, cuando es
sometido al entrenamiento de una respuesta ante un estímulo auditivo, que va seguido de un
trozo de carne. Si el experimentador hace sonar un timbre inmediatamente antes de poner la
carne cerca del perro, la repetición de esta secuencia hará que el sonido sea el que genere la
respuesta de salivación (Navarick D.J. 1979; Rosenzweig y Leiman, 1997; Saavedra, M.A.
1999; Kandel y col., 2000).
Para obtener la salivación, que es la respuesta condicionada, la repetición de la
secuencia varias veces, permite que el animal establezca la asociación entre los dos eventos,
extrayendo de ellos “la información que un estímulo entrega sobre el otro” (Saavedra, 1999).
De modo que el sonido se transforma en una “señal” del alimento y el perro responde a él
como si el alimento estuviese presente.
En el presente estudio, la respuesta condicionada corresponde al registro
electromiográfico del cierre palpebral. Este registro representa la variable dependiente que es
la que se analiza. En este registro, se puede medir la amplitud de la respuesta condicionada, así
como la latencia de inicio de dicha respuesta condicionada. También se puede medir la
latencia a la amplitud máxima de la respuesta, el porcentaje de respuestas condicionadas en
una sesión y, finalmente, la resistencia a la extinción.
En la Figura 9 se muestra el diseño básico del condicionamiento clásico o
pavloviano.
Introducción 30
A
Estímulo Neutro
Sin salivación
EstímuloNeutro
Estímulo Incondicionado
Salivación
Estímulo Incondicionado Salivación
+
B
Estímulo Neutro (despuésde emparejarlos)
Salivación
Figura 9. Esquema del modelo tradicional del condicionamiento clásico de Pavlov. A. Fotografía de Iván Pavlov observando las respuestas en uno de sus animales de experimentación. B. En el protocolo del condicionamiento el
estímulo neutro corresponde al sonido de una campana, la cual no produce respuesta en el animal, en el período
de condicionamiento se presentan los estímulos neutro (campana) e incondicionado (carne) pareados y se produce
la respuesta de salivación, finalmente en el período post condicionamiento, la sola exposición de la campana
(ahora estímulo condicionado) y se produce la salivación, demostrando que el animal fue capaz de aprender a
asociar el sonido de la campana con la llegada del alimento.
Introducción 31
La formación de la respuesta condicionada se construye sobre la base del reflejo
incondicionado, estableciéndose una asociación entre el estímulo condicionado y
incondicionado. Sin embargo, hay límites biológicos en la contigüidad temporal entre el
estímulo condicionado e incondicionado para producir la respuesta condicionada, los cuales se
detallarán más adelante.
El condicionamiento clásico del reflejo corneal es un tipo de aprendizaje motor que
depende del hipocampo y del cerebelo (Takehara 2002; McCormick y col., 1982). Como se
señalo anteriormente, es un tipo de modelo extensamente utilizado y que ha permitido estudiar
los mecanismos electrofisiológicos asociados al aprendizaje motor, como también conocer los
circuitos neuronales implicados (Gormezano, 1965, 1966; Gormezano y col., 1983; Gruart y
col., 1994, 2000; 2006; Thompson y Kim, 1996; Thompson, 1986, 1988; Bao, et al., 1998;
Weiss et al., 1999; Trigo y col., 1999; Ramnani y col., 2000; Múnera y col., 2001; Valenzuela-
Harrington y col., 2007). Como se describió en párrafos anteriores, este modelo considera la
presencia de un estímulo condicionado neutro (un tono), que es emparejado con un estímulo
incondicionado, generalmente aversivo (choque eléctrico, soplo de aire, etc). Entre ambos
estímulos se establecen distintas relaciones temporales (Gormezano y col., 1983). Estas
relaciones temporales en los estímulos condicionado e incondicionado son las que caracterizan
a los diferentes tipos de paradigma. En el estudio del condicionamiento clásico del reflejo
corneal hay dos paradigmas fundamentales y que son los más utilizados: el paradigma de
retraso o demora y el paradigma de traza o huella.
En el paradigma de retraso ambos estímulos se solapan temporalmente y deben
terminar idealmente juntos (ver Figura 10). El intervalo interestímulos depende del tipo de
especie en estudio, siendo el rango óptimo para el caso de los roedores entre 250 y 500 ms
(Thompson, 1989; Gruart, 1993; Clarke y col., 1996).
En el paradigma de traza, el estímulo condicionado y incondicionado están separados
por intervalos variables de tiempo (Takehara, 2002). Los rangos de intervalos más empleados
varían entre 150 y 2000 ms para el entrenamiento (Steinmetz, 2000). Sin embargo, la duración
de estos intervalos es específica para cada especie. Los humanos tienen respuestas
condicionadas a intervalos mayores que los conejos y estos a su vez mayores que las ratas
(Power y col., 1997).
Introducción 32
EC
EI
Paradigma de traza
Paradigma de retraso
EC
EI
Figura 10. Dos tipos de paradigmas empleados en el condicionamiento clásico. En el paradigma de traza existe
una separación tempral entre el estímulo condicionado y el incondicionado. En el paradigma de retraso, ambos
estímulos comienzan a intervalos distintos pero finalizan simultáneamente. Abreviaturas: EC: Estímulo
Condicionado; EI: Estímulo Incondicionado.
A través de la asociación entre el estímulo condicionado y el estímulo incondicionado,
este último es capaz de elicitar una respuesta denominada respuesta condicionada, (Lee y Kim,
2004, Jimenez-Díaz, 2003). Sin embargo, si el estímulo condicionado es presentado en
repetidas oportunidades en ausencia del estímulo incondicionado, la probabilidad de que
ocurra la respuesta condicionada disminuye, lo cual se conoce como extinción. (Gormezano,
1965, 1966; Kandel et al., 2000). Es importante señalar que la generación de esta respuesta
condicionada no solo depende de la proximidad entre el estímulo condicionado y el
incondicionado, sino que también debe existir una relación de contingencia, lo que implica
una verdadera posibilidad de ocurrencia inmediata del estímulo incondicionado (Rescola,
1988, Kandel y col., 2000); además, hay que considerar que la respuesta condicionada se
produce en el intervalo de tiempo que sigue a la aparición del estímulo condicionado, es en
este período donde queda la huella que permite al animal asociar ambos estímulos.
Considerando que a intervalos mayores de 500 ms las ratas no son capaces de
generar una respuesta condicionada (Thompson 1989; Power y col., 1997; Domingo y col.,
1997), y por los experimentos previos realizados en nuestra División de Neurociencias, se
seleccionó para nuestro modelo experimental el rango libre de estímulos de 300 ms
(Múnera, 2001; Gruart y col., 2006; Valenzuela-Harrington y col., 2007).
Introducción 33
1.5.1. Parámetros analizados en pruebas de aprendizaje asociativo
En una situación de aprendizaje, el animal se expone a una tarea que debe aprender.
Hay dos formas de aprender: i) la tarea problema, donde los animales deben explorar la
situación, ejemplo un laberinto T, y encontrar la solución y ii) la tarea lección aquí el animal
no explora y sólo aprende una respuesta. En los aprendizajes asociativos, el condicionamiento
instrumental implica una tarea problema y el condicionamiento clásico una tarea lección.
El esquema general de un experimento sobre aprendizaje, transferencia o memoria está
constituido por tres etapas: a) La actividad que produce el aprendizaje, b) Un intervalo de
tiempo, y c) En sentido general, un recuerdo, que demuestra el post efecto del aprendizaje.
El tiempo de intervalo entre la actividad y el recuerdo puede variar: si es largo,
estamos frente a un experimento de memoria, si es corto, es un experimento de adquisición.
Dentro de ese contexto, el utilizar un intervalo muy breve minimiza el olvido. A medida que el
animal se expone regularmente a la tarea, se van produciendo respuestas que representarán una
“curva de aprendizaje”. Esta curva es una relación funcional entre dos o más datos que han
sido procesados.
Se puede extraer mucha información al analizar la curva de aprendizaje. A medida que
transcurren los días, las respuestas van cambiando, al hacerse más conocida la tarea por los
sujetos experimentales Por ejemplo, si se considera la pendiente, ésta representa la tasa de
aprendizaje, que es la proporción de aprendizaje en el tiempo. También se pueden considerar
el número de ensayos que debe emplearse para llegar a un criterio de aprendizaje pre-
establecido. También, en estas curvas se puede graficar un reaprendizaje, donde se señalarán
la cantidad de ensayos necesarios para volver a obtener el porcentaje de aprendizaje pre-
establecido, de esta manera obtendremos una medida de la cantidad de olvido producida
(Stevens, 1951).
En la Figura 11 se muestra un ejemplo de curva de aprendizaje, mediante
condicionamiento clásico del reflejo palpebral en ratas. Se muestra el porcentaje de respuestas
condicionadas obtenidas durante las sucesivas sesiones de habituación, condicionamiento y
extinción en animales condicionados y pseudocondicionados.
Introducción 34
Figura 11. Esquema de una curva de aprendizaje donde se representa el número de días versus el porcentaje de
respuestas correctas obtenidas en dos animales distintos, los con en círculo relleno son los controles y que se
sometieron a pruebas de condicionamiento clásico y los demarcados en círculos sin relleno que son los animales
pseudocondicionados.
1.5.2. Estructuras nerviosas implicadas en el condicionamiento clásico del reflejo corneal
El condicionamiento clásico del reflejo corneal ha sido extensamente utilizado para
identificar los sustratos neuroanatómicos del aprendizaje asociativo (Steinmetz, 2000;
Woodruff-Pak y Steinmetz, 2000; Delgado-García y Gruart, 2006). Existen estudios donde se
sugiere que ciertas estructuras neuronales serían las responsables exclusivas de la generación
de la respuesta condicionada (Yeo y Hardiman, 1992; Llínas y Welsh, 1993; Bloedel y
Bracha, 1995); sin embargo, también existen propuestas que señalan la existencia de varías
estructuras neuronales que participarían de manera conjunta en la formación de la respuesta
condicionada (Krupa y col., 1993; Thompson y Kim, 1996; Steinmetz, 2000; Delgado-García
y Gruart, 2002, 2006; Jiménez-Díaz y col., 2004, Bloedel y col., 2007).
Las primeras propuestas respecto del circuito del aprendizaje señalaban que las
primeras aferencias (del estímulo incondicionado, o sea, del soplo de aire) llegarían a los
núcleos olivares inferiores contralaterales y desde aquí se proyectarían a través de las fibras
trepadoras hacía la corteza cerebelosa, haciendo sinapsis con las células de Purkinje. En su
1 4Habituation
1 1Conditioning Extinction
5 510
Con
ditio
ned
resp
onse
s (%
)
Introducción 35
trayecto a la corteza, las fibras trepadoras emiten colaterales excitatorias a los núcleos
profundos del cerebelo (Marr, 1969; Matsushita y Ikeda, 1970; Albus 1971; Thompson, 1986).
En el caso del estímulo condicionado, provenientes de las células ciliadas de la cóclea
(en el caso del sonido), hacen sinapsis con los núcleos del puente desde donde surgen las
fibras musgosas. Estás últimas al igual que las fibras paralelas también hacen un relevo a los
núcleos profundos del cerebelo (Tsukahara y col., 1968; Ito y col., 1970) previo a su llegada a
la corteza cerebelosa, específicamente a la capa granular, donde hacen sinapsis con un
complejo denominado “glomérulo cerebeloso”. El complejo está constituido por las dendritas
de las células de los granos y los axones de las células de Golgi. Son los axones de las células
de los granos que en la capa molecular de la corteza cerebelosa pasan a denominarse fibras
paralelas, los que hacen sinapsis con las dendritas de las células de Purkinje, de modo que
ambas fibras extracerebelosas están influenciando directa e indirectamente la actividad
sináptica de la única vía de salida de la corteza cerebelosa, la célula de Purkinje (Carpenter,
1994).
Entre los núcleos profundos de cerebelo, el interpósito ha sido propuesto como una
estructura esencial en el aprendizaje del condicionamiento clásico, basándose
fundamentalmente en estudios de lesiones, de modo que si la estructura es responsable de la
respuesta condicionada, su eliminación supondrá la imposibilidad de adquirirla (McCormick y
col., 1981,1982; Lavond y col., 1985; Yeo y col., 1985; Weisz y Lo Turco, 1988; Steinmetz y
col, 1992, Krupa y col., 1993; Clark y Lavond, 1994; Chen y col., 1999) sin embargo cuando
se produce una lesión pueden afectarse otras vías de comunicación entre el cerebelo y el
tronco encefálico (Yeo y co., 1985) o activarse mecanismos de compensación. Además, puede
disfacilitarse la respuesta aprendida, lo que impide su expresión.
Además del cerebelo han sido propuestos varios núcleos del tronco encefálico, como el
núcleo rojo, la formación reticular, los núcleos del puente, como estructuras implicadas en la
formación de la respuesta condicionada (Chapman y col., 1990; Irwin y col., 1992; Welsh y
Harvey, 1998). Aparte de estas estructuras subcorticales, también se ha documentado la
participación de estructuras corticales como la amígdala, el hipocampo y otras zonas de la
corteza cerebral. De entre las estructuras corticales, el hipocampo ha sido destacado como una
estructura importante en este tipo de aprendizaje asociativo (Thompson, 1986; Woody, 1986;
Thompson y Krupa, 1994; Múnera y col., 2001; Gruart y col., 2006; Valenzuela-Harrington y
Introducción 36
col., 2007, Green y Arenos, 2007). Su participación se hace fundamental en
condicionamientos con el paradigma de traza (Kim y col., 1995), pero no así en el paradigma
de demora (Thompson, 1988; Kim y col., 1995; Moyer y col., 1990, 1996; Weiss y col.,
1999). La posible explicación estaría en la necesidad del sujeto experimental de percibir y
asociar los estímulos, para lo cual debe emplear un conocimiento consciente para ese
aprendizaje (Clarke y Squire, 1998) como también una memoria declarativa o explícita
(Eichenbaum, 1999).
En recientes trabajos de nuestro laboratorio, se ha demostrado que durante la
adquisición de respuestas palpebrales condicionadas se modifica la actividad sináptica en el
circuito hipocampal, fortaleciendo la idea de la participación del hipocampo en la generación,
en parte, de la respuesta condicionada (Gruart y col., 2006).
Objetivos 37
2. OBJETIVOS
Objetivos 38
Objetivos 39
2.1 OBJETIVO GENERAL
El objetivo general de esta tesis doctoral fue caracterizar la actividad electroencefalográfica de
los principales sitios de relevo sináptico en el circuito del hipocampo en situaciones de
aprendizaje motor y pruebas de eficacia sináptica en ratas en condiciones fisiológicas.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Para lograr el objetivo general de esta investigación, se plantearon los siguientes objetivos
específicos:
1. Establecer la existencia de patrones de actividad hipocampal asociados a la generación
de respuestas condicionadas en tres sitios específicos del hipocampo como son el giro
dentado y las células piramidales de CA3 y CA1,
2. Establecer la existencia de cambios en parámetros electrofisiológicos como
pendientes, amplitudes y latencias sinapticas de los potenciales de campo producidos
en las regiones registradas, durante las pruebas de aprendizaje asociativo. Como
prueba de aprendizaje se utilizó el condicionamiento clásico del reflejo corneal, con
un paradigma de traza.
3. Estudiar la participación de los receptores NMDA en la generación de un aprendizaje
asociativo y en los mecanismos de plasticidad neuronal como la potenciación a largo
plazo y la depresión a largo plazo.
MATERIALES y MÉTODOS 40
3. MATERIALES Y MÉTODOS
MATERIALES y MÉTODOS 41
MATERIALES y MÉTODOS 42
3. MATERIALES Y MÉTODOS
Para estudiar el fenómeno de la plasticidad neuronal en el hipocampo fue necesario
inicialmente caracterizar cada sitio de relevo sináptico (giro dentado (GD); células
piramidales de CA3 (CA3) y células piramidales de CA1 (CA1)), a fin de conocer la
respuesta electrofisiológica que se evoca al estimular las diferentes vías aferentes
(colaterales de Schaffer y vía perforante). Por este motivo, los animales de dividieron en
dos tipos de grupo: agudos y crónicos. En los primeros se caracterizó la actividad
electroencefalográfica de cada sitio de relevo, determinando las coordenadas más
adecuadas para los electrodos de registro y estimulación. En los animales crónicos se
implantaron electrodos intracraneales y se registró in vivo la actividad
electroencefalográfica del hipocampo durante pruebas de aprendizaje asociativo. En este
último grupo se hicieron subdivisiones experimentales dependiendo de la posición y
número de los electrodos de registro y estimulación.
3.1. SUJETOS EXPERIMENTALES
Para los experimentos agudos y crónicos se emplearon 83 ratas macho de la cepa
Wistar, criadas en condiciones de libre acceso a comida y bebida. Los pesos al momento
de la cirugía fluctuaron entre los 250 y 300 gr. Los animales se obtuvieron de dos
proveedores oficiales (Animalario de la Universidad de Granada y Centro de Reproducción
Animal de la Universidad de Sevilla) y se manipularon de acuerdo a la legislación de la
Unión Europea (86/609/EU) y de España (BOE 67/8509-12, 1998 y BOE 252/34367-91,
2005) en materia de obtención y cuidado de animales de experimentación. Las ratas se
mantuvieron bajo condiciones estables de iluminación (ciclo de 12 horas de luz –
oscuridad), temperatura (21 ± 1º C) y humedad relativa (55 ± 5%).
3.2. PROCEDIMIENTO QUIRÚRGICO EN ANIMAL AGUDO
En la preparación quirúrgica para el registro de la actividad eléctrica basal en los
sitios seleccionados del hipocampo, los animales se mantuvieron en ayuno durante las doce
horas previas a la cirugía. Quince minutos antes de la misma, las ratas se anestesiaron con
hidrato de cloral al 4% a una dosis de 0,5 ml por cada 100 g de peso por vía intraperitoneal
y se administraron dosis controladas durante el desarrollo de la operación para mantener el
nivel adecuado de anestesia. Primero, se afeitó la región fronto-parieto-occipital de la
cabeza y parte del tercio rostral de la nuca. A continuación, se situó el animal sobre una
manta térmica durante toda la operación, manteniendo su temperatura controlada. Las ratas
MATERIALES y MÉTODOS 43
se montaron en un aparato estereotáxico (David Kopf Instrument 1204, Tujunga, CA,
EE.UU.) en el que se les fijó firmemente la cabeza (ver Figura 11). Todo el material
quirúrgico, así como el área operatoria, se esterilizaron antes de su uso.
Los pasos quirúrgicos realizados fueron los siguientes:
1.- Se realizó una incisión mediana fronto-occipital, comprendiendo piel y tejido celular
subcutáneo.
2.- Se expuso el cráneo (huesos frontal, parietal y occipital) mediante retracción de los
músculos temporales y el periostio. Se hizo hemostasia con cera quirúrgica
(Ethicon ®, Johnson-Johnson Intl., Bélgica) en los puntos sangrantes.
3.- Se identificó la posición de Bregma y se fijaron las coordenadas estereotáxicas para la
localización de los electrodos intracraneales.
4.- Se localizaron y marcaron, bajo guía estereotáxica, los puntos de inserción de los
electrodos intracraneales de registro y estimulación siguiendo las coordenadas del
atlas estereotáxico de Paxinos y Watson, (1986) (ver Figura 12).
5.- Se taladró la tabla ósea en los lugares marcados, respetando la duramadre, en un
diámetro que permitía el fácil ingreso de los electrodos.
6.- Previa extirpación de la duramadre, se insertaron los electrodos intracraneales hasta la
profundidad prevista.
Figura 11. Fotografía de los equipos utilizados durante las operaciones agudas y crónicas. El animal se ubicó
en un aparato estereotáxico y a ambos costados se colocaron los micromanipuladores empleados para implantar intracranealmente los electrodos de estimulación y registro.
MATERIALES y MÉTODOS 44
En los primeros registros extracelulares se emplearon pipetas realizadas en tubos de
borosilicato, utilizando un estirador de pipetas para su elaboración (modelo PE–2,
Narishige, Tokio, Japón) que contenía NaCl 2M como solución conductora. Las
resistencias de los electrodos fluctuaron entre 1 a 5 MOhmios.
Las pipetas se montaron en un micromanipulador (ME–7, Narishige) unidas a un
soporte de metacrilato, se recubrieron parcialmente con papel aluminio que se unió a la
tierra del sistema. Por el extremo libre de la pipeta se introdujo un alambre de plata en
cuyo extremo se conectó la entrada del amplificador (NEX – 1 Biomedical Engineering,
New York, EE.UU).
El adecuado control del ruido eléctrico del sistema de registro obtenido con el uso de
pipetas, permitió caracterizar los potenciales de campo de cada sitio que sería registrado
posteriormente de manera crónica.
Finalmente, se conectaron los electrodos con sus respectivos cables a los equipos de
registro y estimulación y toda la preparación se llevó a tierra, dando inicio a los diferentes
protocolos de estimulación, para caracterizar electrofisiológicamente el sitio de interés.
Figura 12. Vista dorsal del cráneo de una rata, colocada en un aparato estereotáxico. Como se describe en el procedimiento quirúrgico para animales agudos, se observa la separación del tejido subcutáneo y muscular del cráneo. Además, en el hueso parietal derecho se observan dos orificios, realizados para descender los
electrodos de estimulación y registro. El orificio más rostral corresponde al sitio de registro (Giro dentado) y el orificio más caudal es el sitio de estimulación (Vía perforante).
MATERIALES y MÉTODOS 45
3.3. REGISTRO DE LA ACTIVIDAD ELECTROENCEFALOGRÁFICA Y
CALIBRACIÓN DE LOS ESTÍMULOS ELÉCTRICOS
Las pipetas se implantaron en el cerebro bajo inspección visual de los potenciales
de campo evocados, con la ayuda de un osciloscopio digital. El protocolo de estimulación
empleado constó de estímulos de 0,1 a 5 mA de intensidad, 50 µs de duración y de 0,1 a 1
Hercios de frecuencia. Los electrodos de estimulación fueron bipolares, para minimizar la
zona estimulada y atenuar los artefactos de estimulación en la zona de registro (Delgado-
García, 1995). El montaje de los equipos de estimulación y registro permitió tener
movilidad independiente para cada electrodo, lo cual facilitó la localización de la zona de
registro. De modo que, una vez identificada por coordenadas estereotáxicas la capa que se
deseaba estudiar, se pudieron realizar perfiles electrofisiológicos descendiendo en pasos de
0,1 mm hasta localizar el sitio ideal, que correspondió al sitio donde los registros de campo
fueron de mayor amplitud empleando una mínima intensidad de estimulación.
Las señales electrofisiológicas se amplificaron diez veces con un preamplificador
acoplado a corriente continua (NEX -1, Biomedical Engineering). La señal preamplificada
se aumentó 100 veces y se filtró, con una amplitud de banda entre corriente continua y 10
KHercios con un amplificador multicanal (MCA -1 Biomedical Engineering). La
digitalización de la señal se realizó por medio de una unidad de digitalización Neuro
Corder, (DR – 890 Cyngus Technology, Nueva York, EE.UU.) y se almacenó en cintas de
vídeo (Fuji E-180) para, posteriormente, traspasar los datos a un ordenador, empleando una
tarjeta de adquisición (POWER 1401, Cambrige, Reino Unido) y un programa de análisis
comercial (Spike 2 CED, Cambrige, Reino Unido).
3.3.1 Protocolo experimental en animales agudos
El descenso de la pipeta se realizó lentamente de manera que el tiempo transcurrido
desde el inicio hasta la ubicación óptima del electrodo fue del orden de 50 – 60 minutos.
En este diseño experimental, se estudiaron los principales sitios de relevo sináptico
del hipocampo. A continuación se señala en primer término la zona de estimulación y
posteriormente el (los) sitio(s) de registro:
a) Vía perforante – Giro dentado
b) Vía perforante – Giro dentado y CA3
c) Giro dentado (fibras musgosas) – Piramidales de CA3
d) Colaterales de Schaffer – Piramidales de CA1
e) Vía perforante – Giro dentado, CA3 y CA1
MATERIALES y MÉTODOS 46
3.3.1.1 Registro de la actividad basal
Previo a las pruebas electrofisiológicas, se realizó un registro de dos minutos de la
actividad basal del hipocampo, controlando la presencia de actividad rítmica tipo theta,
característica del hipocampo.
3.3.1.2 Perfil de intensidades
El perfil de intensidades comenzó con valores subumbrales y a una frecuencia de
0,3 Hercios. Estos valores se incrementaron paulatinamente, hasta obtener la máxima
amplitud del campo, realizándose seis mediciones de un minuto cada una por cada animal.
Se construyeron curvas estímulo/respuesta aplicando intensidades crecientes. Sobre
esta curva se determinó el valor de intensidad de estimulación capaz de producir una
espiga poblacional semi-máxima que se empleó para la obtención de registros en la prueba
de pulsos pareados. (López-Planes y col., 1999)
3.3.1.3 Prueba de pulsos pareados
Esta prueba se utilizó para examinar la modulación de la excitabilidad celular a
corto plazo. (López-Planes y col., 1999; Yorns y col., 2004). La prueba consistió en el
cálculo de la diferencia entre una segunda respuesta postsinaptica (SRP) producida
brevemente después de una primera respuesta (PRP). La selección de diferentes
frecuencias de estimulación buscó establecer si existen cambios en la transmisión
sináptica, en los diferentes sitios de relevo sináptico del hipocampo. En los registros
obtenidos se tomó como parámetro para comparar, la pendiente del EPSP (siglas en inglés
de Excitatory Post Synaptic Potencial). En cada animal se registraron 10 pares de
respuestas en cada intervalo interpulsos de 10, 20, 30, 50, 100, 200 y 500 ms.
El IPP (índice de pulsos pareados) fue determinado al analizar el porcentaje de
cambio en la pendiente del EPSP de la segunda respuesta con respecto a la primera
respuesta (PPR) (Yorns, y col., 2004). Para ello se empleó la siguiente fórmula:
IPP = ((SRP – PRP)/ (PRP)) 100
Se realizaron cuatro ensayos de pulsos pareados. En los dos primeros se mantuvo la
frecuencia constante (0,3 Hercios) y se varió la intensidad de los estímulos. En los otros
dos ensayos se mantuvo la intensidad constante (valor medio del perfil de intensidades) y
se cambió la frecuencia de estimulación (1 y 5 Hercios, respectivamente).
MATERIALES y MÉTODOS 47
Se midió la variación de la pendiente del EPSP en ambos potenciales y el grado de
facilitación o inhibición se expresó en la relación porcentual de la amplitud de la espiga
poblacional del segundo potencial (SRP) en relación con el primero (PRP) (López-Planes y
col., 1999).
3.4. PROCEDIMIENTO QUIRÚRGICO PARA ANIMALES CRÓNICOS
Los primeros pasos quirúrgicos (del 1 al 5) fueron idénticos a los realizados en los
animales agudos. Las diferencias se detallan a continuación:
1.- Se localizaron y marcaron bajo guía estereotáxica los puntos de inserción de los
electrodos intracraneales de registro y estimulación. Se marcaron, además, los sitios para
insertar los tres tornillos (dos para el anclaje de las torretas y uno como referencia para los
electrodos de estimulación del hipocampo izquierdo).
2.- Se taladró la tabla ósea en los lugares marcados, respetando la duramadre.
3.- Se insertaron y aseguraron al cráneo los tornillos de anclaje, siendo recubiertos
por una capa de cianocrilato y, posteriormente, con cemento dental (Duralay, Worth, IL,
EE.UU.).
4.- Previa extirpación de la duramadre, se insertaron los electrodos intracraneales
hasta la profundidad prevista por las coordenadas estereotáxicas (ver Figura 16). La
posición dorso – ventral final de los electrodos de estimulación y registro se determinó por
inspección visual de los potenciales de campo provocados por estimulación con pulsos
simples y monitorizados en el osciloscopio.
5.- Una vez localizados en su posición definitiva, los electrodos, unidos a sus
respectivas torretas, se fijaron al cráneo con cemento dental (Duralay).
6.- Partiendo del extremo rostral de la incisión, se disecó un trayecto subcutáneo
hasta el borde libre del párpado superior del lado izquierdo. Se identificó la posición de la
rama supraorbitaria del trigémino y se ubicó en su proximidad dos electrodos de
estimulación, confeccionados en acero inoxidable recubiertos de Teflón (Du Pont de
Nemours, Boston EE.UU.) de un diámetro de 50 µm, con las puntas descubiertas y
dobladas en forma de arpón.
7.- En el mismo trayecto subcutáneo se identificó la posición de los músculos
orbiculares de los párpados superior e inferior y en ellos se situaron dos electrodos de
registro confeccionados en acero inoxidable recubiertos de Teflón® de un diámetro de 50
µm, con las puntas descubiertas y dobladas en forma de arpón. Los electrodos no afectaron
la posición ni la movilidad del párpado implantado en ningún caso.
MATERIALES y MÉTODOS 48
8.- Los extremos libres de los cuatro electrodos se soldaron a un terminal de
zócalos rectos (RS, Amidata, Madrid, España). Los sitios de unión se recubrieron con
esmalte de uñas y la torreta se fijó al cráneo con cemento dental (Duralay).
9.- Los extremos caudal y rostral de la incisión se suturaron con seda de 2-0,
usando puntos simples y separados. Al suturar se aproximaron al máximo los bordes libres
de la herida a la torreta. Todo el borde de la incisión de cubrió con una pomada cicatrizante
(Blastoestimulina, Almirall Prodesfarma, Barcelona, España).
En los animales crónicos, para la estimulación y registro de las estructuras
nerviosas, se probaron distintos tipos de electrodos metálicos, siendo finalmente
seleccionados los de tungsteno de 25 µm recubiertos con esmalte. En ambos tipos de
electrodos se emplearon dos cables trenzados, con sus puntas peladas y separadas diez
micras aproximadamente. Los extremos libres fueron soldados a conectores machos libres.
Los electrodos de estimulación se implantaron con la ayuda de un
micromanipulador Narishige, modelo M–3. Para estimular, se empleó un estimulador CS–
20 (Cibertec, Madrid, España) unido a una unidad de aislamiento modelo ISU- 165
(Cibertec). El resultado final de la operación se aprecia en la figura 14.
AB C
Figura 14. Se muestra el resultado final de la operación de implantes crónicos y la condición de registro de las ratas. La caja de metacrilato posee en la cara anterior agujeros que permiten el paso del sonido. Se
observan los tres cables unidos a cada tortea. La A corresponde a los cables de estimulación y registro del músculo orbicular de los párpados, la B es el cable de estimulación en el hipocampo y las tierras del sistema.
Finalmente, la letra C corresponde a los cables de registro de la actividad hipocampal.
MATERIALES y MÉTODOS 49
3.4.1. Recuperación, cuidados post-operatorios y habituación a las condiciones de
registro
Tras el procedimiento quirúrgico, los animales se recuperaron en unos 10 días antes
de iniciar los experimentos. En tres días sucesivos, durante la segunda semana de este
período, se condujo al animal a la sala de registro en una caja de plástico translúcido. Los
dos primeros días se mantuvo al animal sin conectar las torretas a los cables de
estimulación y registro. Las torretas se conectaron al tercer día. Las ratas se mantuvieron
en la caja de registro por intervalos de tiempo crecientes para habituarlas a las condiciones
experimentales.
Para los registros experimentales, se ubicaron las ratas en una caja de metacrilato,
especialmente diseñada para este experimento (Figura 3.5.). A cada conector [terminal de
zócalos rectos, (RS, Amidata)] situado en la cabeza del animal, se acopló un conector
complementario (terminal sin cubierta recto, de Tyco/Electronic, Amidata) soldado a un
conjunto de cables, que permitieron la estimulación del hipocampo y a la rama
supraorbitaria del trigémino y el registro de la actividad de campo del hipocampo y las
respuestas electromiográficas del músculo orbicular de los párpados. Este fue el diseño
más completo que se logró y fue empleado en aquellos animales que tuvieron tres sitios de
registro simultáneo en el hipocampo, tal como se detalla en la Figura 15.
Estimulación Rama trigemino
Registro EMGOrbicular de lospárpados
Registro sitioGiro dentado
Registro sitiopiramidales CA 3
Registro sitiopiramidales CA 1
Estimulación envía perforante
Tierras
R
L M
C
Figura 15. Esquema de la distribución de las torretas ubicadas en los animales crónicos. Cada cuadrado
envolviendo, a su vez, a cuatro cuadrados más, corresponde a un conector hembra que se fijo firmemente al cráneo del animal. Este orden corresponde a los animales crónicos que tuvieron tres sitios de registro.
Abreviaciones: R, L, M, y C: rostral, lateral, medial y caudal.
MATERIALES y MÉTODOS 50
Coordenadas estereotáxicas:
CA 3CA 1
G D
Stim. PP - 6.8 mm AP; -3.0 mm L; + 2.0 mm DV
- 3.3 mm AP; -3.2 mm L; + 3.2 mm DV
- 3.6 mm AP; - 1.2 mm L; + 3.4 mm DV
- 4.3 mm AP; - 2.8 mm L; + 2.0 mm DV
Figura 16. En el dibujo se señalan las coordenadas estereotáxicas utilizadas para los electrodos de estimulación y registro. Para el giro dentado (GD) fueron en el eje anteroposterior (AP) - 3.6 mm; en el eje lateral (L) –1.2 mm; y en el eje dorsoventral (DV) + 3.4 mm. Para el área CA3 fueron: - 3.3 mm AP; - 3.2 mm L; y + 3.2 mm DV. Para la región de CA1 fueron: - 4.3 mm AP; - 2.8 mm L y + 2.0 mm DV. Finalmente, para los electrodos de estimulación fueron: - 6.8 mm AP; - 3.0 mm L; y + 2.0 mm DV.
3.5. REGISTRO DE LAS ACTIVIDADES ELECTROMIOGRÁFICAS Y
ELECTROENCEFALOGRÁFICAS Y CALIBRACIÓN DE LOS ESTÍMULOS
ELÉCTRICOS
La actividad electromiográfica del músculo orbicular de los párpados se registró
con la ayuda de un amplificador diferencial (P511 AC Amplifier, GRASS, Instruments
Division, Astro-Med, Inc. West Warmick, RI, EE.UU.) que filtró la señal con una amplitud
de banda entre 10 Hz y 10 KHz, previa amplificación de 1000 veces.
La actividad electroencefalográfica del hipocampo se registro en tres
amplificadores diferenciales (P511 AC Amplifier, GRASS) en los cuales se filtró la señal
con una amplitud de banda entre 10 Hercios y 10 KHercios, previa amplificación * 1000.
Para determinar los estímulos a emplear en cada animal, en una sesión previa al
inicio de los experimentos de condicionamiento, se realizó un perfil de intensidades en el
MATERIALES y MÉTODOS 51
hipocampo y rama supraorbitaria del trigémino. Se seleccionó aquel estímulo que
equivaliese aproximadamente al 70% de la intensidad máxima empleada, para estimular en
el hipocampo y para provocar en el párpado un movimiento reflejo como un ligero
movimiento palpebral. Para cada animal experimental se registró y almacenó el tipo de
respuestas inducidas por ambos estímulos para establecer una referencia basal.
3.5.1. Registro de la actividad poblacional en la capa piramidal del área CA3 y CA1
del hipocampo
La actividad poblacional se registro a través de electrodos de tungsteno de 25 µm
desplazado a la capa piramidal del área CA3 y CA1 de manera independiente, la señal se
aumento 10 veces con un amplificador acoplado a corriente continua (NEX-1, de
Biomedical Engineering). La señal preamplificada se aumentó 100 veces y se filtró con
una amplitud de banda de 10 KHercios en un amplificador diferencial (P511 AC
Amplifier, GRASS).
3.5.2. Registro de la actividad poblacional en la capa granular del giro dentado del
hipocampo
La actividad poblacional se registro a través de electrodos de tungsteno de 25 µm
desplazado a la capa granular del giro dentado, la señal se aumento 10 veces con un
amplificador acoplado a corriente continua (NEX-1, Biomedical Engineering). La señal
preamplificada se aumentó 100 veces y se filtró con una amplitud de banda de 10
KHercios en un amplificador diferencial (P511 AC Amplifier, GRASS).
3.5.3. Protocolo experimental en animales crónicos
El protocolo experimental empleado en los animales crónicos una vez determinada
la localización definitiva de los electrodos de registro y estimulación fue la misma que se
empleó en los animales agudos. En cada animal, se realizaron registros de la actividad
basal del ritmo theta del hipocampo, series de pulsos pareados y perfiles de intensidad.
Esto permitió caracterizar cada sitio en la etapa preoperatoria y compararla con las posibles
variaciones que los registros pudieran sufrir al recuperarse el tejido nervioso de la acción
lesiva de los electrodos.
MATERIALES y MÉTODOS 52
3.6. GRUPOS EXPERIMENTALES CRÓNICOS Las ratas se dividieron en 6 grupos experimentales:
1) GRUPO I: Animales con cuatro electrodos de registro colocados en un sitio del
hipocampo.
a. Seis animales con implante de electrodos de registro en la región CA1 y
electrodos de estimulación en las colaterales de Schaffer.
b. Tres animales con implante de electrodos de registro en el giro dentado (GD,
células granulosas) y electrodos de estimulación en las fibras de la vía
perforante medial.
2) GRUPO II: Animales con dos sitios de registro en el hipocampo, de dos electrodos
cada uno.
a. Tres animales con implante de electrodos de registro en las regiones CA3 y
CA1. Los electrodos de estimulación estaban en la vía perforante medial.
b. Cinco animales con implante de electrodos de registro en la región CA3 y en
el giro dentado (GD) y electrodos de estimulación en la vía perforante
medial.
c. Tres animales con implante de electrodos de registro en el giro dentado (GD)
y la región CA1. Los electrodos de estimulación se colocaron en las fibras
de la vía perforante medial.
3) GRUPO III: Este grupo solo tuvo implantes de electrodos de registro en el músculo
orbicular de los párpados y se sometió a la prueba de condicionamiento clásico del
reflejo palpebral.
a. Dos animales se destinaron al seudocondicionamiento (control aprendizaje).
b. Dos fueron control normal, y
c. Dos recibieron tratamiento farmacológico (Ro 25-6981) durante el
condicionamiento.
4) GRUPO IV: Este grupo consistió en 7 animales con tres sitios de registro en
hipocampo (G.D., CA3 y CA1) que se sometieron a la prueba de condicionamiento
clásico del reflejo palpebral, además de pruebas de eficacia sináptica (LTP y LTD).
5) GRUPO V: 6 animales destinados a pruebas electrofisiológicas (LTD, siglas del
inglés long-term potentiation) y LTP (siglas del inglés long-term depression)
6) GRUPO VI: 6 animales destinados a pruebas farmacológicas (Ro 25-6981,
AV1625, CPP, NBQX)
MATERIALES y MÉTODOS 53
3.6.1. Condiciones generales para las sesiones de condicionamiento
Las sesiones de condicionamiento clásico comenzaron 9 a 10 días después de la
operación de implante de los electrodos intracraneales en el hipocampo y los electrodos de
estimulación y registro de los movimientos palpebrales.
Todas las sesiones tuvieron una duración aproximada de 35 min. Con el fin de
evitar ruidos que pudiesen alterar el aprendizaje, se utilizó como ruido blanco el producido
por el aparato de aire acondicionado en la habituación del registro, de unos 60 dB. Las
sesiones se realizaron en días consecutivos, y a la misma hora para cada animal.
La presentación de los distintos estímulos se controló por medio de un programa de
ordenador (Estimulador Multicanal de Pulsos Programable, EMDPP, Cibertec). Una tarjeta
de generación de pulsos, diseñada en el laboratorio, permitió establecer las características
de los estímulos condicionado e incondicionado, los intervalos entre estímulos, parejas de
estímulos y bloques de estimulación, para el paradigma de condicionamiento seleccionado.
3.6.2. Estructura general de los programas de condicionamiento
Un programa de condicionamiento está formado por tres fases sucesivas:
habituación, condicionamiento y extinción. Cada una de esas fases se llevó a cabo en
varias sesiones. En cada sesión se hicieron 60 presentaciones de estímulos o ensayos. El
intervalo entre ensayos consecutivos fue de 30 ± 5 s variando, en este rango, de forma
aleatoria. La fase de habituación se llevó a cabo en cuatro sesiones sucesivas. En todos los
ensayos de estas sesiones se presentó aisladamente el estímulo condicionado. Durante la
fase de condicionamiento se realizaron diez sesiones. Para poder apreciar mejor la
adquisición de la respuesta condicionada, en el primer ensayo de cada diez consecutivos,
se presentó únicamente el estímulo condicionado. En el resto de los ensayos se presentaron
los estímulos condicionado e incondicionado, asociados según el programa de
condicionamiento elegido. Finalmente, la fase de extinción consistió en cinco sesiones
donde se volvió a aplicar aisladamente el estímulo condicionado.
En el programa empleado se utilizó un intervalo interestímulos de 500 ms, lo que
permitió que a los 300 ms se programara un tercer estímulo dirigido al hipocampo,
aplicado a las colaterales de Schaffer o a la vía perforante, dependiendo del diseño
experimental, el cual generó un potencial de campo postsináptico en el área de registro
correspondiente.
MATERIALES y MÉTODOS 54
3.6.3. Paradigmas de condicionamiento empleados
3.6.3.1. Paradigma de traza: tono – choque eléctrico
En este tipo de paradigma, se presenta inicialmente el estímulo condicionado que
en este caso fue un tono de 50 ms de duración, con una frecuencia de 2.400 Hercios y una
intensidad de 85 dB (Gruart y col., 2006). Al cabo de 500 ms del inicio del sonido se
aplicó, como estímulo incondicionado, un choque eléctrico en la rama supraorbitaria del
nervio trigémino, de 500 µs de duración y con una intensidad suficiente para producir un
cierre consistente del párpado (ver detalle en la Figura 17 ).
500 ms
E IE C
EC =Tono de 50 ms, 2.400 Hercios y 85 dB
E I = Choque de 500 µs, 3 x Umbral
Figura 17. Representación esquemática del paradigma de condicionamiento empleado. EC indica el estímulo condicionado y EI el estímulo incondicionado.
3.6.3.2. Paradigma de Pseudocondicionamiento
En este paradigma los animales recibieron, en cada ensayo, dos estímulos con la
misma intensidad y duración que las indicadas en sección 3.6.3.1. pero presentados de
manera aleatoria de modo que el animal no puede establecer una asociación temporal entre
ellos.
3.7. PRUEBAS ELECTROFISIOLÓGICAS Y FARMACOLÓGICAS
Un total de 34 ratas se sometieron a pruebas de eficacia sináptica como la LTP y y
la LTD. Además se emplearon los siguientes fármacos:
1) Ro 25-6981 (Sigma) un antagonista específico de la subunidad NR2B de los
receptores de NMDA (Fischer y col., 1997; Pinard y col., 2001; Lynch y col., 2001) en la
prueba de LTD y LTP (Liu L, y col., 2004).
MATERIALES y MÉTODOS 55
2) NBQX: Es un antagonista específico de receptores de No-NMDA (AMPA)
(Svendsen y col., 1999; Kapuz y col., 2000), que se empleó en la prueba de LTP en
conjunto con
3) CPP, un fármaco antagonista de receptores NMDA (Harris y col., 1986;
Lehmann y col., 1987) que también se empleó en la prueba de LTP (Escobar y col., 1998).
4) Ifenprodil, un antagonista selectivo para la subunidad NR2B del receptor de
NMDA (Williams, K., 1993).
3.7.1 Protocolo empleado para inducir una potenciación a largo plazo (LTP)
Inicialmente se estableció un registro de línea base de quince minutos con estímulos
a una frecuencia de 0,2 Hercios, y con una duración del pulso de 50 µs. Transcurrido este
tiempo, se aplicó el protocolo de LTP que consistió en seis series de estimulaciones
tetánicas, donde cada serie estaba compuesta de cinco trenes de una frecuencia de 200
pulsos y una duración de 50 µs/pulso. Se dejó un intervalo inter-series de 1 min.
Posteriormente se volvió a la condición inicial y se registró durante dos horas.
3.7.2 Protocolo empleado para inducir una depresión a largo plazo (LTD)
Las características para evocar LTD son similares a lo antes señalado, también se
establece una línea base de quince minutos con estímulos a una frecuencia de 0,2 Hercios,
duración de 50 µs/pulso. Posteriormente, se aplicó durante 10 minutos un total de 600
pulsos a 1 Hercio a la misma intensidad de los pulsos control. Transcurrido este tiempo, se
restableció la frecuencia inicial y se registró durante dos horas.
3.7.3. Pruebas farmacológicas y condicionamiento
En las pruebas farmacológicas durante el condicionamiento con el antagonista
selectivo de la subunidad NR2B del receptor de NMDA (Ro 25-6981). La administración
se realizó en animales bajo dos condiciones:
- Animales que habían aprendido la asociación a los que se les inyectó el fármaco
en un período post condicionamiento de 10 días, durante los primeros 5 se les administró el
fármaco 30 minutos antes de iniciar la sesión y se suspendió su administración en los 5
días posteriores.
- Animales que no habían aprendido la asociación y se les inyectó el fármaco
durante todo el programa de condicionamiento. La dosis empelada en ambos casos fue de
10 mg/kg i.p. de Ro 25-6981 (Sigma, Madrid, España).
MATERIALES y MÉTODOS 56
3.8 ANÁLISIS DE DATOS
3.8.1. Generalidades
Todas las señales analógicas se procesaron on-line con una frecuencia de muestreo
de 11 KHercios, una ganancia de 2,5 y una resolución vertical de 12 bits, en una unidad
digitalizadora de ocho canales (NeuroCorder DR-890, NEURO DATA, Nueva York,
EE.UU). Bajo estas condiciones, las señales registradas se almacenaron en cintas de vídeo.
Los datos almacenados se traspasaron a discos compactos mediante el convertidor
analógico – digital (1401 plus, CED, Cambridge, Reino Unido). Los archivos generados
tuvieron las extensiones .smr que son compatibles con el programa comercial Spike2
(CED). Las señales grabadas fueron la actividad electroencefalográfica del hipocampo, la
electromiografía del músculo orbicular de los párpados y los perfiles de los estímulos
aplicados.
3.8.2 Parámetros analizados de la actividad del músculo orbicular de los párpados.
Se analizaron las variables de latencia, amplitud y área bajo la curva de las respuestas
reflejas y condicionadas del músculo orbicular de los párpados tras la estimulación
eléctrica de la rama infraorbitaria del nervio trigémino y sonido respectivamente. Las
mediciones de las variables de las respuestas reflejas y condicionadas de la musculatura
intrínseca se hicieron sobre el registro electromiográfico rectificado (EMGr), como se
ilustra en la Figura 18.
3.8.2.1 Parámetros de las respuestas condicionadas En este estudio se aplicaron los siguientes criterios para considerar un movimiento
palpebral como una respuesta condicionada. Así pues, se consideró como respuesta
condicionada a todo registro electromiográfico que tuviese un aumento significativo de la
amplitud y que fuese el resultado de un movimiento activo del cierre del párpado, durante
el intervalo interestímulos, con un valor del área bajo la curva del 90% mayor que la
actividad electromiográfica registrada en los 100 ms previos a la aparición del estímulo
condicionado.
3.8.2.1.1 Porcentaje de respuestas condicionadas
Para cada sesión se contabilizó el número de respuestas palpebrales que cumplían los
criterios antes señalados. Basándose en ello, se calculó el porcentaje de respuestas
condicionadas por el animal en cada sesión. También se calcularon los porcentajes de
MATERIALES y MÉTODOS 57
ensayos sin respuestas condicionadas y los ensayos eliminados. Cuando los animales
realizaron al menos el 60% de respuestas condicionadas en una sesión se consideró que
había cumplido con el criterio de aprendizaje.
1
3
4
5
6
7
8
EI
EC
Figura 18. Ejemplo de un registro de electromiografía rectificada (EMGr) en la que se incluye la respuesta condicionada y la respuesta incondicionada. En la ventana de tiempo se observa la presentación del estímulo condicionado (EC) y del estímulo incondicionado (EI). Los números corresponden a: (1) Período previo al
estímulo condicionado, (2) presentación del estímulo condicionado, (3) intervalo entre estímulo condicionado y el estímulo incondicionado, (4) Período posterior al estímulo incondicionado, (5) Latencia de inicio de la respuesta condicionada, (6) Latencia al pico máximo de la respuesta condicionada, (7) Amplitud máxima de
la respuesta condicionada, (8) Área bajo la curva de la respuesta condicionada.
3.8.2.1.2. Latencia al pico máximo de la respuesta condicionada.
La latencia al pico máximo de las respuestas en la musculatura orbicular se calculó
como el tiempo entre el inicio del estímulo y la máxima respuesta electromiográfica
rectificada en el intervalo entre el estímulo condicionado y el estímulo incondicionado
(número 3 en la Figura 18).
3.8.2.1.3. Latencia al inicio de la respuesta condicionada.
La latencia al inicio de las respuestas condicionadas se calculó como el tiempo
entre el inicio del estímulo y el incremento de la amplitud en la respuesta electromiográfica
rectificada (número 5 en la Figura 18).
MATERIALES y MÉTODOS 58
3.8.2.1.4. Amplitud máxima relativa de la respuesta condicionada.
Para determinar la amplitud máxima relativa de la respuesta condicionada, en todos
los ensayos de cada sesión se midió la amplitud máxima (en mV) de la actividad
electromiográfica rectificada en el período entre el estímulo condicionado y el estímulo
incondicionado (número 3 de la Figura 18) y la amplitud media (en mV) de la línea de base
(la actividad electromiográfica durante los 40 ms previos a la administración del estímulo).
Se calculó entonces la variación porcentual de la amplitud máxima con respecto a la
amplitud media de la línea de base.
3.8.2.1.5. Área relativa de la respuesta condicionada.
Para determinar el área relativa de la respuesta condicionada, en todos los ensayos
de cada sesión se midió el área bajo la curva (en mV × ms) de la actividad
electromiográfica rectificada en el intervalo entre el estímulo condicionado y el estímulo
incondicionado (número 3 de la Figura 18) y el área bajo la curva (en mV × ms) de la línea
de base (período de 40 ms previos a la llegada del estímulo). Para cada componente se
calculó entonces la variación porcentual del área bajo la curva con respecto a la línea de
base.
3.8.3. Cálculo de la variación de la pendiente en los registros de potenciales de campo
sinápticos en el hipocampo.
La pendiente de los EPSPs se calculó mediante un programa diseñado en el
laboratorio (por el Dr. R. Sánchez Campuzano) empleando el programa MatLab 12.0. Este
programa permitió promediar los valores de los potenciales de campo sinápticos y
seleccionar en la fase ascendente un período que comprende entre el 10% del inicio y el
10% final de la pendiente, evitando contabilizar las espigas poblacionales. El programa
permitió seleccionar los registros libres de interferencias. A este respecto, hay que recordar
que se realizaron las pruebas en animales despiertos y en movimiento, los análisis se
realizaron para cada sesión, pudiendo seleccionar también el número de sesiones a
analizar.
En este programa se consideraron un total de 19 parámetros de entrada, que fueron
incorporados ordenadamente antes de cualquier análisis:
1: NI, se refiere al número de individuos involucrados en el análisis
2: NS, se refiere al número de sesiones, ya sean de habituación, condicionamiento o
de extinción
MATERIALES y MÉTODOS 59
Figura 19. Ventana del programa MatLab, donde se observa que al ingresar los criterios solicitados se obtiene como resultado: A la izquierda, tres promedios de los potenciales de campo sinápticos en tres sitios
diferentes del hipocampo (mV v/s ms). A la derecha se muestran los promedios de las pendientes en dos puntos distintos de cada campo promediado (Mean Slope v/s Number).
3 y 4: R1 y R2, se refieren a las dos latencias (en segundos) de referencia (para el
primer canal del hipocampo)
5 y 6: R3 y R4, se refieren a las dos latencias (en segundos) de referencia (para el
segundo canal del hipocampo)
7 y 8: R5 y R6, se refieren a las dos latencias (en segundos) de referencia (para el
tercer canal del hipocampo)
9 y 10: R7 y R8, se refieren a las dos latencias (en segundos) de referencia (para el
cuarto canal del hipocampo)
11 y 12: r1 y r2, se refieren a los valores de desplazamiento del cursor (para el
primer canal)
13 y 14: r3 y r4, se refieren a los valores de desplazamiento del cursor (para el
segundo canal)
MATERIALES y MÉTODOS 60
15 y 16: r5 y r6, se refieren a los valores de desplazamiento del cursor (para el
tercer canal)
17 y 18: r7 y r8, se refieren a los valores de desplazamiento del cursor (para el
cuarto canal)
Y 19: (salvo). Si salvo = 1, entonces deben salvarse todas las salidas. Si salvo = 0,
entonces no se salvan las salidas independientes.
El programa garantizó el análisis de los valores reales obtenidos en los registros
electroencefalográficos y aseguró la repetición fiable de los análisis evitando los típicos
errores de cálculo visual.
3.8.4. Análisis estadístico
Para todos los análisis estadísticos se empleó el programa SigmaStat 3.0 (SPSS,
Inc., Chicago, IL, USA). Como índice de significancia estadística se utilizó un nivel de
probabilidad de P ≤ 0,05.
3.8.4.1 Experimentos de estimulación en hipocampo
En los potenciales de campo postsinápticos excitatorios se calculó el promedio y la
desviación estándar de cada pendiente.
Se realizó un análisis de regresión para establecer si existía alguna relación en los
valores de las pendientes de los potenciales de campo y los porcentajes de respuestas
condicionadas durante las diferentes condiciones de aprendizaje.
3.8.4.2 Experimentos de condicionamiento
En cada sesión de condicionamiento se calculó el promedio y la desviación estándar
para cada una de las variables estudiadas entre los animales que tuvieron el mismo
paradigma de condicionamiento.
Para cada variable se evaluó la existencia de tendencias evolutivas a lo largo del
programa de entrenamiento mediante un ANOVA de una vía para medidas repetidas.
Para determinar si estos cambios evolutivos eran debidos específicamente al
aprendizaje asociativo, se tomaron como referencia los valores obtenidos durante las
sesiones de pseudocondicionamiento. Las medidas de los parámetros de dicha variable en
las sesiones de condicionamiento se compararon con los valores de referencia, mediante un
ANOVA de dos vías para medidas repetidas, asociado con un procedimiento de Tukey.
MATERIALES y MÉTODOS 61
3.9. HISTOLOGÍA
Una vez finalizado el experimento, cada rata se anestesió con hidrato de cloral con
una dosis de 5 ml/kg por vía intraperitoneal. Se procedió a colocar al animal en posición
decúbito supino, en la mesa de perfusión. Se rasuró la región torácica abdominal para
posteriormente cortar la piel y la pared abdominal bajo el reborde costal. Empleando una
tijera se practicó una costotomía bilateral para exhibir las vísceras torácicas. Se seccionó
periféricamente el diafragma y se cortaron las costillas en ambos lados, retrayendo el peto
esternocostal sujeto con una pinza Keller dejando expuesto el corazón para visualizar el
ventrículo izquierdo. Se practicó una incisión en el ventrículo izquierdo introduciendo por
ella la cánula en dirección a la aorta ascendente. Se pinzó la aorta descendente y se cortó la
aurícula derecha, por donde fluyó libremente la solución salina. La presión del líquido de
perfusión fue semejante a la sistólica (13 mmHg). Se continuó la perfusión con el líquido
fijador (paraformaldehido al 4%), para la fijación del tejido nervioso.
Una vez concluida la perfusión, se extrajo el cerebro y se le retiraron las meninges,
siendo colocado en un tubo con paraformaldehido al 4% y almacenados en un refrigerador
a 4º C. (Fiaren y col., 1995)
En las 48 horas previas al corte en un micrótomo de congelación, los cerebros se
sumergieron en una solución de sacarosa al 17%. El cerebro se colocó sobre la plataforma
de congelación y se bañó con la solución de sacarosa, procurando su total congelación
antes de iniciar los cortes coronales seriados, que se realizaron con un espesor de 50 µm y
recogidos en una solución tampón fosfato sódico 0,1 M a pH 7,4. Posteriormente, los
cortes obtenidos fueron montados en portaobjetos gelatinizados y se dejaron secar durante
12 h, aproximadamente, para luego teñirlos con azul de toluidina al 0,5 %.
Las preparaciones histológicas se examinaron al microscopio óptico Zeiss (Carl
Zeiss, Oberkochen, Alemania) conectado a una cámara digital (Cool-Snap, Roper
Scientific GmbH, Munich, Alemania) para determinar la ubicación de los electrodos de
registro y estimulación, utilizando como referencia el atlas estereotáxico de Paxinos y
Watson (1986).
Resultados 62
4. RESULTADOS
Resultados 63
Resultados 64
4.1 CARACTERIZACIÓN DE LOS POTENCIALES DE CAMPO EVOCADOS EN
TRES SITIOS DE RELEVO SINÁPTICO DEL HIPOCAMPO
Con la finalidad de identificar correctamente los potenciales de campo provocados
en las neuronas del giro dentado y en las células piramidales de CA3 y CA1, se realizaron
perfiles en profundidad atravesando las diferentes láminas del hipocampo y registrando las
variaciones del potencial de campo que se generaba, a partir de la estimulación de la vía
perforante. En la Figura 4.1 se muestran ejemplos de potenciales de campo a diferentes
profundidades y sus relaciones anatómicas con las regiones neuronales determinadas por
coordenadas estereotáxicas.
Figura 4.1 Perfiles laminares del hipocampo, estimulando la vía perforante y registrando en CA1, CA3 y giro
dentado (G.D.). A la derecha del esquema se observa cómo el registro del campo se va invirtiendo desde la
región del soma (estratos oriens y radiatum) hacía la región de las dendritas distales (estrato lacunosum
moleculare), donde se obtiene el mayor flujo de corriente sináptica. A la izquierda se muestra un perfil en el
giro dentado en el que los primeros registros corresponden a las dendritas distales de las células granulosas;
posteriormente se invierte el potencial a la altura de los somas neuronales. Abreviaturas: E. Lac. Mol ., estrato lacunosum moleculare.
10 ms
0.5 mV
CA1
G.D.
10 ms
0.5 mV
E. Oriens
E. Radiatum
E. Lac. Mol.
E. Lac. Mol.
Hilus
Resultados 65
Los registros de los potenciales de campo provocados en el giro dentado se
realizaron a profundidades comprendidas entre los 100 a 130 µm buscando registrar en la
proximidad de los somas neuronales. Los potenciales de campo consistieron en una onda
inicial positiva (EPSP) sobre la cual podían montarse espigas poblacionales expresadas
como una onda aguda y negativa, a intensidades altas de estimulación. En el caso de los
registros de campo obtenidos en las células piramidales de CA3 y CA1 realizados a
profundidades de 100 a 150 µm, los potenciales consistieron en una onda inicial positiva
(EPSP) sobre la cual se monta una espiga poblacional expresada como una onda aguda y
negativa. La morfología del registro varió dependiendo de la profundidad del electrodo de
registro (ver Figura 4.1), siendo mayor su amplitud cuando éste se localizó en las dendritas
apicales. En términos generales, los perfiles de profundidad mostraron que los flujos de
corrientes en las regiones de las dendritas apicales se comportan como sumideros de
corriente, en cambio en las proximidades de los somas se comportan como fuentes de
corriente, lo que se explica por que estas sinapsis se ubican en las dendritas apicales.
Para la obtención de estos registros, el diseño del modelo experimental empleado
permitió desplazar de manera independiente los electrodos de estimulación y registro, lo
cual facilitó la selección de aquellas sinapsis que son específicamente estimuladas por las
fibras aferentes. Gracias a ello, las intensidades de estimulación empleadas fueron bajas
(rango de 0,2 a 0,4 mA) evitando activar un número mayor de interneuronas, adyacentes a
los estratos de los somas de las neuronas principales del hipocampo.
4.2 CARACTERIZACIÓN DE LAS RESPUESTAS CONDICIONADAS DURANTE
LAS PRUEBAS DE APRENDIZAJE ASOCIATIVO Y DE
PSEUDOCONDICIONAMIENTO
4.2.1 Porcentaje de respuestas condicionadas ejecutadas por sesión
Como se ilustra en la Figura 4.2 los animales control presentaron una curva normal
de aprendizaje, las cuales se han descrito en trabajos previos para ratones (Gruart y col.,
2006, 2008; Madroñal y col., 2007) y ratas (Servatius, 2000). Durante la etapa de
habituación, los animales control presentaron valores de respuestas condicionadas similares
a los obtenidos en los animales pseudocondicionados (6,77 ± 1,60 y 6,94 ± 1,18,
Resultados 66
respectivamente).
En la evolución de su aprendizaje, los animales condicionados presentaron un
promedio de 34,58 ± 5,67 % de respuestas durante la cuarta sesión de condicionamiento.
Este porcentaje fue incrementándose de manera asintótica hasta llegar a valores mayores a
60 % de respuestas condicionadas en las sesiones 9 y 10 de condicionamiento. Durante la
fase de extinción se produjo una disminución del porcentaje de respuestas condicionadas
(13,01 ± 3,64 en la cuarta sesión). En cambio, los animales pseudocondicionados tuvieron
un bajo rendimiento a lo largo de todo las etapas del condicionamiento y nunca lograron
sobrepasar el 7 % de respuestas condicionadas durante las sesiones de entrenamiento.
Figura 4.2 Curva de aprendizaje expresado como el porcentaje de respuestas condicionadas en los grupos
condicionado y pseudocondicionado, durante las sesiones de habituación, condicionamiento y extinción. Se
obtuvieron diferencias significativas entre ambos grupos en todas las sesiones de condicionamiento y
extinción, a excepción de la sesión 4 de extinción (F (18,54) = 32,34, P < 0,001).
* * * * * * * * * * * * * *
Resultados 67
Considerando que todos los animales pseudocondicionados tuvieron respuestas
reflejas normales en respuesta a los estímulos eléctricos de la rama supraorbitaria del
trigémino, la ausencia de respuestas condicionadas no se debió a ningún problema en la
cirugía de implante de electrodos o a errores técnicos en los equipos de registro. Los
porcentajes de respuestas condicionadas de los animales control comparados con los
animales pseudocondicionados fueron estadisticamente diferentes (P < 0,001, ANOVA de
dos vías, F (18, 54) = 32,34).
4.2.2 Área bajo la curva de las respuestas condicionadas
La evolución del área bajo la curva de las respuestas condicionadas de ambos
grupos estudiados se muestran en la Figura 4.3, durante las sesiones de habituación,
condicionamiento y extinción. Se entiende como el área bajo la curva la presencia de
componentes estables del registro electroencefalográfico que corresponden a la respuesta
condicionada. Dicha respuesta se midió en el registro del electromiograma como la
variación con respecto a la línea base. Durante la sesiones de habituación, no se observaron
diferencias significativas entre ambos grupos (ANOVA dos vías, t ═ 1,507, P < 0,01). En
las primeras cinco sesiones de condicionamiento tampoco se obtuvieron diferencias
significativas. Las diferencias empezaron a manifestarse a partir de la sexta sesión,
incrementándose hasta la sesión 10. Finalmente, en las sesiones de extinción, aun cuando el
área bajo la curva disminuyó, sus valores siguieron siendo significativamente mayores a los
encontrados en el grupo pseudocondicionado. En el caso del grupo pseudocondicionado,
los valores promedios de las áreas bajo la curva se mantuvieron relativamente constantes
durante las sesiones de habituación, condicionamiento y extinción.
4.2.3 Amplitud máxima de las respuestas condicionadas
Como se ilustra en la Figura 4.4, la evolución de la amplitud máxima de las
respuestas condicionadas durante el paradigma de traza, se mantuvo durante la etapa de
habituación sin diferencias entre los grupos control (condicionado) y el
pseudocondicionado. La amplitud máxima de las respuestas condicionadas se determinó en
el registro electromiográfico del músculo orbicular de los párpados. Durante la mitad del
condicionamiento tampoco se observaron diferencias significativas; pero a partir del sexto
día de condicionamiento aparecieron diferencias entre ambos grupos (F (18,72) = 1,965; P <
Resultados 68
0,023). Estas diferencias se mantuvieron hasta finalizar las sesiones de condicionamiento y
durante la primera sesión de extinción. Posteriormente, la amplitud de las respuestas
condicionadas disminuyó a valores similares a los encontrados durante la primera parte del
condicionamiento. Aún cuando la amplitud de las respuestas condicionadas fue
incrementando paulatinamente durante la segunda parte del condicionamiento, sólo al final,
en la sesión 10, alcanzó su valor porcentual máximo: 1243,45 ± 34,26 (mV x ms).
Figura 4.3 Evolución de la variación del área bajo la curva de las respuestas condicionadas expresada en porcentaje. Las respuestas se obtuvieron durante las sesiones de habituación, condicionamiento y extinción
para el condicionamiento clásico del reflejo palpebral. Los datos se obtuvieron de animales condicionados (n
= 5) y pseudocondicionados (n = 5) y se encontraron diferencias significativas a partir de la sesión 6 de
condicionamiento hasta la sesión 5 de extinción (F (18,72) = 3,29, P < 0,001). El área bajo la curva se expresa
como el porcentaje de aumento con respecto a los valores de la línea base, calculado en el registro
electromiográfico del músculo orbicular de los párpados. Los círculos corresponden a los valores promedios y
sus desviaciones estándar para ambos grupos.
1 5 10
Condicionamiento o Pseudocondicionamiento
* * * * * * * ** *
Resultados 69
Esta variación de la amplitud máxima de la respuesta condicionada está
estrechamente relacionada con la prueba de aprendizaje, debido a que los animales
pseudocondicionados no mostraron ningún tipo de variación con respecto a los valores
promedios de sus respuestas condicionadas durante las sesiones de condicionamiento.
Figura 4.4 Evolución temporal de las variaciones de amplitud de las respuestas condicionadas durante las
sesiones de habituación, condicionamiento y extinción. A partir de la sesión 6 de condicionamiento se
obtuvieron diferencias estadísticamente significativas entre ambos grupos (F (18,72) = 1,965 ; P < 0,023), las
cuales se mantuvieron hasta la primera sesión de extinción. La amplitud de la respuesta condicionada se
expresa como el porcentaje de aumento con respecto a los valores de la línea base en el registro
electromiográfico del músculo orbicular de los párpados. Los círculos corresponden a los valores promedios,
con indicación de los errores estándar para ambos grupos.
* * * * * *
Resultados 70
4.2.4 Latencia de inicio y al pico máximo de las respuestas condicionadas
Se analizaron tanto la latencia de inicio, como la latencia al pico máximo de las
respuestas condicionadas en los registros electromiográficos del musculo orbicular del
grupo condicionado durante las sesiones de condicionamiento y extinción. No se incluyeron
las sesiones de habituación porque en ellas no se presentaron respuestas condicionadas,
sino más bien repuestas tipo alfa o de sensibilización (ver Gruart y col., 1995). En lo que
respecta a las latencias al pico máximo de la respuesta condicionada (ver Figura 4.5), al
inicio de las sesiones de condicionamiento los valores de las latencias fueron cercanos a los
400 ms pero a medida que transcurrieron las sesiones de condicionamiento sus valores
disminuyeron progresivamente. En el caso de la sesiones de extinción, se observó la
tendencia inversa. Es decir, hubo un incremento progresivo pero que no alcanzó los valores
de las primeras sesiones de condicionamiento. La misma tendencia se observó en las
latencias al inicio de la respuesta condicionada (ver Figura 4.6) en las que inicialmente los
valores fueron cercanos a los 320 ± 20 ms. Pero a medida que transcurrieron las sesiones,
se observó una disminución en la latencia de la respuesta condicionada respecto del
estímulo condicionado (condicionamiento 10 = 200 ± 30 ms)
Figura 4.5 Gráfico que muestra los valores promedios y sus errores estándar de las latencias al pico máximo
de la amplitud de las respuestas condicionadas (RC) en las sesiones de condicionamiento dos y nueve (C2 y
C9) y los valores recogidos en las sesiones de extinción dos y cuatro (E2 y E4).
Latencia al Pico de la RC (m
s)
0
100
200
300
400
C2 C9 E2 E4
Resultados 71
Figura 4.6 Gráfico que muestra los valores promedios y sus errores estándar de las latencias al inicio de las
respuestas condicionadas (RC) en las sesiones de condicionamiento dos, cinco y nueve (C2, C5 y C9) y los
valores recogidos en las sesiones de extinción dos y cuatro (E2 y E4).
4.2.5 Características electromiográficas de las respuestas condicionadas
En la parte superior de la Figura 4.7 se ilustra el protocolo de traza empleado para el
condicionamiento clásico del reflejo palpebral. Este protocolo de condicionamiento clásico
consiste en la aplicación de un estímulo condicionado (tono 20 ms, 2.400 Hercios y 85 dB)
distanciado 500 ms del estímulo incondicionado que fue un choque eléctrico de 500 µs, tres
veces el umbral de activación y con una intensidad menor de 1 mA. En la parte intermedia
de la misma figura se ilustra el estímulo eléctrico que se aplicó en el hipocampo, a los 300
ms del inicio del estímulo condicionado, con una duración de 50 µs.
En la Figura 4.7 se muestran también ejemplos de respuestas electromiográficas
registradas en un animal experimental durante las diferentes etapas del condicionamiento.
En la fase de habituación se observó que en el espacio interestímulo no hubo actividad
electromiográfica, sólo un ligero incremento en respuesta al estímulo condicionado. En el
tercer día de condicionamiento se evidenció una respuesta en el espacio entre los estímulos
condicionados e incondicionados (ver flecha con N° 1). Dicha respuesta fue de baja
amplitud y área bajo la curva. En la misma sesión también se observa la respuesta refleja al
Latencia de inicio de la RC (m
s)
Resultados 72
Figura 4.7 En la parte superior de la figura se representa el paradigma experimental empleado para el
condicionamiento clásico del reflejo palpebral, el cual incluye la aplicación de un estímulo condicionado (EC)
y uno incondicionado (EI). En la figura se indican las características de ambos estímulos. En el intervalo entre
ambos estímulos se aplicó un pulso simple (100 µs, cuadrado y bifásico) en el hipocampo. Abajo en la figura
se muestran ejemplos de los registros electromiográficos obtenidos en un mismo animal durante las diferentes
sesiones de habituación (Habit 2), condicionamiento (Condi 3 y 9) y extinción (Extinc 4). Nótese cómo el
tamaño de la respuesta condicionada se incrementa hacia las sesiones finales del condicionamiento y
desaparece en la extinción.
50 ms
Habit 2
Condi 3
Extinc 4 O.O. EMG
EC
EI
1 2
3 4
Resultados 73
estímulo incondicionado (ver flecha con N° 2). Hacia el día nueve de condicionamiento se
observó que la respuesta condicionada se incrementó, involucrando una mayor cantidad de
unidades motoras, implicando un aumento del área bajo la curva (ver flecha N° 3). Como se
puede ver la respuesta refleja se mantuvo presente (ver flecha N° 4). Finalmente, en la
sesión cuatro de la extinción se observó la ausencia de respuestas condicionadas.
Así pues, durante la prueba de condicionamiento clásico del reflejo corneal con un
paradigma de traza, los animales experimentales modificaron las respuestas condicionadas,
incrementando la amplitud y duración de las mismas, lo cual implica que las conexiones
sinápticas se potenciaron, pudiendo involucrar un mayor número de unidades motoras o
mejorando la eficacia en la transmisión sináptica.
4.3 CÁLCULO DE LA VARIACIÓN DE LA PENDIENTE EN LOS REGISTROS
DE POTENCIALES DE CAMPO SINÁPTICOS EN EL HIPOCAMPO, DURANTE
EL CONDICIONAMIENTO CLÁSICO DEL REFLEJO PALPEBRAL
Los potenciales sinápticos de campo (siglas en inglés: fEPSP) provocados en las
sinapsis del giro dentado, y en las de las piramidales de CA3 y CA1, por la aplicación de un
pulso simple en la vía perforante homolateral, se registraron en paralelo con la adquisición
de una respuesta condicionada con el paradigma de traza para el condicionamiento clásico
del reflejo palpebral. Estos fEPSPs presentaron un comportamiento inverso en las sinapsis
del giro dentado y CA3 con respecto a las de CA1. En los dos primeros casos, se observó
una facilitación mientras que, en el caso de las piramidales de CA1, se observó una
inhibición (ver Figura 4.8). De acuerdo con recientes estudios (Gruart y col., 2006;
Madroñal y col., 2007; Whitlock y col., 2006) estas modificaciones a nivel sináptico están
relacionados con la generación de las respuestas palpebrales aprendidas. Las diferencias
entre los tres sitios se observaron a partir de la primera sesión de condicionamiento, con
una mayor pendiente en el caso de las piramidales de CA3 y en menor medida en el giro
dentado. Estas diferencias se mantuvieron entre los tres sitios hasta la sesión 8 de
condicionamiento, posteriormente las piramidales de CA3 decrecen en sus valores y
pierden significancia respecto de las células granulosas del giro dentado que continúan
incrementando sus valores (F (36, 108) = 8,419, P = 0,001).
Resultados 74
En el caso de las piramidales de CA1, su descenso comienza en la primera sesión en
valores de un 25% por debajo de la línea base. Estas diferencias se acentúan con el
transcurrir de las sesiones de condicionamiento y experimentan un incremento a partir de
las sesiones de extinción, logrando aproximarse a los valores registrados en la etapa de
habituación.
4.4 EFECTO DEL FÁRMACO RO 25-6981 EN ANIMALES SOMETIDOS A LA
PRUEBA DE CONDICIONAMIENTO CLÁSICO DEL REFLEJO PALPEBRAL
En este experimento contamos con dos grupos controles, los animales normales a
los cuales se les inyectó el vehículo (dimetil sulfóxido, DMSO, intraperitoneal) y los
animales pseudocondicionados a quienes también se les inyectó DMSO mas un grupo
experimental que recibió dosis diarias de un antagonista específico de la subunidad NR2B
del receptor NMDA (Ro 25-6981).
Durante la fase de habituación, no se obtuvieron diferencias estadísticamente
significativas entre los tres grupos. Sin embargo, a partir de la primera sesión de
condicionamiento, se observó que tanto el grupo experimental como el pseudocondicionado
tuvieron diferencias estadísticamente significativas, respecto del grupo control (ANOVA
dos vías, control frente pseudocondicionado t = 27,451 P < 0,01; control frente a
experimental t = 26,443 P < 0,01). Estas diferencias se mantuvieron durante las diez
sesiones de condicionamiento y las cinco de extinción.
Otra aproximación experimental empleada fue la administración de un antagonista
de la subunidad NR2B del receptor NMDA (Ro 25-6981) en animales que previamente
habían aprendido a asociar dos estímulos en el paradigma de traza del condicionamiento
clásico del reflejo palpebral. Esta inyección se realizó durante cinco días del período de
recondicionamiento (ver Figura 4.10). Los resultados obtenidos demuestran que los
animales que recibieron el fármaco durante los primeros cinco días de la etapa de
recondicionamiento sufrieron una inhibición en la capacidad de expresar la respuesta
condicionada, presentando porcentajes de respuestas condicionadas similares a los
obtenidos en la etapa de habituación. De hecho, el porcentaje de respuestas condicionadas
Resultados 75
durante estos cinco días presentó diferencias estadísticamente significativas respecto del
grupo control (F (9,45) = 27,34; P < 0,001).
Una vez que se les suspendió la administración del fármaco, los animales
experimentales aumentaron sus porcentajes de respuestas condicionadas aproximándose a
los valores del grupo control, pero siendo incapaces de lograr los porcentajes alcanzados
por dicho grupo (F (9,45) = 27,34; P < 0,001).
Figura 4.8 Evolución de los potenciales de campo evocados en el giro dentado (triángulos blancos),
piramidales de CA3 (triángulos negros) y piramidales de CA1 (triángulos rojos) por pulsos simples aplicados
a la vía perforante, durante las sesiones de habituación, condicionamiento y extinción. Se obtuvieron
diferencias significativas entre las tres regiones desde la sesión 1 a la 8 del condicionamiento. (F (36, 108) =
8,419, P = 0,001). Desde la sesión 9 de condicionamiento a la 5 de extinción se mantuvieron diferencias entre
el giro dentado y las piramidales de CA1 y entre las sesiones 9 de condicionamiento y 3 de extinción las
diferencias fueron entre las piramidales de CA1 y CA3. Asteriscos = * diferencia significativa entre CA3 y
CA1 (P < 0,001), ** diferencia significativa entre CA1 y giro dentado (P < 0,001), *** diferencia
significativa entre CA3 y giro dentado (P < 0,001).
75
50
100
125
150
170
ExtinciónCondicionamiento
Pendiente fEPSP (% de la línea base)
******
******
******
******
******
******
******
****** *** *** *** *** *** ** **
Resultados 76
Figura 4.9 Evolución de los porcentajes de respuestas condicionadas durante las sucesivas sesiones de aprendizaje (habituación, condicionamiento o pseudocondicionamiento y extinción) en ratas condicionadas,
pseudocondicionadas y ratas inyectadas con Ro 25-6981. Las diferencias entre el grupo condicionado y los
grupos pseudocondicionados y Ro 25-6981 fueron estadísticamente significativas en todas las sesiones de condicionamiento y extinción (asteriscos, P < 0,01). Abreviatura: DMSO, dimetil sulfóxido.
También se realizaron algunos estudios preliminares con el antagonista selectivo de
la subunidad NR2B del receptor NMDA ifenprodil (a una dosis de 10 mg/kg de peso, i.p.),
obteniéndose resultados similares a los descritos para el RO25-6981. Dado el pequeño
tamaño de la muestra, no se analizaron estadísticamente los resultados obtenidos
0
1 4
Habituación
Respuestas condicionadas (%)
20
40
60
80
100
Extinción
1
Condicionamiento yPseudocondicionamiento
5 10 1 5
* ** * ** * ** *** * **
Pseudo (DMSO)
Control (DMSO)
Ro 25-6981
Resultados 77
Figura 4.10 Efectos del fármaco Ro 25-6981 durante el recondicionamiento. Un grupo de animales se inyectó
con Ro 25-6981 (10 mg/kg, i.p., círculos negros) durante las cinco primeras sesiones. Se observaron
diferencias significativas entre los controles (círculos blancos) y los animales inyectados en las cinco primeras
sesiones de recondicionamiento (F (9,45) = 27,34 ; P < 0,001). Desde la sexta sesión en adelante, se suspendió
la administración del fármaco. En esta situación, los animales incrementaron su tasa de respuestas
condicionadas, pero fueron incapaces de alcanzar los valores del grupo control.
En paralelo con el estudio de la generación de las respuestas condicionadas, se
estudiaron las variaciones en los potenciales sinápticos de campo provocados en las células
del giro dentado por la estimulación con pulsos eléctricos simples de la vía perforante
medial a los 300 ms después de aplicado el estímulo condicionado (ver Figura 4.7). Los
fEPSPs inducidos en los dos grupos (control y experimental) incrementaron
progresivamente su pendiente, respecto de los valores basales establecidos con las
pendientes registradas en las sesiones de habituación. Este incremento alcanzó valores
cercanos al 125% durante las últimas sesiones. Se obtuvieron diferencias estadísticamente
significativas a partir de la sesión cuatro hasta la diez (F (18,90) = 54,32; P < 0,01), cuando se
compararon con los valores obtenidos en la habituación. Sin embargo, si se comparan
01 4
Habituación
Respuestas condicionadas (%)
20
40
60
80
100
1
Recondicionamiento5 10
Extinción1
Condicionamiento 5 10 1 5
* * * **
Resultados 78
ambos grupos en las distintas sesiones de habituación, condicionamiento y extinción, no se
obtuvieron diferencias estadísticamente significativas (F (18,90) = 0,37; P = 0,741).
Por otra parte, los potenciales evocados registrados durante las cinco primeras
sesiones de recondicionamiento en el grupo experimental fueron significativamente
menores a los valores obtenidos en el grupo control (F (9,45) = 83,04; P < 0,001).
Figura 11. Evolución de los potenciales sinápticos de campo evocados (fEPSP) en el giro dentado por pulsos
simples aplicados a la vía perforante en animales control (triángulos blancos) y animales inyectados con un
antagonista selectivo de la subunidad NR2B del receptor NMDA(Ro 25-6981, triángulos negros), durante las
sesiones de habituación, condicionamiento, extinción y recondicionamiento. Sólo en los primeros cinco días
de recondicionamiento se les inyectó Ro 25-6981 (10 mg/kg i.p.). Arriba se muestran ejemplos de fEPSPs
recogidos de ambos grupos experimentales en las sesiones indicadas por las flechas.
En estos experimentos, se analizó también la relación entre el porcentaje de
respuestas condicionadas y los valores de las pendientes de los potenciales de campo,
encontrando que estaban relacionados linealmente (r ≥ 0,75, P < 0,001) a lo largo de las
sesiones de condicionamiento (pendiente, 1,78), extinción (pendiente, 1,11) y
recondicionamiento (pendiente, 1,04), pero no con la habituación (ver Figura 4.12).
75
501 4
Habituación
100
125
150
1
Recondicionamiento5 10
Extinción1
Condicionamiento 5 10 1 5
* * * **
Pendiente fEPSP (% de la línea base)
5 ms0.5 mV
Resultados 79
Por otro lado, de el grupo experimental (que recibió la administración del Ro 25-
6981) no sólo no se pudo readquirir la respuesta condicionada ni la potenciación del fEPSP,
sino que tampoco se pudieron establecer diferencias significativas entre el porcentaje de
respuestas condicionadas y el valor de las pendientes de los fEPSPs (r = 0,36; P = 0,689;
ver Figura 4.13).
Figura 4.12 Análisis cuantitativo de la relación entre el porcentaje de respuestas condicionadas y las pendientes de los potenciales sinápticos de campo provocados (fEPSP) para el grupo control. Cada punto
representa el valor medio de sólo un animal durante la correspondiente sesión: habituación (triángulos
negros), condicionamiento (círculos negros), extinción (cuadrados negros) y recondicionamiento (círculos
blancos). Las líneas de regresión y sus correspondientes ecuaciones se incluyen sólo para coeficientes de
correlación estadísticamente significativos (P ≤ 0,05 y de un valor de r > 0,6).
Respuestas condicionadas (%)
20
050 75 100 125 150
40
60
80
100
Pendiente fEPSP (% de la línea base)
Y = -76,84 + 1,11x; = 0,76, < 0,001r P
Y = -165,9 + 1,78x; = 0,81, < 0,001 r P
Y = -62,83 + 1,04x; = 0,75, < 0,001r P
r P = 0,01, = 0,974
Resultados 80
Figura 4.13 Análisis cuantitativo de la relación entre el porcentaje de respuestas condicionadas y las
pendientes de los potenciales de campo (fEPSP) para el grupo inyectado con Ro 25-6981, un antagonista
selectivo de la subunidad NR2B de los receptores NMDA. Cada punto representa el valor medio de sólo un
animal durante la correspondiente sesión: habituación (triángulos oscuros), condicionamiento (círculos
oscuros), extinción (cuadrados oscuros) y recondicionamiento (círculos claros). Las líneas de regresión y sus
correspondientes ecuaciones sólo se incluyen para coeficientes de correlación estadísticamente significativos
y de r > 0,6. Los resultados obtenidos en las primeras cinco sesiones de recondicionamiento, durante las
cuales se les inyectó Ro 25-6981, se indican por la flecha (círculos sombreados). Nótese que no hay una
relación lineal entre las respuestas condicionadas y las pendientes de los fEPSP (r > 0,36, P = 0,689) en los
animales inyectados con Ro 25-6981 durante las primeras cinco sesiones de recondicionamiento.
4.5 EFECTO DEL FÁRMACO RO 25-6981 EN LA PRUEBA
ELECTROFISIOLÓGICA DE POTENCIACIÓN A LARGO PLAZO
Este experimento se diseño para determinar qué papel desempeña la subunidad
NR2B del receptor NMDA en la potenciación a largo plazo evocada in vivo en las células
granulares del hipocampo, estimulando en la vía perforante medial. Se formaron tres grupos
de animales. Aquellos que recibieron una dosis única del antagonista Ro 25-6981 fue el
Respuestas condicionadas (%)
20
050 75 100 125 150
40
60
80
100
Pendiente fEPSP (% de la línea base)
Y = -32,34 + 0,74x; = 0,65, < 0,001 r PY = -76,94 + 1,05x;
= 0,67, < 0,001r P r P = 0,36, = 0,689
Y = -98,64 + 1,33x; = 0,74, < ,.001 r P
r P = 0,01, = 0,861
Resultados 81
grupo experimental. Además se realizaron dos grupos controles: uno que recibió una
inyección del vehículo (DMSO) y otro que no recibió ningún tratamiento previo. Como se
ilustra en la Figura 4.14, tras registrar la línea base durante 15 min se aplicó un protocolo
de potenciación a largo plazo. Se obtuvieron incrementos del orden de los 250% a 300% en
los valores promedio de las pendientes de los potenciales de campo (fEPSPs) registrados,
todas estadísticamente significativas respecto de los valores obtenidos en la línea basal
(ANOVA de dos vías, F(10,50) = 140,7; P ≤ 0,01). Sin embargo, no se obtuvieron diferencias
estadísticamente significativas entre los grupos, comportándose los tres de manera similar.
En el caso del grupo experimental se puede señalar que el valor de la pendiente porcentual
máxima fue menor comparada con los otros grupos y su descenso se produjo a los 80 min
de registro. El grupo control y el grupo DMSO tuvieron valores mayores en las variaciones
de la pendiente pero presentaron descensos diferenciados: el grupo control inició su
descenso a los 50 minutos de registro y el grupo DMSO pasados los 80 min. En los tres
casos, los animales recuperaron los valores basales al final de los 110 minutos.
4.6 EFECTO DEL FÁRMACO RO 25-6981 EN LA PRUEBA
ELECTROFISIOLÓGICA DE DEPRESIÓN A LARGO PLAZO
La prueba complementaria a la potenciación a largo plazo, es la depresión a largo
plazo (o LTD, del inglés long-term potentiation) ya que en ella también participan los
receptores de glutamato del tipo NMDA. Empleando los mismos grupos experimentales, se
estableció la línea base durante 15 minutos con estímulos de baja frecuencia (0,3 Hercios).
Posteriormente, se indujo una depresión a largo plazo empleando un protocolo de estímulos
a baja frecuencia (600 pulsos a 1 Hercio) por diez minutos.
Sólo los grupos control y DMSO experimentaron un descenso en los valores de las
pendientes, alcanzando valores del 60%, estableciendo diferencias estadísticamente
significativas respecto del grupo que recibió el fármaco Ro 25-6981. El grupo control
experimento una LTD que duró aproximadamente 60 min, mientras que el grupo que
recibió el vehículo DMSO tuvo una LTD cercana a los 110 min. Por otro lado, el grupo que
recibió el antagonista selectivo de la subunidad NR2B no experimento una depresión a
largo plazo. Desde el punto de vista estadístico, se obtuvo que el grupo Ro 25-6981 no
presentó diferencias al compararse con los valores basales; en cambio, los grupos control y
Resultados 82
DMSO presentaron diferencias estadísticamente significativas (P ≤ 0,01; ANOVA de dos
vías, F (10,50) = 82,1) en los valores de las pendientes de los potenciales de campo evocados,
al compararlos con los valores de la línea basal.
Figura 4.14 Efecto del fármaco Ro 25-6981, antagonista selectivo de la subunidad NR2B de los receptores de NMDA, en la potenciación a largo plazo in vivo medido como la evolución de la pendiente de los potenciales
de campo provocados (fEPSPs) con pulsos de baja frecuencia. A, en tres series experimentales se indujo un
protocolo de potenciación a largo plazo (LTP) en los tres grupos de animales. Arriba se ilustran ejemplos de
registros de fEPSPs recogidos durante los tiempos (línea base, 1 y 2) indicados en A. B, los valores de las
medias obtenidas para los grupos control (n = 10), DMSO (n = 4) y Ro 25-6981(n = 5) fueron
estadísticamente diferentes de los valores de la línea basal (P ≤ 0,01, ANOVA de dos vías, F(10,50) = 140,7)
pero no hubo diferencias estadísticamente significativas si se comparan los grupos entre sí. Abreviatura:
DMSO, dimetil sulfóxido.
4.7 INDUCCIÓN DE POTENCIACIÓN Y DEPRESIÓN A LARGO PLAZO EN
TRES SITIOS DE RELEVO SINÁPTICO DEL HIPOCAMPO AL ESTIMULAR LA
VÍA PERFORANTE HOMOLATERAL
De acuerdo con en el diseño del modelo experimental propuesto en este estudio, se
estimuló en el borde angular homolateral a los sitios de registro (CA1, CA3 y giro
Tiempo (min)
0 0
250 250
150 150
200 200
350 350
300 300
Pendiente fEPSP (%
de la línea base)
Pendiente fEPSP (%
de la línea base)
100 100
50 50
0 20 40 60 80 100 120
Línea base
30 min
15 min
60 min
90 min
120 min-20
HFS
DMSO
DMSO
1
1 1 1
2
22 2
Línea base
Línea base
B
Control
Control
Ro 25-6981
Ro 25-6981
5 ms0.5 mV
*
*
*
*
*
***
**
*
*
Línea base Línea base
A
Resultados 83
dentado). Antes de aplicar el protocolo de depresión a largo plazo se registró la actividad
electroencefalográfica y posteriormente se aplicaron pulsos de baja frecuencia para
determinar las características de los potenciales de campo monosinápticos en cada sitio de
registro, estableciendo para cada sitio los valores de la línea basal. Así mismo, se realizó un
protocolo de potenciación a largo plazo en 6 animales, el cual consistió en 15 min de
registro de la línea base. Para ello se aplicaron estímulos simples de una frecuencia de 0,2
Hercios, una duración de 50 µs, una latencia de 70 µs y una intensidad entre 0,4 a 2 mA.
Figura 4.15 Efecto del fármaco Ro 25-6981, antagonista selectivo de la subunidad NR2B de los receptores de
NMDA, en la depresión a largo plazo in vivo medido como la evolución de la pendiente de los potenciales de
campo provocados (fEPSP) con pulsos de baja frecuencia. A, en tres series de experimentos se indujo una
depresión a largo plazo (LTD) que duró algo más de 80 min para los animales control (n = 5) y cercano a los
110 para los animales con vehículo (DMSO, n = 5). Los animales que se inyectaron con Ro 25-6981, (n = 6)
no presentaron signos de LTD. Arriba se ilustran ejemplos de registros de fEPSPs recogidos durante los
tiempo (línea base, 1 y 2) indicados en A. B a la derecha de la figura se muestran los valores medios
recolectados para cada grupo y sus errores estándar, confirmando que el grupo Ro 25-6981 no presenta
indicación de LTD, mientras los grupos control y DMSO presentan una disminución significativa en la
pendiente los potenciales de campo comparados con los valores de la línea base (P ≤ 0,01; ANOVA de dos
vías, F(10,50) = 82,1). Abreviatura: DMSO, dimetil sulfóxido.
Tiempo (min)
0 0
100 100
60 60
80 80
140
120 120
Pendiente fEPSP (%
de la línea base)
Pendiente fEPSP (%
de la línea base)
40 40
20 20
0 20 40 60 80 100 120
Línea base
30 min
15 min
60 min
90 min
120 min-20
LFS
DMSO
DMSO
1
11
2
2
2 21
Línea Base
Línea Base
B
Control
Control
Ro 25-6981
Ro 25-6981
5 ms0.5 mV
*
*
*
*
*
*
*
*
Línea Base
Línea Base
A
Resultados 84
Los estímulos se aplicaron en la región del borde angular, donde atraviesa un gran
número de fibras de la vía perforante. Posteriormente, se aplicaron cinco trenes de alta
frecuencia (200 Hercios) por seis veces, con un intervalo de 1 minuto y una duración de
100 ms. Al regresar a las condiciones basales, se observaron cambios en la pendiente del
potencial de campo registrado, siendo estos cambios más notorios en los sitios de CA3 y
CA1.
En los animales estudiados, el protocolo de potenciación a largo plazo empleado
indujo la respuesta de potenciación de manera simultánea en los tres sitios registrados. Sin
embargo, la evolución temporal de cada sitio fue diferente (ver Figura 4.16). Así, en los
potenciales de campo registrados en CA3 se obtuvieron los mayores incrementos
porcentuales (382 ± 45%), pero a los 5 minutos los valores de los fEPSP evocados
descendieron rápidamente a valores superiores al 200%, manteniéndose dentro de ese rango
hasta el final del registro (120 min). Las pendientes registradas en las células piramidales
de CA1 aumentaron a valores ligeramente superiores al 300% y los valores descendieron
de manera menos pronunciada, llegando a los 40 minutos a valores estables dentro del
rango de los 240%. En el giro dentado, el incremento post estimulación de alta frecuencia,
fue menor comparado con los otros sitios registrados (296 ± 31%). La disminución de los
valores de las pendientes se acentuaron durante los primeros 20 minutos y tuvo una
duración de sólo 60 minutos. En este último caso, la corta duración de la potenciación
inducida en el giro dentado por la estimulación a alta frecuencia de la vía perforante no
permite hablar de potenciación a largo plazo, en sentido estricto.
En el caso de la depresión a largo plazo, se obtuvo una disminución simultánea en
los tres sitios de registro de un 70%. Esta disminución se mantuvo con pocas variaciones
durante los 120 minutos de registro, mostrando un patrón similar en la evolución temporal
de los sitios sometidos al protocolo de LTD (ver Figura 4.17).
En algunos animales (n = 2), se siguió la evolución de la LTP y de la LTD en días
sucesivos. En ambas situaciones experimentales, la LTP y la LTD se mantuvieron hasta 4
días tras las sesiones de estimulación a alta y baja frecuencia, respectivamente. Dado el
pequeño tamaño de la muestra no se realizó un análisis cuantitativo de los datos obtenidos.
Resultados 85
Figura 4.16 Potenciación a largo plazo en tres sitios del hipocampo por estimulación en la vía perforante.
Evolución temporal del promedio ± el desvío estándar de la pendiente de los potenciales de campo
provocados (fEPSP) en los tres sitios de relevo sináptico CA3, CA1 y giro dentado (G.D.) expresados como
aumento porcentual con relación a la línea de base (15 minutos antes de la estimulación tetánica en la vía
perforante). Estimulación basal: Un pulso de 50 µs de duración, 0,6 mA de intensidad, a una frecuencia de 0,1
Hercios. Estimulación tetánica o de pulsos de alta frecuencia (HFS): Pulsos de 50 µs de duración, 1 mA de
intensidad, a una frecuencia de 100 Hercios. Durante la HFS se aplicó un total de 600 estímulos. Abreviatura:
HFS (siglas en inglés de High Frecuency Stimulation)
4.8 PRUEBA DE PULSOS PAREADOS
Se implementó la prueba de pulsos pareados a fin de conocer las características
funcionales de las principales sinapsis registradas en el hipocampo y su relación con las
fibras aferentes de la vía perforante. De las cuatro modalidades implementadas se observó
que las sinapsis entre la vía perforante y CA3 presentaron facilitación en el primer intervalo
interestímulo registrado y esa facilitación se mantuvo hasta los 50 ms salvo cuando se
aplicaron los estímulos a 5 Hercios, donde hubo inhibición entre los 20 y 50 ms. En CA1 se
HFS
0 20 40 60 80 100 120-15
Tiempo (min)
Pendiente
(% de la linea base)
fEPSP
Resultados 86
observó facilitación en las frecuencias de 0,03 Hercios a la intensidad alta y a 1 y 5 Hercios
en el primer intervalo interestímulos. Hubo inhibición en la frecuencia de 0,03 Hercios a
baja intensidad en la sinapsis entre la vía perforante y CA3. Finalmente, en la sinapsis del
giro dentado con las aferencias de la vía perforante hubo inhibición en los tres primeros
intervalos interestímulos a excepción de la frecuencia de 5 Hercios.
Figura 4.17 Depresión a largo plazo en tres sitios del hipocampo por estimulación en la vía perforante. Evolución temporal del promedio ± el desvío estándar de la pendiente de los potenciales de campo
provocados (fEPSP) en los tres sitios de relevo sináptico CA3, CA1 y giro dentado (G.D.) expresados como
aumento porcentual con relación a la línea de base (15 minutos antes de la estimulación en la vía perforante).
Estimulación basal: 50 µs de duración, 0,6 mA de intensidad, frecuencia de 0,1 Hz. Estimulación de pulsos de
baja frecuencia (LFS) presentada para provocar la depresión a largo plazo: 50 µs de duración, 1 mA de
intensidad, frecuencia de 1 Hercios. Abreviatura: LFS (siglas en inglés de Low Frecuency Stimulation).
0
100
60
80
180
160
Pendiente
(% de la línea bas)
fEPSP
40
20
LFS
100
120
140
Tiempo (min)
0 20 40 60 80 100 120-15
Resultados 87
Figura 4.18 Gráficos de las variaciones de los potenciales de campo en la prueba de pulsos pareados. El
protocolo implementado consistió en series de siete pares de pulsos con intervalos interestímulos crecientes
(10, 20, 30, 50, 100, 200 y 500 ms). Cada serie tuvo una duración de un minuto y se representó el porcentaje
de variación de la pendiente de la respuesta del segundo pulso en relación con la pendiente de la respuesta del
primer pulso. Las frecuencias de estimulación fueron de 0,03, 1 y 5 Hercios. En el caso de la frecuencia de
0,03 Hercios se registró además con intensidades mínimas (arriba a la derecha) y máximas (arriba a la
izquierda). Sólo se obtuvieron diferencias estadísticamente significativas entre las regiones de CA1 y CA3, y
CA1 y GD para la frecuencia de 0,03 Hercios y en el primer intervalo interestímulos (F (12,12) = 11, 30; P <
0,001)
4.9 COMPROBACIÓN HISTOLÓGICA DE LA LOCALIZACIÓN FINAL DE LOS
ELECTRODOS DE ESTIMULACIÓN Y REGISTRO
A la finalización de los experimentos, se realizaron cortes coronales de los cerebros
de los animales experimentales a fin de determinar la correcta ubicación de los electrodos
de estimulación y registro. Los cortes se montaron y tiñeron con la técnica de Nissl con
azul de toluidina al 0,1%, como se explica en la sección de Materiales y Métodos.
Porcentaje de cambio Ca1
GD
Ca3
Intervalo interestímulos (ms)
Frec. Estim = 0,03 Hercios(alta intensidad)
Porcentaje de cambio Ca1
GD
Ca3
Intervalo interestímulos (ms)
Frec. Estim = 1 Hercio
Intervalo interestímulos (ms)
Frec. Estim = 5 Hercios
Porcentaje de cam
bio
Ca1
GD
Ca3
10 20 30 50 100 200 500
Ca1
GD
Ca3*
**
-100
-50
0
50
100
150
Porcentaje de cambio
Intervalo interestímulos (ms)
Frec. Estim = 0,03 Hercios(baja intensidad)
Resultados 88
En las fotomicrografías de la Figura 4.19 se muestran la ubicación de los electrodos
en los tres sitios de registro [CA1, CA3 y giro dentado (G.D.)] y en el sitio de estimulación
(vía perforante, V.p). Los datos cuantitativos utilizados en el presente estudio se
seleccionaron de entre aquellos registros en los que la posterior comprobación histológica
indicó una correcta ubicación de los electrodos de estimulación y registro.
Figura 4.19 Fotomicrografías de cortes de hipocampo de rata, teñidos con la tinción de Nissl, en los que las
flechas señalan la ubicación final de los electrodos de registro en el estrato piramidal de CA1 y CA3 y en el
estrato granular del giro dentado. Se señala además en la fotografía inferior derecha la posición de los
electrodos de estimulación en el borde angular por donde atraviesa la vía perforante. Barras de calibración:
500 µm. Abreviaciones: D, M, dorsal, medial; G.D., giro dentado; V.p., vía perforante.
1. CA 1
3. G.D. 4. V.p.
CA1
CA 3G.D.
CA1
CA 3
G.D.
CA1
CA 3G.D.
V.p.
500µm
D
M
500µm 500µm
500µm
Discusión 89
5. DISCUSIÓN
Discusión 90
Discusión 91
5.1 DISEÑO DE UN MODELO PARA EL ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD
HIPOCAMPAL DURANTE PRUEBAS DE APRENDIZAJE ASOCIATIVO Y DE
POTENCIACIÓN Y DEPRESIÓN SINÁPTICA
Como se señaló en la Introducción de este estudio, los modelos animales in vivo
para el estudio de la fisiología del hipocampo difieren de los que se realizan en rodajas
de cerebro, ya que en rodajas se cortan las conexiones neuronales provenientes de
regiones más alejadas a esta estructura (Matthews y col., 1976). Por lo tanto, los
circuitos presentes en las rodajas carecen de factores importantes como las aferencias
tónicas que recibe el hipocampo (por ejemplo: septum medial, núcleo del rafe medial,
locus coeruleus, etc.) y que están presentes en el animal intacto cuando se produce el
aprendizaje (Herreras y col., 1988, Freund y Antal, 1988; Frotscher y Leranth, 1988;
Freund y col., 1990). Además, es un método ciertamente artificial cuando se compara
con procesos funcionales en un animal intacto (Hassan y col., 2006) y que está sujeto al
deterioro de la rodaja en el tiempo (Teyler, 1980). Aún así, los estudios realizados en
rodajas de hipocampo han permitido avanzar en nuestros conocimientos acerca de la
fisiología sináptica y de la intervención de numerosos fenómenos moleculares y
celulares en los procesos de aprendizaje y memoria. Una buena forma de complementar
las limitaciones en el uso de registros de rodajas in vitro, es estudiar los mismos
fenómenos en un animal in vivo (Hassan y col., 2006). Las diferencias se presentan
incluso con el uso de modelos de animales anestesiados, en los que la utilización de
anestésicos como el uretano producen una disminución de las pendientes de los
potenciales de campo excitatorios postsinapticos y eliminan la presencia de las espigas
poblacionales (Riedel y col., 1994; Hassan y col., 2006).
Al ser nuestro interés el análisis de funciones cognitivas como la memoria y el
aprendizaje en una estructura como el hipocampo (lo cual involucra la activación de
grupos neuronales ampliamente distribuidos) fue necesario que en el diseño del modelo
experimental se tuviese en cuenta que el implante crónico de los electrodos en el
hipocampo no afectara la salud ni la libre movilidad de la rata dentro de su hábitat,
permitiendo, además, el registro electroencefalográfico en el animal despierto. Los
modelos animales que utilizan implantes crónicos publicados a la fecha consideran sólo
uno o dos sitios de registro en hipocampo (Moyer y col., 1996; Davis y col., 1997;
Múnera y col., 2001 ; Gilmartin y McEchron 2005; Hassan y col., 2006; Gruart y col.,
2006 y 2007; Valenzuela-Harrington y col., 2007), lo cual supone que se estudia el
sistema parcialmente, considerando sólo algunas vías sinápticas dentro de un sistema
Discusión 92
complejo donde interactúan una importante red de interneuronas y las células
piramidales y granulares del hipocampo que son las principales células de esta
estructura en procesos de aprendizaje asociativo (McEchron y Disterhoft, 1997; Gruart
y col., 2006; Whitlock y col., 2006). Tomando en consideración los estudios de Yeckel
y Berger (1990), en los que se redefine el circuito trisináptico del hipocampo,
describiendo que las aferencias provenientes de la corteza entorrinal pueden hacer
sinapsis con las células granulares del giro dentado, las células piramidales de CA3 y las
células piramidales de CA1 de manera monosináptica, se buscó obtener registros
monosinápticos en todos los sitios del circuito trisináptico del hipocampo mediante la
estimulación de la vía perforante.
Es importante señalar que en el diseño del modelo experimental se tuvo que
considerar el tipo de electrodo que se utilizaría, buscando emplear el de menor diámetro
a fin de provocar el menor daño posible en el tejido nervioso, que tuviera la suficiente
rigidez para no torcerse durante el descenso hacia la región de registro o estimulación y
que evitara adecuadamente las señales ruidosas de origen no nervioso. Además, se
adaptó una torreta que debía ser lo suficientemente fuerte para evitar que la rata, un
animal que se acicala constantemente, no la dañase, o se la sacara, y que tuviese un
tamaño pequeño para que le permitiera libertad de movimientos dentro de su jaula.
Como se detalló en la sección de Materiales y Métodos, cada animal experimental tuvo
finalmente ocho electrodos de registro, distribuidos en: cuatro para giro dentado, dos
para las células piramidales de CA1 y dos para las células piramidales de CA3. Esto
permitió, incluso, poder seleccionar cuál de los sitios de registro tenía el mejor potencial
de campo sináptico para estudiar. Adicionalmente, se agregaron dos electrodos de
estimulación. El modelo incluyó así mismo electrodos para el registro de la
electromiografía del músculo orbicular de los párpados y para la estimulación de la
rama supraorbitaria del nervio trigémino. Todos estos electrodos se concentraron en
cuatro torretas, lo cual permitió que, por su bajo peso y la reducción de la superficie de
contacto, los animales pudieran desenvolverse con comodidad dentro de su jaula,
disminuyendo el estrés.
El modelo diseñado y empleado en este trabajo, al desplazar de manera
independiente los electrodos de estimulación y registro, permitió seleccionar aquellas
sinapsis que son específicamente estimuladas, de manera que hizo posible la inducción
de potenciales sinápticos de campo con intensidades muy bajas de estimulación,
atenuando la activación inespecífica de las transmisiones sinápticas que pudieran alterar
Discusión 93
los registros electroencefalográficos. Además, esta independencia de movimiento de los
electrodos de registro y de estimulación, a la hora de su implementación, permitió
potenciar una de las ventajas de la LTP denominada especificidad, por la cual las
sinapsis que se modifican son aquellas que son específicamente estimuladas (Whitlock
y col., 2006).
Hasta la fecha no se ha publicado ningún estudio realizado en roedores, que
suponga el registro simultáneo en el hipocampo de tres sitios diferentes, estimulando en
una de sus principales vía aferentes como es la vía perforante, lo cual convierte a este
modelo experimental en el primero que permite estudiar en tiempo real las variaciones
funcionales en el circuito del hipocampo en una prueba de aprendizaje asociativo, así
como en pruebas de eficacia sináptica.
5.2 PATRONES DE ACTIVIDAD HIPOCAMPAL DURANTE PRUEBAS DE
APRENDIZAJE ASOCIATIVO
En este estudio se tuvieron en cuenta los antecedentes anatómicos que
cláramente señalan que la vía perforante es la principal aferencia al hipocampo,
estableciendo conexiones monosinapticas con las células granulosas del giro dentado
(Lee y Kesner, 2004), las piramidales de CA3 (Steward, 1976; Lee y Kesner, 2004) y
las piramidales de CA1 (Doller y Weight, 1982). En el caso de las sinapsis entre la vía
perforante y CA3, su número puede llegar a ser casi igual al que establece las vía
perforante con el giro dentado, lo que indica la importancia que adquiere esta vía para el
funcionamiento de las células piramidales de CA3 (Berzhanskaya y col., 2001). En el
trabajo de McNaughton y col., 1989 se demostró que las células de lugar siguen
disparando en las áreas de CA1 y CA3 aún después de destruir las células del giro
dentado. Estos hallazgos sugieren que las aferencias directas de la vía perforante sobre
CA3 y CA1 desempeñan un rol importante en el funcionamiento del hipocampo
(Berzhanskaya y col., 2001). Además, las extensas colaterales excitatorias dentro del
campo de CA3 constituyen el principal candidato para un sistema de memoria
recurrente de corto plazo en el hipocampo (Weibe y col., 1997). Esto es así porque las
células piramidales de CA3 presentan una prolongada actividad post-estímulo frente a
aferencias sensoriales presentadas en paradigmas de condicionamiento con retraso (Otto
y Eichenbaum, 1992; Wiebe y Staübli, 1996), paradigmas de traza (Solomon y col.,
1986) y en situaciones de aprendizaje asociativo (Vinogradova 1975, Vinogradova y
Brazhnik 1978; Vinogradova 1995). Todo esto ha llevado a proponer hipótesis
Discusión 94
funcionales que señalan que la región de CA3 estaría involucrada en el desarrollo de
predicciones en secuencias de aprendizaje (Abbott y Blum, 1996; Jensen y Lisman,
1996; Levy, 1996; August y Levy, 1999).
Para estudiar la actividad sináptica neuronal en el hipocampo durante las
sesiones de aprendizaje del condicionamiento clásico del reflejo palpebral (ó corneal),
se aplicó un pulso eléctrico en el borde angular por donde transitan los axones de la vía
perforante medial. Estos pulsos aplicados a un intervalo de 300 ms del estímulo
condicionado, no afectaron el ritmo theta característico del hipocampo, de modo que a
partir de estos pulsos eléctricos se pudieron medir las variaciones en las pendientes de
los potenciales de campo excitatorios postsinápticos (fEPSP) en las principales células
del hipocampo durante las diferentes sesiones de aprendizaje.
En el momento actual se acepta en general que las redes neuronales cambian
estructural y funcionalmente cuando se adquiere una habilidad cognitiva o un
aprendizaje motor. Y es en los cambios funcionales o estructurales de las sinapsis donde
se asume que se almacena esta información (Hebb, 1949; Delgado-García y Gruart,
2006). En ese mismo sentido, Power y col., (1997a) han señalado que en el incremento
en las sinapsis hipocampales puede subyacer la adquisición de las respuestas
condicionadas del parpadeo (Power y col., 1997a). Si consideramos que la adquisición
de la respuesta condicionada permite inferir la formación de asociaciones entre el
estímulo condicionado y el incondicionado (Holland y Bouton, 1999), los registros de
los potenciales sinápticos de campo (fEPSPs) obtenidos en los distintos relevos
sinápticos en nuestro estudio presentaron cambios a lo largo de las diferentes sesiones
de condicionamiento. Durante la habituación no existieron diferencias significativas en
la potenciación sináptica porque en estas sesiones no hay respuestas condicionadas. En
el caso de la habituación, las actividades electromiográficas que se registran
corresponden a respuestas de tipo alfa o de sensibilización, donde no hay asociación
entre estímulos (Gruart y col., 1995). De modo que en la etapa de habituación no se
obtuvieron variaciones estadísticamente significativas en las pendientes de los
potenciales de campo que se asocien a la generación de un aprendizaje. Los cambios se
observaron a partir de las sesiones de condicionamiento, en las que las pendientes de los
potenciales sinápticos de campo experimentaron incrementos, en el caso de las células
piramidales de CA3 y células granulares del giro dentado, y decrementos en el caso de
las células piramidales de CA1.
Discusión 95
En algunos trabajos similares al nuestro se señala la existencia de patrones con
relaciones inversas entre las distintas regiones del hipocampo; sin embargo, estas
relaciones sólo se han determinado entre dos sitios del hipocampo: generalmente, entre
el giro dentado y las células piramidales de CA1, considerados como la entrada y la
salida del hipocampo respectivamente (Gilmartin y McEchron, 2005). En algunos
modelos computacionales se sugiere que las neuronas del giro dentado se
especializarían en codificar patrones para las entradas sensoriales y enviarlas a las
células piramidales de CA3 y CA1 (McClelland y col., 1995; Rolls, 1996). Por otro
lado, en otros modelos experimentales se plantea que las neuronas de CA1 actuarían
como comparadores de las aferencias provenientes de la corteza entorrinal y de las áreas
del giro dentado y CA3, lo cual les permitiría distinguir patrones familiares de patrones
novedosos (Hasselmo y col., 2000).
En el estudio de Gilmartin y McEchron (2005) se registraron neuronas del giro
dentado y de CA1, en ratas sometidas a un tipo de aprendizaje asociativo como es el
condicionamiento de miedo, usando un paradigma de traza. En este estudio mostraron
que la información en el condicionamiento de traza de miedo se codifica en las neuronas
del giro dentado y en las células piramidales de CA1 de una manera inversa.
Observaron que las neuronas del giro dentado incrementan su actividad en el período
comprendido entre los estímulos condicionado e incondicionado, lo cual se mantiene
durante las diferentes sesiones de aprendizaje, y sirve, probablemente para mantener la
fuerza de la asociación sináptica de los estímulos aplicados. Por otro lado, las neuronas
piramidales de CA1 muestran una actividad inversa a la observada en el giro dentado.
Las células piramidales de CA1 incrementan su actividad sólo en el día 1, posiblemente
por la llegada de un nuevo patrón de estímulos, como son los dos estímulos y su
intervalo. Posteriormente, la respuesta neuronal de las piramidales de CA1 comienzó a
disminuir progresivamente con el avance de las sesiones y en la medida que el patrón
neuronal disminuyó en novedad. Esto se interpreta como la capacidad de la neuronas
piramidales de CA1 para distinguir patrones nuevos y patrones familiares. Otros
estudios mantienen la idea de que el giro dentado y las células piramidales de CA1
tiene distintos roles en el aprendizaje (Gilbert y col., 2001). En este último estudio
demostraron que lesiones realizadas en el giro dentado de la rata dificultan una tarea de
localización espacial, mientras que lesiones en las células piramidales de CA1 no tienen
efectos en esta tarea.
Discusión 96
Se ha descrito que durante el condicionamiento clásico del reflejo palpebral el
hipocampo participa en la asociación entre el estímulo condicionado e incondicionado,
enviando el patrón que se genera como resultado de esta asociación a regiones
cerebrales superiores como la corteza prefrontal, un área que recibe una densa
proyección desde el hipocampo (Chiba, 2000; Jay y Witter, 1991), donde se
almacenaría la respuesta aprendida. Algunos autores consideran la corteza prefrontal
como otro elemento clave en la formación de la respuesta condicionada, ya que esta
corteza mantiene niveles de actividad tónicos durante los intervalos temporales (Chang
y col., 2002; Fuster 1973; Fuster 1990; Frank y Brown, 2003). De modo que las
neuronas del hipocampo van respondiendo a medida que producen las sesiones de
aprendizaje de manera progresiva ante la llegada de los estímulos sensoriales, buscando
establecer el patrón de respuesta.
En nuestro estudio obtuvimos que la estimulación de la vía perforante implicó
que en los tres sitios de relevo registrados se pudieron observar cambios en los valores
de las pendientes a medida que se sucedían las sesiones de aprendizaje. El incremento
en los valores de las pendientes de los potenciales sinápticos de campo indicaría que
está participando un número mayor de neuronas y, por el contrario, si hay un
decremento en los valores de las pendientes, es indicativo que un menor número de
neuronas están participando, o que las interneuronas inhibitorias están más activas sobre
las células piramidales, considerando que estas células piramidales son las estructuras
neuronales del hipocampo que expresan los cambios relacionados con el aprendizaje
(Berger y Thompson, 1978).
El potencial sináptico de campo obtenido en cada caso constituye una verdadera
“fotografía” de los procesos sinápticos que estaban sucediéndose en las proximidades
del electrodo de registro por la acción de las aferencias sensoriales originadas por los
estímulos condicionado e incondicionado. Es importante señalar que los pulsos
aplicados en la vía perforante fueron del orden de 0,02 mA, por lo que prácticamente no
tuvieron efecto en la actividad global que estaba realizando el hipocampo en el
momento del aprendizaje. En estudios previos de nuestro laboratorio (Gruart y col.,
2006) se obtuvo que registrando la sinapsis entre las células piramidales de CA3 y las
células piramidales de CA1 los valores de las pendientes de los potenciales sinápticos
de campo registrados se incrementa en paralelo con la aparición de la respuesta
condicionada y a medida que el animal se somete a las sesiones de condicionamiento.
En nuestro estudio, cuando registramos la sinapsis de la vía perforante sobre las células
Discusión 97
piramidales de CA1 obtuvimos que la pendiente decrece durante las mismas sesiones de
condicionamiento. Esto podría deberse a que las neuronas no funcionan como un todo
sino que pueden presentar regiones de su anatomía activas y inactivas, dependiendo de
los tipos de receptores presentes, de las concentraciones iónicas del medio intra. y
extracelular, de los cambios en las afinidades por los neurotransmisores que
experimentan los receptores, de los cambios en las densidades de receptores en las
sinapsis y, por último, de los efectos de las interneuronas inhibitorias que rodean a las
células piramidales. Podríamos suponer que, durante este tipo de aprendizaje, el células
del giro dentado se activan cuando reciben las aferencias de los estímulos condicionado
e incondicionado y también lo hace CA3, pero en esta estación de relevo sináptico la
proyecciones desde las colaterales de Schaffer adquieren mayor peso sináptico sobre las
piramidales de CA1 observándose un incremento en las pendientes cuando se registra
estimulando las colaterales de Schaffer (Gruart y col., 2006), pero no se observa ese
incremento cuando la vía que se estimula es la vía perforante y se registra en las células
piramidales de CA1. Así pues, las células de CA1 enviarían al subículum y corteza
prefrontal los patrones de actividad neuronales provenientes de la activación de las
piramidales de CA3, lo cual indicaría que en este circuito las conexiones internas del
hipocampo son las que se encuentran facilitadas. Es importante destacar, como señala
Fries y col. (2003), que la generación de patrones de actividad neuronal son producidos
por la ejecución de la tarea y no son simplemente estados producidos por defecto del
sistema (Fries y col., 2003). Además, la activación de estos patrones durante la
ejecución de la tarea contiene una estructura temporal debido a que diferentes grupos
neuronales están involucrados a tiempos diferentes durante la tarea (Fries y col., 2003).
Otro elemento a considerar es el que aporta el trabajo de Bartesaghi y Gessi
(2003), en el que los autores señalan que las neuronas de la capa II de la corteza
entorrinal poseen un bajo umbral de excitación, lo cual facilita la rápida transferencia de
señales corticales al giro dentado. En cambio, las neuronas de la capa III poseen un alto
umbral de excitación, y serían incapaces de transferir las señales sensoriales a las
células piramidales de CA1. Esto podría explicar que cuando estimulamos en la corteza
entorrinal, activando las aferencias monosinapticas con las piramidales de CA1, éstas
obtienen un descenso en las pendientes de los potenciales evocados ya que esta región
se encontraría inhibida respecto a las sinapsis provenientes de las colaterales de
Schaffer, las cuales aumentarían. Esto último ha sido demostrado en anteriores trabajos
Discusión 98
con ratones (Gruart y col., 2006) y correspondería a la activación del mecanismo de
memoria recurrente a corto plazo de las piramidales de CA3.
El esquema de la Figura 5.1 resume las variaciones de los potenciales sinápticos
de campo en el hipocampo durante la prueba de aprendizaje asociativo del
condicionamiento clásico del reflejo palpebral en el paradigma de traza, obtenidas en
este estudio.
Figura 5.1 Esquema de las variaciones en los potenciales sinápticos de campo registrados
simultáneamente en tres regiones del hipocampo durante las sesiones de habituación (Habit 2),
condicionamiento (Condi 3 y 9) y extinción (Extinc 4) del programa de condicionamiento clásico del
reflejo palpebral con un paradigma de traza. Todos los potenciales se indujeron por la estimulación de la
vía perforante. Se señala con círculos los sitios donde hacen sinapsis las aferencias de la corteza entorrinal
a través de la vía perforante (V.p.) y se proyectan los cambios que experimentaron los potenciales de
campo en las diferentes sesiones de aprendizaje. Nótese cómo en las células piramidales de CA3 y giro
dentado hay un incremento en los potenciales evocados de la sesión 3 de condicionamiento, en cambio en
las células piramidales de CA1 se observa una disminución del campo, para la misma sesión.
Abreviaturas: G.D.= giro dentado.
Habit 2
Condi 3
Condi 9
Extinc 4
0.1 mV
10 ms
CA1
G.D.
Habit 2
Condi 3
Condi 9
Extinc 4
Habit 2
Condi 3
Condi 9
Extinc 4
0.1 mV
10 ms
0.1 mV
10 ms
V.p.
Discusión 99
5.3 PROCESO DE APRENDIZAJE MOTOR POR CONDICIONAMIENTO
CLÁSICO DEL REFLEJO PALPEBRAL
En el modelo de aprendizaje asociativo del condicionamiento clásico del reflejo
palpebral, con un paradigma de traza, los animales experimentales presentaron una
curva de aprendizaje que alcanzó valores máximos sobre el 60% de las respuestas
condicionadas. Estudios anteriores señalan que utilizando intervalos interestímulos de
250 ms, permiten que los animales (gatos), obtengan un 100% de las respuestas
condicionadas a partir de la cuarta a sexta sesión de condicionamiento (Gruart y col.,
1995). En el caso de este estudio en el que empleamos un intervalo interestímulos de
500 ms, el porcentaje de aprendizaje se logró en las dos últimas sesiones de
condicionamiento. En la etapa de extinción no se pudo obtener la extinción completa de
las respuestas: sólo al cuarto día se obtuvieron valores cercanos a los del grupo
pseudocondicionado; en los días restantes los valores fueron estadísticamente
significativos. De acuerdo a la progresión del descenso en el porcentaje, es probable que
con más días de extinción la respuestas se suprimieran por completo. Estos resultados
concuerdan con la bibliografía que señala que cuando el intervalo interestímulos es
mayor de los 250 ms, se dificulta la capacidad de adquirir la respuesta condicionada
(Gormezano, 1966; Beylin y col., 2001; Power y col., 1997).
Junto con el aumento en el porcentaje de respuestas condicionadas, se
observaron aumentos en la amplitud de la respuesta condicionada y del área bajo la
curva. En el caso de las latencias de inicio de las respuesta condicionada y latencia al
inicio del pico máximo, también se observaron variaciones a lo largo de las sesiones de
condicionamiento y extinción. Todas estas características se analizaron en los registros
electromiográficos del músculo orbicular de los párpados. La amplitud de la respuesta
condicionada evolucionó con una progresión lenta, obteniendo diferencias
estadísticamente significativa a partir del sexto día de condicionamiento. Algo similar
se obtuvo en el caso del área bajo la curva; es decir, las diferencias entre los grupos
condicionado y pseudocondicionado se observaron a partir del sexto día de
condicionamiento, alcanzando los valores máximos en la última sesión de
condicionamiento. Tendencias similares se describen en el trabajo de Troncoso (2005)
para un estudio similar realizado en ratones. Esto indicaría que a medida que los
animales adquieren los patrones neuronales que asocian los estímulos condicionado e
incondicionado, mejora el nivel de sincronización neuronal; por lo tanto, se suma un
mayor número de neuronas del núcleo facial en el proceso de transformación sensorio-
Discusión 100
motriz. Este mayor número de motoneuronas va a permitir que respondan más fibras
musculares y, por lo tanto, que el área bajo la curva se incremente en el registro
electromiográfico del músculo orbicular del párpado.
Para los parámetros de latencia, tanto al inicio de la respuesta condicionada
como al pico máximo de la misma, se observó una disminución progresiva en las
sesiones de condicionamiento, lo que significa que, a medida que los animales
experimentales aprenden a asociar los dos estímulos sensoriales, la respuesta es cada
vez más cercana a la aparición del estímulo condicionado y se mantiene en los
milisegundos posteriores, lo cual estaría relacionado con la mayor sincronización. En
este caso, las neuronas alcanzan de manera más rápida los valores umbrales de
excitación y esto les permite realizar una sumación temporo-espacial suficiente para
generar potenciales de acción lo cual implica una disminución en la latencia de la
respuesta. La tendencia se invierte cuando los animales experimentales están en las
sesiones de extinción: al no existir el estímulo incondicionado las respuestas empiezan a
alejarse del estímulo condicionado, aunque no logran las latencias observadas en los
primeros días de condicionamiento. Al igual que con la extinción de las respuestas
condicionadas, si el número de sesiones fuese mayor se lograrían los valores iniciales de
latencia.
5.4 PARTICIPACIÓN DE LOS RECEPTORES DE GLUTAMATO DEL TIPO
NMDA EN LA GENERACIÓN DE UN APRENDIZAJE ASOCIATIVO
Para discutir los resultados acerca de la participación del receptor de NMDA en
la generación de las respuestas condicionadas con el paradigma de traza, es necesario
señalar previamente que los receptores de glutamato del tipo NMDA y AMPA
intervienen directamente en la transmisión sináptica excitatoria en el cerebro. Ambos
son receptores ionotrópicos activados por glutamato que transforman una señal química
en una corriente eléctrica transmembrana (Yashiro y Philpot, 2008). Los receptores tipo
NMDA se denominan detectores de coincidencia, ya que requieren de la llegada
simultánea de glutamato de origen presináptico junto con una potente despolarización
de la membrana postsináptica que permita la liberación del Mg2+ que bloquea el
receptor (Mayer y col., 1984; Nowak y col., 1984). Se han descrito siete subunidades
del receptor de NMDA: la subunidad NR1 (Moriyoshi y col., 1991), la subunidad NR2
(incluye desde la A a la D; Kutsuwada y col, 1992; Monyer y col., 1994; Ishii y col.,
Discusión 101
1993) y la subunidad NR3 (A y B; Ciabarra y col., 1995; Sucher y col., 1995; Nishi y
col., 2001; Matsuda y col., 2002).
Cada miembro de las tres familias de subunidades poseen patrones de
distribución diferentes durante el desarrollo, siendo las subunidades NR1 las de más
amplia distribución en las distintas áreas cerebrales. En cambio, las subunidades NR2
son de distribución selectiva (Kutsuwada y col., 1992; Laurie y Seeburg, 1994; Monyer
y col., 1994; Mori y Mishina, 1995; Fischer y col., 1997). De la asociación de estas
distintas subunidades se forma el receptor NMDA operado por glutamato que va a
permitir el paso inespecífico de iones de sodio, potasio y, de manera muy importante, de
calcio. Ahora bien, dependiendo de qué subunidades se ensamblen, así serán las
propiedades funcionales de los receptores de NMDA observadas a nivel
electrofisiológico y farmacológico. (Luo y col., 1997, Paoletti y Neyton, 2007; Chaffey
y Chazot, 2008).
En diversos estudios, se ha examinado la expresión de diferentes combinaciones
de las subunidades del receptor NMDA empleando oocitos o líneas celulares
transfectadas, encontrando claros indicios de diferencias farmacológicas entre las
diferentes combinaciones (Farrant y col., 1994; Grimwood y col., 1996a,b; Lynch y
col., 1995; Williams y col., 1993).
La presencia de la subunidad NR2B no es fija en la sinapsis, sino que sufre
cambios durante del desarrollo, así como por la experiencia sensorial (Sheng y col.,
1994; Liu y col., 2004; Carmignoto y Vicini, 1992; Nase y col., 1999) y la plasticidad
sináptica (Bellone y Nicoll, 2007; Sobczyk y Svodoba, 2007). Asumiendo que el
aprendizaje adquirido se almacena en la forma de cambios estructurales, o funcionales,
de la eficacia sináptica y estos cambios están mediados en el hipocampo por la
presencia de receptores del tipo NMDA, es que buscamos estudiar la participación de
subunidades del receptor NMDA en la adquisición de la respuesta condicionada en el
paradigma de traza y, más específicamente, cuál es el papel que desempeña la
subunidad NR2B en la adquisición de ese aprendizaje asociativo. Para ello utilizamos
un potente antagonista de la subunidad NR2B de los receptores de NMDA, el Ro 25-
6981 (Fischer y col., 1997; Pinard y col., 2001).
Basándonos en los resultados obtenidos en este estudio, podemos señalar que los
receptores de NMDA que contienen la subunidad NR2B desempeñan un importante
papel tanto en las etapas de adquisición (y readquisición, período posterior a las
sesiones de extinción) de aprendizaje asociativo de condicionamiento clásico del reflejo
Discusión 102
palpebral en un paradigma de traza, en ratas adultas y conductualmente alertas. Estos
resultados confirman hallazgos previos en cuanto a la participación de la subunidad
NR2B en los mecanismos subyacentes a la generación de las señales de LTP, como se
muestra en la sinapsis CA3-CA1 (Köhr y col., 2003; Berberich y col., 2005) y en la
corteza cingulada anterior (Zhao y col., 2005). De hecho, la unión entre la potenciación
sináptica funcional durante la adquisición del aprendizaje asociativo y los procesos de
LTP ha sido convincentemente demostrado recientemente durante experimentos in vivo
realizados en nuestro laboratorio con ratones (Gruart y col., 2006) y ratas (Whitlock y
col., 2006). Junto con esto, se ha demostrado así mismo que la subunidad NR2B parece
que juega un rol crítico en el condicionamiento clásico del parpadeo en ratones
mutantes heterocigotos para el GluRe2 (NR2B; Takehara y col., 2003).
En un trabajo pionero, Weiz y col. (1984) demostraron una potenciación de las
sinapsis entre los axones de la vía perforante y las células del giro dentado durante la
adquisición de las respuestas condicionadas de la membrana nictitante. Esta modulación
del fortalecimiento sináptico durante el proceso de aprendizaje ha sido confirmada en
este estudio para la misma vía sináptica, como también para la sinapsis CA3-CA1
(Gruart y col., 2006; Whitlock y col., 2006). Aparentemente, el condicionamiento de
traza requiere de una modificación dependiente de actividad de la respuesta sináptica
para que el aprendizaje ocurra (Weiz y col., 1984; Gruart y col., 2006) y esto podría
estar unido a la activación de receptores de NMDA que contienen la subunidad NR2B,
ya que el Ro 25-6981, fue capaz de bloquear tanto la potenciación sináptica y la
adquisición de las respuestas condicionadas de parpadeo. De hecho la disminución de la
amplitud de los fEPSP durante la aplicación del Ro 25-6981 se puede explicar como
una regulación a la baja (down-regulation) de los receptores de AMPA, lo cual
resultaría muy probablemente del bloqueo sostenido de los receptores de NMDA
(Zhong y col., 2006). En resumen, podemos señalar que los receptores de NMDA que
contienen subunidades NR2B localizados en selectivos sitios postsinápticos del
hipocampo podrían jugar un rol regulatorio y/o homeostático (Pérez-Otaño y Ehlers,
2005), contribuyendo a depotenciación sinaptica (Abraham y Williams, 2003) o
debilitamiento de la transmisión sináptica (Kim y col., 2005).
Discusión 103
5.5 PARTICIPACIÓN DE LOS RECEPTORES DE GLUTAMATO DEL TIPO
NMDA EN LOS MECANISMOS DE PLASTICIDAD SINÁPTICA COMO LA
POTENCIACIÓN Y DEPRESIÓN A LARGO PLAZO
Hay varias ventajas al medir una potenciación o una depresión sináptica a largo
plazo in vivo frente a in vitro, entre las cuales la más obvia es la posibilidad de seguir el
curso temporal completo del efecto. Además, existe la posibilidad de que la magnitud
de una LTP o LTD en el ambiente artificial de la rodaja de hipocampo pueda ser muy
diferente de la obtenida en la misma región en un animal anestesiado o despierto
(Nosten-Bertrand y col., 1996).
Como hemos mencionado con anterioridad, en el mecanismo de la potenciación
a largo plazo tienen una activa participación los receptores de NMDA y la composición
de éstos es fundamental para producir dicha potenciación. De hecho, aún empleando
una baja frecuencia de estimulación, que sería mas propio de una depresión a largo
plazo, es posible inducir una LTP si las células post-sinápticas tienen sus potenciales de
membrana despolarizados (Kelso y col., 1986; Wigstrom y Gustafsson, 1986). Por lo
tanto, más importante que el protocolo que se emplee es el tipo de composición de las
subunidades que tengan los receptores de NMDA en el momento en que se produzca la
estimulación.
Habiendo demostrado que el receptor de NMDA y particularmente su subunidad
NR2B están relacionados con en la adquisición del aprendizaje asociativo, lo cual
supone un fortalecimiento en las sinapsis participantes y, como mencionamos
anteriormente, que la unión entre la potenciación sináptica funcional durante la
adquisición del aprendizaje asociativo y los procesos de LTP ha sido recientemente
demostrado en ratones (Gruart y col., 2006) y ratas (Whitlock y col., 2006) es que
buscamos estudiar cuál es el papel que desempeña la subunidad NR2B en los
mecanismos de potenciación y depresión a largo plazo. Para determinar la participación
de la subunidad NR2B, al igual como se realizó en los estudios del condicionamiento,
empleamos un inhibidor selectivo de la misma que fue el Ro 25-6981 (Fischer y col.,
1997; Pinard y col., 2001).
En lo que respecta a los mecanismos de plasticidad sináptica, los resultados
presentes no pueden ser relacionados con la generación de señales del tipo LTD, como
se demostró in vitro usando rodajas de hipocampo (Liu y col., 2004) y corteza perirrinal
(Massey y col., 2004), y en un ratón mutante defectuoso de la subunidad NR2B para el
receptor de NMDA (Kutusuwada y col., 1996). La principal razón es que la pendiente
Discusión 104
de los fEPSP evocados en el giro dentado por pulsos simples presentados en la vía
perforante medial durante el intervalo entre el estímulo condicionado y el estímulo
incondicionado se incrementan (y no decrecen, como debería esperarse en un proceso
relacionado a la depresión a largo plazo) a través de las sesiones de condicionamiento y
recondicionamiento. El inhibidor de la subunidad NR2B, Ro 25-6981 induce una
disfacilitación de la potenciación fisiológica sináptica producida por el
condicionamiento. A este respecto ha sido recientemente publicado que el Ro 25-6981
reduce selectivamente la potenciación a largo plazo, pero no la depresión a largo plazo
provocada en la región de CA1 en rodajas de hipocampo (Bartlett y col., 2007). Otro
elemento importante a considerar es que mientras la potenciación a largo plazo es
fácilmente provocada in vivo en las sinapsis de la vía perforante – giro dentado (Fazeli y
col., 1993), la depresión a largo plazo no lo es tanto (Kemp y Bashir, 2001). Es también
importante destacar que el cerebelo no está involucrado en los déficit de aprendizaje
evocados por Ro 25-6981, debido a que en el estado adulto esta estructura carece de
subunidades de NR2B (Watanabe y col., 1993; Mori y Mishina 1995). De hecho, las
subunidades NR2B son sustituidas en el cerebelo adulto por subunidades NR2C
(Watanabe y col., 1993; Mori y Mishina 1995).
Una posible explicación de los presentes resultados y de las contradictorias
publicaciones referentes a los efectos de los receptores de NMDA que contienen la
subunidad NR2B (Kutsuwada y col., 1996; Tang y col., 1999; Liu y col., 2004; Massey
y col., 2004; Barberich y col., 2005) es que las subunidades NR2B juegan diferentes
roles en el desarrollo sináptico y en la plasticidad sináptica, dependiendo del estado del
desarrollo y de los circuitos sinápticos y las áreas cerebrales involucradas. Por ejemplo,
ratones que sobreexpresan subunidades NR2B inmaduras presentan una aumentada
potenciación a largo plazo en el hipocampo y muestran una gran capacidad de
aprendizaje (Tang y col., 1999), mientras que ratones mutantes defectuosos en las
subunidades NR2B tienen dificultades para evocar depresión a largo plazo en la sinapsis
hipocampal entre las células piramidales de CA3 y las células piramidales de CA1. Sin
embargo, el incremento de la disponibilidad o el bloqueo de las subunidades de NR2B
puede producir diferentes efectos en la depresión a largo plazo o en la potenciación a
largo plazo, dependiendo de los sitios neuronales o de la activación de diferentes vías
intracelulares (Liu y col., 2004). Así, las contradicciones presentes en varias
publicaciones indicarían la presencia de diferentes procesos regulatorios y
Discusión 105
homeostáticos que implican a los diferentes tipos de receptores de NMDA (Pérez-
Otaño y Ehlers, 2005).
Otra posible explicación de estos resultados la encontramos en el modelo
planteado recientemente sobre la regulación de la plasticidad sináptica por las
subunidades de los receptores de NMDA (Philpot y col., 1999; Yashiro y Philpot,
2008). En este modelo, si la proporción entre las subunidades NR2A y NR2B es
elevada, se requiere de una estimulación de alta frecuencia para generar una
potenciación a largo plazo; pero no ocurría lo mismo si la proporción de las
subunidades NR2A y NR2B es baja. Esto se debería a que, al tener una alta proporción
de NR2A y NR2B, se limita el ingreso de Ca2+ por los receptores de NMDA y eso
también dificulta la activación de la calmodulin kinasa II. Por lo tanto, es necesario una
fuerte estimulación que permita elevar las concentraciones de Ca2+ intracelular para
activar la calmodulina e inducir la potenciación a largo plazo (Yashiro y Philpot, 2008).
A la inversa, si la proporción entre NR2A y NR2B es baja, es muy probable que una
baja estimulación permita el ingreso masivo de Ca2+ y active los niveles de calmodulin
kinasa II para provocar la potenciación a largo plazo. Se ha demostrado que el grado de
LTP que se obtenga, depende de proporción de NR2A / NR2B y este valor cambia entre
las espinas dendríticas (Matsuzaki y col, 2004). Por eso al inhibir los receptores de
NMDA con la subunidad NR2B se bajaría artificialmente la proporción de las
subunidades NR2A y NR2B y eso permitiría generar una potenciación a largo plazo aún
en presencia del antagonista. Si por el contrario se aplica un protocolo de depresión a
largo plazo el ingreso de Ca++
por las subunidades NR2B sólo permitiría la activación
de la calcineurina y no de la calmodulina kinasa II, por lo tanto la depresión a largo
plazo sería inducida.
5.6 EFECTO DE UNA ESTIMULACIÓN EN VÍA PERFORANTE Y REGISTRO
SIMULTÁNEO DE TRES SITIOS DEL HIPOCAMPO EN LOS MECANISMOS
DE PLASTICIDAD SINÁPTICA COMO LA POTENCIACIÓN Y DEPRESIÓN
A LARGO PLAZO
Al tener un registro simultáneo de los tres principales sitios de relevo en el
hipocampo, y dada la intrincada red de interneuronas inhibidoras, pensamos que un
mismo protocolo de potenciación a largo plazo podría producir depresión en un sitio y
potenciación en otro. A partir de los resultados obtenidos en el presente estudio, se
puede proponer que estimulando en el borde angular los tres sitios de registro
Discusión 106
experimentan simultáneamente la misma respuesta fisiológica con algunas diferencias
en los porcentajes de cambio de la pendiente de los potenciales sinápticos de campo
(fEPSP). Esta diferencia se vio más acentuada en los fEPSP del giro dentado, durante la
prueba de la potenciación a largo plazo. En la figura 4.16 de los Resultados, se
demuestra que existen diferencias en los cursos temporales de los tres sitios sometidos a
una potenciación a largo plazo simultáneamente, ya que la potenciación a largo plazo
obtenida en el giro dentado tiene una duración aproximada de 60 min, lo que
consideraríamos una potenciación corta. En cambio las células piramidales de CA1 y
CA3, al cabo de los 120 min de registro mantienen todavía la potenciación.
En el caso de la depresión a largo plazo, no se observaron diferencias en los
cursos temporales para los tres sitios registrados (ver Figura 4.17), manteniéndose
inhibidas las sinapsis incluso más allá de los 120 minutos registrados (datos no
presentados). Es importante destacar que en los tres sitios registrados se produjo un
descenso simultáneo de los potenciales de campo.
De modo que en este modelo experimental fue posible inducir una potenciación
a largo plazo o una depresión a largo plazo en el hipocampo de manera simultánea en
los principales tipos celulares, aplicando los protocolos adecuados en la vía perforante.
5.7 EFECTO DE LA PRUEBA DE PULSOS PAREADOS EN LAS SINAPSIS
DEL HIPOCAMPO
Existen varias formas de plasticidad a corto plazo, que abarcan desde los
milisegundos a los minutos, las cuales se han descrito desde en invertebrados hasta en
mamíferos (Zucker y Regehr, 2002). Estas formas de plasticidad jugarían importantes
roles en las adaptaciones a estímulos sensoriales, cambios en los estados conductuales y
formas de memoria (Citri y Malenka, 2008). La prueba de pulsos pareados es un
ejemplo de plasticidad sináptica a corto plazo, en la que dos estímulos son aplicados con
un breve intervalo de tiempo y en la que la respuesta al segundo estímulo puede
incrementarse o decrecer con respecto a la evocada por el primero (Katz y Miledi, 1968;
Zucker y Regehr, 2002; Yorns y col., 2004). En el caso de los pares de pulsos que
producen depresión se suelen observar en las sinapsis en las que el intervalo
interestímulo es menor de 20 ms (Citri y Malenka, 2008). Este efecto se produciría
probablemente porque los canales iónicos de sodio o calcio, de tipo voltaje dependiente,
se encuentran todavía en estado inactivo por lo que la llegada de un estímulo no
Discusión 107
generaría un nuevo potencial de acción. Otras posibilidad estaría en una depleción
transitoria de la reserva de vesículas sinápticas que impediría un incremento en la
concentración de neurotransmisor en el espacio sináptico (Citri y Malenka, 2008) o un
incremento en la actividad de las interneuronas inhibitorias (Yorns y col., 2004).
En el caso de la facilitación por pares de pulsos se ha observado cuando los
intervalos interestímulos son mayores, abarcando un rango desde los 20 a 500 ms. Las
posibles explicaciones pasarían por: i) incrementos de la concentración de calcio en el
espacio sináptico que favorezcan una mayor liberación de vesículas sinápticas; o, ii)
activación de cascadas de segundos mensajeros que activarían proteína quinasas (Citri y
Malenka, 2008) las que fosforilarian proteínas presinápticas como la sinapsina, una
proteína de la membrana de la vesícula sináptica que se ancla al citoesqueleto y que al
ser fosforilada, libera las vesículas sinápticas hacia las barras densas de la zona activa.
Un aspecto importante a tener en cuenta en el análisis de los resultados
obtenidos en los experimentos realizados es este estudio es que si una sinapsis expresa
una facilitación o depresión a un determinado protocolo de pulsos pareados, su
respuesta dependerá de la historia reciente de activación de esa sinapsis (Citri y
Malenka, 2008). De modo que si una sinapsis tiene una alta probabilidad de liberar sus
vesículas, tenderá a deprimirse en respuesta al segundo estímulo; por el contrario si la
sinapsis tiene bajas probabilidades de liberación del neurotransmisor, casi siempre se
producirá un incremento en la respuesta al segundo estímulo.
En nuestro estudio se registraron las sinapsis entre la vía perforante y el giro
dentado (Vp-GD), vía perforante y piramidales de CA3 (Vp-CA3) y vía perforante con
piramidales de CA1 (Vp-CA1). Se emplearon siete series de pares de pulso con
intervalos interestímulos crecientes (10, 20, 30, 50, 100, 200 y 500 ms). Además se
utilizaron tres frecuencias de estimulación: 0,03, 1 y 5 Hercios. En el caso de la
frecuencia de 0,03 Hercios se utilizaron estímulos con bajas y altas intensidades.
A la frecuencia de 0,03 Hercios, las principales diferencias se observaron en la
sinapsis Vp-CA1 y en las tres primeras series de pares de pulsos. A baja intensidad y en
los intervalos antes señalados, se observó una inhibición que puede explicarse de
acuerdo con los argumentos antes señalados, es decir una inactivación de los canales
iónicos voltaje dependientes de Na+ y/o Ca
2+. El fenómeno anterior impide la entrada de
corrientes despolarizantes y, por lo tanto, imposibilita la sumación temporo-espacial que
permitiría generar un segundo potencial de acción. Hay que señalar que al ser registros
extracelulares, los potenciales de acción registrados suelen corresponder a potenciales
Discusión 108
de acción compuestos. Sin embargo, cuando se incrementó la intensidad de los
estímulos, la misma sinapsis experimentó una facilitación sináptica en el primer y tercer
par de pulsos. Esto podría significar que a mayores intensidades la cantidad de
neurotransmisor liberado se incrementa y, por lo tanto, ejercen su influencia en un
número mayor de receptores postsinápticos, elevando la excitabilidad y favoreciendo la
sumación temporo-espacial para generar nuevos potenciales de acción. Además, el
incremento de la actividad de las células piramidales de CA1 podría enviarla hacia las
capa III de la corteza entorrinal proporcionando una facilitación en las neuronas de esta
capa, que poseen un alto umbral de excitación, lo cual permitiría una mayor descarga
que sería transferida a las piramidales de CA1 incrementando la excitabilidad de la
región (Bartesaghi y Gressi, 2003).
A la frecuencia de 1 Hercio, las células piramidales de CA1 y CA3 se comportan
de modo diferente a lo que señala la bibliografía. Se esperaría que a intervalos
interestímulos breves, las sinapsis se deprimieran; si embargo, en las tres primeras
series se observó una facilitación. La explicación podría estar en que las series
experimentales fueron sucesivas, empezando con 0,03 Hercios y eso podría mantener un
alto nivel de excitabilidad en estas regiones, por aumento en la cantidad de
neurotransmisores liberados, o aumento en las concentraciones iónicas de Na+ y/o Ca
2+
lo que aumentó las probabilidades de respuesta al segundo estímulo en estas neuronas.
En las pruebas de pares de pulsos a 5 Hercios, se obtuvo una facilitación
sináptica en el primer par de pulsos en las tres regiones registradas. Posteriormente, las
tres regiones experimentaron una depresión en los siguientes tres pares de pulsos, para
finalmente variar entre facilitación, inhibición y facilitación en los últimos tres pares de
pulsos aplicados. La frecuencia de 5 Hercios aplicada es una frecuencia que cae en el
ritmo theta y diversos estudios han demostrado que la generación del ritmo theta puede
no sólo fortalecer las sinapsis glutamatérgicas, sino también las GABAérgicas (Yorns y
col., 2004). Hay que considerar, además, la participación de la glía en la fisiología
sináptica, ya que este elemento celular del sistema nervioso presenta en su membrana
diferentes receptores para neurotransmisores, los cuales al activarse pueden liberar
sustancias como el ATP y actuar sobre los terminales presinápticos modulando la
liberación de los neurotransmisores (Araque y col., 2001; Citri y Malenka, 2008).
En estas variaciones de las respuestas al segundo estímulo con respecto al
primero tenemos que considerar que, en los experimentos in vivo, no se pueden eliminar
los factores extrahipocampales como son las aferencias provenientes de núcleos del
Discusión 109
tronco como el locus coeruleus, rafe medial entre otros, que pueden influenciar en los
cambios electrofisiológicos del hipocampo, así como otras aferencias de origen cortical
y subcortical.
Conclusiones 110
6. CONCLUSIONES
Conclusiones 111
Conclusiones 112
El interés final de este estudio se centró en conocer los cambios en la actividad
sináptica de los tres principales tipos celulares (células de los granos del giro dentado y
células piramidales de CA3 y CA1) del hipocampo, en dos situaciones experimentales:
i) pruebas de aprendizaje asociativo (condicionamiento clásico del reflejo palpebral) y
ii) pruebas de eficacia sináptica como la LTP (long term potentiation) y LTD (long term
depression). Las principales conclusiones obtenidas son las siguientes:
1. Se desarrolló por primera vez un modelo animal que permitió el registro
simultáneo del arco trisináptico del hipocampo in vivo, en ratas adultas y
despiertas, sin afectar la salud o la conducta del animal. El modelo experimental
permitió registrar la actividad electroencefalográfica de los animales en un
estado de libre movimiento y por varias semanas.
2. Durante el condicionamiento clásico, las neuronas del giro dentado y las células
piramidales de CA3 codifican información relacionada al aprendizaje asociativo
con un patrón inverso al que realizan las células piramidales de CA1, expresado
en los valores de las pendientes de los potenciales de campo provocados.
3. De acuerdo con los resultados presentados en este trabajo se puede concluir que
el hipocampo participa en la generación de la respuesta condicionada de manera
diferenciada en sus regiones, empleando el giro dentado y CA3 un patrón
similar, incrementando la pendiente de sus respuestas y las células piramidales
de CA1 exhibiendo un patrón inverso.
4. El fármaco Ro 25-6981 aplicado durante el condicionamiento clásico impidió la
adquisición de las respuestas condicionadas en los animales experimentales.
Aplicado en animales que ya hubiesen aprendido la respuesta condicionada,
durante un período de cinco días, en un período de recondicionamiento, impidió
la expresión de la respuesta condicionada, de modo que la subunidad NR2B
desempeña un papel esencial en la adquisición y expresión de la respuestas
condicionadas.
5. La inhibición de la subunidad NR2B impidió la expresión de la depresión a
largo plazo obtenida en este estudio.
6. La inhibición de la subunidad NR2B no impidió que los animales
experimentales expresaran una potenciación a largo plazo.
Conclusiones 113
7. Los receptores de NMDA son necesarios para la generación y expresión de las
respuestas condicionadas, especialmente su subunidad NR2B. Dicha subunidad
sería necesaria para que se genere y exprese la LTD, pero no así para la LTP.
8. Durante el condicionamiento clásico del reflejo palpebral, en el paradigma de
traza, se observó un incremento en el área bajo la curva de la actividad
electromiográfica rectificada y en la amplitud de la respuestas condicionadas.
Dicha incremento está estrechamente relacionado con la adquisición de la
respuesta condicionada ya que no se observa en los animales
pseudocondicionados.
9. Las neuronas piramidales de CA3 y CA1 a iguales frecuencias de estimulación
pero a diferentes intensidades, modifican sus respuesta a pares de estímulos en el
rango de los 10 a los 30 ms.
10. Existen diferencias en los cursos temporales en los tres sitios registrados del
hipocampo, cuando son sometidos a una potenciación a largo plazo simultánea,
siendo el giro dentado quien experimentan un descenso en su actividad más
tempranamente.
11. La estimulación simultánea en el hipocampo produce variaciones en las
respuestas temporales lo cual indicaría que las interneuronas inhibitorias estarían
jugando un papel importante en las generación de respuestas de eficacia
sináptica del tipo LTP.
En resumen, los principales resultados obtenidos en esta tesis doctoral nos
permiten señalar la necesidad de incrementar estos estudios en animales vivos y en
condiciones fisiológicas a fin de mantener las influencias de los factores
extrahipocampales sobre el hipocampo, especialmente las provenientes desde otras
estructuras corticales y subcorticales.
Referencias Bibliográficas 114
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Anexo 115
8. ANEXOS
Contribution of NMDA receptor NR2B subunit to synapticplasticity during associative learning in behaving rats
Mauricio Valenzuela-Harrington, Agnes Gruart and Jose M. Delgado-GarcıaDivision de Neurociencias, Universidad Pablo de Olavide, Ctra. de Utrera, Km. 1, 41013-Sevilla, Spain
Keywords: classical conditioning; hippocampus; LTD; LTP; NMDA receptor; NR2B subunits
Abstract
The difference in the amounts of NR2 subunits contained in NMDA receptors of the hippocampus has been related to their differentinvolvement in activity-dependent synaptic plasticity. Here, we show that Ro 25-6981, a high-affinity and selective blocker of NMDAreceptors containing NR2B subunits, is able to block the acquisition of a trace conditioning paradigm in adult rats, a task that requiresthe active participation of hippocampal circuits. Reconditioning with the same trace paradigm was also prevented by Ro 25-6981. Inaddition, we show that the slope of monosynaptic field excitatory postsynaptic potentials evoked at the dentate gyrus by single pulsespresented to the medial perforant pathway increases significantly across conditioning sessions and during reconditioning, in a linearrelationship with the increase in the number of classically conditioned eyelid responses. Administration of Ro 25-6981 preventedthese learning-related changes in synaptic strength at the perforant pathway–dentate granule cell synapse. The present resultssuggest the involvement of NR2B-containing NMDA receptors in hippocampal functions related to both associative learning andactivity-dependent synaptic plasticity.
Introduction
The NMDA receptor (NMDAR) plays a crucial role in the activity-dependent synaptic processes underlying learning and memory. TheNMDAR has a heteromeric nature, presenting NR1, NR2A-D andNR3A-B subunits (Mori & Mishina, 1995). In the hippocampus ofadult mammals, NMDARs are assembled from NR1 and NR2Aand ⁄ or NR2B subunits (Kohr et al., 2003). It has been proposed thatthe functional properties of NMDARs depend, at least in part, on thetype of NR2 subunit incorporated (Perez-Otano & Ehlers, 2005;Bartlett et al., 2007; Neyton & Paoletti, 2006). The availability ofNR2A subunits increases with age, whereas the opposite trend isfound for NR2B subunits (Watanabe et al., 1993), but it is assumedthat NR2B subunits do have a role (one that is not well defined) in theenhancement of learning and memory functions (Tang et al., 2001;Loftis & Janowsky, 2003; Zhao et al., 2005).There is some controversy regarding the function of NMDARs
containing NR2B subunits. For example, it has been shown thatoverexpression of NR2B subunits increased both learning capabilitiesand long-term potentiation (LTP), with no changes in long-termdepression (LTD; Tang et al. 1999), but mutant mice defective inNR2B subunits show an impairment in hippocampal LTD (Kutsuwadaet al., 1996). Recently, it has been proposed that NR2A-containingNMDARs are required for LTP, whereas NR2B subunits are requiredfor LTD (Liu et al., 2004; Massey et al., 2004), a proposal notconfirmed by others (Berberich et al., 2005; Bartlett et al., 2007).Indeed, a role of NR2B subunits in LTP has been described at theCA3–CA1 synapse (Kohr et al., 2003; Berberich et al., 2005) and inthe anterior cingulate cortex (Zhao et al., 2005).Here, we studied the effects of Ro 25-6981 on the acquisition and
reconditioning of classically conditioned eyelid responses (CRs) using
a trace paradigm, and on the slope of field excitatory postsynapticpotentials (fEPSPs) evoked at the dentate gyrus by single pulsespresented at the medial perforant pathway. Ro 25-6981 is an activity-dependent and highly selective blocker of NMDARs containing NR2Bsubunits (Fisher et al., 1997). In trace conditioning, the conditionedstimulus (CS) is separated from unconditioned stimulus (US) presen-tation by a stimulus-free interval. Trace conditioning requires an intacthippocampus (Moyer et al., 1990), and it has been shown recently thathippocampal synaptic strength is modulated by this type of associativelearning (Gruart et al., 2006). Moreover, trace conditioning is severelyaffected in NR2B heterozygous mutant mice (Takehara et al., 2003).Adult rats were prepared for the chronic recording of the electromy-ographic (EMG) activity of the orbicularis oculi muscle and for theelectrical stimulation of the supraorbitary nerve. A tone was used as aCS and, after a time interval of 500 ms, an electrical shock waspresented to the supraorbitary nerve as a US. Modulation in thesynaptic strength of the perforant pathway–dentate granule cellsynapse during the acquisition and reconditioning of associativelearning in controls and following the administration of Ro 25-6981was also studied here, following technical developments describedrecently (Gruart et al., 2006; Whitlock et al., 2006). The presentresults provide substantial evidence of the involvement of NR2B-containing NMDARs both in hippocampally dependent associativelearning and in activity-related changes in the synaptic strength of theperforant pathway–dentate granule cell synapse.
Materials and methods
Subjects
Experiments were performed on adult male Wistar rats (3 months old;200–250 g) obtained from an official supplier (University of GranadaAnimal House, Granada, Spain). Before surgery, animals were housedin separate cages (3–4 per cage) and kept on a 12-h ⁄ 12-h light ⁄ dark
Correspondence: Professor J. M. Delgado-Garcıa, as above.E-mail: [email protected]
Received 11 October 2006, revised 26 November 2006, accepted 28 November 2006
European Journal of Neuroscience, Vol. 25, pp. 830–836, 2007 doi:10.1111/j.1460-9568.2007.05325.x
ª The Authors (2007). Journal Compilation ª Federation of European Neuroscience Societies and Blackwell Publishing Ltd
cycle with constant temperature (21 ± 1 �C) and humidity (50 ± 7%).Food and water were provided ad libitum. Behavioral and electro-physiological studies were conducted in accordance with the guide-lines of the European Union Council (86 ⁄ 609 ⁄ EU) and followingSpanish regulations (BOE 67 ⁄ 8509-12, 1988) for the use of laboratoryanimals in chronic experiments. Experiments were approved by thelocal Ethics Committee.
Surgery
Animals were anesthetized with 4% chloral hydrate (0.5–1 mL ⁄ 100 g,i.p.) following a protective injection of atropine sulfate(0.1 mg ⁄ 100 g, i.m.). Animals aimed exclusively for classical condi-tioning (n ¼ 15) were implanted with bipolar EMG recordingelectrodes in the left orbicularis oculi muscle and with bipolarstimulating electrodes on the ipsilateral supraorbitary branch of thetrigeminal nerve (Fig. 1A). Electrodes were made of 50-lm, Teflon-coated, annealed stainless steel wire (A-M Systems, Carlsborg, WA,USA), and with their tips bared of the isolating cover for � 0.5 mm.The electrode tips were bent as a hook to facilitate a stable insertion inthe upper eyelid tissues. A 0.1-mm bare silver wire was affixed to theskull as a ground. Wires were connected to a five-pin socket (RSAmidata, Madrid, Spain), and the socket was fixed to the skull withthe help of three small screws and dental cement (Domınguez-del-Toro et al., 2004).
Animals selected for classical conditioning and fEPSP recordings(n ¼ 12) were anesthetized as described above and implanted withsimilar recording and stimulating electrodes in the left orbicularis oculi
muscle. As illustrated in Fig. 1A, stereotaxic coordinates (Paxinos &Watson, 1986) were followed to implant these animals with bipolarstimulating electrodes in the dorsomedial aspect of the right angularbundle (6.8 mm posterior and 3 mm lateral to Bregma; depth frombrain surface, 2 mm) and with three recording electrodes aimed at thegranular cell layer and ⁄ or the hilus of the right dorsal dentate gyrus(3.6 mm posterior and 1.2 mm lateral to Bregma; depth, 3.2–3.6 mm).These electrodes were made of 25-lm, Teflon-coated tungsten wire(Advent Research Materials, Eynsham, UK). Animals were alsoimplanted with a 0.1-mm bare silver wire as ground. All wires (fourimplanted in the left eyelid, five implanted in the right cerebral cortex,and a ground) were soldered to two five-pin sockets, and the socketswere fixed to the skull as indicated above (Gruart et al., 2006).
Classical conditioning
For conditioning, the animal was placed in a Faraday box(30 · 30 · 30 cm), and the stimulating and recording wires wereconnected to the implanted socket. Sessions started 10 days aftersurgery. Classical conditioning was achieved with a trace paradigm(Fig. 2A). For this, a tone (50 ms, 2.4 kHz, 85 dB) was presented as aCS. The US started 500 ms from CS onset, and consisted of a 500-ls,3· threshold, square, cathodal pulse (< 0.8 mA). A total of fourhabituation, ten conditioning and five extinction sessions were
Fig. 1. Experimental design. (A) Animals aimed for classical conditioningwere implanted with bipolar electromyographic (EMG) recording electrodes inthe orbicularis oculi (O.O.) muscle of the upper left eyelid. For trace eyeblinkconditioning, a tone was presented as a conditioned stimulus (CS). The CS wasfollowed 500 ms from its onset by an unconditioned stimulus (US) consistingof an electrical shock applied to the supraorbitary nerve. As shown in the topdiagram, another group of animals was prepared for recording the fieldexcitatory postsynaptic potential (fEPSP) evoked on dentate granule cells bythe electrical stimulation of the medial perforant pathway. For this, animalswere implanted with stimulating (St.) and recording (Rec.) electrodes aimed atactivating medial perforant pathway projections to the dentate gyrus. (B and C)Photomicrographs illustrating the location of recording (B) and stimulating(C) sites (arrows). Scale bar ¼ 500 lm. Abbreviations: D, L, M, V, dorsal,lateral, medial, ventral; DG, dentate gyrus.
Fig. 2. Learning curves in conditioned (control), pseudoconditioned andRo 25-6981-injected animals. (A) A schematic representation of the condi-tioning paradigm, illustrating the conditioned (CS) and unconditioned (US)stimuli. An example of an electromyographic (EMG) record collected from theeighth conditioning session of a control animal is illustrated. (B) Evolution ofthe percentage of conditioned responses (CRs) during the successive sessionsfor control, pseudoconditioned and Ro 25-6981-injected animals. Ro 25-6981(10 mg ⁄ kg, i.p.) was administered 30 min before each conditioning session.Control and pseudoconditioned animals were injected with vehicle (DMSO).Mean percentage values and their SEM are given. Differences between controland pseudoconditioned and Ro 25-6981-injected groups were statisticallysignificant for all conditioning and extinction sessions (asterisks, P < 0.01).
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performed (Fig. 2B). For the experiment illustrated in Fig. 3 below, tenadditional reconditioning sessions were carried out. A conditioningsession consisted of 60 CS–US presentations separated at random by30 ± 5 s. Conditioning sessions lasted � 30 min. For habituation andextinction sessions, the CS was presented alone, also for 60 times persession at intervals of 30 ± 5 s. For reconditioning, we followed thesame procedure as for conditioning. Pseudoconditioned animalsreceived ten sessions of unpaired CS and US presentations, as wellas four habituation and five extinction sessions (Domınguez-del-Toroet al., 2004).
Recording and stimulation procedures
EMG recordings were performed using Grass P511 differentialamplifiers with a bandwidth of 0.1 Hz to 10 kHz (Grass-Telefactor,West Warwick, RI, USA). As a criterion, we considered a ‘CR’ as thepresence, during the CS–US period, of EMG activity lasting > 20 msand initiated > 50 ms after CS onset. In addition, the integrated EMGactivity recorded during the CS–US interval had to be 2.5 timesgreater than the averaged activity recorded 500 ms before CSpresentation (Gruart et al., 2006). For hippocampal recordings, weused the same Grass amplifiers, with a high-impedance probe(2 · 1012 W, 10 pF). To determine the final location of dentate gyruselectrodes, we used, as a guide, the field potential depth profile evokedby paired (interval of 10–50 ms) pulses presented to the medialperforant pathway. The middle of the three recording electrodes wasfixed at the site where a reliable monosynaptic (� 2–3 ms) fEPSP wasrecorded (McNaughton, 1980; Kosub et al., 2005). For in vivorecordings during classical conditioning, the stimulus intensity was setat 30–40% of the intensity necessary for evoking a maximum fEPSPresponse (Gureviciene et al., 2004). An additional criterion forselecting stimulus intensity was that a second stimulus, presented 10–50 ms after a conditioning pulse, evoked a larger (> 20%) fEPSP(Bliss & Gardner-Medwin, 1973).
Drugs and histology
R-(R*,S*)-a-(4-hydroxyphenyl)-b-methyl-4-(phenylmethyl)-1-piperi-dine propranolol (Ro 25-6981) hydrochloride (Sigma, Madrid, Spain)was dissolved in DMSO (vehicle) at a concentration of 10 mg ⁄ mL.Animals received 10 mg ⁄ kg (i.p.) of this solution or the same volumeof DMSO. At the end of the experiments, rats were re-anesthetized(sodium pentobarbital, 50 mg ⁄ kg), and perfused transcardially withsaline and 4% phosphate-buffered paraformaldehyde. Selected sec-tions (50 lm) were mounted on gelatinized glass slides and stained
Fig. 3. Learning curves and evolution of the synaptic field potential incontrols and in Ro 25-6981-injected animals. (A) A representation of theexperimental paradigm, including the conditioned (CS) and unconditioned (US)stimuli, and the moment at which a single pulse (100 ls, square, biphasic) waspresented to the medial perforant pathway (vertical arrow). An example of anelectromyographic (EMG) recording from the orbicularis oculi muscle (O.O),obtained from the eighth conditioning session of a control animal, is illustrated,as well as an extracellular recording of dentate gyrus activity from the sameanimal, session and trial. Note the field excitatory postsynaptic potential(fEPSP) evoked by the single pulse presented to the perforant pathway (smallarrow, St.). Calibrations are indicated for both traces. (B) Effects ofRo 25-6981 during reconditioning. A group of animals were injected withRo 25-6981 (10 mg ⁄ kg, i.p., closed circles) during the first five sessions ofreconditioning (shaded rectangle). Mean percentage values of conditionedresponses and their SEM are illustrated. Differences with the corresponding(first–fifth) reconditioning sessions of controls (open circles) were statisticallysignificant (asterisks, P < 0.001). From the sixth session onwards, animalsfrom the experimental group (closed circles) were maintained under the samereconditioning protocol, with no further administration of Ro 25-6981, but theywere unable to reach control values (sixth–tenth sessions, P < 0.001).(C) Evolution of fEPSPs evoked at dentate granule cells by single pulsesapplied to the perforant pathway for controls (open triangles) and Ro 25-6981-injected animals (closed triangles). Injection sessions are indicated by theshaded rectangle. At the top are illustrated representative examples of fEPSPsrecorded from controls and experimental animals during the third habituation(left), the ninth conditioning (middle) and the third reconditioning (right)sessions. The graphs at the bottom show the evolution of the fEPSP slope forcontrols and experimental groups. fEPSP slopes from controls and experimen-tal animals during the first–fifth reconditioning sessions were significantlydifferent (P < 0.001), as well as during the following sixth–ninth sessions(P < 0.001).
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with 0.1% Toluidine blue to determine the location of recording andstimulating electrodes (Fig. 1B and C).
Data analysis
EMG and hippocampal recordings were stored digitally on a computerthrough an analog ⁄ digital converter (CED 1401 Plus, Cambridge,UK), at a sampling frequency of 11–22 kHz with an amplituderesolution of 12 bits. Commercial computer programs (Spike 2 andSIGAVG from CED) were modified to represent EMG and fEPSPrecordings. Data were analysed off-line for quantitation of CRs andthe fEPSP slope with the help of custom-designed representationprograms (Domınguez-del-Toro et al., 2004; Gruart et al., 2006). Theslope of evoked fEPSPs was collected as the first derivative (V ⁄ s) offEPSP records (V). For this, five successive evoked field synapticpotentials were averaged, and the mean value of the slope wasdetermined for the rise-time period (i.e. the period of the slopebetween the initial 10% and the final 10% of the evoked fieldpotential). Computed results were processed for statistical analysisusing the SPSS for Windows package. Unless otherwise indicated,data are represented as mean ± SEM. Collected data were analysedusing a two-way anova test, with time or session as the repeatedmeasure, coupled with contrast analysis when appropriate. Repeated-measures anova allowed us to check the statistical differences of thesame group across sessions. Regression analysis was used to find therelationship between the fEPSP slope and the percentage of condi-tioned responses during the different learning situations.
Results
First, we confirmed that electrode implantation in the upper eyelid didnot disturb reflexively evoked eyeblink responses. We found that theelectrical stimulation (2· threshold) of the supraorbitary nerve evokedan early (6–7 ms) activation of the orbicularis oculi muscle, followedby a second, more variable (15–25 ms) EMG activation. Thesesuccessive muscle activations corresponded to the R1 and R2components described in humans (Kugelberg, 1952), cats (Gruartet al., 1995) and mice (Domınguez-del-Toro et al., 2004).
In a first series of experiments, we compared the learningcapabilities of control (n ¼ 5), pseudoconditioned (n ¼ 5) andRo 25-6981-injected (n ¼ 5) rats, using a trace conditioning para-digm. Animals included in the Ro 25-6981 group were injected30 min before each conditioning session. Both control and pseudo-conditioned animals were injected with vehicle (DMSO). As illustra-ted in Fig. 2, control animals presented the normal learning curvepreviously described in mice when using a similar trace conditioningprocedure (Gruart et al., 2006). These animals presented a mean of30.3 ± 1.9% responses during the fourth conditioning session, andreached asymptotic values by the 9th)10th conditioning sessions(> 59% responses, see Fig. 2B). By contrast, both pseudoconditionedand Ro 25-6981-injected animals presented very poor learningperformances, never reaching values above those recorded duringthe habituation sessions (Fig. 2B). Ro 25-6981-injected animals neverreached > 7% of CRs during conditioning sessions, i.e. the same levelreached during habituation sessions. Given that they presented normalblink reflexes in response to electrical stimulation of the supraorbitarynerve, but were unable to develop noticeable eyelid CRs, the absenceof the latter responses was not due to any technical problem with theEMG recording system, nor to any motor impairment in facial motoror premotor pathways. Moreover, Ro 25-6981 administration did notevoke any observable abnormal behavior in the injected animals. The
percentages of CRs collected from controls as compared withpseudoconditioned and Ro 25-6981-injected animals were signifi-cantly different (P < 0.01, two-way anova, F36,144 ¼ 30.7) for allconditioning and extinction sessions.To confirm further the deficits presented by Ro 25-6981-injected
animals for the acquisition of CRs, we designed a second series ofexperiments. First, animals (n ¼ 12, divided into two groups:controls, open circles; experimental, closed circles, Fig. 3B) under-went a complete cycle of habituation, conditioning and extinctionsessions (Fig. 3B). Both groups of animals acquired CRs to a levelsimilar to that presented by the control group illustrated in Fig. 2B.One day after the fifth extinction session, the two groups of animalswere reconditioned, but in this case the experimental group wasinjected with Ro 25-6981 30 min before each of the first fiveconditioning sessions (shaded rectangle in Fig. 3B). As expected,reconditioned animals of the control group presented a fasteracquisition rate than during conditioning sessions. By contrast, duringthe five (first–fifth) reconditioning sessions in which animals of theexperimental group were injected with Ro 25-6981, they presentedpercentages of CRs similar to those reached during the habituationsessions. In fact, the percentage of CRs reached during the first fivereconditioning sessions by the experimental group was significantlylower than the values reached during the same sessions by the controlgroup (P < 0.001, repeated-measures anova, F9,45 ¼ 27.34;Fig. 3B). As soon as we stopped the administration of Ro 25-6981(sixth–tenth reconditioning sessions), animals acquired CRs at theexpected rate (Fig. 3B), but they were still unable to reach valuessimilar to those of the control group (F9,45 ¼ 27.34, P < 0.001) forthe same set of sessions.As explained in Fig. 3A, this second series of experiments included
the presentation of a single electrical pulse to the medial perforantpathway 300 ms after CS presentation. Figure 3A shows a singlerecording of the fEPSP evoked in a control animal during the eighthconditioning session. Although the stimulus presented to the perforantpathway disrupted the regular theta rhythm recorded in the localelectroencephalogram for � 200 ms, the rhythm reappeared in phaseafterwards. fEPSPs evoked in the dentate gyrus of the two groups(control and experimental) increased progressively in slope (taking theslope of fEPSPs collected during the four habituation sessions as100%) across conditioning to a maximum of � 125% during the tenthconditioning session (Fig. 3C). Thus, the fEPSP slopes recorded fromthe fourth to the tenth conditioning sessions were significantlydifferent from values collected during habituation sessions(F18,90 ¼ 54.32, P < 0.01). During extinction, the fEPSP slopedecreased to a minimum of � 90% during the fourth extinctionsession for both groups of animals, but values collected were notsignificantly different from those obtained during habituation sessions.Moreover, fEPSP slopes for the two groups (control and experimental)presented no significant differences for habituation, conditioning andextinction sessions (F18,90 ¼ 0.37, P ¼ 0.741; Fig. 3C). By contrast,fEPSP slopes recorded during the first five reconditioning sessions(shaded rectangle, Fig. 3C) for the experimental group (i.e. wheninjected with Ro 25-6981) were significantly smaller than thecorresponding values collected in the control group (F9,45 ¼ 83.04,P < 0.001). Significant differences in fEPSP slopes between thecontrol and experimental groups were still present for the sixth–ninthsessions (when no further Ro 25-6981 was administered).As illustrated in Fig. 4A, the slope of fEPSPs evoked by the
electrical stimulation of the medial perforant pathway at dentategranule cells was linearly related (r ‡ 0.75, P < 0.001) to thepercentage of CRs across sessions of conditioning (slope, 1.78),extinction (slope, 1.11) and reconditioning (slope, 1.04), but not
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habituation. As already reported for the CA3–CA1 synapse (Gruartet al., 2006), the fact that the slopes of the three regression lines weresimilar suggests that the activity-dependent plasticity at the perforantpathway–dentate gyrus synapse functions as a continuum for thesedifferent (conditioning, extinction, reconditioning) learning situations.Similar results were obtained from the experimental group in theabsence of Ro 25-6981. By contrast, Ro 25-6981 administration(during the first–fifth reconditioning sessions) to the experimentalgroup not only impeded the CR reacquisition and fEPSP potentiation,but also prevented any significant relationship between the percentage
of CRs and fEPSP slopes (r ¼ 0.36, P ¼ 0.689; Fig. 4B, shadedcircles).
Discussion
Based on the present results, NR2B-containing NMDARs play adefinite role both in the acquisition (and reacquisition after extinctionsessions) of associative learning in alert behaving adult rats and in theactivity-dependent synaptic plasticity at the medial perforant pathway–dentate gyrus synapse. These results confirm previous findingsregarding the involvement of the NR2B subunits in mechanismsunderlying the generation of LTP signals, as shown at the CA3–CA1synapse (Kohr et al., 2003; Berberich et al., 2005) and at the anteriorcingulate cortex (Zhao et al., 2005). In fact, a link between functionalsynaptic potentiation during the acquisition of associative learning andLTP processes has been convincingly demonstrated recently during invivo experiments carried out in mice (Gruart et al., 2006) and rats(Whitlock et al., 2006). In this regard, it has also been shown thatNR2B subunits seem to play a critical role in classical eyeblinkconditioning in GluRe2 (NR2B) heterozygous mutant mice (Takeharaet al., 2003).However, the present results cannot be related to the generation of
LTD signals, as demonstrated in vitro using hippocampal (Liu et al.,2004) and perirhinal cortex (Massey et al., 2004) slices, and in mutantmice defective for NMDA NR2B subunits (Kutsuwada et al., 1996).The main reason is that the slope of the fEPSP evoked in the dentategyrus by single pulses presented in the medial perforant pathwayduring the CS–US interval increased (i.e. did not decrease, as wouldbe expected in an LTD-related process) across conditioning andreconditioning sessions. Ro 25-6981 evoked a disfacilitation of thephysiological synaptic drive across conditioning. In this regard, it hasbeen recently reported that Ro 25-6981 reduces selectively LTP, butnot LTD, evoked in the CA1 region of hippocampal slices (Bartlettet al., 2007). Moreover, whereas LTP is easily evoked in vivo at theperforant pathway–dentate gyrus synapse (Fazeli et al., 1993), LTD isnot (Kemp & Bashir, 2001). It is also important to point out that thecerebellum cannot be involved in the learning deficits evoked byRo 25-6981, because in the adult state this structure is devoid ofNR2B subunits (Watanabe et al., 1993; Mori & Mishina, 1995). Infact, NR2B subunits are substituted in the adult cerebellum by NR2Csubunits (Watanabe et al., 1993; Mori & Mishina, 1995).The present results also indicate that the physiological potentiation
of the medial perforant pathway–dentate granule cell synapse isrelated to the process of acquisition of new learning abilities, as is LTP(Do et al., 2000; Abraham & Williams, 2003), and that NR2B-containing NMDARs seem to be necessary for this process to occur(Kohr et al., 2003; Berberich et al., 2005; Zhao et al., 2005). On theother hand, the present results cannot be reasonably ascribed to LTD-related processes (Liu et al., 2004). As discussed below, it is stillpossible that NR2B subunits play a dominant homeostatic and ⁄ orregulatory role in the adult brain, being preferentially involved indepotentiation processes following the activation of NR2A-containingNMDARs (Abraham & Williams, 2003; Perez-Otano & Ehlers, 2005).In a seminal study, Weisz et al. (1984) demonstrated a potentiation
of synaptic activation of dentate granule cells by perforant pathwayaxons during the acquisition of nictitating membrane CRs. Thismodulation in synaptic strength during the learning process has beenconfirmed here for the same synaptic pathway, as well as for theCA3–CA1 synapse (Gruart et al., 2006; Whitlock et al., 2006).Apparently, trace conditioning requires an activity-dependent modi-fication of synaptic responsivity for learning to occur (Weisz et al.,
Fig. 4. Quantitative analysis of the relationships between percentage ofconditioned responses and fEPSP slopes for the two groups (controls andRo 25-6981-injected) illustrated in Fig. 3. (A) Data collected from the controlgroup. Each point represents the mean value collected from a single animalduring the corresponding session: habituation (closed triangles), conditioning(closed circles), extinction (closed squares) and reconditioning (open circles).Regression lines and their corresponding equations are included only forcoefficient of correlation (r > 0.6). The P-values for each regression analysisare always indicated. (B) Data collected from the experimental group.Symbols and analysis are similar to data illustrated in A. Results obtained inthe first–fifth reconditioning sessions, during which Ro 25-6981 was injected,are indicated by the arrow (shaded circles). Data from the sixth–tenthreconditioning sessions are indicated by open circles. Note that there was nolinear relationship between conditioned responses and fEPSP slopes (r > 0.36,P ¼ 0.689) in Ro 6981-injected animals during the first–fifth reconditioningsessions.
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1984; Gruart et al., 2006), and could be linked to the activation ofNR2B-containing NMDARs, as Ro 25-6981 was able to block bothsynaptic potentiation and the acquisition of classically conditionedeyelid responses. In fact, the decrease in fEPSP amplitude duringRo 25-6981 application can be tentatively explained as a down-regulation of the AMPA receptor, resulting probably from thesustained blockage of the NMDA receptor (Zhong et al., 2006). Inaccordance, the NR2B-containing NMDARs located in selectivehippocampal postsynaptic sites could play a regulatory and ⁄ orhomeostatic role (Perez-Otano & Ehlers, 2005), contributing tosynaptic depotentiation (Abraham & Williams, 2003) or weakeningof synaptic transmission (Kim et al., 2005).
A parsimonious approach to the present results and to thecontradictory (Kutsuwada et al., 1996; Tang et al., 1999; Liu et al.,2004; Massey et al., 2004; Berberich et al., 2005) reports on theNR2B-containing NMDARs suggests that NR2B subunits playdifferent roles in synaptic development and plasticity, depending onthe developmental stage and on the synaptic circuits and brain areasinvolved. For example, mice overexpressing immature NR2B subunitspresent enhanced hippocampal LTP and higher learning capabilities(Tang et al., 1999), whereas mutant mice defective in NR2B subunitspresent an impairment for evoking LTD at the hippocampal CA3–CA1synapse. Nevertheless, the increased availability or the blocking ofNR2B subunits might produce different effects on LTD or LTP,depending on the neural sites or on the activation of differentintracellular pathways (Liu et al., 2004). Thus, the reported contra-dictions indicate the presence of many different homeostatic andregulatory processes involving the different types of NMDARs (Perez-Otano & Ehlers, 2005).
Acknowledgements
This study was supported by grants from the Spanish MCYT (BFU2005-01024and BFU2005-02512) and Junta de Andalucıa (CTS-168). M.V.-H. was avisiting predoctoral fellow. We thank Ms Marıa Esteban for animal care andhandling and Mr Roger Churchill for his editorial help.
List of abbreviations
CS, conditioned stimulus; CR, conditioned responses; EMG, electromyo-graphic; fEPSP, field excitatory postsynaptic potential; LTD, long-termdepression; LTP, long-term potentiation; NMDARs, NMDA receptors; US,unconditioned stimulus.
References
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