actividad de raoultella sp. como entomopatógena de t
TRANSCRIPT
![Page 1: Actividad de Raoultella sp. como entomopatógena de T](https://reader035.vdocuments.co/reader035/viewer/2022080219/62e854f7dd335118db12d9da/html5/thumbnails/1.jpg)
1
Actividad de Raoultella sp. como entomopatógena de Tecia solanivora frente a: AHLs (N-acil homoserina lactonas), co-inoculaciones, una
formulación preliminar y compatibilidad con insumos agrícolas
Diana Katherine Moreno Quintana María Camila Obando León
Asesor interno Carolina Jaime Rodríguez
Especialista y Magíster en Gestión Ambiental - Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca
Asesor externo Dr. Javier Vanegas Guerrero - Universidad Antonio Nariño
Bogotá D.C, 2018
![Page 2: Actividad de Raoultella sp. como entomopatógena de T](https://reader035.vdocuments.co/reader035/viewer/2022080219/62e854f7dd335118db12d9da/html5/thumbnails/2.jpg)
2
PRINCIPALES DEPARTAMENTOS PRODUCTORES DE
PAPA EN COLOMBIA
![Page 3: Actividad de Raoultella sp. como entomopatógena de T](https://reader035.vdocuments.co/reader035/viewer/2022080219/62e854f7dd335118db12d9da/html5/thumbnails/3.jpg)
En Colombia se cultivan 60
variedades de papa en 130.000
hectareas
Su producción es de 2.751.837 toneladas.
La papa en Colombia genera anualmente cerca
de 264 mil empleos.
Ministerio de agricultura y desarrollo rural (2018) 3
![Page 4: Actividad de Raoultella sp. como entomopatógena de T](https://reader035.vdocuments.co/reader035/viewer/2022080219/62e854f7dd335118db12d9da/html5/thumbnails/4.jpg)
Boletín de la papa. Corpoica (2000)
Tecia solanivora Ocasiona
perdidas
económicas
entre el 30 -50%
de los costos de
producción.
4
Parte del ciclo de
vida de la polilla se
desarrolla bajo el
suelo, lo que dificulta
su control.
![Page 5: Actividad de Raoultella sp. como entomopatógena de T](https://reader035.vdocuments.co/reader035/viewer/2022080219/62e854f7dd335118db12d9da/html5/thumbnails/5.jpg)
5
Control químico contra T. solanivora
Boletín de la papa. Corpoica (2000)
● Resistencia de la plaga a los insecticidas
● Destrucción de los enemigos naturales
● Presencia de residuos químicos en los
tubérculos.
● Contaminación de los suministros de aguas y
daños irreversibles en los suelos.
![Page 6: Actividad de Raoultella sp. como entomopatógena de T](https://reader035.vdocuments.co/reader035/viewer/2022080219/62e854f7dd335118db12d9da/html5/thumbnails/6.jpg)
ANTECEDENTES
6
![Page 7: Actividad de Raoultella sp. como entomopatógena de T](https://reader035.vdocuments.co/reader035/viewer/2022080219/62e854f7dd335118db12d9da/html5/thumbnails/7.jpg)
7
Biocontrol de T. solanivora
Cortes, A. (2004) actividad bio-
controladora de Serratia
marcescens contra T.
solanivora (59-65%).
Suquillo et al, (2012)
Baculovirus y Bacillus
thuringiensis contra T.
solanivora (98%).
Baculovirus presenta una eficacia
del 80% contra T. solanivora, en
cultivos de papa, especialmente,
en papas almacenadas. Quiroga,
et al, (2014).
Son limitados los reportes
del control de T. solanivora
con el uso de rizobacterias.
![Page 8: Actividad de Raoultella sp. como entomopatógena de T](https://reader035.vdocuments.co/reader035/viewer/2022080219/62e854f7dd335118db12d9da/html5/thumbnails/8.jpg)
8
Raoultella sp. como mejor
opción ■ Tiene actividad
entomopatógena y producción de AHLs.
■ Al ser rizobacteria garantiza la colonización de la planta actuando en el área deseada.
Pantoja 2018
![Page 9: Actividad de Raoultella sp. como entomopatógena de T](https://reader035.vdocuments.co/reader035/viewer/2022080219/62e854f7dd335118db12d9da/html5/thumbnails/9.jpg)
9
Quorum sensing (QS) es un mecanismo de comunicación basado por moléculas señal como Acil hemoserina lactona, influenciado por la densidad de la población.
Las AHLs :
Bio-películas, expresión de factores de virulencia, producción de metabolitos secundarios y mecanismos de resistencia al estrés
Venturi 2003
![Page 10: Actividad de Raoultella sp. como entomopatógena de T](https://reader035.vdocuments.co/reader035/viewer/2022080219/62e854f7dd335118db12d9da/html5/thumbnails/10.jpg)
Actividad biológica de Raoultella sp.
10
Anandhakumar y Zeller (2008) Raoultella sp inhibe a
Phytophthora spp.
Kotan et. al, (2009) Raoultella sp. Inhibe a Aspergillus
flavus.
Li et. al, (2014) Raoultella terrigena protege plantas de
tomate contra nematodos.
![Page 11: Actividad de Raoultella sp. como entomopatógena de T](https://reader035.vdocuments.co/reader035/viewer/2022080219/62e854f7dd335118db12d9da/html5/thumbnails/11.jpg)
Formulación de bacterias entomopatógenas
11
Rosas N. (2002) selección de cepas de Bacillus thuringiensis con
actividad tóxica contra Diatraea sp, aumento la viabilidad mediante
polímeros bio-degradables como el almidón de maíz y la gelatina.
Rosas N. (2008), el desarrollo de las formulaciones insecticidas
elaboradas a base de la bacteria Bacillus thuringiensis determina el
éxito del inoculante.
![Page 12: Actividad de Raoultella sp. como entomopatógena de T](https://reader035.vdocuments.co/reader035/viewer/2022080219/62e854f7dd335118db12d9da/html5/thumbnails/12.jpg)
BIO-CONTROLADOR
Actividad
Compatibilidad:
Insumos químicos
Colonización y Persistencia:
Formulación
Condiciones para un buen bio-controlador
12
![Page 13: Actividad de Raoultella sp. como entomopatógena de T](https://reader035.vdocuments.co/reader035/viewer/2022080219/62e854f7dd335118db12d9da/html5/thumbnails/13.jpg)
OBJETIVOS
13
Objetivo general: Potenciar la actividad de Raoultella sp. como entomopatógena de T. solanivora mediante el uso de
AHLs (N-Acil homoserin lactona), co-inoculaciones, una formulación preliminar y compatibilidad
con insumos agrícolas.
Objetivos específicos: 1. Definir el efecto de las AHLs sintéticas sobre los mecanismos de acción
2. Determinar la viabilidad de Raoultella.
3. Evaluar la co-inoculación entre Raoultella sp. y una rizobacteria promotora de
crecimiento vegetal.
4. Determinar la compatibilidad de Raoultella sp. con los insumos químicos.
![Page 14: Actividad de Raoultella sp. como entomopatógena de T](https://reader035.vdocuments.co/reader035/viewer/2022080219/62e854f7dd335118db12d9da/html5/thumbnails/14.jpg)
METODOLOGÍA
14
![Page 15: Actividad de Raoultella sp. como entomopatógena de T](https://reader035.vdocuments.co/reader035/viewer/2022080219/62e854f7dd335118db12d9da/html5/thumbnails/15.jpg)
1 Obj:Definir el efecto de las AHLs sintéticas sobre
los mecanismos de acción.
Curva de crecimiento
Proteasas
Motilidad tipo swarming
Producción de ácido cianhídrico.
Sideróforos
15
(C4-AHL y C6-AHL) a 25, 50 y 100 nM.
![Page 16: Actividad de Raoultella sp. como entomopatógena de T](https://reader035.vdocuments.co/reader035/viewer/2022080219/62e854f7dd335118db12d9da/html5/thumbnails/16.jpg)
16
Efecto de AHLs sobre el crecimiento de Raoultella sp.
Inocular Raoultella sp. en caldo LB con y sin
suplementar con AHLs sintéticas
(C4-AHL y C6-AHL) a concentraciones de [25], [50] y [100] nM.
Lectura cada dos horas.
Mantilla (2006)
![Page 17: Actividad de Raoultella sp. como entomopatógena de T](https://reader035.vdocuments.co/reader035/viewer/2022080219/62e854f7dd335118db12d9da/html5/thumbnails/17.jpg)
Proteasas
17
Agar Skin Milk suplementado con
AHLs exógenas.
Sembrar por punción Incubar a 30°C por
tres días.
Lectura:
hidrolisis de la caseína
Suárez y Herrera (2012)
![Page 18: Actividad de Raoultella sp. como entomopatógena de T](https://reader035.vdocuments.co/reader035/viewer/2022080219/62e854f7dd335118db12d9da/html5/thumbnails/18.jpg)
18
Motilidad tipo swarming
Agar nutritivo al 0,85% suplementado con AHLs
Inocular 10 µl de la suspensión bacteriana.
Incubar durante 5 días a 30°C
Desplazaminto
Boyer (2008)
![Page 19: Actividad de Raoultella sp. como entomopatógena de T](https://reader035.vdocuments.co/reader035/viewer/2022080219/62e854f7dd335118db12d9da/html5/thumbnails/19.jpg)
Sideróforos Agar nutritivo al
1.5% suplementado con
las AHLs exógenas.
Inocular 5µl de la suspensión bacteriana.
Incubar 24 horas a 30°C
Agregar 10 ml de solución CAS
Incubar 3 horas a 30°C
19
Dertz (2004)
![Page 20: Actividad de Raoultella sp. como entomopatógena de T](https://reader035.vdocuments.co/reader035/viewer/2022080219/62e854f7dd335118db12d9da/html5/thumbnails/20.jpg)
Producción de Ácido Cianhídrico
800 µl de caldo nutritivo suplmentado con glicina
al 0.4% y AHLs sintéticas
200 µl Inóculo de Raoultella sp.
Incubar a 30°C durante 96 horas.
Lectura: observar cambios de coloración
20 Bakker (1998)
![Page 21: Actividad de Raoultella sp. como entomopatógena de T](https://reader035.vdocuments.co/reader035/viewer/2022080219/62e854f7dd335118db12d9da/html5/thumbnails/21.jpg)
2 Obj: Determinar la viabilidad de Raoultella sp. en tres
transportadores (Turba, aserrín y líquido).
Capacidad de retención de agua y pH del transportador
Método para el recuento de colonias en placa
Preparación de la formulación
21
![Page 22: Actividad de Raoultella sp. como entomopatógena de T](https://reader035.vdocuments.co/reader035/viewer/2022080219/62e854f7dd335118db12d9da/html5/thumbnails/22.jpg)
Preparación de la formulación.
Inocular Raoultella
sp. en Buffer de fosfato a un pH de 7.0
Adicionar el buffer a los transportadores
(turba y aserrín).
Cada uno se almacena a 4°C y
18°C
Control negativo: Buffer sin inóculo
bacteriano
Lectura: Cada 15 días
se evaluó por series de diluciones la viabilidad del
inóculo. Durante 60
días.
22
![Page 23: Actividad de Raoultella sp. como entomopatógena de T](https://reader035.vdocuments.co/reader035/viewer/2022080219/62e854f7dd335118db12d9da/html5/thumbnails/23.jpg)
3 Obj: Evaluar la co-inoculación entre Raoultella sp. y PGPR productora de AHLs sobre T.
solanivora.
Compatibilidad de bacterias PGPR TN26, TN33 y TN503
Raoultella sp.
Bioensayo
23
![Page 24: Actividad de Raoultella sp. como entomopatógena de T](https://reader035.vdocuments.co/reader035/viewer/2022080219/62e854f7dd335118db12d9da/html5/thumbnails/24.jpg)
Compatibilidad de bacterias PGPR y Raoultella sp.
24
Incubar a 30°C por 24 horas
Lectura: Inhibición de
crecimiento sobre Raoultella sp
![Page 25: Actividad de Raoultella sp. como entomopatógena de T](https://reader035.vdocuments.co/reader035/viewer/2022080219/62e854f7dd335118db12d9da/html5/thumbnails/25.jpg)
25
Bioensayo
Preparar formulación
Control positivo: CHAO
Control Negativo: formulación sin inóculo.
Inóculo: Raoultella sp
Co-inóculo: Raoultella sp, con Serratia proteamaculans
Lecturas a 35 días del montaje.
Determino presencia
de daño por T.
solanivora
![Page 26: Actividad de Raoultella sp. como entomopatógena de T](https://reader035.vdocuments.co/reader035/viewer/2022080219/62e854f7dd335118db12d9da/html5/thumbnails/26.jpg)
4. Obj. Compatibilidad de Raoultella sp. con los insumos de
síntesis química en papa.
Karate Zeon
La lambdacialotrina: actúa sobre el sistema nervioso del insecto
Fulminator 600E
Organofosforados (profenofos) y piretroides (cipermetrina): inhibidor de la
colinesterasa
Lorsban 4E
Clorpirifos: inhibe la acción de la acetilcolinesterasa
26
![Page 27: Actividad de Raoultella sp. como entomopatógena de T](https://reader035.vdocuments.co/reader035/viewer/2022080219/62e854f7dd335118db12d9da/html5/thumbnails/27.jpg)
Compatibilidad de Raoultella sp. con plaguicidas de síntesis química
Metódo 1: Sensidiscos con plaguicidas en agar nutritivo con Raoultella sp. a 5 concentraciones diferentes.
Metódo 2: Crecimiento de Raoultella sp. con agar nutritivo suplementado con plaguicidas
27
![Page 28: Actividad de Raoultella sp. como entomopatógena de T](https://reader035.vdocuments.co/reader035/viewer/2022080219/62e854f7dd335118db12d9da/html5/thumbnails/28.jpg)
RESULTADOS
28
![Page 29: Actividad de Raoultella sp. como entomopatógena de T](https://reader035.vdocuments.co/reader035/viewer/2022080219/62e854f7dd335118db12d9da/html5/thumbnails/29.jpg)
1ro. Definir el efecto de las AHLs sobre los mecanismos de acción.
29
![Page 30: Actividad de Raoultella sp. como entomopatógena de T](https://reader035.vdocuments.co/reader035/viewer/2022080219/62e854f7dd335118db12d9da/html5/thumbnails/30.jpg)
30
Curva de crecimiento
Cheng et. al, (2017), no
encontraron aumento en el
crecimiento de Paraccocus
denitrificans al agregarle 2
µmol/L de C6-AHL
Van et. al, (2006),
Escherichia coli
suplementado con 0,5 µM
de C6-AHL no se afecto.
![Page 31: Actividad de Raoultella sp. como entomopatógena de T](https://reader035.vdocuments.co/reader035/viewer/2022080219/62e854f7dd335118db12d9da/html5/thumbnails/31.jpg)
31
Proteasas CONCENTRACIÓN
(nM)
Área (cm2) Longitud
(mm)
C47 0,71 (0,09) a 5,15 (1,23) b
C4 [25] 0,75 (0,16) a 3,91 (0,92) b
C4 [50] 0,67 (0,08) a 2,87 (0,29) b
C4 [100] 0,63 (0,06) a 4,75 (1,56) b
C6 [25] 0,68 (0,08) a 4,21 (0,91) b
C6 [50] 0,66 (0,08) a 3,29 (0,57) b
C6 [100] 0,72 (0,05) a 12,67(1,75) a
Ulrich, et. al, (2004),
Burkholderia thailandesis
suplementada con AHLs
exógenas (C6-AHL, C8-AHL
y C10-AHL) no encontró
diferencias en proteasa.
![Page 32: Actividad de Raoultella sp. como entomopatógena de T](https://reader035.vdocuments.co/reader035/viewer/2022080219/62e854f7dd335118db12d9da/html5/thumbnails/32.jpg)
32
Proteasas
Diggle et. al, (2002),
adicionaron 10 µM de C4-
AHL y 30C12-AHL a
Pseudomona aeruginosa no
encontraron diferencia frente
a PA01 sin suplementar para
proteasas.
![Page 33: Actividad de Raoultella sp. como entomopatógena de T](https://reader035.vdocuments.co/reader035/viewer/2022080219/62e854f7dd335118db12d9da/html5/thumbnails/33.jpg)
33
Sideróforos CONCENTRACIÓN
(nM)
ÁREA (cm2)
C47 0,76 (0,23) d
C4 [25] 2,07 (0,48) dc
C4 [50] 6,62 (0,4) c
C4 [100] 17,20 (1,77) b
C6 [25] 15,94 (1,79) b
C6 [50] 4,66 (0,97) dc
C6 [100] 30,25 (1,53) a
Ulrich, et. al, (2004),
Burkholderia thailandesis
suplementada con AHLs
exógenas (C6-AHL, C8-AHL
y C10-AHL).
![Page 34: Actividad de Raoultella sp. como entomopatógena de T](https://reader035.vdocuments.co/reader035/viewer/2022080219/62e854f7dd335118db12d9da/html5/thumbnails/34.jpg)
34
Sideróforos
Diggle et. al, (2002),
adicionaron 10 µM de C4-
AHL y 30C12-AHL a
Pseudomona aeruginosa no
encontraron diferencias en
la producción de
sideróforos.
![Page 35: Actividad de Raoultella sp. como entomopatógena de T](https://reader035.vdocuments.co/reader035/viewer/2022080219/62e854f7dd335118db12d9da/html5/thumbnails/35.jpg)
35
Movilidad swarming CONCENTRACIÓN
(nM)
ÁREA
(cm2)
C47 6,67 (1,57) c
C4 [25] 31,17 (4,92) cb
C4 [100] 58,59 (7,84) a
C6 [25] 36,81 (2,23) ba
C6 [50] 46,48 (5,47) ba
C6 [100] 6,75 (3,13) c
Dávila (2007), Vibrio aumentó el
desplazamiento swarming con la
producción de AHLs.
![Page 36: Actividad de Raoultella sp. como entomopatógena de T](https://reader035.vdocuments.co/reader035/viewer/2022080219/62e854f7dd335118db12d9da/html5/thumbnails/36.jpg)
36
Movilidad swarming
La movilidad swarming es
considerada como un factor de
virulencia importante que
permite invadir y colonizar la
rizósfera.
![Page 37: Actividad de Raoultella sp. como entomopatógena de T](https://reader035.vdocuments.co/reader035/viewer/2022080219/62e854f7dd335118db12d9da/html5/thumbnails/37.jpg)
37
Producción de Ácido Cianhídrico (HCN)
Pessi et. al, (2001)
encontraron que en P.
aeruginosa la molécula
rsmA modula la expresión
de HCN a través de AHLs.
![Page 38: Actividad de Raoultella sp. como entomopatógena de T](https://reader035.vdocuments.co/reader035/viewer/2022080219/62e854f7dd335118db12d9da/html5/thumbnails/38.jpg)
38
2do. Determinar la viabilidad de Raoultella sp. en tres transportadores.
![Page 39: Actividad de Raoultella sp. como entomopatógena de T](https://reader035.vdocuments.co/reader035/viewer/2022080219/62e854f7dd335118db12d9da/html5/thumbnails/39.jpg)
39
TRANSPORTADORES A 18°C
El-Fattah et. al, (2013),
Azotobacter chroococcum
inoculado en mezcla de
turba con otros
transportadores orgánicos a
8°C y 30°C durante 3
meses.
![Page 40: Actividad de Raoultella sp. como entomopatógena de T](https://reader035.vdocuments.co/reader035/viewer/2022080219/62e854f7dd335118db12d9da/html5/thumbnails/40.jpg)
40
TRANSPORTADORES A 4°C
Amer et. al, (2000) La
supervivencia de Bacillus
subtilis fue mejor a 22°C y P.
putida tuvo mejor viabilidad
a ~0°C.
![Page 41: Actividad de Raoultella sp. como entomopatógena de T](https://reader035.vdocuments.co/reader035/viewer/2022080219/62e854f7dd335118db12d9da/html5/thumbnails/41.jpg)
41
3ro. Evaluar la co-inoculación entre Raoultella sp. y una rizobacteria promotora
de crecimiento vegetal y productora de AHLs sobre la mortalidad de T. solanivora.
![Page 42: Actividad de Raoultella sp. como entomopatógena de T](https://reader035.vdocuments.co/reader035/viewer/2022080219/62e854f7dd335118db12d9da/html5/thumbnails/42.jpg)
42
Enfrentamiento de Raoultella sp. con
bacterias promotoras de crecimiento
Vaquero y Álvarez (2018),
de 30 aislamientos de
rizobacterias promotoras de
crecimiento vegetal
evaluaron el incremento de
peso seco de vástago y
raíz, donde tres
aislamientos incrementaron
más del 200% con respecto
a los controles.
Serratia proteamaculans
PGPR y productora de
AHLs
![Page 43: Actividad de Raoultella sp. como entomopatógena de T](https://reader035.vdocuments.co/reader035/viewer/2022080219/62e854f7dd335118db12d9da/html5/thumbnails/43.jpg)
43
Bioensayo
Gómez et. al, (2013) formulación
a base de carbonato de calcio,
Baculovirus y B. thurigiensis
contra T. solanivora en
condiciones de almacenamiento
(95.8%).
![Page 44: Actividad de Raoultella sp. como entomopatógena de T](https://reader035.vdocuments.co/reader035/viewer/2022080219/62e854f7dd335118db12d9da/html5/thumbnails/44.jpg)
44
4to. Compatibilidad de Raoultella sp. con los insumos de síntesis química en papa.
![Page 45: Actividad de Raoultella sp. como entomopatógena de T](https://reader035.vdocuments.co/reader035/viewer/2022080219/62e854f7dd335118db12d9da/html5/thumbnails/45.jpg)
45
Crecimiento de Raoultella sp. en medio suplementado con plaguicidas de
síntesis química
Santos et. al, (2013)
definió la importancia
de la compatibilidad
entre bio-
controladores y
plaguicidas de
síntesis química.
![Page 46: Actividad de Raoultella sp. como entomopatógena de T](https://reader035.vdocuments.co/reader035/viewer/2022080219/62e854f7dd335118db12d9da/html5/thumbnails/46.jpg)
46
Conclusiones
• Las AHLs influyen en los mecanismos de acción de Raoutella sp. como
producción de sideróforos, motilidad tipo swarming y la producción de
ácido cianhídrico.
• El transportador más efectivo para mantener la viabilidad de Raoultella sp.
es la turba, en especial cuando se almacena a 4°C.
• Raoutella sola o co-inoculada no presentó una reducción significativa
contra T. solanivora, sin embargo disminuyo el daño en un 70%.
• Se evidencio que Raoultella sp. y los insumos de síntesis química Lorsban,
Karate Zeon y Furminator son compatibles y podrían usarse de forma
coordinada para el control de insectos plaga.
![Page 47: Actividad de Raoultella sp. como entomopatógena de T](https://reader035.vdocuments.co/reader035/viewer/2022080219/62e854f7dd335118db12d9da/html5/thumbnails/47.jpg)
47
Recomendaciones ■ Analizar la viabilidad de Raoultella sp. en los tres transportadores almacenados a 4°C por un
tiempo mayor a 60 días y evaluar su actividad entomopatógena en el transcurso de este tiempo.
■ Evaluar la co-inoculación entre Raoultella sp con otras bacterias productoras de AHLs para determinar la actividad entomopatógena.
■ Recomendaciones para el Bioensayo: aumentar el número de replicas y evaluar diferentes absorbancias del inóculo.
■ Evaluar los mecanismos asociados a la actividad entomopatógena de Raoultella sp. co-inoculada con una bacteria productora de AHLs en un medio suplementado con insumos de síntesis química.