actividad antimicrobiana in vitro del extracto etanÓlico de las hojas de ruta graveolens (ruda)...
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ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA IN VITRO DEL EXTRACTO
ETANÓLICO DE LAS HOJAS DE RUTA GRAVEOLENS
(RUDA) MEDIANTE EL MÉTODO DE BAUER-KIRBY
Equipo 1, Bretado De Santiago Benjamín, Ávila Martínez Geraldine Guadalupe, Chavarría Torres Wuendy María, Borjón Arroyo Gustavo Asael
. Laboratorio de Química Medicinal, Unidad Académica de Ciencias Químicas, Universidad
Autónoma de Zacatecas. Carretera Zacatecas-Guadalajara Km. 6, ejido “La Escondida”, C.P. 98160, Zacatecas, Zac.
Resumen: Se evaluó la actividad antimicrobiana de la concentración 0.1µg/ml del extracto
etanólico liofilizado de hojas de ruta graveolens (ruda) mediante el método de Bauer-Kirby
con las cepas de Escherichia coli y Staphylococcus aureus. Los resultados indican que la
concentración del extracto es muy baja, observando que no hay inhibición en las cajas
Petri, comparando con el control positivo (penicilina) se observó un halo de inhibición.
Estos resultados permiten desestimar el uso del extracto liofilizado de ruta graveolens
como antimicrobiano. En tanto se sugiere analizar otras enterobacterias y bacterias
además de concentraciones mayores del extracto.
Palabras Clave: Ruda, maceración, extracción etanólica, destilación, inhibición.
.
Introducción
Las plantas medicinales han sido
utilizadas desde épocas ancestrales. La
gran mayoría de nosotros, en algún
momento, hemos escuchado o incluso
usado alguna de ellas en remedios
caseros, pero ¿qué son las plantas
medicinales?
Los expertos de la Organización Mundial
de la Salud (OMS) la definen como toda
especie vegetal, de la cual toda o una
parte de la misma está dotada de
actividad farmacológica y pueden
clasificarse en: a) Aquellas destinadas en
forma exclusiva a la obtención de
principios activos responsables de la
acción farmacológica. b) Planta o parte de
ella usados como tales, o bien bajo la
forma de alguno de los distintos tipos de
extracto que pueden obtenerse a partir
de ellas (Navarro, 2000).
De acuerdo con la Organización
Panamericana de la Salud (OPS), una
planta medicinal es: i) Cualquier planta
usada para aliviar, prevenir o curar
cualquier enfermedad o alterar un
proceso fisiológico y patológico. ii)
Cualquier planta empleada como fuente
de fármacos o sus precursores (Rates,
2001)
Teniendo en mente estos conceptos
podemos empezar a hablar de plantas
medicinales.
Generalidades y propiedades de la planta
La ruda
Reino : Plantae
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Filo : Magnoliophyta Clase : Magnoliopsida Subclase : Rosidae Orden : Sapindales Familia : Rutaceae Subfamilia: Rutoideae Género : Ruta Especie : Ruta graveolens
La conocidísima Ruda o Rutas graveolens
es un pequeño arbusto de la familia de las
Rutáceas. Arbusto de 50 a 90cm de
altura, el tallo está muy ramificado. Tiene
hojas carnosas, muy divididas de color
verde azuloso y con aroma fuerte. Las
flores son amarillas de 5 pétalos como
con dientecillos, con el centro verde. Los
frutos son carnosos por dentro, por
encima son rugositos y al madurar se
abren en 4 partes, empezando por la
punta hasta la mitad. (Pérez, 2015)
Las especies de este género se conocen
comúnmente como “ruda”, y la Ruta
graveolens L. es una antigua planta
medicinal nativa del Sur de Europa; entre
sus diversas aplicaciones encontramos
que se utiliza la infusión de las hojas
como digestivo, calmante nervioso, para
gases intestinales y cólicos hepáticos y
menstruales, así como en lavados para la
inflamación de ojos y oídos. Otros usos
son: contra el aire (frotar las sienes con
las hojas), contra la fiebre (aplicar el
cocimiento en aguardiente de la planta
machacada sobre el vientre y cabeza), en
prácticas de chamanismo para alejar los
malos espíritus (poner un manojo en la
puerta o en la casa), etc. (Alvarez, 2006)
Composición química
En esta especie se menciona que
contiene:
Aceite esencial: Cetonas (nonan-2-ona,
undecan-2-ona). Monoterpenos
(eucaliptol, mentol). Acetato de linalol.
Además de
Flavonglucósido (rutina, quercitina,
ramnosa), Derivados de la cumarina
(hidroxicumarinas: umbeliferota,
herniaria, graveliferona, rutacultina;
furanocumarinas: bergapteno,
xantotoxina, psoraleno, rutarina,
rutaretina, calepensina; piranocumarinas,
xantiletina). Alcaloides (alcaloides
benzoquinoleínicos: esquimianina,
gamma-fagarina, pteleína, dictamnina,
cocusaginina; alcaloides derivados de la
acridina: Arborinina-2-arilquinolina;
alcaloides quinazolínicos: arborina;
alcaloides quinoleícos: graveolina,
graveolineína; otros: 2-benzil-1-metil-
4(1H)-quinazoline, 4,6-Dimetoxifuro[2,3-
b]quinolina, furolina, gravacridoneclorine,
gravacridonediol, rutacridona,
rutagravine, rutalium).
Además de lignanos, principio amargo,
resina, goma taninos.
Método de Bauer-Kirby
En este método se emplean discos de
papel absorbente, impregnados con una
concentración conocida del
antimicrobiano. Estos se colocan en la
superficie de la placa de agar, en la que se
acaba de inocular una suspensión de la
cepa por probar. (Cavallini, 2005)
3
Actividad antimicrobiana de extractos
vegetales
Los productos naturales tales como los
extractos de plantas y/o sus compuestos
puros proveen oportunidades ilimitadas
para el desarrollo de nuevas drogas que
puedan ser utilizadas para el control
microbiano. A este respecto, el desarrollo
de farmacéuticos comienza con la
identificación de los principios activos,
para después utilizando diversos ensayos
biológicos obtener información sobre la
capacidad antimicrobiana del compuesto
de interés, ya sea obteniendo la
concentración mínima inhibitoria o la
concentración mínima bactericida. Para
determinar su correcta evaluación existen
pruebas estandarizadas que se llevan a
cabo con el fin de valorar su activad, en
especial la antimicrobiana, a través de
diferentes métodos, in vitro,
principalmente desarrollados en el
laboratorio y así establecer que
microorganismos son sensibles o
muestran una resistencia ya sean a
bacterias, hongos y protozoos. (Morales,
2016)
Se evaluó la actividad antimicrobiana de la
ruda en dos cepas diferentes.
Escherichia coli
Escherichia coli es un bacilo Gram
negativo, anaerobio facultativo de la
familia Enterobacteriaceae, esta bacteria
coloniza el intestino del hombre pocas
horas después del nacimiento y se le
considera un microorganismo de flora
normal, pero hay cepas que pueden ser
patógenas y causar daño produciendo
diferentes cuadros clínicos, entre ellos
diarrea. (Rodríguez-Angeles, 2001)
Staphylococcus aureus
El género Staphylococcus está formado
por cocos Gram positivos, con un
diámetro de 0.5 a 1.5 μm, agrupados
como células únicas, en pares, tétradas,
cadenas cortas o formando racimos de
uvas. Ogston introdujo el nombre de
Staphylococcus, del griego staphyle que
significa racimo de uvas, para describir a
los cocos responsables de inflamación y
supuración. Son bacterias no móviles, no
esporuladas, no poseen cápsula, aunque
existen algunas cepas que desarrollan una
cápsula de limo, son anaerobias
facultativas. El género Staphylococcus
contiene 32 especies, de las cuales 16 de
ellas se localizan en los humanos, algunas
forman parte de la microbiota de piel y
mucosas en humanos, y otras se
encuentran sólo entre la flora de otros
mamíferos y aves. Algunas de estas
especies son patógenas cuando existe
predisposición e inmunosupresión en el
huésped o en presencia de cuerpos
extraños. (García, 2014)
Tanto el uso tradicional de la ruta
graveolens (ruda), además de estudios
farmacológicos y ensayos clínicos indican
la posible utilización de ésta como agente
antimicrobiano; por ello el objetivos
principal de este trabajo es determinar si
el extracto liofilizado de las hojas de la
ruda tiene una actividad antimicrobiana
frente a las cepas bacterianas de E. coli y
S. aureus.
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Material y Métodos
Material vegetal: Se utilizó hojas de ruda
Secado: Se secó una gran cantidad de
ruda en un horno eléctrico por un
periodo de 4 horas a una temperatura
aproximada de 90°C, para así aislar las
hojas y utilizarlas como materia primara
para obtención de los principios activos.
Trituración y tamizado. Se realizaron dos
etapas; en la primera etapa se colocaron
las hojas ya secas en un mortero para
pulverizar. La segunda etapa se colocaron
las hojas pulverizadas en una licuadora
marca oster para así dejar el triturado
más fino, finalmente se utilizó un tamiz
del número 20 para el tamizado.
Maceración. Se pesó 50 gramos del
tamizado para colocarlos en un frasco de
un litro de boca ancha envuelto en
aluminio, se añadieron 500 ml de alcohol
a una concentración de 90. Se dejó
macerando durante 7 días mezclándose
dos veces por día.
Filtración. Se realizaron 3 etapas; en la
primera se utilizó una media de marca
Dorian grey y se estuvo exprimiendo para
obtener el mayor líquido posible
pasándose a un vaso de precipitado de un
litro, a este filtrado se le añadieron 10
gramos de carbón activado para eliminar
el pigmento verde y se puso en agitación
en la plancha con la bala magnética
durante 30 minutos. En la segunda etapa
se realizaron tres filtraciones por
gravedad en embudo de vidrio. En la
tercer etapa se realizaron cuatro
filtraciones en embudo al vacío así
eliminando totalmente el carbón
activado.
Destilación y Liofilización. Se montó un
sistema de destilación, colocando el
filtrado en un matraz bola para destilar
por un tiempo de tres horas, después de
tener el extracto etanólico se liofilizo para
eliminar le agua mediante desecación al
vacío y a muy bajas temperaturas.
Preparación de los cultivos y sensidiscos.
Las cepas utilizadas en la evaluación
antimicrobiana son E. coli y S. aureus. Se
emplearon medios de cultivos
enriquecidos que garantizaron el
crecimiento de microorganismo, agar
nutritivo de marca Gifco.
Para la elaboración de sensidiscos, se
impregnaron círculos de papel filtro de un
diámetro y grosor determinado con el
extracto liofilizado a una concentración
de 0.1 µg/ml que previamente se
obtuvieron y almacenaron.
Evaluación antimicrobiana. Previamente
se rotuló las cajas Petri, en forma de 4
cuadrantes, una para cada cepa a utilizar.
Y se inoculó con las bacterias a analizar
(E. coli y S. aureus) masivamente en toda
la caja Petri.
Como controles; se utilizó para el positivo
penicilina, y como negativo un sensidiscos
sin impregnar con nada.
Una vez los discos impregnados con los
controles y el extracto 6 a una
concentración 0.1 µg/ml, se colocaron
los sensidiscos en el siguiente orden,
cuadrante 1; control positivo, cuadrante
2: control negativo y cuadrante 3 y 4 los
5
extractos en cada una de las cajas Petri
inoculadas con los microorganismos a
evaluar. Se incubaron a 37°C y se observó
si hubo halo de inhibición a las 24 horas y
48 horas.
Resultados
Evaluación antimicrobiana en cepas de E.
coli y S. aureus
La evaluación que se desarrolló en este
trabajo como se indicó con anterioridad,
parte de las preparaciones del secado,
maceración, destilación, liofilización y
pruebas de inhibición.
Extracción con etanol
Planta Filtrado recuperado (ml)
Ruda 400
Destilado
Planta Extracto recuperado (gr)
Ruda 13.8
Actividad antimicrobiana
Grafica 1. Área de inhibición promedio en
cm2 con una desviación estándar y un CV de
0.012 y 0.9049 para 24 hrs y 0.170 y 2.42
para 48 hrs respectivamente, donde se
observa los controles positivo (penicilina) y
negativo (disco sin nada), en el positivo hay
una inhibición de la bacteria E. coli mientras
que para el extracto 6 que estaba a una
concentración de 0.1µg/ml y para el negativo
no hubo inhibición en 24 ni en 48 hrs.
Imagen 1. Cultivo de E. coli donde se evaluó
la actividad antimicrobiana del extracto de
ruda y los controles positivo (penicilina) y
negativo (el disco sin nada) a las 24 hrs de
incubación.
Imagen 2. Cultivo de E. coli donde se evaluó
1,3985
0 0 0
7,0435
0 0 0 0
1
2
3
4
5
6
7
8
C. Positivo c. Negativo Extracto 6 Extracto 6
24 horas
48 horas
Gráfica de actividad antimicrobiana de E.coli
6
la actividad antimicrobiana del extracto de
ruda y los controles positivos (penicilina) y
negativo (el disco sin nada) a las 48 hrs de
incubación.
Grafica 2.Área de inhibición en cm2 con una
desviación estándar y CV de 0.0900 y 19.71
para 24 hrs y 0.290 y 2.750 respectivamente,
donde se observa el control positivo
(penicilina) que inhibió el desarrollo de la
bacteria S. aureus, mientras que en el control
negativo (disco sin nada) y el extracto 6 a una
concentración de 0.1µg/ml no presento
ningún tipo de inhibición en 24 ni 48 hrs.
Imagen 3. Cultivo de S. aureus donde se
evaluó la actividad antimicrobiana del
extracto de ruda y los controles positivos
(penicilina) y negativa (el disco sin nada) a las
24 horas de incubación.
Imagen 4. Cultivo de S. aureus donde se
evaluó la actividad antimicrobiana del
extracto de ruda y controles positivo
(penicilina) y negativo (disco sin nada) a las
48 hrs de incubación.
Discusión
A lo largo de la historia se ha hecho uso
de las plantas medicinales; sin embargo
es hasta hace algunos años que se
fomentó su estudio. En este proyecto se
analizó el extracto de las hojas de ruda
con posible actividad antimicrobiana, por
medio de la prueba de sensibilidad
antimicrobiana.
Los resultados del filtrado, se pudo
recuperar un volumen de 400 ml de la
maceración etanólica, después del
proceso de destilación se obtuvo 13.8
gramos del extracto recuperado, pudo ser
aquí donde influyera para una no posible
0,4567 0 0 0
10,5623
0 0 0 0
2
4
6
8
10
12
C. Positivoc. Negativo Extracto 6 Extracto 6
24 horas
48 horas
área
Gráfica de actividad antimicrobiana S. aureus
7
inhibición del desarrollo de la bacteria
mediante el extracto, ya que el tiempo de
destilación fue muy poco.
Para la evaluación de la actividad
antimicrobiana se terminó realizando
pruebas de sensibilidad, utilizando la
técnica de Bauer-Kiuirby (Koneman E,
1985).
Los resultados de la actividad
antimicrobiana fueron negativos, no se
presentó inhibición del crecimiento de las
bacterias evaluadas (E. coli y S.aureus).
No se correspondió con los de la
literatura comparada, que plantea
extractos etanólicos obtenidos a partir de
las hojas de la ruda, en esta literatura se
evaluó la actividad antimicrobiana para
las mismas cepas, con la diferencia que
los extractos que se prepararon fue de
diferentes concentraciones (0.5 y 0.25
mg/ml) y además de que del extracto
etanólico se hizo un tamizado fitoquímico
para la separación de los componentes
químicos de las hojas de la ruda (tabla 1)
y haciendo las pruebas de identificación
para estos componentes. (Maita Vásquez
Jessica, 2015)
Tabla 1. Resultados obtenidos del tamizaje
Fitoquímico del extracto etanolico de las
hojas de Ruta graveolens “ruda” (Maita
Vásquez Jessica, 2015)
Grafica 3. Gráfico de barras del extracto
etanólico frente las cepas de estudio (Maita
Vásquez Jessica, 2015).
8
Grafico 4. Gráfica donde se observa que las
cepas utilizadas para el estudio fueron
sensibles al tratamiento con “gentamicina”
160mg/ml (fármaco) como control positivo
mostrando concentraciones inhibitorias de 8
y 2 µg/ml para las cepas. (Maita Vásquez
Jessica, 2015)
Analizando con las demás concentraciones
evaluadas, que fueron; 10, 100 µg/ml y 1
g/ml. Donde la concentración mínima
inhibitoria fue de 1 g/ml apreciándose en la
imagen 5 y 6.
Imagen 5. Cultivo de E. coli donde se evaluó la
actividad antimicrobiana con extracto a una
concentración de 1 g/ml a las 48 hrs,
observándose halo de inhibición
Imagen 6. Cultivo de S. aureus, donde se evaluó la
actividad antimicrobiana a las 48 hrs,
observándose halo de inhibición.
Conclusión
Se puede concluir que el extracto
etanólico liofilizado de las hojas de la
ruda no presento inhibición en los
cultivos de E. coli y S. aureus a una
concentración de 0.1 µg/ml. Se
recomendaría evaluar para otras
enterobacterias y bacterias además de
probar con otras concentraciones
mayores para poder observar inhibición.
Bibliografía Alvarez, C. M. (2006). ANÁLISIS DE RUTINA
EN RUTA GRAVEOLENS O RUTA spp. ,
“ruda”,. 1-11.
Cavallini, E. R. (2005). Bacteriología General
(4ta ed.). Universidad de Costa Rica.
García, E. C. (2014). Características generales
del Staphylococcus. Patologpia
Clínica , 30.
9
Koneman E, e. a. (1985). Diagnóstico
Microbiológico. México: Médica
Panamerica.
Maita Vásquez Jessica, e. a. (2015).
ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA In Vitro
DEL EXTRACTO ETANÓLICO DE LAS
HOJAS DE Ruta graveolens (Ruda),
MEDIANTE EL MÉTODO DE
MACRODILUCIÓN FRENTE A
Staphylococcus aureus y Escherichia
coli. Iquitos, Perú: Facultad de
Farmacia y Bioquímica.
Morales, C. R. (2016). Investigación en
Plantas de importancia médica.
México: OmniaScience.
Navarro. (2000). Uso raccional de las plantas
medicinales. Pharm Care, 2, 9-19.
Pérez, B. E. (2015). Manual de Plantas
medicinales (Primera ed.). Xalapa,
Veracruz, México: Instituto de
Ecología A.C.
Rates. (2001). Plants as source of Drugs.
Toxicon, 39, 603-613.
Rodríguez-Angeles, G. (2001). Principales
características y diagnóstico de los
grupos patógenos de Escherichia
coli. Salud Pública, 464-465.