Actividad antibacteriana de seis péptidos nuevos de veneno de Escorpión Tityus discrepans. Un estudio de sonda fluorescente de membrana

microbiano, cambios de permeabilidad Na+

Resumen

Seis nuevos péptidos (llamado bactridines) fueron aislados de Tityus discrepans Veneno. De la masa espectrometría de masas moleculares fueron 6916, 7362, 7226, 7011, 7101 y 7173 Da (bactridines 1-6). Bactridines 1 y 2 se secuenciaron por la degradación de Edman. Las secuencias y in silico análisis, indicó que está cargado positivamente polipéptidos compuesto por 61 y 64 aminoácidos (AA), respectivamente, bactridine 1 y 2 bactridine contiene 4 puentes disulfuro. Bactridine un sólo tóxico para las cucarachas y cangrejos, y bactridine 2-6 sólo tóxico para los ratones. Bactridine 1 tiene una identidad de secuencia con el 78% ardiscretin. Ardisctretin es una toxina para insectos de sodio específicos que también produce una pequeña e induce la despolarización de cocción repetitivos en los axones del calamar parecidas a las del DDT [1,10 (pchlorobenzyl)] 2-trichloretane en su capacidad para frenar potencial de acción, para inducir la cocción repetitivos. Medido como la concentración inhibitoria mínima, bactridines tuvieron actividad antibacteriana de alta en contra de una amplia gama de bacterias Gram positivas y Gram negativas. La inhibición completa se produjo el crecimiento de bacterias en concentraciones 20 a 80 mM dependiendo de la bacteria y el péptido prueba. Efectos sobre la membrana de Na + la permeabilidad inducida por bactridines se observaron en Yersinia enterocolitica cargado con una mM Corona Roja ™. Corona ™ fugas fluorescencia roja de las bacterias se observó después de la exposición a 0,3 mM de cualquier bactridine probado, lo que indica que han modificado Na+

permeabilidad de la membrana. Este efecto fue bloqueado por amilorida 10 mM y en un 25 mM mibefradil drogas que afectan a Na+ y Ca2 + canales respectivamente. No se encontraron pruebas de los cambios de K+ o Ca2 + concentraciones ni dentro ni fuera de la bacteria en experimentos con los tintes fluorescentes 04 a.m. Fluo (10 mM) y PBFI (20 mM).

Introducción

los organismos vivos, están expuestos diariamente a las infecciones microbianas. Con el fin de defenderse contra el medio ambiente hostil, han desarrollado potentes mecanismos de defensa que forman parte de la inmunidad innata y adaptativa. péptidos antibacterianos son las moléculas efectoras de la inmunidad innata y su principal objetivo son las membranas bacterianas. Los péptidos antimicrobianos fueron descubiertas inicialmente en invertebrados y más tarde también se han descrito en los vertebrados. Estos péptidos presentan secuencias diferentes, las estructuras y la especificidad de destino. Algunos de ellos son catiónicos, péptidos anfipáticos con masas moleculares por debajo de 10kDa y una mayor especificidad para los procariotas que para célula eucariota. Con el problema creciente de organismos patógenos resistentes a los antibióticos convencionales, hay un creciente interés en la aplicación farmacológica de los péptidos antimicrobianos. Los péptidos antimicrobianos puede de divide en tres grandes grupos: (1) anfipáticas péptidos lineales libre de la cisteína y la frecuencia con la estructura alfa-hélice, (2)

péptidos con tres enlaces disulfuro y (3) péptidos con abundancia inusual de ciertos aminoácidos, prolina , arginina, triptófano o histidina. El péptido antimicrobiano aislado por primera vez desde escorpiones eran del tipo de defensina quinquestriatus Leirus Hebraeus hemolinfa. Más tarde cytolitic y / o péptidos antibacterianos fueron aislados de escorpión que pertenece también el Buthidae, Scorpionidae, Ischnuridae, y la linfa superfamilias luridae hemo-y veneno. El descubrimiento de estos péptidos en el veneno de escorpión de Eurasia, África y América, han confirmado su presencia generalizada de las funciones biológicas importantes.

El sitio principal de la actividad antimicrobiana es la membrana plasmática de las bacterias y los protozoos parásitos. Algunos péptidos antimicrobianos son iónicamente atrajo al grupo de carga negativa de la superficie celular, donde se adoptan una conformación alfa-helicoidal y acumulan en la membrana. Esto puede resultar en la formación de poros transitorios, perturbación de la membrana y lisis celular. Otros péptidos antimicrobianos se ha demostrado que inducen perturbaciones permeabilidad de la membrana bacteriana que indica interaccion con los canales iónicos de la membrana. Su mecanismo de acción de las bacterias canales de la membrana de iones no se entiende bien.

En el presente trabajo, reportamos el aislamiento de seis péptidos antibacterianos del veneno de escorpión T. discrepans. Su capacidad para inducir cambios de permeabilidad de la membrana bacteriana se estudió con métodos de epifluorescencia en diferentes condiciones experimentales. la actividad biológica y las interacciones farmacológicas de estos péptidos con tetrodotoxina, amilorida y el mibefradil bacteriana canales de Na +-, sugieren que actúan en los canales parecida a la de cchannels NaChBact hallodurans bacilo. Algunos de los resultados presentados aquí han sido comunicados previamente en forma preliminar.

Discusion

La mayoría de los péptidos antimicrobianos aisladas de venenos de artrópodos son péptidos lineales helicoidales alfa-. Sin embargo dos péptidos antimicrobianos escorpión cisteína ricos, y scorpine BmTXKS2, son estructuralmente diferentes. Un péptido antibacteriano nuevo y único que es también rico en cisteínas y las características de las defensinas y K +-bloqueadores de los canales toxinas es aurelin, recientemente aislada de la medusa Aurelia aurita. En este trabajo se han estudiado 28 picos de T. discrepans veneno fracción II Sephadex G50, a partir de éstos, sólo 6 fueron anti-bacteriano, y fueron nombrados bactridines. Las estructuras de bactridine 6.4 Actualmente se desconocen, pero posiblemente puede ser similar a bactridine 1 y 2, basado en el comportamiento cromatográfico, masa molecular, y la actividad antibacteriana. Bactridine 1 y 2 se secuenciaron por completo y se comprobó que la cisteína péptidos ricos como scorpine. Sin embargo scorpine es capaz de bloquear los canales de potasio, mientras que la membrana bactridines actuar sobre los canales de membrana de sodio. Bactridine 1 es 78% idéntico a ardiscretin un insecto Na +-canal de sodio a partir de la toxina beta T discrepans veneno y un 63% con TsNTxP una proteína no tóxica del veneno de T serrulatus. Bactridine 1 era tóxico para las cucarachas y cangrejos, y no es tóxico para los ratones. el cuadro 4 contiene una alineación Clustal W de bactridine 1 y 2, abarcando también gran ardiscretin y TsNTx. A pesar de los 4 péptidos tienen diversos grados de identidad de secuencia (consenso de los otros 3 péptidos con una

bactridine están subrayados en la tabla), las identidades y la secuencia entre ardiscretin bactridine 1 son sorprendentes (onda subrayó residuos en la tabla). partir de la secuencia de AA bactridine 1 y 2 se puede inferir que tienen carga positiva, como todos los péptidos antibacterianos conocidos de hemolinfa de artrópodos venenosos o venenos.

motivos teóricos han sido establecidas para determinar cuando el resultado de modelado in silico predecir con precisión una estructura terciaria, y definir, la llamada "zona de seguridad modelado por homología". En esta zona secuencias similares adoptar estructuras prácticamente idénticas, y las secuencias relacionadas lejanamente todavía se pliegan en estructuras similares. Algunas de las razones teóricas fueron establecidas por chothia y Lesk (1986), lijadora y Schneider (1991) y Rost (1999) y se resumen por Krieger et al. (2003). En bactridine modelos 1 y 2, las similitudes con la plantilla de péptidos utilizados, garantizamos que nuestras modelado por homología se encuentra dentro de la llamada "zona de seguridad modelado por homología". que existen para los péptidos de AA = 60 cuando la identidad entre el alcalde de destino o Igual un 60%. los modelos tridimensionales obtenidos mediante modelado por homología sugieren fuertemente que bactridine 1 y 2 que se muestra en la fig. 3 son proteínas globulares que doblan de acuerdo con la alfa-beta-cisteína motivo. Estos péptidos tienen un segmento de alfa-hélice y una estructura conservada beta-hoja gestionada por puentes disulfuro.

Las concentraciones utilizadas para los experimentos toxicológicos y fisiológicas para ardiscretin en DSuze et al (2004). ¿Se ha calculado suponiendo que alfa prime = 1, que ahora volverán a calcular los valores de la primera alfa de ardiscretin de la misma manera hace aquí por los bactridine y obtuve 4,458 Asumiendo que todas las cisteínas cys aparecen como media. por lo tanto, utilizando a primera alfa = 4,458, ardiscretin: 0,7 gramos Por microgramos cangrejos muertos U. rapax, 12-22 gramos Por microgramos mataron grillos y 33-300 gramos Por microgramos muertos triatominos (Rhodnius prolixus). en esta comunicación bactridine 1, 1,3 microgramos Por gramos no mató a los ratones, una dosis aproximadamente igual al doble de la dosis de ardiscretin utilizado por D'Suze et al (2004), pero bactridine 1 en una dosis tan baja 0,9 aas Por gramos microgramos sialorrea inducida en los cangrejos, qhen la dosis se aumentó a 1,8 gramos Por microgramoss la sialorrea era más intensa y el 43% de cangrejo muerto. Las cucarachas (americana P, similares 1 pc g) inyectado a través de la primera articulación de una pierna con = 22 gramos Por microgramos de bactridine 1, murió; esta dosis está cerca de la una grillos matar, y cerca del límite inferior de la dosis matando triatominos en D'Suzr (2004). Estos resultados indican que ardiscretin y bactridine 1 son aproximadamente igualmente tóxico para los vertebrados e invertebrados.

Bactridine 5 tenían una masa molecular de 7101 Da, muy cerca de ardiscretin que tiene una masa molecular de 7103 Da, sin embargo, las masas similares, no me refiero a la igualdad de las secuencias. Bactridine 5 se encontró que los ratones afectan a = 1 Gramo Por microgramo, y no tuvo efecto sobre las cucarachas incluso usando = 20 Por miicrogramos cucarachas Gramo, por lo que es o alcalde Igual 20 veces más potente en los mamíferos que en los insectos, junto con bactridine 2 , 3 y 4, 5 bactridine fue totalmente ineficaz en los cangrejos. Ardiscretin, 0,7 gramos Por micragramos animal, no tuvo ningún efecto en ratones, pero aproximadamente a la misma

dosis cangrejos muertos, y mató a los grillos aproximadamente a la misma dosis bactridine 5 no matar a las cucarachas. dos moléculas químicamente diferentes pueden tener el mismo efecto, pero si difieren del efecto de dos moléculas, estudió en los mismos animales (ratones y cangrejo), en condiciones similares y en concentraciones similares, sus estructuras tienen que ser diferente este parece ser el caso de bactridine 5 y ardiscretin.

Bactridine fueron eficaces contra varios Gram positivas y Gram-negativos en concentraciones que iban 20-77 micrometro en función de las bacterias y bactridine prueba. este rango está de acuerdo muy razonable con la CIM de otros péptidos aislados de artrópodos hemolinfa y veneno contra las bacterias Gram positivas o contra las bacterias Gram negativas. Desde bactridine se detectaron en los lotes veneno diferentes, parecen ser parte integral de T veneno de escorpión discrepans; Esto sugiere que se puede escuchar bactridine un papel fisiológico importante en este escorpión. Curiosamente, los escorpiones, al menos en cautividad, su veneno rociado sobre sus cuerpos de una manera que sugiere una limpieza o la práctica de protección.