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Tesis de Posgrado

Acción del dietilestilbestrol yAcción del dietilestilbestrol yanálogos sobre la cadena deanálogos sobre la cadena de

transporte de electronestransporte de electronesmitocondrialmitocondrial

Diz de Otamendi, María Elisa

1969

Tesis presentada para obtener el grado de Doctor en CienciasQuímicas de la Universidad de Buenos Aires

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Cita tipo APA:Diz de Otamendi, María Elisa. (1969). Acción del dietilestilbestrol y análogos sobre la cadena detransporte de electrones mitocondrial. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad deBuenos Aires. http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_1348_DizdeOtamendi.pdf

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Universidad de Buenos Aires

FACULTAD EE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES

Accióndel dietilestilbestrol y análogos sobre lacadena de transporte de electrones mitocondrial

María Elisa Diz de Otamendi

Tesis presentada para optar al título de Doctor en Quimica

1 3 4 8

1969 ¿2+3

Este trabajo se realizó en la Cátedra deQuimica Biológica de la Facultad de Medicinade la Universidad de Buenos Aires.

El tema que se desarrolla, fué propuestopor su director, Profesor Dr. Andrés O.M. Stoppani, a quien agradezco su dedicación y muyespecialmente, que me brindara 1a oportunidadde colaborar en la investigación, tarea particularmente grata para mi.

A los integrantes de la Cátedra mi agradecimiento por el apoyo y estímulo recibido.

Resúmen

El astilbestrol a1 igual que las hormonasesteroides,inhibe selectivamente la cadena de transporte deselectrones mitocondrial. La NADHoxidasa es mucho más sensible

que la succinato oxidasa, ubicándose inicialmente su sitiode acción en el segmento NADH-(Q,cit b).

Se ensayó un fraccionamiento de la cadena, con elobjeto de eliminar sectores no involucrados, utilizándose partfcular NADHy succinato citocromo c reductasa.En adelante se utilizaron segmentos funcionales, ya quelas modificaciones preparativas introducidas por elfraccionamiento, alteraban las respuestas al estrógeno.

Se utilizó el segmento NAIH-citocromob. Con el estilbestrol y análogos, se determinaron por espectrofotometria diferencial modificaciones en los niveles de óxidoreducción de los componentes de la región "NADHflavo

proteina" en primer lugar citocromo b y en segundo lugarflavoproteinas y otros componentesque contribuyen a lasvariaciones espectrofotométricas a 465-510 nm, Se determinó que el estilbestrol produce desplazamientos delnivel de estado estacionario de óxido-reducción del citocromo b hacia la oxidación en el sistema aeróbico y coincidentemente una inhibición de la reducción directa en elsistema inhibido por cianuro.

Se tituló el efecto del estrógeno y análogos sobreeste sistema NADH-citocromob y se encontró que actúancon la mismaespecificidad que sobre la nmpiración mitocondrial, sobre la NADHoxidasa y sobre 1a NADH-Qreductasa, segmentofuncional utilizado posteriormente, Losdimetiléteres (fisiológicamente inactivos) no inhibenla transferencia de electrones.

II

La concentración I ) para estos efectos fué para(50Stil: 2 uM. Sobre la NADH-oxidasa midiendo consumo de O?polarográficamente, se obtuvo un valor 0.751flM.

Se encontró que el ascorbato potencia significativamente1a inhibición por estilbestrol.

La antimicina A modifica el flujo de electroneshacia el b por acción sobre dicho componente, además delbloqueo que produce a un sitio inmediato posterior. No seobserva efecto del Stil cuando el parámetro utilizado esreducción del b en sistema anaeróbico por cianuro másantimicina A. El ascorbato es capaz de antagonizar elefecto del antibiótico y restablecer el efecto de Stil.

En el sistema cerrado, con cianuro comoinhibidorterminal el citocromo b se muevelibremente en presencia de Stil, en un equilibrio de óxido-reducción sumamente sensible a las variaciones del flujo de electro

nes desde el NADH.Se ensayó el agregado de Q2 y fumarato. En todos los casos, la reoxidación del citocromo bresulta dependiente de la concentración del estrógeno,en función de su efecto primario: inhibición del transporte a un sitio anterior a b. Por lo tanto b no es elsitio de acción del estrógeno. Quedaabierta la cuestiónde una posible influencia sobre la conformación del mismo, pero no en relación con el sitio de acción fundamental.

El citocromo b, según criterios cinéticos no se encontró alineado en la cadena principal, sino en posición desalto tal comoocurre en general en este tipo de preparaciones no fosforilantes. La reoxidación observada del citocromob en el sistema cerrado por cianuro se efectuariaa través de una via paralela a la via principal, insensible al cianuro.

IIIEn cuanto a las variaciones eSpectroscópicas a

465-510 nm(flavoproteínas), en el sistema aeróbico,Stil no modifica la reducción y sí la reoxidación. Ensistemas cerrados, inhibidos con cianuro se produceuna curva bifásica de reducción y si el estrógeno seagrega a la flavoproteína ya reducida, se logra unpequeñoaunque significativo desplazamiento hacia laoxidación. Agregando ascorbato al medio de reacción laacción de Stil se potencia, al igual que el caso observado del citocromo b y el sector NnDH-deshidrogenasa seresuelve en dos componentes de óxido-reducción, uno de

bajo potencial del lado sustrato y otro del lado O2del sitio sansible al Stil. El succinato resulta capazde reducir a este último, además de su correspondienteflavoproteina.

Se ensayó la acción de Stil y análogos sobre elsegmento NADH-Qexógena de la cadena respiratoria conidénticos resultados que los comentados para el segmentoNADH-citocromo b.

Se mantiene el requerimiento de OHfenólicos libres.

Las concentraciones inhibidoras 50 % (ISO) son paraQ2pM 4.o (Stil); 7.5 (Hex); 15 (Stil MPH)y para Q0(Stil) 18; (Hex) 15 y (Stil MME)3o.

Los dimetiléteres no resultaron activos en ningunode los sixemas ensayados.

Se determinó que la disminución de la actividadenzimática en presencia de Stil es proporcional a lacantidad de enzima presente y depende de la concentración del inhibidor en la mezcla de reacción. La inhibición se revierte por simple dilución de la mezcla enzima/inhibidor. La naturaleza reversible de la inhibición

IV

permitió un tratamiento cinético en el estudio de lainhibición sobre el segmento NADH-Q.Se descarta unaprobable competencia entre Stil y quinona ya que losgráficos (Lineweaver y Burk ) obtenidos dan una inhibición no competitiva de Stil con relación al sitio funda

mental de entrada de la quinona. Los valores de Kiobtenidos confirman la naturaleza no competitiva de lainhibición en cuanto a la reacción de quinona con lacadena al sitio fundamental de entrada. Se hace un cálculo relativo de las contribuciones respectivas a dossitios de entrada de la quinona exógena. Se analiza unasupuesta competencia que resulta de la aparición de una

actividad NADH-Qoinsensible al estrógeno a altas concentraciones de quinona. Esta actividad seria la conse—

cuencia de una interacción directa de Q0con el grupoflavina de bajo potencial de la NADH-deshidrogenasa.Comose esperaba, dicha actividad resultó competitivacon respecto al NADH.

Se ensaya el efecto de Stil sobre reacciones queinvolucran directamente a dicho grupo flavina talescomotranshidrogenasa y ferricianuro reductasa. El estilbestrol no afecta estas actividades de acuerdo con lo

encontrado para la actividad NADH-Qoreductasa a altasconcentraciones de la quinona. Se descarta el grupoflavina comositio de acción del inhibidor.

En experimentos de preincubación de la enzima conStil no directamente comparables se obtienen variaciones de las actividades NADH-citocromoc reductasas yferricianuro reductasa que se deberian a cambios conformacionales de la NADHdeshidrogenasa partiouladafuncional. En correspondencia se obtiene aumentadareactividad a mercuriales.

Todosestos resultados localizan el sitio sensiblesobre el sector NADHdeshidrogenasa en las proximidadesdel componente I (excluyendo al grupo flavina), dejandoun segundo componente redox del lado oxigeno. La naturaleza de este segundo componente es por el momento discutible ya que se han propuesto dos esquemas diferentes.

Se ha ensayado el efecto de Stil y rotenona, resultando aditiVas las inhibiciones ó dando respuestas análogas cuando se ensayaron separadamente. Esto indicaríaque ambos inhibidores afectarían al mismocomponenteenzimático, no necesariamente al mismo grupo ya que seencontraron diferencias en presencia de ferricianuro yascorbato. Pueden suponerse diferentes mecanismos deacción dadáolaudiferencia de estructuras.

Se ha postulado un probable mecanismo de acción enlo que respecta a la acción del estilbestrol y análogos,no comprobado, pero que responde a los hechos experimentales observados.El estilbestrol actuaría en este sistema por su capacidad de producir radicales libres Ho,capaces de ceder electrones a un sustrato orgánicoadecuado, grupos disulfuro u otros equivalentes. Elagregado de acido ascórbico potenciaria al sistema porregeneración del difenol a partir de la doble quinona,explicándose así la mayoractividad del sistema acidoascórbico-estilbestrol que el del estilbestrol aislado.El monometiléter tendría menor eficacia ya que darial Ha por mol en lugar de dos. El otro radical seria menos reactivo ya que puede estabilizarse por resonancia.Finalmente los dimetiléteres inactivos formarian bisradicales pero no Hs, cumpliendose de esta manera laprOporcionalidad del efecto con el número de OHfenólicos libres. Los experimentos de preincubación aunque

VI

no directamente comparables, sugieren la formación degrupos sulfhidrilos libres ya que se observa aumentadareactividad a mercuriales. El ferricianuro interfeririala reacción a nivel de la enzima compitiendo con elgrupo Prot-Sq por el electrón cedido por el átomo dehidrógeno. Esta hipótesis seria válida exclusivamentepara el estilbestrol y análogos en coincidencia con losrequerimientos para su acción estrogénioa, no así paralos estrógenos naturales en los cuales no se requierenOHfenólicos libres para la inhibición, comolo prueba

la acción de los dimetil-dnrivados del 17r estradiol.

I N D I C E

Bag.I. Sitio de acción de hormonas esteroides sobre 1a

cadena de transporte de electrones mitocondrial l

Descripción.esquemática de cadena respiratoria... 2Inhibición del transporte de electrones mitocondrial porhormonasesteroides.................... 6Acciones de esteroides sobre preparaciones fosforilantes: otros efectos.... . . . . . . . . .............. llEfectos de esteroides sobre oxidaciones de NADHy succinato insensibles a antimicina A, en particulas de transporte de electrones.. . . . . . . ...... 13Efectos de estilbestrol y hormonasesteroidessobreestructura demembrana..................... 15Interacciones de hormonasesteroides y enzimas... 17Localización actual del sitio de inhibición porhormonasesteroides sobre cadena respiratoria.... 24Referencias-.000...0000.-oooooovolotovooolooocooo

II. Materiales yAMÉtodosPreparacionesenzimáticasutilizadas............ 36Medida de actividades enzimáticas . . . . . . . . . . ..... 39Actividades enzimáticas: condiciones de ensayo.. 41Reactivosutilizados............................ 43Referenciasooolooooooono.OOOOOOIOOOOOOQOOOOOOQOO

III. Inhibición por hormonasesteroides de la oxidación dg succinato x NADHen sistemas citodromo creductasademiocardio......................... 45Fraccionamiento de cadena respiratoria mitocondI‘ialOOIOIIOOUI’0’000......IIOOOOOOOIOOOOOOOOOO

Obtención y propiedades de una partícula NADHsuccinato citocromo c reductasa de fragmentosSarcosomales..cnco0.000nosaaooooooo-OIOOOOOIOOO

VIIIAcción de hormonas esteroides sobre actividades..enzimáticas catalizadas por preparaciones NADHsuccinatocitocromoc reductasa................ 51DiSCuSiÓnOÁIOIOIOOUC¡IOOOIIIODO’OOO'OOOCOOODOII

Referencias....... . . . . . . . . ..................... 56

Acción del estilbestrol y angiogos sobre loscomponentes de óxido-reducción del segmentoNADH-citocromob de la cadena respiratoria .... 58

Efecto del estilbestrol sobre la cinética deóxido-reduccióndel citocromoE................ 59Especificidaddel efecto de Stil............... 62Comparacióndel efecto de Stil sobre la reduccióndel citocromo Q por NADH,succinato y menadiol. 62Acción de Stil sobre la reducción del citocromo g 64Experimentoen presencia de ascorbato.......... 66Reducción de g por NADHen presencia de Stil.Efectodelascorbato........................... 67Efecto de Stil sobre 1a reducción de p por NADHySuccinatOOOCOOIOOO.G.0...OCIOCOCOOIUOOOIOOOOO

Anulación por antimicina A del efecto de Stilsobrela reduccióndep........................ 69Oxidación de g por fumarato en presencia deStillloOCIOUIOOOOOOOOOOOÜOIIOIOCOGOCIOOOOOOUOOO

Titulación del efecto de Stil sobre la reoxidadeECCOOIOOOOOOIOICIOOOOOOOCOOOOIUOQIÁQQOO

Efecto de la antimicina A sobre la reoxidacióndeg porel estilbestrol....................... 76Acción de Stil sobre citocromo g reducido porNADH.‘OOÓÍOCOIOOCIIOOOOOOODO.ÍOOOOOOOOOÜCOOÍOOO

Efecto de Stil sobre la reducción de flavoproteinas (absorbanciaa 465-510nm).............. 78Discusión..OOIOÍOCOOICCÜOOOOO0.0.0.0.0...'00...ReSúmenolotooooooiolooooooivlcoocnioooocoolloooReferenciasooooIOOIoooouo.oo’llcoooaoooOOOOOltl

VI.

Accióndel dietiletilbestrol xianáloggs sobre elsector NADH-quinongde la cadena respiratoria...

Efecto de Stil y análogos sobre la actividadNADH-QOy NADH-Q2reductasa de miocardio........Efecto de la concentración de QOsobre la sensibilidad a1 Stil de la NADH-Qoreductasa....,..Acción inhibidora de Stil, a diferentes concen

NADH—Oxidasa-Iu¡oc-ooooaooooo-ooooooReversiónde la inhibición por dilución.......,.Variación de la actividad NADH-Qreductasa, conla concentraciónde la quinona............

Efecto de Stil sobre el aparente Kmpara NADH-Q2reductasanoooo-00-000000000.oo

Efecto de Stil sobre el Kmaparente para NADH-Qoreductasa........

ooo...

O...0......OOOOOOODOOOOODIOOOO

Variación de la actividad NADH-Qreductasa conla concentración de Q . InfluenCia de la concen. .. olqADHIOOOOOIOIOOOOOOIOI.¡000.00.00.00Efecto de Stil sobre la reacción de transhidrogenación.................Variación de la actividad ferricianuro reductasa con la concentración de ferricianuro.cia de Stil y rotenona..mscusión...coo-IQQOOOOIcoonOto¡000.000.000.000

toooooo.oocoooocooooolooo000000.0ReferenciasocCocoa...00-00....-UOOOOOOOOIIOOIIO

Analogias y diferencias en las inhibiciones porestilbestrol y rotenong en los diferentes sistemasanalizados...............................,.Efecto de rotenona sobre la reducción de citocromob, en sistemas aeróbico y anaeróbico.....Efecto de AA, sobre la reoxidación del citocromob porrotenona...........................Competencia entre Stil y rotenona sobre lareoxidación del citocromo b producida porambosinhibidores...,.¿........................

Influen

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VII. Engaxos de acción de Stil sobre la NADH-deshidrogenasa funcional, particulada en el sistema

Reoxidación del citocromo b por rotenona y Stil.Efectosdel ascorbato...........Reducción de flavoproteina a 465-510. Influencia de Stil y rotenona en presencia y ausenciade ascorba‘to...OOOCOOIOCOOO.I'ÚIOIÜIÍOOOOO.....'

Efecto de rotenona sobre la actividad NADH-Qoreductasa...........Efecto de rotenona sobre el aparente Kmpara

reduCtasaoooooooooooocoocoooooooooonoooVariación de la actividad NADH-ferricianuroreductasa con la concentración de ferricianuro.EfectodeStil y rotenona.......................Conclusiones-lotto'0.0.0.0....0000.0.0Referencias...IOOIOOOOOIIooohoool.

completonofosforilante......................Curva de efecto de concentración de estrógenosobre consumode 02. Métodopolarográfico.....Reactividad a mercuriales luego de preincuba—

SJGj-l...OOUOUOOODOOIOOIIOQIOÜIDOÍIODID

Efecto de Stil y Etil-maleimida sobre la oxidación de NADH.........Discusión........OQODOÜOOOO

Conclusiones...oIO...-00.00.0000.colo-000.000....ReferenciaSOOoOliloIIOOOOOIOOOO.¡oo-I

general.OIC.IOOCOCOCOIOIOOOIOIOOOIII

IX.

Sitio de acción del estilbestrol sobre eltransporte de electrones mitocondrial........Naturaleza de la inhibición.,.Efectos comparativosdel estilbestrol y rotenona...OIOOIDOICOOIOOQDOIOCIOOOIOOUOOUOOOOOOO

Probable mecanismode acción......Referencias..........

Conclusiones......

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Abreviaturas

Stil: dietilestilbestrolHex: hexestrolStil-MMEy Stil-DME: dietilestilbestrol monometil y

dimetiléteres, respectivamente.Hex-BME:hexestrol dimetiléter

NADH:nicotinamida adenina dinucleótido (formareducida)

Fp: flavoproteinaCoQ: coenzima Q

APAD:aoetilpiridin NAD

Q0: 2,3 dimetoxi-Z' metil p-benzoquinonaRot: rotenonaAA: antimioina A

Aso: ascorbato

p-ClMBp-cloromercuribenzoatoEM:etil-maleimidaFe-nh: hierro no heminico

Tris: 2-amino-2-hidroximetilpropane-l,3-diolATP:—5'adenosina trifosfatoADP:-5‘adenosina difosfatoNADP:nicotinamida adenina dinucleótido fosfatoNADPH:nicotinamida adenina dinucleótido fosfato

(reducida)ETP: partícula transportadora de electronesS.D: sucoinato deshidrogenasa

CAPITULO I

Sitio de acción de hormonas esteroides sobre lacadena de transporte de electrones mitocondrial

Los efectos fisiológicos conocidos de las hormonasesteroides, se vincularon tempranamentea modificacionesde procesos bioquímicos endocelulares. Era presumible quelas hormonasactuaran sobre "sitios esgecificos" dentro osobre la superficie de la célula.

Por su importancia clave dentro del metabolismo, laactividad oxidativa de tejidos fué uno de los campos deelección, para el estudio de las acciones a nivel celularde las hormonasesteroides. En efecto "Interfiriendo conmecanismosde liberación de energia, los esteroides podríanafectar otras reacciones esenciales, tales comobiosintesis,transferencia a través de membranas, degradación de carbohidratos, acidos grasos y aminoácidos..."(l). Es importante señalar que diferentes sitios de acción (proteínas represoras, genes oderadores, membranacelular diferentessistemas enzimáticos), no implican necesariamente diferentes modos de acción (2). Algunos de los efeCtos descriptosde las hormonasesteroides, podrian tener significaciónfisiológica. De todos modos, mientras tal información noeste disponible, los sistemas enzimáticos uailizados permiten conocer eventuales modos de acción de los esteroidesa nivel molecular (3). Pese al esfuerzo hecho hasta el presente, los mecanismosbásicos de la interacción hormonal,permanecensin resolver (4).

La acción de hormonas esteroides sobre sistemas enzi

máticos y más particularmente sistemas NADHy succinatooxidasa fueron objeto de amplia y detallada revisión (1,3).En esta introducción se mencionan solamente los hallazgosde interés fundamental para describir el cuadro actual de

conocimientos sobre la inhibición por hormonas esteroidesdel transporte de electrones mitocondrial. Entre la variedad de lineas de trabajo en este campo, una de ellasadquiere importancia comgarativa. Es la interacción delas hormonasesteroides con macromoléculas en particularenzimas, ya que nuestro sistema de estudio es eStructuradoy multienzimático.

Descripción esquemática de cadena respiratoria

Se considera comúnmentecadena respiratoria al sistemamultienzimático que cataliza la dehidrogenación de sustra

tos y la transferencia de equivalentes reducidos al O2°Por un extremo las dehidrogenasas, flavoproteinas estructuralmente ligadas, tales comoNADHy succinaco dehidrogenasa. Por el otro extremo la cadena de citocromos yligando a ambos probablemente la ubiquinona (5). "Existirían relativamente grandes distancias a cubrir entre lasdehidrogenasas y las cadenas de citocromos receptoras delos equivalentes de reducción. Podrian requerirse entonces, metabolitos transportadores Queunieran dichasdistancias por difusión" (5). La ubiquinona que está presenteen gran exceso y es además, una molécula no ligada a proteína, parecería llenar ese papel (6).

Termodinamicamente, la secuencia de reacción de loscomponenses de cadena respiratoria guede ser determinadaaproximadamente por los potenciales redox de los mismos,los cuales en conjunto abarcan el intervalo total de1.200 mVentre sustrato y O Los potenciales normales2.determinados para los comgonentes aislados, no representan los de cadena intacta y hasta su acoplamiento con latransferencia de energia puede modificarlos.

Cinétioauente, puede ser analizada siguiendo directamente la transferencia de los equivalentes de reducción.La aplicación de técnicas espectrofotométricas desarrolladas por Chance y col. (7), fué uno de los caminos elegidos para el conocimiento de la naturaleza y secuenciade los componentes de cadena respiratoria. Otra via deexperimentación la constituyen los trabajos de fraccionamiento fundamentalmente llevados a cabo por Green ycol. (8). El aislamiento de secciones de cadena en 4 complejos permitió conocer nuevos componentes probablementeinvolucrados en el transporte como por ejemplo Fe no heminico entre flavoproteínas y citocromo b y entre citocromos b y c (9).

El uso de inhibidores constituye otro método que hadado enorme información acerca de una serie de aspectosdel funcionamiento del sistema fosforilante y del transporte de electrones. Se pueden citar verdaderos desacoplantes tales comoel dinitrofenol, que permiten máximavelocidad de respiración; inhibidores de la fosforilaciónoxidativa que secundariamente, inhiben el transporte deelectrones acoplados tales comooligomicina y verdaderosinhibidores del transporte sea en cadenas acopladas odesacopladas tales comoantimicina A, rotenona y cianuro.Los esteroides pertenecen al tipo de inhibidores mixtosque influencian en determinadas condiciones el acoplamiento de energia y el transporte de electrones.

La energia liberada durante el pasaje de electronesdel sustrato al O está acoplada a la sintesis de ATP.27El sistema fosforilante intacto implica control de res

piración. La presencia de AD?acelera el consumo de O2(estado metabólico activo 3),su agotamiento en el mediofrena la respiración marcadamente (estado metabólico de

4

reposo 4) (7). Las cadenas desacogladas tienen máximavelo

cidad de consumo de 02.

Se ha supuesto una probable estequiometria entre eltransporte y la fosforilación. En un sistema fuertementeacoplado, aproximadamente 3 moléculas de AIP serían sintetizadas ¿or cada molécula de NADHoxidado. Esto ocurriria en 3 lugares de conservación de energia establecidos ¿or Chance (7), basado en la observación de cambiosen los niveles de estado estacionario de oxido-reducciónde los componentes de cadena respiratoria. Recientementeha sido modificada la ubicación del primer sitio (lO).

Esguemagg cadena resgiratoria

Sitios de fosforilación e inhibición

Sitio I Sitio II Sitio III

Amytal 1/A A ¡CNErotenona Azidaesteroides HQNO l,Co

NADH--> FpD (Fe nh) _-á Q cit b -——9 cit cl —“-) cit c ———>cit a, a3 -—-9 02A

l

I

(Fe nh)

Succinatu FpS

Los mecanismos de la fosforilación oxidativa en cadena

resgiraaoria no se han aclarado. En 1953 Slater posaula elrequerimiento de intermediarios de alta energia a la maneraclásica. Esta hipótesis quimica no es facilmente comprobable por la imposibilidad de aclarar la naturaleza de los

\.71

intermediarios hasta el Presente. Por osra parte Mitchell (ll) con su hipótesis quimio-osmótioaexplica lasintesis de ATPpor reversión de la actividad de unaenzima anisotrópica "ATPasa", ligada a membranacon

determinada permeabilidad para H+y OHÏLa separaciónde cargas, manejaria la síntesis de AIP previa formaciónde un anhídrido intermediario de alta energia. Boyer postula una posibilidad alternativa (12); sugiere que elintermediario de alta energia represente simglemente unestado energizado acompañado de cambio conformacionalproteico. Estas discusiones han promovidoel estudio delos elementos ligados fundamentalmente a membranainterna.Hacker y su grugo han tenido éxito en la reconstituciónde fosforilación oxidativa con garticulas submitocondriales no fosforilantes y agregado de factores proteicosacoplantes íntimamente ligados a membrana(13,14). Losexperimentos realizados gor este grupo permiten tambiénconfirmar Hue las enzimas solubilizadas de los complejosenzima-membranamodifican sus gropiedades con relación alas ligadas eStructuralmente (15). La eStructura membranosa de mitocondrias con las enzimas asociadas a ella,hacen que el arreglo estrucuural en la matriz lipoproteica, determine las interacciones mutuas de los componentes (16).

Klingenberg (5) discute los diferentes mecanismospropuestos gara la transferencia de eleccrones prOpiamente dichos, ¿ue constituye otro aspecto del problema,"En todos los mecanismos debe suponerse que la transferencia electrónica está basicamente organizada para producir además, transferencia de energia. En todos los sistemas de cadena respiratoria aún desacoglados y fraccionados, deben estar presentes proteinas y lípidos esen

6

ciales para la secuencia y organización de la transferenciaelecarónica, pero la función de los cuales puede ser entendida solamente, teniendo en cuenta la transferencia deenergia”.

Resumiendo: El arreglo, númeroy función de los transportadores de electrones en la cadena resgiratoria mitocondrial es actualmente incompleta. Los aceptores inmediatos gara algunos de ellos, no están bien establecidos.Tamgocohan sido identificados los componentes sensiblesa los inhibidores anteriormente mencionados (lO). Convienedesde ahora destacar ¿ue la ubiquinona ocupa una posiciónclave entre las flavogroteinas, NADHy succinato dehidrogenasas y los citocromos. Su ubicación del lado sustratodel citocromo c parece claramente establecida, no asi suposición con relación al citocromo b (lO). Recientementese habla además, de un nuevo comgonente flavoproteicoentre NADHy citocromo b (17).

Inhibición del transporte de electronesmitocondriales por hormonasesteroides

El dietilestilbestrol es un estrógeno sintético degran gotencia. Fué utilizado juntamente con el benzestrolpor McShan y Meyer quienes describieron su acción inhibitoria sobre succinato oxidasa de higado y pituitaria derata (18,19).

Case y Dickens (20) investigaron la acción del estilbestrol comoprobable inhibidor de la citocromo oxidasa.Los resultados no muestran sensibilidad a la hormona delas enzimas terminales de la cadena.

Gordan y Elliot (21,22) con homogenatos de cortezacerebral de rata, coincidieron en que la citocromo oxidasano es el sisio de la inhibición. La interpretación de losresultados obtenidos con homogenatos es bastante complejapor la multiplicidad de factores que pueden incidir enel efecto.

En preparaciones libres de células de levadura e higadode rata, Hochster y Quastel (23,24) encontraron que elestilbestrol inhibe también la oxidación del glicerofosfato. Con los sistemas de levadura, postulan que el estilbestrol actúa comotransportador competitivo participandoen una conversión quinona-hidroguinona. La hormona podriacompetir comoaceptor de hidrógeno con otro transportador,produciendo entonces inhibición de la actividad. En esaforma, variaria el curso de las oxidaciones intracelulares sin interferencia con las enzimas involucradas o sincompetencia con los sustratos, afectando finalmente almetabolismoy crecimiento celular (23). En sistemas totalemente distintos (peroxidasas y fenolasas) WilliamsAshman(25) sugiere que una forma de radical libre de los

estrógenos fenólicos, podria servir comotransportador deelectrones.

Prosiguiendo con estudios sobre los sistemas oxidativos NADHy succinaso oxidasas de músculo cardiaco y preparaciones de Otras fuentes, incluso bacterias, Yielding yTomkins (26) y Stoppani y col. (27,28) concluyeron casisimultáneamente due una variedad de hormonas esteroidesy estilbestrol, a concentraciones micromolares inhibenal sistema especifico para NADHcon mucho mayor potenciaque al sistema succinaso oxidasa. Extendidas estas observaciones por ambosgrupos, la localización del sitio deinhibición fué hecha sobre la actividad NADHcitocromo c

reductasa (1,27) y tentativamente entre flavoproteina yCOQ (29).

Jensen, utilizando hormonasadrenocorticales (30,31)observó los mismos efectos sobre la NADHcitocromo c

reductasa. Para este tipo particular de hormonas, lainhibición resultó reversible y no competitiva con elsustrato. Este gru¿o de trabajos (l,26—3l) introducenuna conclusión imgortante a saber: que el transporte deelectrones es afectado directamente por los esteroides.Alguna de las preparaciones utilizadas por ser fragmentosde mitocondrias permitían excluir la posibilidad de unaacción de permeabilización sobre las mismas, con pérdidade coenzimas y cofactores. "Con la preparación de Keiliny Hartree la sensibilidad a hormonas, es una propiedadintrínseca del sistema oxidativo no dependiente de ladisrupción de una estructura más comgleja (mitocondrias,sarcosomas)" (l). Esto contradecia las interpretacionesde resultados anteriores por Gallagher y Packer y Bacilaque atribuyeron a cambios de la estructura mitocondrialy consiguiente pérdida de coenzimas y cofactores, el origen de la inhibición sobre el transporte de electrones (32,33).

Stritmatter con sistemas bien caracterizados defracciones celulares de corazón e higado de pollo,concluyó que la inhibición por progesterona ocurre solamente en las actividades NADHcitocromo c reductasa demitocondrias sensibles a Antimicina A.

Stoppani y col. (l) discuten criticamente algunosresultados obtenidos por los diferentes grugos, en relación con la estructura lipoproteica mitocondrial nativay aparición de contaminaciones microsomales o shunts

artificiales. Esto explicaría por ejemplo la muyactivaNADHoxidasa insensible a esteroides (29), al agregarcitocromo c exógeno a fracciones particuladas de higadoy otras (34).

Stoppani y col. ensayan la acción de los esteroidessobre reducción de quinonas exógenas (35) teniendo encuenta que serían los intermediarios entre flavoproteinasy citocromos, en preparaciones de fragmentos sarcosomalestipo Keilin y Hartree. Sus resultados fueron consistentescon los observados anteriormente para progesterona (29).

Yielding y fomkins (29) suponen idéntico sitio deinhibición para otro inhibidor de cadena respiratoria,Amytal (36). A pesar de ello 1a inhibición por hormonasesteroides es revertible por alfa-tocoferol, a diferenciascon la inhibición por Amytal.

Dietrich (37) extrae NADHcitocromo c reductasa queretienen sensibilidad al estilbestrol pero no al Amytal,de preparaciones mitocondriales de hígado de rata yadenocarcinoma.

Ambosgrupos (Stoppani y col. y Yielding y Tomkins),además de establecer aproximadamente el sitio de adción,puntualizan el efecto comoinherente a la transferenciade electrones prOpiamentedicha y enfatizan particularmente la importancia de la estructura lipoproteica enrelación con la inhibición.

Las NADHoxidasas, partículas ricas en lípidos (26,29) serían especialmente capaces de concentrar esteroides.Estos, no parecerian inhibir por interacción física inespecífica pues estructuras similares tienen efectos muydistintos. Stoppani y col. (l) concluyen por su parteque la inhibición de transporte electrónico no seria

lO

el efecto inespecifico de una estruCtura carbonada policiclica insoluble en agua, ya que cambios limitados lashacen inefectivas con relación al efecto estudiado. Otrosfactores a tener en cuenta, señalan, serian su solubilidaden lípidos e interacción de intermediarios de oxido-reducción con lipoprotefnas (38). "Disolviendose preferentemente en estas últimas podrian afectar la interacción decomponentes de oxido-reducción y comoconsecuencia inhibiroxidaciones intracelulares". Citan además, el refuerzoque dan a esta interpretación los ensayos de concentraciónde esteroides en interfase iniciada por Munck(39).

Para dar continuidad a los experimentos encaminadosa dilucidar el sitio de acción de esteroides sobre eltransporte de electrones propiamente dicho, incluiremosmás tarde los relativos a otros efeccos dentro del mismo

campo de acción, (48,51) pero que son previos en el tiempo,e inspiraron además, el trabajo que se comenta seguidamente. Varicchio y Sanadi (40) utilizando partículassubmitocondriales y espectrofotometria de doble haz,encuentran inhibición de la reducción de citocromo bpor progesterona y azasteroide. En coincidencia con trabajos anteriores de Stoppani y Vallejos encuentran unsitio entre citocromo b y c que da cuenta de la inhibiciónpor succinato y en la región citocromo oxidasa a mayoresniveles de concentración de las hormonas ensayadas.Utilizan una NADHubiquinona reductasa soluble (41,42)y quinonas comoaceptores exógenos con igual resultadoquen en trabajos anteriores (29,3l,43). El sitio quedaentonces localizado entre NADHflavoproteina y CoQocitocromo b.

llAcciones de esteroides sobre preparaciones

fosforilantes: otros efectos

Wadey Jones (44,45), encontraron inhibición de lafosforilación oxidativa y aumento de actividad de ATPasalatente por la progesterona. En mitocondrias frescas dehígado de rata, se describen también activaciones deATPasa(44,46,47) aunque a concentraciones relativamentealtas 0.6 mMde acetato de deoxicorticosterona y progesterona.

Vallejos y Stoppani (48) concluyen que la inhibicióndel transporte electrónico en el sitio anteriormente localizado (1,29) es decir la región NADHflavoproteina, seconfirma en mitocondrias fosforilantes y es de importanciaprimaria con relación a los procesos de "swelling" óhinchamiento. Sin embargo con bajas concentraciOnes deprogesterona y deoxicorticosterona la activación de laATPasa es escasa y no hay "swelling", a pesar de lainhibición de la respiración. La inhibición de la oxidación del succinato se produce por interferencia al segundo

sitio de fosforilación entre citocromos b y cl. La inhibición del transporte no es revertida por desacoplantescomodinitrofenol en contraste con la respuesta positivaen mitocondrias de corazón de paloma (49,50).

En cuanto al uso del estilbestrol en estas preparaciones Stoppani y Vallejos (51), citan trabajos anteriorescon resultados no del todo consistentes entre si: Salmony (52) usando la "cicloforasa" como sistema de ensayoobservó inhibición de la oxidación de glutamato por estilbestrol y también desacoplamiento de la fosforilaciónoxidativa. Packer y Bacila (32) encontraron inhibiciónde respiración y reducción de citocromo b en mitocondrias

12

estimuladas por ADP,mientras que en condiciones de reposo(estado metabólico 4) el estilbestrol activaba la repiración. Estos efectos comose dijo anteriormente, los atribuyeron a cambios en la estrucaura fisica de la mitocondria, imputables a fenómenos de hinhamiento. Concentraciones de estilbestrol que no eran capaces de producir"swelling", no provocaban cambios en la respiración, control respiratorio o eficacia de la fosforilación oxidativa. Contrariamente, Emmeloty Bos (53) podían inhibirla oxidación de glutamato usando estilbestrol a concentraciones que no producían alteración de la estructuramitocondrial.

Stoppani y Vallejos ensayan la acción del estilbestroly compuestos relacionados sobre el metabolismo de mitocondrias de hígado de rata (51). Confirman el sitio de inhibición establecido para preparaciones no fosforilantes;con succinato comosustrato las concentraciones inhibidoras de estilbestrol son mayores. Por otra parte el estilbestrol, hexestrol y dienestrol desacoplanla fosforilación al tercer sitio. Actúan en forma distinta a losdesacoplantes y no inducen activación significativa dela ATPasa latente aún en presencia de Mg++, lo que descarta la posibilidad de un efecto detergente (55).

En cuanto a relaciones de estruCtura de los estrógenoscon el efecto estudiado (51), la esterificación y alquilación de grupos OHdisminuye la acción de estrógenos artificiales sobre el metabolismomitooondrial. Es importanteseñalar (dicen los autores) que los derivados sustituidoscon efecto nulo o menor, tienen también poca o ningunaactividad estrogénica (56).

13

El trabajo ya mencionado de Varicchio y Samadi (40)aparte de confirmar los resultados comentados sobre elsitio de inhibición primaria y los sitios secundarios amayores concentraciones no agregan mucho sobre los otrosefectos que se comentan. Isstacan únicamente que no encuentran inhibición de transferencia de energia por progesterona ya que preparaciones estimuladas por AD?ódesacopladas por dinitrofenol, son igualmente inhibidas.Dan comoposible causa la fuerte incidencia del efecto

. . , . .1. . ,primario, o sea 1nh101ClÓndel transporte.

En las apreciaciones sobre el probable mecanismo deacción resume las sugestiones hechas por Stoppani ycol. (l), modificación de la interacción entre los compOnentes de óxido-reducción, como consecuencia de cambiosen la estructura de la partícula oxidante. Unasugestiónsimilar, pero afectando a la enzima "per se" (57) y unaacción sobre el medio lipidico comoposibilidad relacionada (40).

Recientementese describe un efecto distinto al estu

diado, pero también sobre cadena respiratoriat

Efectos de esteroides sobre oxidaciones de NADHysuccinato insensibles a Antimicina Alien particu

las de transporte de electrones

Jensen y col. (58,59) comunican ¿ue cuando la oxidación de NADHpor gragmentos mitocondriales es inhibidaal máximogrado con Antimicina A (inhibidor de cadenarespiratoria ya mencionadoen los esquemasanterióres(60)), la accividad residual, oxidación NADHinsensiblea AA, es estimulada por bajas concentraciones,

14

Se describen Otros ensayos en los que la concentraciónafecta no solamente el grado, sino la dirección del efectoesteroide (61,62).

La velocidad de la reacción en estudio aumenta con el

pH hasta un máximoidéntico al de la velocidad de oxida

ción de las particulas no inhibidas, a igual pH. Se pro

duce H2 O2 aunque no en relaciones estequiométricas (63).

La divergencia de efectos de esteroides a diferenteconcentración (estimulación o inhibición) parece consecuencia de la modificación de la curva de pH, en ladirección ácida para la actividad ensayada en presencia

de hormona. La formación de HZO2estaría de alguna maneravinculada al efecto esteroide. Una explicación teóricadada por Jensen, seria la posibilidad de cambios en lasconstantes de disociación para grupos disociables, en elsitio activo de las enzimas (64). Este posible origen deldesplazamiento de pH, no sería comprobable por la complejidad del sistema involucrado. Establece la posibilidadde que este efecto tuviera vinculación con desplazamientos de curvas de pH encontrados para enzimaso proteínassimples en presencia de esteroides. Desplazamiento endirección ácida por un número de esteroides del pHóptimo, para la aldehido dehidrogenasa (65). Alteraciónde la rotación óptica y desplazamiento de la curva detitulación en dirección ácida para proteinas ligadas atestosterona (66). A este tipo de efecto comolineaindependiente de trabajo, se lo mencionará más adelante.

Efectos de estilbestrol y hormonasesteroidessobre estruCtura de membrana

Stoppani y Vallejos (48,51), demuestran claramenteque los cambios fisicos mitocondrfales, revelados por"swelling" o sea alteración de la estructura mitocondrialno producen por si, las respuestas metabólicas de losestrógenos. Citan el caso de un poderoso agente de swelling, el estilbestrol monometiléter,el cual prácticamente no afecta la respiración.

Weissmany Keisser, en relación con estas accionesencuentran actividad hemolitica a concentraciones aproximadas de 200-500 ¡1Mde esteroides (67,68). Basados enestos y en Otros resultados (69) el grugo de Green ensayaefectos del estilbestrol sobre membranasmitocondriales (70). Los objetivos del trabajo no están encaminadosa dilucidar la acción hormonal sino a aportar datos tarala actual polémica desencadenada con el uso de la microscopia electrónica, sobre localización de enzimas, en lasdiferentes membranasmitocondriales, cuestión a la quehan aportado valiosos datos también el grupo de Racker(7l).A pesar de ello las conclusiones del trabajo llevan a incluirlo en esta introducción. En un trabajo anterior (72)encuentran las condiciones óptimas de fraccionamientocontrolado de las membranasmitocondriales por estilbestrol y Mg++.Comose dijo, la conclusión quizás más importante del trabajo seria la diferenciación de membranasen virtud del diferente comportamientofrente al agenteperturbador: estilbestrol + Mg++.En el caso de las membranas externas sufren disolución, rotura completa de lasbarreras de permeabilidad lo que involucra completa des

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trucción de las uniones proteina-fosfolipidos. En el casode las membranasinternas (cristae membranas), se producesimple debilitamiento de las uniones con transformaciónde su estrucuura tubular en vesicular, cambio quizásparalelo al "swelling" mitocondrial. En cuanto al efectoobjeto de nuestro estudio las conclusiones del trabajo (70) serian: "La perturbación por estilbestrol llevaa las membranasinsernas a una transición de tubularesa vesiculares, a la pérdida de capacidad acoplante y ala pérdida 0 modificación del transoorte electrónico".Las concentraciones usadas en el trabajo con apariciónde actividades AQPásicae isocitrauo dehidrogenasa son

del orden 150-200 pm.

Se pueden mencionar algunos trabajos de la lineainiciada por Munck(39,73,74) angel y otros sobre interacción a interfases y los más actuales sobre interacciones específicas e inespecificas (75,76). Aunqueestostrabajos constituyen una línea independiente por lossistemas utilizados, puedenresultar de utilidad susconclusiones. A concentraciones in vitro.>lO_'5 M, aparecen efectos inespecificos no relacionados a la actividad fisiológica y que podrian deberse a la capacidad deesteroides de concentrarse en interfase. Efectos producidos a través de mecanismos y probablemente sitios deligadura que difieren de los especificos (75).

Las limitaciones de los sistemas organizados y multienzimáticos para el avance en este campo, llevaron a ensayar paralelamente otros modelos.

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Interacciones de hormonas csteroidáay enzimas

Tomkinsy Maxwell (3) hacen una revisión detalladahasta el año 1963.

Las observaciones descriptas del efecto inhibidor deesteroide sobre la oxidación de NADH,por preparacionesmitocondriales llevaron a investigar las gosibles consecuencias metabólicas de tal inhibición.

NAD NADH..,.. .I

NADP HZO í cetogluuarato NADPH+ NH4L glutamato +

Esta reacción fué considerada de primordial interésen vista de sus conexiones con el metabolismo intermedio.

Cuando la concentración de NADfuera limitante, el fenómenode inhibición de transporte estudiado o sea inhibición de oxidación de NADH,debia deprimir la oxidaciónde glutamato. EfeCtivamente se encontró acumulación en

un sistema que contenía NAD,glutamato y preparaciónparticulada de hígado (77).

Ademásde este efecto algunos estrógenos entre ellosel estilbestrol, podian inhibir directamente a la glutamato dehidrogenasa. La observación agregada de que AD?podia revertir la inhibición, hizo muyatractivo al sistema. La concentración mitocondrial del nucleótido, podria controlar la magnitud del efecto.

La glutamato dehidrogenasa existe en solución en unequilibrio dependiente de la concentración entre un pesomolecular próximo a 2.000.000 y otro bajo de 320.000.

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A su vez estos agregados están constituidos por subunidades idénticas de peso molecular 52.000 (78-80).

La actividad de la glutamato dehidrogenasa es inhibida por estrógenos, menos efectivamente por andrógenosy hormonas progestacionales y muyespecialmente por elestrógeno sint tico el estilbestrol (77,81-84).

Otros inhibidores cuyo sitio de acción coincide enla cadena respiratoria también afectan la actividad de laenzima comorotenona (85) y o-fenantrolina (86).

Estos efectos comose dijo fueron estudiados especialmente con el estilbestrol (81). Se observó que producíaun decrecimiento del peso molecular de la proteina,cuando se usaban soluciones de alta concentración. Todos

los metabolitos que producían desagregación de la moléculaproteica, inducían un cambio de especificidad para elsustrato, pues emergia actividad de alanina dehidrogenasa (81-84,86). Comose esperaba de los experimentoscinéticos el AD?prevenía también, la desagregación.Pudieron correlacionarse los resultados de inhibición deactividad con los de ultracentrifugación (84,87).

La afinidad de la enzima por sus coenzimas (NAD,NAD?)no era alterada por hormonas, pero si los sitiosdisponibles para la ligadura del sustrato, según técnicas de intensificación de fluorescencia (88).

Todos estos resultados, condujeron a postular queel mecanismode estas acciones se deberia a interferencia con uniones hidrofóbicas criticas. Podria sucederque las regiones hidrofóbicas estuvieran implicadas enla agregación. "El fenómeno no parecía tan simple yaque factores estéricos y requerimientos de coenzimas,estaban también implicados (82,83)". Se establece una

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correlación con los fenómenosobservados en respiraciónmitocondrial (83). (interacciones de esteroides con ligaduras hidrofóbicas entre los comgonentes del sistema deóxido-reducción).

La acción de estrógenos persistia sin embargo en soluciones a concentraciones tales que la enzima se encuentraal eStado de monómero.Correlaciones cinéticas y de pesomolecular por técnica de disgersión de luz sobre una mismamezcla de reacción, llevaron a la conclusión de que losmonómeros de 320.000 PM pueden adOjtar una de las confor

maciones rágidamente interconvertibles, que difieren encuanto a especificidad de sustrato y tendencia a agregación en polímeros (89-92).

Polímero ——-—-) monómero ———-——>—monómeroX Y

Tomkinsy Yielding (78) expusieron tempranamente laposibilidad de que la ligadura del estrógeno a la enzimafavoreciera la conformación Y del monómerocon mayor actividad de alanina dehidrogenasa y sin tendencia a agregarse.Se refieren a esta acción comosituada a un sitio diferenteal catalitico y que godria germitir regulación cualitativay cuantitativa; regulación multivalente además, por la influencia de otros metabolitos sobre el efecto. Monod,Changeux y Jacob (93) llamaron regulación alostérica a estetipo de efecto.

Otros datos experimentales muestran que las hormonasesteroides inducen alteraciones estructurales sobre la enzima como ser: cambios en ligadura de coenzimas (88,94),cambios en laspropiedades inmunológicas (95) y velocidadesalteradas de inactivación térmica (96).

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Recientemente se describen (97) experimentos diseñadospara la selectiva marcaciónde los sitios cataliticos yalostéricos sobre la enzima. mstos reactivos poseen ungrupo alquilante por el que podrían ligarse covalentementea 1a enzima en el sitio especifico.

La leuóina y el ADP(98) antagonizan ambos el efectohormonal, aunque por caminos diferentes. La leuoina pareceprevenir la ligadura del estilbestrol a la enzima, determinado por el método de diálisis deequilibrio. El AD?produce un efecto distinto.

En esta regulación multivalente y comotal elegida comomodelo de interacción (78), es muy importante destacar queel efecto es dependiente de la concentración de coenzima (82,88,94). Ultimamente (98) se encuentran curvas deefecto esteroide, hiperbólicas a niveles saturantes de NADHy sigmoidea a bajas concentraciones de coenzima.

Alteraciones menores de la estructura proteica sin producir desagregación, fueron observadas por el mismogruposobre otras enzimas, piruvato kinasa de músculo de 00ne—jo (99) y aldehido dehidrogenasa de hígado de conejo (100).Ambosefectos fueron descriptos con detalle anteriormente (3).

La marcadaalteración de actividad catalitica por lashormonasesteroides, seria el resultado de cambios conformacionales de estas enzimas (3). Permanece sin resolver lasignificación fisiológica de estos hallazgos, a nivel molecular. En ese sentido Grisolia y col. (101,102) estudiandoglutamato dehidrogenasa de higado y útero (bovina y humana),encuentran que las hormonasnaturales a concentraciones fisiológicas ejercen minimos efectos, no comparables con elestilbestrol. Si bien consideran excesivos el énfasis puesto en la regulación de la especificidad de sustrato y sus

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vinculaciones al metabolismo en los trabajos descriptosanteriormente (83) recalcan la imgortancia del requerimiento de cofactor. Comoobservación adicional Mg++aconcentraciones intracelulares grotege a la enzima de la

inestabilidad inducida por estilbestrol + NADPHyNADH(102).

Jl estilbestrol y las hormonasesteroides parecerianregular además, la glutamato deiidrogenasa mitocondrial(103), de acuerdo con los resultados sobre la enzima cristalina, El estilbestrol no solamentealtera la actividadde la enzima, sino también su ligadura a mitocondrias.El estilbestrol libera la actividad de glutamato dehidrogenasa de mitocondrias y el AD?es capaz de retardar estefenómeno (103).

Cabe consignar que a diferencia con estos resultados¿ngel y Scott en los primeros estudios sobre la glutamatodehidrogenasa encontraban estimulación de su actividad ¿orcorticosterona 10-8JM(104).

La glucosa Q2 dehidrogenasa constituye otro ejemplo dedehidrogenasas, cuya actividad es afectada por hormonas.Tambiénse detallan (3) los primeros estudios sobre ellasin incluirla en la categoria de enzima cuya conformaciónfuera alterable por los esteroides. Posteriormente suactividad y la consecuente producción de NADPHfué correlacionado con la sintesis de corticoides (105). ¿l efectoACTHde estimulo a la sintesis de corticoides se deberiaa una acción sobre la dehidrogenasa con el consiguienteaumento de NADPi.Cada hormona trófica activaria la glucosa 6? dehidrogenasa de su órgano (106,107).

Durhan y Adams(108) ensayan el efecto in vitro sobreactividad de glucosa 6P dehidrogenasa microbiana. El efecto

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requiere OHfenólicos no sustituidos, lo que recuerda lainhibición sobre el transporte de electrones (51). Lainhibición resulta reversible y no competitiva para NADP.La explicación más aceptable del efecto seria según dichosautores una modificación en la configuración proteica porligadura a un sitio distinto al catalítico, o sea inhibición alostérica. Estos resultados la incluyen entre lasque sufren cambios conformaoionales por acción de hormonas esteroides.

Anteriormente McKerns (109) a la luz de sugestioneshechas por Williams ¿shman (25) pensó que los estrógenosfenólicos podían ser oxidados reversiblemente por el sistema. Se examinaronsus caracteristicas espectrales y nose encontraron evidencias de formas oxidadas en el espectro. Sus datos parecian indicar que los estrógenos sintéticos podrían competir con los sitios de ligadura de NAD?sobre la apoenzima.

Los grupos ionizados del inhibidor activo en la formatrans, estarian a una separación de 15 Á correspondientea la distancia interatómica determinada de modelos moleculares entrc el pirofosfato y el fosfato terminal del NADPen su forma más extendida (109).

En previos estudios de ligadura de estrógenos en úterohan sido implicados grupos SH (llO) tejidos que respondena estrógenos tales comoútero y vagina contienen cantidades minimas de componentes llamados receptores de estrógenos que muestran gran afinidad por el estradiol. GruposSH, de la sustancia receptora parecen esenciales a sucapacidad para asociarse con estradiol. La presencia dereaCtivos de tioles en el medio, elimina la caracteristica afinidad del tejido por el estrógeno. Ademásla presencia de mercuriales, eluye del tejido a los estrógenos

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previamente ligados. El descubrimiento por Jensen y Jacobson de que el útero de rata es capaz de tomar selectivamente y retener 17 B estradiol, ha llevado a investigarla naturaleza de las especies moleculares involucradasen la ligadura. Experimentos de digestión con enzimashan indicado que probablemente se trate de una proteina.Conestradiol tritiado y centrífugación en gradientes desacarosa, la radioactividad migra comoun pico simple concoeficiente de sedimentación 9.5 S (111,112).

La glutamato deshidrogenasa de hígado y la piruvatokinasa de músculo ligan 17 B estradiol. Se ensaya elefecto de 4-merouri-l7 B estradiol sobre ambas enzimasen presencia y ausencia de la hormona (113). La formacióndel mercaptida aparece disminuida en presencia de la hormona, Posiblemente esta compite por un proceso de exclusión al sitio especifico de ligadura. Estos trabajosasi como los de Kallos y Tomkins (97) parecen encaminadosa dilucidar la naturaleza del sitio de ligaduras de hormonas esteroides sobre glutamato dehhidrogenasa y otrasenzimas.

En relación con la alteración de estructuras, puedecitarse un reciente trabajo sobre capas monomoleculares(114) influenciados por hormonasesteroides.

Puedenaportar datos interesantes al ocnjunto lasseries publicadas sobre interacciones proteina-esteroidepor Nestphal y col. de los cuales hay algunos muyrecientes (115,116).

La acción sobre transhidrogenasas para piridin nucleótidos está detalladamente descripta (3). Su mecanismonose ha aclarado aunque parece un fenómeno no relacionadocon el que nos ocupa (26). Villee (117) resume tambiénalgunos de los mecanismos propuestos. Tanto estos comolos mencionadosanteriormente para explicar los efectos

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de las hormonasesteroides sobre los diferentes sistemasen estudios permanecen aún en el ¿lane de las postulaciones (4,78,115,118).

Estudios sobre el mecanismode reacción orgánicavinculados a procesos bioquímicos, puede ayudar a avanzaren este camgo. Un ejemplo de ellos lo constituye el publicado recientemente (119). Los estrógenos sintéticos hexestrol, estilbestrol parecen producir radicales de adiciónde hidrógeno en reacciones ¿ue se gostulan como etapasmecanisticas de su acción hormonal. Esto surgiria de comparaciones establecidas con sus requerimientos para la

acción estrogénica (120).

Resultan un paso adelante, las conclusiones sobrerequerimientos estructurales de esteroides en lo queconciernen a la inhibición del transporte de electronesmitocondrial, establecidos recienteaente por Stoppani ycol. (121). En cuanto a la significación fisiológica delefecto, esaán en progreso estudios in vivo (122é124).

Localización actual del sitio de inhibición porhormonasesteroides sobre cadena rggiratoria

Los trabajos (l,26-3l,35,40,43,48,51) fundamentalmente, situan la acción del estilbestrol y derivadosentre la NADHflavoproteina y CoQo citocromo b.

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Arreglo de los coaponentes resoiratoriosen la región flavina de la cadena

respiratoria de gamiferos (lO)

ATPamytalrotenona

NADHw- >Fp (Fe ) estilbestrolNH .(g1,94)xxi i

coanima Qlo.... O2_ citocromo b

succinato-Gqu (Fe /¡/””NH)"

(g 1,94)

Desarrollo del plan de trabajo

¿ste trabajo fue realizado con preparaciones no fosforilantes tigo Keilin y Hartree (125,126). ¿sta pregaraciónconsiste de fragmentos mitocondriales (sarcosomas) probablemente derivados de membranainterna (16). Las mitocondrias fragmentadas no tienen en este caso capacidad paraproducir fosforilación oxidativa y sintesis de ATP,aunQuemantienen la capacidad de producir reacciones dependientes deenergia. De tal manera, estaria perturbada la transferencia final de energia (127-129). Tiene en generalmayoractividad respiratoria que las mitocondrias intactas (16), es más indicada ¿ara estudios espectroscópicos,se eliminan complicaciones de interpretación por otrosefectos sobre metabolismo mitocondrial (48,51) y tienenmayoraccesibilidad varios metabolitos usados exógenamente.

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1.- Se ensaya un fraccionamiento, con el objeto de eliminar segnentos no involucrados en la inhibición.2.- Se estudia la acción del estilbestrol y derivados,sobre la reducción por NADHy succinato del citocromo b,con el objeto de descartar alguna acción del inhibidorsobre dicho componente.3.- Se estudia la reversibilidad de la inhibición bajolas condiciones de medida de los experimentos cinéticos.Los resultados peraiten ensayar una probable acción delestilbestrol sobre quinonas (dada su estructura y lipofilicidad), mediante un tratamiento cinético.4.- Se establecen algunas resguestas diferenciales conrotenona, inhibidor de cadena resgiratoria, cuyo sitio deacción coincide hasta el presente con el del estilbestrol (8,130).5.- Se ensaya la acción del eatilbestrol sobre 1a NADHdehidrogenasa funcional, para establecer posibles diferencias con las respuestas en sistemas solubles ensayadosanteriormente (1,40).

(I-l)

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(I—5)

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(I—8)

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(I-ll)(I-12)

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CAPITULO II

Preparaciones enzimáticas utilizadas

Preparación no fosforilante tipo Keilinx Hartree de músculo cardiaco

Se obtuvo partiendo de corazones de cerdo por latécnica de Slater (l) ligeramente modificada. Los corazones de animales recién faenados fueron traídos del matadero enfriados con hielo. Se quitaron grasas y tejido conectivo. El músculo se pióó y lavó por agitación con aguade la canilla seis veces durante 15 minutos. En cada casoel agua se eliminaba exprimiendo la carne colocada dentrode un lienzo. En general seis lavados eran suficientespara no obtener coloración del agua. En la misma forma sehacia un último lavado con agua destilada. El músculo sehomogeneizó durante 45 segundos a máxima velocidad en un

homogeneizador eléctrico comercial waring, modelo CB-4de 3.500 ml de capacidad, con 500 ml de fosfato disódicolO mMcada 200 gr de carne picada.

El homogenato se centrifugó a 0° C durante media horaa 1.500 rpm (900 g) en una centrífuga refrigerada International, modelo PB 2. Se filtró el sobrenadante. Estossobrenandantes reunidos se centrifugaron a 4° C en unacentrifuga Servall en el rotor GSAa 9.000 rpm (14.000 g),durante 40 minutos. El residuo se homogenizó con un volúmen igual de buffer fosfato 0.2 M pH 7.4. La cancentra—ción final de proteína oscilaba aproximadamenteentre40-55 Ing/ml.

Para usos espectrofotométricos la preparación se lavócon igual volúmen de una solución de nitrito de sodio al0.2 % para eliminar la interferencia de mioglobina y hemoglobina, según sugestiones de Chance (2). Se centrifugó

37

en una centrífuga Servall refrigerada 40 minutos en elrotor SS 34 15.000 rpm (27.000 g).

Preparación de músculo cardiaco con actividades NAEH

succinato citocromo C reductasa. Fraccionamiento de lapreparación anterior.

Se siguió para el fraccionamiento la técnica de Rabinowitz y De Bernard (3) quienes utilizaban comomaterialde partida suspensiones mitocondriales y ETP.

Suspensiones de la preparación anterior en buffer fosfato 0.2 M pH 7.8, 0.25 M de sacarosa, congeladas a-15° C, se llevaron a temperatura ambiente, se diluyeroncon solución 0.25 Mde sacarosa hasta una concentración

aproximada de 22 mg/ml.

Se le agregó colato de sodio neutro lentamente, gotaa gota entre 0-4o C hasta que la relación acido cólico/proteina era 0.36 mg/mgprot. relación considerada extremadamentecritica. Luego se agregó solución saturada desulfato de amonio pH 7 hasta 40 fi de saturación. Se centrofugó a 50.000 g 15 minutos en el rotor 30 de la ultracentrífuga Spinco L. La fracción precipitada no se utilizó por contener citocromo oxidasa. El sobrenadante sefraccionó luego a 50 y 60 % de saturación, también consolución saturada de sulfato de amonio pH 7. Se controlóel pH con hidróxido de amonio. Luego de cada etapa sedejó en reposo 15 minutos y se centrifugó a 60.000 gdurante lO minutos. El precipitado se suspendió enbuffer fosfato 0.2 MpH 7.8, 0.25 Mde sacarosa.

Eliminación de colato y SO‘QNH4)2residuales: Para1+ _—'_'—evitar la inactivación y obtener mayoresactividades sediluyó a concentraciones aproximadas a 0.5 mg prot/ml.durante 30 minutos y se sedimentó posteriormente por

38

centrifugación 4 horas a 60.000 g. El precipitado suspendido igualmente en buffer fosfato 0.2 M pH 7.8, 0.25 M desacarosa.

Solución de colato: Se disolvieron 3.70 g de hidróxidode sodio en 50 ml de buffer fosfato 0.1 M pH 7. Se agregaron 38 g de ácido eólico purificado por recristalizacionessucesivas. Se ajustó el pH de la solución y el volumen sellevó a lOOal con el mismobuffer.

Purificación del dioxano: Comosolvente de esteroides

se usó dioxano libre de ¿eroxidos y aldehidos. El dioxanocomercial se destiló en presencia de sulfato ferroso

(1010-1030 en baño de aceite) y ¿osteriormente se pasó porcolumna de alumina-.,) También se trató el dioxano comer

cial con bisulfito de sodio y lentejas de hidróxido de potasio l hora. Luego de un nuevo tratamiento con sulfito selo secó con hidróxido de potasio. Luego fué destilado a1010-1030 y gasado por columna de alumina, para retenerperóxido. El procedimiento seguido, de acuerdo a las especificaciones de Falk (6) y Cornford (7) dió un dioxano conreacción negativa frente al reaccivo de Schiff y al testdel ácido tiobarbiturico (8).

Purificación de etanol: Para uso espectrofotométrico,se le agregó Zn en polvo (20 g) e hidróxido de potasio(40 g) a l litro de etanol. La mezcla se refluja l hora,antes de ser destilada.

Metanol: Se refluja media hora y se destila luego,en presencia de ácido oxálico.

Deterningción de proteínas: Las proteínas se determinaron por el método clásico de Biuret según Gornall yBardawill (4) modificado por Slater (5). La curva de calibración se hizo con solución de albúmina cuya concen

39

tración se determinó por Kjeldahl.

Medida de actividades enzimáticas: Se utilizó unBeckman DUmonocromador ligado a un convertidor (Model

200 Gilford Inst. Lab. Inc.) con registrador Leeds yNorthrup.

Espectro de absorción diferencial: Se utilizó unespectrofotómetro BeckmanDK. El registro dió en unintervalo de longitudes de oídas 400-700 nmyla diferencia de absorción a temperatura ambiente para unamisma susgensión dividida en las dos celdas de medida.Una de ellas aeróbica y la otra anaeróbica por agregadode ditionito ó sustratos. Se obserVuron asi, los componentes enzimáticamente activos de la partícula NADHsuccinato citocromo c reductasa.

Determinaciones espectrofotométricasdiferenciales de doble haz

Se utilizó un espectrofotómetro Aminoo-Chance(American Instruments Co, Silver Springs, Maryland).

Este espectrofotómetro, alterna dos longitudes deonda, de las cuales una, sirve de referencia. Los pareselegidos por Chance, eliminan al máximolas interferencias debidas a otros pigmentos. El medio de reacciónutilizado fué buffer fosfato 0.1 M, pH 7.4. La mezclade reacción, se colocó en la celda del espectrofotómetro, termostatizada a 10° C É l. Luego de ajuste ópticoy equilibración térmica, la reacción se inició en cadacaso por adición de los sustratos. Los reactivos seagregaron en volúmenes tales, que la variación deabsorbancia por dilución de la mezcla de reacción resultara deepreciablet

4o

Se utilizaron los siguientes valores de.fi€ (mM-lom_1)

Citocrouo b (562-575) : 23Citocromo b (430-410) : 180

Citocromo c - cl (550-541) : 19Flavoproteina (465-510) : ll

Todos estos valores, de acuerdo a Chance (11),

Polarografía: El consumode oxígeno se ensayó polarográficamente con un electrodo de oxigeno de Clark.

Con un voltaje de polarización aproximado de -O.6 voltios, la corriente es directamente proporcional a la concentración de oxigeno de la solución. El polarógrafoconsta de un registrador, que se calibra. La concentración de oxigeno del buffer a la temperatura de las experiencias se tomó de tablas (12). Jl medio de reacciónutilizado fué buffer fosfato 0.1 M, pH7.4. El volumenfinal de la celda de reacción es de 5 ml y uJiliza agitador magnéticorecubierto, ¿ara facilitar el establecimiento del eguilibrio entre el oxigeno disuelto y el quedifunde a través del electrodo de oxígeno. El aparato seequilibra con el buffer Saturado de aire a temperaturaambiente. Luego de cada registro se lava por succiónexhaustivamente la celda de reacción.

Determinaciones fluorométricas de nucleótidos degpiriding

Se hicieron utilizando el accesorio para fluorescencia Aminco, equipado con un filtro primario Chance O x l(máximode trasmitancia 366 nm) y recibiendo la luz emi

tida (¿.450) a 45° sobre lu misma cara de la cubeta através de un filtro flratten 2 A.

41

Actividades enzimáticas

Condiciones de ensayo. Actividad NADHoxiggsg: Semidió la variación de absorbaacia a 30o C por el decrecimiento de absorbancia a 340 nm. El medio de reacción

fué el siguiente: buffer fosfato O¿1 M, pH 7.4; NADH0.25 mM;enzima aproximadamente 0.1 mg/ml, en un volúmen

final de 3 ml, El coeficiente de extinción para NADHseconsideró 6.22 x 106 cmz/mol. La actividad especificase expresó como micromoles de NnDH/min/mgproteina.

Actividades de citocromo c reductasa en particulasfraccionadas: La reducción de citocromo g se midió espectrofotométricamente a 30o C por el aumento de absorbancia a 550 nm. El medio de reacción fué el siguiente:

buffer fosfato pH 7.8, 0,02 M; citocromo g l mg/ml;azida sódica 0.5 mMpara evitar reoxidación de citocromo c y NADH0.25 mMó succinato lO mMpara iniciar las

reacciones. Enzima, alrededor de 0.1 mg/ml en un volúamenfinal de 3 m1. El coeficiente de extinción utilizadopara citocromo c fué 19 x 106 cm2/m01 (9).

Actividades de CoQreductasa en particulas fraccioggggg: Se siguió la variación de absorbancia a 275 nm.

El medio de reacción fué el siguiente: Q0, 0.1 mM;sacarosa 0.2 M; buffer fosfato 0.1 M, pH 7.4; NADH0.25 mM

ó succinato lO mMiniciaban las reacciones. Enzima, aproximadamente 0.1 mg/ml en un volúmen final de 3 m1.

ActividgdiADH-fumarato reductasa se midió de acuerdoa Slater (10).

42

Actividades enzimáticas de la preparaciónno fosforilante tipo Keilin y Hartree

Para las medidas se utilizó un espectrofotómetroBeckmanDUdescripto anteriormente.

NADH- CpQ reductasa: Se midió de acuerdo a Pharo y

col (13). 1.- Actividad a concentración fija de Q0, Q1yQ2. 2.- actividad máxima, a variadas concentraciones delas 1uinonas. En ambos casos el medio de reacción fué elsiguiente: buffer Tris-sulfato 0.05 MpH8; cianuro l mM;NADH0.125 mMy quinona en las concentraciones indicadas.

Se siguió la variación de absorbencia a 340 nmy lareacción se iniciaba por agregado de NADH,luego de un

minuto de adición de la quinona. La concentración de proteina se mantuvo en un rango no mayor de 0.2 mg/ml. Para

Q0la velocidad resulta lineal, para Q1y Q2se utilizaron velocidades iniciales a los 15 segundos, periodo enque se mantiene lineal.

Ferricianuro reductasa: Se midió esta acaividad, segúnSinger y col° (14) a velocidad máxima, siguiendo la variación de absorbencia a 420 nm. El medio de reacción utilizado fué buffer fosfato 0.04 M pH 7.4; NADHoxidasa alrededor de 0.05 ug/nl, “lumen final 3 ml. Solución de ferricianuro 0.01 Magregado en volumenes de 0.16 a 0.4 ml a losdiferentes tubos de reacción. Para iniciar las medidas seagregaba NADHy luego de un minuto la enzima, descartandoasi la posible reducción no enzimática del ferricianuro.El NADHse utilizó a dos concentraciones diferentes, baja(0.15 mM)y alta (0.6 mM).

Medida de actividad trangbidrogenagg: Se midió deacuerdo a Stein, Kaplan y Ciotti (15) con el siguientemedio de reacción: NADHoxidasa, del orden de 0.5 mg/ml;

43

NADH0.13 mM; APAD0.2 mM; CNK 1.0 mM; buffer fosfato 0.1 M

pH7.4 temperatura 30° C. Se siguió la variación de absorbencia a 375 nm, teniendo en cuenta ¿un una variación deabsorbencia de 0.0051 equivale a un nanomol de análogoreducido.

NADH-citocrogp C reductasa: Se siguió el aumento deabsorbencia a 550 nm. El medio de reacción fué el siguiente: buffer fosfato 0.1 MpH 7.4; cinauro 2 mM;citocromo C;l mg/ml y NADH0.3 mM.La reacción sc inició por adicióndel NADH.

Reactivos utilizados: NADH,STIL, AAy Tris de SigmaChemical Co. Ascorbato de sodio de Roche argentina. Hexestrol, estilbestrol monometiléter,estilbestrol-dimetilétery hexestrol dinetiléter de Dextran Chemicals Inc., NewYork. Menadiol se obtuvo por reducción de la menadiona,según; Fieser (16). Luego se determinó su concentraciónespectrofotométricamente.

Las Q0, Q1 y Q2 se obtuvieron de Merck-Sharp y DohmcRahway, NewJersey por cortesía del Dr. K.Folkers.

El sulfato de amonio de Mallinckrodt; ferricianuro ysacarosa de BDH.Nitrito de sodio de Murck Darmstadt.

Acetil pridin -NADse obtuvo de Pabst Laboratories,Milwankee.

El hidróxido de sodio de ¿KASweden. Fosfato disódico de

Hopkins y Williams Ltd. Fosfato monopotásico de May &Baker.

Otros reactivos utilizados eran de grado analítico.

El H20, destilada sobre vidrio y desionizada.

(II-l)(II-2)

(II-3)

(II-4)

(II-5)

(II-6)

(II-7)

(II-8)

(II-9)

(II-10)

(II-ll)

(II-12)

(II-13)

(II-14)

(II-15)

(II-16)

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Referencias

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CAPITULOIII

Inhibición por hormonas esteroides de laoxidación de succinato y NADHen sistemas

citocromo c reductasa de miocardio

fraccionamiento de cadena respiratoria mitocondrialLa cadena transportadora de electrones mitocondrial,

desde el punto de vista de su estructura, es un complejomultienzimático compuesto de proteinas, lípidos y componentes involucrados en el transporte propiamente dicho,capaces de oxidarse reversiblemente en el sistema. "Elconcepto de cadena respiratoria como complejo de componentes individuales, no implica que la actividad de lamismapueda ser cuantitativamente reconstituida, poniendoen solución, sus componentes purificados". En el sistemaintacto ó en particulas derivadas, la actividad es función no solamente de la actividad de los componentesindividuales, sino de su integración en 1a estructuramembranosamitocondrial. Las enzimas solubles obtenidas

hasta el presente, difieren en su comportamientocon lasdel sistema estructurado nativo, tal es el caso de laNADHdeshidrogenasa (l).

Aúna riesgo de introducir modificaciones, se ensayaron fraccionamientos. Estos prometían complementar lainformación obtenida sobre sistemas intactos mitocondriales espectrofotométricamente y con el uso de inhibidores.

Los trabajos sobre reconstitución de actividad resulátan complementarios, ya que una actividad reconstituidaeficazmente constituye la prueba de correcta funcionalidad para los fragmentos obtenidos.

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Se usaron en esta línea de ¿raoajo comomateriales departida dos tipos de preparaciones: aitocondrias intactasy preparaciones no fosforilantes de diversos tipos: (Keilin y Hartree (2)) y partícula transportadora de electrones ¿TP (3) descripta por Green y col. y otras intermediascon capacidad fosforilante limitada, comolas obtenidaspor Cooper y Lehninger en 1955 (4). Las partículas mitocondriales contienen un 30-35 fi de lípidos (5,6) que puedeser removido por tratamiento con acetona acuosa (6,7).El material restante, esencialmente proteico, es todavíainsoluble en agua y soluciones salinas. Los componentesdel sistema transportador permanecenlígados a estafracción particulada, pero la actividad desaparece porextracción de los lípidos.

Para obtener complejos funcionales, se utilizaron encambio diferentes reactivos químicos, tales comosolventes orgánicos, sales, detergentes, etc.