academia de microbiología, departamento de...

Universidad Autónoma Metropolitana-Iztapalapa

MANUAL DE PRÁCTICAS DEL LABORATORIO DEMICROBIOLOGIA GENERAL

Academia de Microbiología,Departamento de Biotecnología

Participantes:

Dra. María de los Angeles Aquiahuatl RamosDra. Tania Volke SepúlvedaDra. Florina Ramírez VivesDra. Margarita Salazar GonzálezDra. Lilia Arely Prado BarragánDra. Keiko Shirai Matsumoto

2010

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PRESENTACIÓN

Este manual está dirigido a estudiantes de la UEA Microbiología General, que forma parte del plan deestudio de las carreras de Ingeniería de los Alimentos e Ingeniería Bioquímica Industrial impartidas en laUAM-Iztapalapa.Como los estudiantes iniciarán su experiencia en el manejo de los microorganismos, consideramos degran importancia incluir al principio las reglas generales del laboratorio.En cada práctica se presentan los Objetivos y una breve Introducción para facilitar la comprensión de losmismos, después se indican los Materiales necesarios y Procedimientos a realizarse en forma deinstrucciones numeradas que se complementan con figuras.En cada práctica se proponen cuadros, para la recopilación de observaciones y resultados. Al final decada práctica se incluyen cuestionarios que el estudiante deberá resolver.La preparación de soluciones y medios de cultivo que se utilizarán en las prácticas se describe en Anexo.

CONTENIDO

PRÁCTICA 1. PREPARACIÓN Y ESTERILIZACIÓN DE MATERIALES Y MEDIOS DE CULTIVO ............................................4

PRÁCTICA 2. TÉCNICAS DE SIEMBRA EN MEDIOS GENERALES, SELECTIVOS Y DIFERENCIALES ...................................8

PRÁCTICA 3. TÉCNICAS DE TINCIÓN SIMPLE Y DIFERENCIAL......................................................................................12

PRÁCTICA 4. CULTIVO Y MORFOLOGÍA DE HONGOS..................................................................................................17

PRÁCTICA 5. CUANTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS: MÉTODO DE DILUCIÓN EN PLACA...................................20

PRÁCTICA 6. CUANTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS: MÉTODO DE TURBIDIMETRÍA Y RECUENTO DIRECTO ENCÁMARA DE NEUBAUER.......................................................................................................................................23

ANEXOS.......................................................................................................................................................................27

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REGLAS DE LABORATORIO*

1. Siempre deberá usar una bata de algodón bien abotonada, la que deberá quitarse antes deabandonar el laboratorio. No usar calzado descubierto y llevar el pelo recogido.

2. Evitar la acumulación de objetos no relacionados con la práctica sobre la mesa de trabajo.3. Se prohíbe beber, comer, fumar y aplicarse cosméticos dentro del laboratorio.4. Se deberá lavar meticulosamente las manos con jabón y agua antes de salir del laboratorio, incluso

cuando salga por breves periodos.5. No deberá pipetear oralmente ningún tipo de solución o cultivo microbiano, deberá realizarse con

pipetas adecuadas para este fin.6. No se admitirán visitas personales ni el uso de aparatos que distraigan la atención y pongan en

riesgo la seguridad en el trabajo.7. Trabajar de manera ordenada y en silencio para evitar accidentes

PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO

1. Antes y después de cada sesión práctica los alumnos deberán limpiar las mesas de trabajo con eldesinfectante que se le proporcionará para este fin.

2. Lavarse perfectamente las manos con jabón al final de la sesión.3. Localizar extintores, botiquín y salidas de emergencia.4. Cuando se utilice el mechero, este deberá colocarse alejado del microscopio y otros equipos así

como de sus cuadernos o prendas de vestir.5. Al concluir cada sesión el estudiante deberá asegurarse de que los materiales de desecho u objetos

contaminados sean colocados en recipientes específicos para ello, colocados en lugares apropiados,que les indicará el profesor.

6. Siempre deberá dejar perfectamente limpios los equipos utilizados (microscopios, potenciómetros,balanzas analíticas, autoclave) y reportar al maestro cualquier irregularidad en el funcionamiento.

7. En caso de producirse un incendio o una herida personal, el alumno deberá notificarlo de inmediatoal profesor. En el caso de derrame de cultivos o ruptura de recipientes con cultivos activos, deberáconservar la calma y además de informar al profesor, seguir inmediatamente el procedimiento:a. Colocar toallas de papel sobre el material derramado para evitar su dispersiónb. Poner abundante solución desinfectante sobre las toallasc. Dejar transcurrir al menos 15 minutos, retirar las toallas y tirarlas en el contenedor destinado a

la eliminación de materiales contaminados.

MATERIALES INDISPENSABLES EN CADA SESIÓN DE LABORATORIO

1. El manual de laboratorio2. 1 cubre bocas y 1 par de guantes de látex3. Un pedazo de tela sin pelusa, cerillos, tijeras, cinta de enmascarar (masking-tape), marcador

indeleble o etiquetas pequeñas, jabón para manos.

* Instructivo de funcionamiento interno y operativo para regular el uso de los servicios e instalaciones de los laboratorios de Docencia.Aprobado por el Consejo Académico el 9 de noviembre del 2009

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PRÁCTICA 1. PREPARACIÓN Y ESTERILIZACIÓN DE MATERIALES Y MEDIOS DE CULTIVO

INTRODUCCIÓN

La esterilización es un método que elimina completamente todo tipo de organismo y que asegura la ausencia absolutade cualquier forma viviente. Una esterilización deficiente o manipulación incorrecta de materiales y medios de cultivoconlleva a contaminaciones, resultados erróneos o pérdida del material biológico, por lo que se requieren buenasprácticas de manejo de éstos.

La esterilización por calor seco o húmedo se encuentra entre los métodos más utilizados en el laboratorio demicrobiología. El calor seco desnaturaliza las enzimas y destruye a los microorganismos por oxidación; un ejemplo de talmétodo es la exposición directa de un material a la flama de un mechero o su introducción a un horno a 150-180°C por2 h. Estos métodos se aplican principalmente en la esterilización de asas de inoculación y todo tipo de material de vidrioy quirúrgico. Los procesos con calor húmedo se aplican para esterilizar medios de cultivo, soluciones y cultivosbacterianos que se desechan. El equipo más común es el autoclave, que utiliza vapor de agua a 121°C con una presiónde 15 lb/in2. El material se mantiene a dicha temperatura por 15 minutos para asegurar la inactivación de endosporas,que son las estructuras bacterianas más resistentes al calor. En la Tabla 1 se resumen otros métodos usados para laesterilización de diversos materiales.

Tabla 1. Métodos de esterilización

Métodos físicos

Calor

Húmedo Vapor a presión (autoclave)

SecoAire caliente (horno)Flameado (calor directo)Incineración

RadiaciónNo ionizante

Rayos ultravioletaRayos infrarrojos

IonizanteRayos XRadiación electrónica de alta energía

FiltraciónMembranas o filtrosFlujo laminar

Métodos químicosGases Óxido de etileno

LíquidosFormaldehidoAlcohol

OBJETIVOS

Que el alumno conozca los principios generales de la preparación y técnicas de esterilización de diversos materiales ymedios de cultivo de uso común en Microbiología. Conocer el efecto de las condiciones de asepsia en el control de lacontaminación microbiana en el laboratorio.

MATERIALES

Por equipo Por grupo6 cajas Petri de vidrio1 matraz Erlenmeyer de 500 mL3 matraces Erlenmeyer de 250 mL1 probeta de 250 mL2 parrillas de calentamiento con agitación2 agitadores magnéticos2 espátulas2 mecheros Fisher

2 autoclaves con base, canastilla y válvula2 balanzas analíticas1 incubadora a 30°C1 refrigerador2 pares de guantes de asbestoEscobillones, fibra, detergente y toallas de papelPapel estraza, algodón y gasa

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Por equipo Por grupo1 piseta con agua destilada1 piseta con alcohol al 70%1 porta-cajas de Petri Medios y reactivos

Agar nutritivo (AN)Agar papa dextrosa (PDA)Agar eosina azul de metileno (EMB)

Material que cada equipo debe traer cada sesión: franela, tijeras, masking tape

PROCEDIMIENTO

Preparación del material de vidrio y medios de cultivo

1. Lavar y enjuagar el material de vidrio. Escurrir el exceso de agua y enjuagar con agua destilada. Dejar escurrir elmaterial sobre una toalla o papel de envolver.

2. Preparar 180 mL de agar nutritivo (AN, 23 g/L) en un matraz Erlenmeyer de 250 mL. Calentar el medio en una parrillacon agitación constante hasta ebullición (cuidar que no se derrame).

3. Preparar 260 mL de medio agar papa dextrosa (PDA, 39 g/L) en un matraz Erlenmeyer de 500 mL. Colocar un agitadormagnético y calentar hasta ebullición, cuidando que no se derrame.

4. Preparar 140 mL de medio de cultivo EMB (36 g/L) en un matraz Erlenmeyer de 250 mL. Colocar un agitadormagnético y calentar hasta ebullición. NOTA: ¡Cuidar que no se derrame!

5. El profesor hará la demostración para elaborar tapones y capuchones para los matraces.

Esterilización de materiales y medios de cultivo

1. Colocar las cajas Petri en cajas especiales de acero inoxidable y esterilizar en autoclave. Se dejan enfriar y las cajasse abren únicamente en área aséptica (cerca del mechero).

2. Todos los medios de cultivo se esterilizarán en autoclave de acuerdo con las siguientes instrucciones:

a. Revisar que el agua esté limpia y el nivel coincida con la marca en el tubo indicador. En caso necesario cambiar oañadir agua destilada.

b. Conectar el autoclave y poner en máximo la perilla de control en calentamiento. Acomodar los medios y materialesen la canastilla del autoclave y colocarlos dentro.

c. Cerrar la tapa, apretar las manijas de dos en dos en posición encontrada y esperar a que salga el vapor por elorificio de purga, después cerrar la válvula.

d. Dejar que el equipo alcance 121°C o 15 lb/in2 de presión y mantener estas condiciones por 15 min. Revisarcontinuamente el manómetro y regular el control de temperatura a medio o mínimo.

e. Apagar el autoclave, desconectar y dejar que la presión baje a CERO. Quitar la válvula y abrir cuidadosamente latapa, desde la parte trasera para evitar que el vapor cause quemaduras. Con ayuda de los guantes de asbestoretirar la canastilla y, con mucho cuidado, los materiales estériles.

Vertido de los medios en cajas Petri y solidificación

1. Limpiar la mesa con solución de etanol al 70% (v/v), encender los mecheros y colocarlos a 50 cm entre sí.2. Enfriar los medios de cultivo de los matraces hasta una temperatura aproximada de 45-50°C, que coincide con la

posibilidad de sostener el matraz en la palma de la mano sin quemarse.3. Verter en cada caja de Petri 20 - 25 mL de cada medio (2 cajas de AN, 2 de EMB, 2 de PDA), dentro de la zona

aséptica. Dejar que los medios enfríen y solidifiquen. Guardar en refrigeración el resto de los medios hasta su uso.

Prueba de esterilidad de materiales

1. Abrir una caja Petri de cada medio durante 1 minuto en una zona aséptica (junto al mechero). Etiquetar.

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2. Abrir una caja Petri de cada medio durante 1 minuto en una zona NO aséptica. Etiquetar.3. Colocar las cajas Petri a 30°C durante 24-48 horas, con la tapa hacia abajo.4. Revisar las cajas para observar la formación de colonias microbianas en la superficie de los medios.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Reportar crecimiento microbiano en forma cualitativa: (-) sin crecimiento, (+) crecimiento regular y (++) crecimientoabundante.

Describir la morfología de las colonias

Discutir los resultados con base en la efectividad de la esterilización y manejo de los materiales.

Discutir acerca de las diferencias en el crecimiento observado para cada medio de cultivo.

CUESTIONARIO

1. Explique las diferencias entre los procesos de esterilización, desinfección y asepsia.

2. ¿Qué es un medio de cultivo y para qué se usa?

3. ¿Qué características de un material o sustancia deben tenerse en cuenta para elegir un método adecuado deesterilización? Cite tres ejemplos.

4. ¿Qué finalidad tienen los tapones de algodón que se colocan en los matraces Erlenmeyer?

5. ¿Por qué se incuban las cajas Petri con las tapas hacia abajo?

Cuadro 1. Descripción de colonias en cajas Petri con medios de cultivo.

Medio de cultivoAbierta al aire Abierta en área aséptica

Crecimiento* Morfología Crecimiento* Morfología

Agar nutritivo (AN)

Agar EMB (EMB)

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Agar papa dextrosa(PDA)

* (-) sin crecimiento; (+) crecimiento regular; (++) crecimiento abundante

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PRÁCTICA 2. TÉCNICAS DE SIEMBRA EN MEDIOS GENERALES, SELECTIVOS Y DIFERENCIALES

INTRODUCCIÓN

Los microorganismos en la naturaleza generalmente se encuentran como poblaciones mixtas. Para caracterizarlos demanera individual éstos deben separarse (aislarse), obteniendo un cultivo puro o axénico. Un cultivo puro está formadopor un solo tipo de microorganismo y es indispensable para conocer sus características morfológicas y estructurales,actividad bioquímica, patogenicidad, sensibilidad a antibióticos y para su identificación.

El aislamiento de microorganismos puede realizarse por métodos de dilución y siembra en medios sólidos o líquidos,considerando que cada célula bacteriana que se separa da origen a una colonia visible a simple vista. Una limitación de lastécnicas de dilución es que no es útil para el aislamiento a partir de muestras donde el microorganismo de interés seencuentra en pequeñas cantidades, en donde se obtendrán los microorganismos dominantes. Para favorecer elaislamiento de microorganismos encontrados en baja concentración, se aplican métodos de cultivo especializados en losque se usan medios que contienen nutrientes especiales, antibióticos, alta concentración de sales y/o se controlan lascondiciones de pH, luz o temperatura. Estos medios se conocen como selectivos o de enriquecimiento.

Otro tipo de medios de gran utilidad para la caracterización e identificación de especies bacterianas, son los conocidoscomo diferenciales. Dichos medios contienen componentes como sangre, colorantes e indicadores, entre otros, paradistinguir entre diferentes especies bacterianas de acuerdo a la forma en que metabolizan los sustratos. Estas diferenciasse manifiestan por cambios en la apariencia del medio o por una modificación en el pH.

OBJETIVOS

Que el alumno aprenda una de las técnicas de aislamiento para la obtención de cultivos microbianos puros y la aplicaciónde medios de cultivos diferenciales y selectivos.

MATERIALES

Por equipo Por grupoMatraces con medio EMB, PDA y AN16 cajas Petri de plástico estériles2 mecheros Fisher2 asas de inoculación2 parrillas de calentamiento con agitación1 piseta con alcohol etílico al 70%1 espátula

1 incubadora a 37°C1 refrigeradorEscobillones, fibra, detergente y toallas de papel

PROCEDIMIENTO

El profesor proporcionará cultivos puros de bacterias Gram positivas (Bacillus sp. Kocuria rosea) y Gram negativas(Escherichia coli), y un cultivo de una levadura (Saccharomyces cerevisiae).

Vaciado de medios a cajas estériles

1. Fundir los medios preparados en la práctica 1 (PDA, EMB y AN): cuidado de que no se derramen!!!2. En área aséptica, vaciar los medios en cajas estériles y dejar que se enfríen: 4 de AN, 4 de EMB, 8 de PDA.

Técnica de estría cruzada (Figura 1)

1. Dividir cada caja Petri en cuatro cuadrantes, por la parte de atrás. Esterilizar el asa con calor en el mechero. Dejarenfriar el asa y tomar la muestra de una colonia

2. Inocular cada muestra haciendo 4-5 estrías simples muy juntas de lado a lado sobre el primer cuadrante de la caja,cerrar la caja. Flamear el asa de inoculación y girar la caja Petri un cuarto de vuelta.

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3. Abrir nuevamente la caja y con el asa de siembra esterilizada y fría, tocar el final del primer grupo de estrías y hacerun segundo grupo igual que el anterior. Repetir el procedimiento en el tercer cuadrante y cuarto cuadrante,realizando en este último una estría más abierta (simple).

4. Las cajas se incuban a 35°C durante 24-48 horas con la tapa hacia abajo.

Figura 1. Técnica de siembra por estría cruzada en cajas Petri


Describir, en los Cuadros 2-4, la morfología colonial de cada cultivo microbiano. Base su descripción en los esquemasde la Figura 2

Comparar los resultados con la literatura y discutir por qué hay diferencias en el crecimiento de los diferentesmicroorganismos en cada uno de los medios utilizados.

CUESTIONARIO

1. ¿Qué es el agar y de donde se obtiene? ¿Qué nutrientes proporciona a los microorganismos?

2. ¿Qué es un medio simple y qué un medio complejo? Mencione tres ejemplos de cada uno.

3. ¿Qué es un medio selectivo y qué un medio diferencial? Mencione tres ejemplos de cada uno.

4. ¿Cuál es la composición química de los medios AN, EMB y PDA? Con base en su composición ¿Cómo se clasifica cadamedio y cuáles son los agentes selectivos y/o diferenciales en cada uno?

5. Explique al menos dos diferencias entre la morfología colonial de levaduras y bacterias.

Figura 2. Características de la morfología colonial de bacterias sobre un medio de cultivo sólido

Forma Borde Elevación Superficie

Suave, rugosa, opaca,brillante, mucosa, seca,

pulverulenta

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Cuadro 2. Morfología colonial de cultivos microbianos en medio AN

Microorganismo

Color

Tamaño (mm)

Forma

Borde

Elevación

Superficie

Cuadro 3. Morfología colonial de cultivos microbianos en medio EMB

Microorganismo

Color

Tamaño (mm)

Forma

Borde

Elevación

Superficie

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Cuadro 4. Morfología colonial de cultivos microbianos en medio PDA

Microorganismo

Color

Tamaño (mm)

Forma

Borde

Elevación

Superficie

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PRÁCTICA 3. TÉCNICAS DE TINCIÓN SIMPLE Y DIFERENCIAL

INTRODUCCIÓN

Los microorganismos vivos o activos generalmente son incoloros (excepto algas y cianobacterias), pero puedenobservarse en un examen en fresco mediante la preparación de una suspensión acuosa que se coloca directamente en unmicroscopio de campo obscuro o de contraste de fases. En un microscopio óptico de campo claro no se pueden observarlos microorganismos debido a la falta de contraste entre las células y el medio circundante, por lo que es necesario fijarlosy teñirlos en un frotis. Un frotis se prepara distribuyendo una pequeña cantidad de una suspensión microbiana sobre unasuperficie transparente (vidrio), que se fija a la superficie con calor o solventes orgánicos. Lo anterior causa la inactivacióno muerte celular y algunas modificaciones de las características microbianas.

De acuerdo con los objetivos de estudio y el tipo y número de soluciones colorantes empleadas, se pueden realizar trestipos de tinción: simple, diferencial y selectiva. La tinción simple emplea un solo colorante y la célula se tiñeuniformemente. La tinción diferencial utiliza más de un colorante y permite diferenciar microorganismos con base ensus características superficiales. La técnica más usada en bacteriología es la propuesta por Christian Gram (1884), queclasifica a las bacterias en dos grupos: Gram-positivas (color azul-violeta) y Gram-negativas (color rojo-rosa). Estasdiferencias se deben a diferencias en la estructura y composición de la pared celular de las bacterias.La tinción selectiva permite observar estructuras especializadas, como endosporas y cápsulas, que son útiles para laclasificación taxonómica de bacterias. Por ejemplo, la tinción de endosporas permite identificar bacterias productorasde endosporas de los géneros Bacillus y Clostridium.

OBJETIVOS

Que el alumno aprenda las técnicas de preparación de frotis, fijación y tinción más utilizadas en el estudio microscópicode cultivos microbianos, así como la observación de su morfología microscópica.

MATERIALES

Por equipo Por grupo2 mecheros Fisher2 asas de siembra10 portaobjetos1 piseta con agua destilada1 piseta con alcohol etílico al 70%2 microscopios ópticos1 frasco gotero con aceite de inmersión1 probeta de 100 mLJuego de colorantes de Gram

Papel sedaEtanol absolutoAcetonaPapel estraza1 frasco gotero con azul de metilenoRefrigeradorEscobillones, fibra, detergente y toallas de papel

PROCEDIMIENTO

El estudiante preparará frotis, hará tinción simple y tinción de Gram de bacterias Gram (+) y Gram (-), de una levadura(S. cerevisiae) y de una muestra problema.

Preparación de frotis

1. Lavar perfectamente los portaobjetos, secarlos con papel y etiquetarlos.2. Los frotis de cultivos líquidos o sólidos deben prepararse de manera diferente (Figura 1).

Medio sólido

a) Colocar en el centro del portaobjetos una gota de agua destilada.b) Encender el mechero y esterilizar el asa en la flama hasta que se ponga al rojo vivo. Dejar enfriar el asa para evitar

la destrucción de los microorganismos al tomar la muestra.

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c) Acercar la caja Petri al mechero, abrirla y tomar una pequeña muestra de la superficie de una colonia, mezclar lamuestra en el agua sobre el portaobjetos, distribuirla suavemente y fijar.

Medio líquidoa) Esterilizar el asa, quitarle el tapón al tubo de cultivo y flamear rápidamente la boca del mismob) Introducir el asa en el tubo y tomar la muestrac) Colocar la muestra en el centro del portaobjetos, extenderla suavemente y esterilizar el asa. Dejar secar el frotis

al aire y repetir este procedimiento 3 veces más, colocando la muestra en el mismo sitio.

Fijación del frotis

1. Los frotis de cultivos sólidos se fijarán con calor. Para esto se pasará el frotis rápidamente 2-3 veces por la flama delmechero.

2. Fijar los frotis de cultivos líquidos con dos gotas de etanol absoluto y dejar secar al aire (hacer esto en zona alejadadel mechero).

Figura 3. Preparación y fijación de frotis.

Tinción simple

1. Cubrir el frotis con 1 gota de azul de metileno durante 60 segundos.

2. Eliminar el exceso de colorante con la piseta de agua destilada y dejar secar al aire.

Tinción de Gram

1. Cubrir el frotis con 2 gotas de cristal violeta durante 60 segundos.2. Lavar cuidadosamente el frotis con agua destilada para eliminar el exceso de colorante3. Eliminar el exceso de agua y cubrir el frotis con 2 gotas de lugol por 30 segundos. Lavar con agua destilada.4. Inclinar el portaobjetos y aplicar gota a gota el decolorante hasta que no fluya más colorante. Lavar con agua

destilada.5. Aplicar 2 gotas de safranina durante 30 segundos.6. Lavar nuevamente con agua, quitar el exceso de agua y dejar secar al aire.

Observación al microscopio

1. Limpiar cuidadosamente los objetivos y el ocular del microscopio con papel seda

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2. Realizar iluminación Kohler al microscopio. Ajustar el haz de luz en el centro del campo de observación, siguiendolas indicaciones del profesor. Abrir el diafragma y hacer observaciones.

3. Colocar el portaobjetos en la platina y localizar la preparación con el objetivo de 10X, posteriormente pasar al de100X, colocando previamente una pequeña gota de aceite de inmersión sobre la preparación.

4. Al finalizar las observaciones, limpiar cuidadosamente el objetivo con papel seda para eliminar el exceso de aceitey evitar incrustaciones que dañan estos sistemas.


Reportar las observaciones de forma, agrupación y tamaño relativo de cada uno de los microorganismos en loscuadros de resultados. Basar los resultados anteriores en los diagramas de la Figura 4.

Comparar estas observaciones con las reportadas en la literatura para cada microorganismo y discutir acerca delas similitudes o diferencias encontradas.

Reportar y concluir acerca de la morfología de(l) (los) microorganismo(s) que contiene la muestra problema ydiscutir el por qué se llegó a ese resultado.

Figura 4. Principales tipos de agrupaciones y morfología microscópica de bacterias: cocos y bacilos.

CUESTIONARIO

1. ¿Qué es un frotis y cuáles son las fuentes de error más frecuentes en su preparación?

2. ¿Cuál es el principio básico o fundamento de la tinción de Gram?

3. Explique por qué una bacteria Gram (+) se ve azul después de la tinción de Gram

4. ¿La tinción de Gram sirve para la tinción de hongos filamentosos? ¿Por qué?

5. ¿Cuáles son las ventajas y desventajas de la tinción simple?

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Cuadro 5. Observaciones microscópicas de cultivos con tinción simple

CaracterísticaMicroorganismo

Problema

Aumento total:

Tamaño (mμ):

Forma:

Agrupación:

Endosporas:Edad del cultivoTamañoLocalización

Cuadro 6. Observaciones microscópicas de cultivos con tinción de Gram

CaracterísticaMicroorganismo

Problema

Aumento total:

Tamaño (mμ):

Forma:

Agrupación:

Gram:

Endosporas:Edad del cultivoTamañoLocalización

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SESIÓN DE PREPARACIÓN DE MATERIAL PARA LAS PRÁCTICAS 4 Y 5

PRÁCTICA 4

Materiales

Por equipo Por grupo4 cajas Petri con 25 mL de PDA2 mecheros Fisher1 asa de siembra1 piseta con alcohol etílico al 70%

Escobillones, fibra, detergente y toallas de papelIncubadora a 30 °CRefrigerador

Actividades

1. Siembra de hongos filamentosos:

Separar cuidadosamente una parte de micelio de los hongos proporcionados con el asa de siembra previamenteesterilizada en la flama del mechero.

Colocar el micelio en el centro de una caja de Petri con medio PDA (inoculación por piquete).

2. Incubar en forma invertida las cajas inoculadas, colocadas en una bolsa de plástico (sin sellar), a 30°C durante 3-5días.

PRÁCTICA 5

Materiales

Por equipo Por grupo15 pipetas de 1 mL y 2 pipetas de 10 mL2 mecheros Fisher1 probeta de 250 mL7 tubos con tapón de rosca de 15 mL1 matraz Erlenmeyer de 500 mL1 matraz aforado de 100 mL1 probeta de 100 mL1 pipetero metálico1 parrilla de calentamiento con agitación1 piseta con agua destilada1 agitador magnético1 gradilla1 espátulaPropipetas de 5 y 10 mL

2 autoclaves con base, canastilla y válvula2 balanzas analíticas2 pares de guantes de asbestoIncubadora a 30 °CRefrigeradorPapel estraza, algodón y gasa

Medios y reactivosAgua destiladaNaClAgar nutritivo (AN)

Actividades

1. Preparar 250 mL de medio AN en un matraz de 500 mL.2. Preparar 100 mL de solución isotónica (NaCl 0.9%) en un matraz aforado de 100 mL. Distribuirla en 7 tubos,

adicionando 9 mL por tubo.3. Colocar algodón a las pipetas y acomodarlas en un pipetero.4. Esterilizar todo el material preparado en autoclave a 15 lb/in2 durante 15 min. Guardar en refrigeración.

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PRÁCTICA 4. CULTIVO Y MORFOLOGÍA DE HONGOS

INTRODUCCIÓN

Los hongos son organismos eucariotas, por lo que resultan de mayor tamaño y complejidad que las bacterias. Se distinguende otros organismos eucariotas, como los animales, por ser inmóviles, y de las algas y plantas, por carecer de pigmentosfotosintéticos. Son de nutrición heterótrofa, ya que utilizan como fuente de carbono compuestos orgánicos disueltos porsistemas enzimáticos específicos, que son absorbidos a través de la pared y la membrana celular.

Estos organismos pueden ser unicelulares (levaduras) o pluricelulares (filamentosos). Las levaduras son células de formaesférica u oval ampliamente distribuidas en la naturaleza, que con frecuencia forman una cubierta pulverulenta finasobre frutos y hojas. Las levaduras se reproducen asexualmente por gemación, un proceso por el cual brota una yemade la célula madre que, posteriormente, se separa como célula individual.

Los hongos filamentosos (mohos) tienen una estructura vegetativa característica denominada hifa, y el conjunto de hifasramificadas forma el micelio. Las hifas de algunos hongos presentan tabiques transversales o septos, excepto en el casode los hongos del grupo Zygomycota, cuyas hifas se conocen como cenocíticas. El principal mecanismo de reproducciónde los hongos filamentosos es asexual, a través de la producción de esporas en estructuras reproductoras llamadasconidióforos y esporangióforos.

La presencia de estructuras de reproducción sexual es el principal criterio de clasificación que permite ubicar a los hongosverdaderos en las siguientes divisiones: Chytridiomycota, Zygomycota, Glomeromycota, Basidiomycota y Ascomycota.Otros criterios importantes para la clasificación de los hongos son las características de las hifas, la formación de esporasasexuales y las estructuras reproductoras asexuales.

OBJETIVOS

Que el alumno aprenda las técnicas de cultivo y manipulación de hongos filamentosos. Que conozca las característicasmorfológicas macroscópicas y microscópicas como criterios de identificación de hongos filamentosos.

MATERIALES

Por equipo Por grupo4 cajas Petri con 25 mL de PDA2 mecheros Fisher8 portaobjetos1 asa de siembra1 piseta con alcohol etílico al 70%1 piseta con agua destilada1 frasco gotero con azul de lactofenol2 microscopios ópticosAceite de inmersiónCinta adesiva transparente (Diurex) de 1 pulgada ancho

Papel sedaEscobillones, fibra, detergente y toallas de papelIncubadora a 30 °CRefrigerador

*NOTA: cada equipo deberá traer cinta adesiva transparente (Diurex) de 1 pulgada ancho.

PROCEDIMIENTO

El profesor proporcionará a los alumnos cultivos de Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum, Rhizopus oligosporus yFusarium sp. El estudiante inoculará cada cepa en cajas de Petri con PDA y hará la descripción macroscópica ymicroscópica de cada especie. Para la observación microscópica se utilizará cinta adhesiva transparente y azul delactofenol como colorante.

Siembra de hongos filamentosos

1. Para sembrar los hongos filamentosos, se separa cuidadosamente una parte de micelio de los hongosproporcionados con el asa de siembra previamente esterilizada en la flama del mechero.

2. El micelio se coloca en el centro de una caja de Petri con medio PDA (inoculación por piquete).

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3. Las cajas de Petri inoculadas se incuban en forma invertida, envueltas en papel o en una bolsa de plástico, a 28-30°C durante 3-5 días.

Descripción macroscópica

Describir las siguientes características de los hongos filamentosos:a) Forma, tamaño y tipo de coloniab) Aspecto del micelio: algodonoso, aterciopelado, velloso, aéreo o pegado al medioc) Color del micelio y color de las esporasd) Cambios en el medio de cultivo

Descripción microscópica por montaje con cinta adhesiva

1. Cortar una tira de 4-5 cm de cinta adhesiva transparente, con cuidado de tomarla solo por los extremos.

2. Abrir la caja Petri cerca del mechero y presionar suavemente la cinta adhesiva sobre la periferia de la colonia.

3. Colocar una gota de azul de lactofenol en el centro de un portaobjetos.

4. Colocar suavemente la cinta con la muestra sobre la gota de azul de lactofenol, evitando la formación de burbujasy sin alterar las estructuras. La cinta funciona como cubreobjetos.

5. Dejar reposar durante 3-5 minutos y hacer observaciones en el microscopio con los objetivos de 10X y 100X.Localizar y observar hifas, determinar si presentan septos o no, buscar estructuras especializadas comoesporangióforos, esporangios, conidióforos, conidias y rizoides.


Reportar las observaciones realizadas en el Cuadro 7.

Comparar las observaciones realizadas con la bibliografía: si corresponden o no y por qué

Investigar en la literatura cómo se clasifican los hongos estudiados en la práctica.

CUESTIONARIO

1. ¿Cuáles son las diferencias entre levaduras y hongos filamentosos?

2. Elabore un cuadro comparativo de las características morfológicas, nutricionales y sensibilidad a antibióticos dehongos y bacterias.

3. ¿Qué características deben considerarse para la clasificación de hongos?

4. Explique las diferencias que hay entre las esporas de hongos y las endosporas bacterianas

5. Describa brevemente tres ejemplos de problemáticas causadas al hombre por hongos filamentosos o levaduras y tresejemplos de su uso industrial.

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Cuadro 7. Descripción morfológica de hongos en medio PDA

CaracterísticaCepa

Descripción macroscópica (colonias)

Color del micelio

Color de las esporas

Tamaño

Aspecto

Descripción microscópica con un aumento total de:

Tipo de hifas: Septos (si/no) Diámetro (μ)

Estructura reproductora

Tamaño (μ)

Tipo de esporas

Tamaño (μ)

Clasificación (Phyla)

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PRÁCTICA 5. CUANTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS: MÉTODO DE DILUCIÓN EN PLACA

INTRODUCCIÓN

El crecimiento microbiano se puede estimar mediante el número de células o la masa celular. Existen métodos directos,como el recuento de células, e indirectos, como la cuantificación de la cantidad de proteína. El método más utilizado enmicrobiología para cuantificar células viables (vivas), es el recuento en placa con medios de cultivo específicos para lapoblación de interés. Para llevar a cabo un recuento en placa pueden emplearse dos técnicas: siembra en superficie overtido en placa. En ambos casos, a la muestra a cuantificar se le aplica el método de diluciones sucesivas y cada diluciónse deposita en cajas de Petri estériles. La técnica por vertido en placa es la más utilizada y, generalmente, se emplea paraestimar poblaciones microbianas en aguas, suelos y alimentos, entre otros.Este método directo se basa en la suposición de que cada célula bacteriana presente en la superficie de un medio conagar (medio sólido), se multiplicará y producirá una colonia visible denominada unidad formadora de colonia (UFC).Después de la incubación se cuentan las colonias desarrolladas y este número, multiplicado por el inverso de la dilucióncorrespondiente (factor de dilución), permite estimar el número de microorganismos viables. El resultado de estemétodo debe considerarse como una estimación aproximada del número total de microorganismos en una muestra, yaque depende del tipo de medio de cultivo utilizado. También pueden presentarse problemas relacionados con falta dehomogeneidad de las diluciones y durante la inoculación de las muestras. En tales casos, el número de UFC puedesubestimarse si las células no se separan bien, o bien, puede sobreestimarse si la toma de muestra se hace del fondo deltubo, donde se concentran los microorganismos por gravedad.

OBJETIVOS

Que el alumno aprenda la técnica de dilución y cuenta en placa para cuantificar microorganismos viables.

MATERIALESPor equipo (sesión 1) Por grupo (sesión 1)15 pipetas de 1 mL y 2 pipetas de 10 mL2 mecheros Fisher7 tubos con tapón de rosca de 15 mL1 matraz Erlenmeyer de 500 mL1 matraz Erlenmeyer de 250 mL1 matraz aforado de 100 mL1 parrilla de calentamiento con agitación1 piseta con agua destilada1 pipetero metálico1 gradilla1 espátulaPropipetas de 5 y 10 mL

2 autoclaves con base, canastilla y válvula2 balanzas analíticas2 pares de guantes de asbestoIncubadora a 30 °CRefrigeradorPapel estraza, algodón y gasa

Medios y reactivosAgua destiladaNaClAgar nutritivo (AN)

Por equipo (sesión 2) Por grupo (sesión 2)10 cajas de Petri estériles2 vasos de precipitados de 50 mL1 piseta con alcohol etílico al 70%1 piseta con agua destilada1 gradilla2 mecheros FisherPropipetas de 1 y 5 mL1 agitador de tubos tipo Vórtex1 parrilla de calentamiento con agitación

1 incubadora a 35 °CRefrigeradorEscobillones, fibra, detergente y toallas de papelPapel estraza

*NOTA: cada equipo deberá traer una muestra líquida (~10 mL) que puede ser: pulque, agua de alfalfa o fresa, jugo dezanahoria, agua de charco, etc.

PROCEDIMIENTO

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Cada equipo debe traer una muestra líquida en la que se determinarán las UFC, usando diluciones decimales y siembraen placas con medio de cultivo.

Preparación de medios y reactivos (una sesión antes)

1. En un matraz de 500 mL, preparar 250 mL de medio AN.

2. En un matraz aforado de 100 mL, preparar solución isotónica (NaCl 0.9%) y distribuirla en 7 tubos, adicionando 9 mLpor tubo.

3. Colocar algodón a las pipetas y acomodarlas en un pipetero.

4. Esterilizar todo el material preparado en autoclave a 15 lb/in2 durante 15 min. Guardar en refrigeración.

Técnica de dilución y siembra en placa

1. En condiciones asépticas, tomar 1 mL de muestra y depositarlo en un tubo con 9 mL de solución isotónica. Este tubocorresponde a una dilución 10-1. Hacer diluciones decimales de la muestra hasta 10-7 (Figura 4). Etiquetar los tuboscon la dilución correspondiente.

2. Para inocular por la técnica vertido, por duplicado y bajo condiciones asépticas: tomar 1 mL de las diluciones 10-2,10-3, 10-4, 10-5 y 10-6 y ponerlo en una caja de Petri estéril. Añadir 20 mL de medio AN fundido TIBIO (~50°C) (Figura5).

3. Homogeneizar el medio con movimientos circulares y suaves para que no salga el medio de la caja (observar lasindicaciones del profesor) y dejar solidificar cerca del mechero.

4. Incubar las cajas en forma invertida a 30°C durante 72 horas y realizar el conteo de colonias. Se seleccionaúnicamente la dilución donde la cuenta de colonias sea entre 30 y 300.

5. La cantidad de microorganismos por gramo o mL de muestra (UFC/mL) se calcula multiplicando el número decolonias promedio por el factor de dilución (FD) y dividiendo entre la cantidad (g o mL) inicial de muestra:

UFC/mL = (no. colonias promedio x FD)/mL de muestra .

FD = 1/dilución = vol. total de líquido (agua + muestra)/vol. de muestra .

Dilución 10-1 10-2 10-3 … 10-6 10-7

Factor de dilución 10 100 1000 … 106 107

Figura 5. Técnica de dilución y cuenta en placa por la técnica de vertido

Tubos con 9 mL de sol. isotónica estéril

1 mL 1 mL 1 mL 1 mL

…

1 mL 1 mL


1 mL 1 mL 1 mL 1 mL

…

1 mL 1 mL

10-3 10-6 10-7


1 mL 1 mL 1 mL 1 mL

…

1 mL 1 mL


1 mL 1 mL 1 mL 1 mL

…

1 mL 1 mL

10-310-3 10-610-6 10-710-7

Muestra

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Figura 6. Técnica de cuenta en placa por la técnica de vertido


Calcular las unidades formadoras de colonias (UFC) por gramo o mL de muestra (UFC/mL) y reportar los resultadosen el Cuadro 8. Incluir todos los cálculos realizados para obtener las UFC/mL.

Discutir acerca de si los datos obtenidos son congruentes o no y por qué. Buscar en la bibliografía cuál es la microflora común de la muestra utilizada y discutir al respecto.

CUESTIONARIO

1. Explique cuáles son las ventajas y las desventajas del método de recuento en placa para cuantificación demicroorganismos.

2. Describa tres métodos, diferentes al recuento en placa, para aislar cultivos puros de microorganismos y compare lasventajas y desventajas de cada uno.

3. ¿Por qué la cuenta microbiana por el método de dilución y recuento en placa se reporta como UFC?

4. Explique por qué razón se debe considerar el factor de dilución para el cálculo de la cuenta de UFC/mL.

5. Si se obtienen 140 colonias en una caja inoculada con 0.5 mL de una dilución 10-4, indique: (i) ¿cuál es el factor dedilución? (ii) ¿cuántas UFC/mL había en la muestra original (sin diluir)?

Cuadro 8. Cuenta viable en placa

MuestraColonias/caja Número promedio de

colonias (+ DS)*Factor de

dilución (FD)Cuenta viable en placa

(UFC/mL)Caja 1 Caja 2

* Desviación estándar

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PRÁCTICA 6. CUANTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS: MÉTODO DE TURBIDIMETRÍA Y RECUENTODIRECTO EN CÁMARA DE NEUBAUER

INTRODUCCIÓN

La concentración de la biomasa microbiana es un parámetro importante que debe estimarse en diversos bioprocesos.Existen diversos métodos directos e indirectos para estimar la biomasa de un cultivo. Entre los métodos directos máscomunes para cuantificar la biomasa microbiana en una muestra líquida, se encuentra la turbidimetría. La turbidez deuna suspensión microbiana es el resultado de la dispersión de la luz por las células. Como la cantidad de luz dispersadaen una suspensión es directamente proporcional al número de células, el crecimiento microbiano (que implica unaumento en el número de células) se refleja en un aumento en la turbidez de la suspensión. Los cambios en la turbidezde un líquido se determinan en un espectrofotómetro, el cual mide la cantidad de luz que pasa a través de un mediolíquido. El crecimiento (medido de esta manera comúnmente) se reporta como un cambio en la densidad óptica (DO), elcual es directamente proporcional a la concentración celular.Es posible relacionar la DO de una suspensión microbiana con el número de células o la masa celular que hay en dichamuestra. Con el uso de una tinción adecuada y una cámara de recuento es posible contar el número de células en unvolumen determinado, determinando así la concentración celular en una suspensión. Las cámaras de recuento sirvenpara cuantificar el número de partículas (p.ej. bacterias, esporas fúngicas, polen) por unidad de volumen en un líquido,a través de su conteo visual bajo un microscopio. A la fecha, el tipo de cámara más utilizado para el recuento directo decélulas, es la cámara de Neubauer (o hemocitómetro); esta es una pieza de cristal grueso con el tamaño de unportaobjetos, en donde se coloca un pequeño volumen de la suspensión a analizar.

OBJETIVOS

Que el alumno compare las técnicas de turbidimetría y conteo directo al microscopio para cuantificar microorganismostotales en una suspensión microbiana.

MATERIALES

Por equipo (sesión 1) Por grupo3 pipetas Pasteur1 cámara de Neubauer5 cubreobjetos1 gradilla3 tubos de ensaye con tapón de rosca de 25 mL3 tubos de ensaye de 25 mL2 pipetas de 10 mL3 pipetas de 1 mL2 propipetas de 1 y 10 mL2 mecheros Fisher1 espectrofotómetro2 celdas para espectrofotómetro1 vórtex2 microscopios ópticos1 piseta con alcohol etílico al 70%1 piseta con agua destilada

2 autoclaves con base, canastilla y válvula2 pares de guantes de asbestoEscobillones, fibra, detergente y toallas de papelAlgodónBolsas de plástico para esterilizar

PROCEDIMIENTO

El profesor proporcionará suspensiones microbianas de tres diferentes microorganismos. Se cuantificará la biomasamicrobiana de cada suspensión, midiendo la densidad óptica (turbidez) y realizando una cuenta directa al microscopio.

Tinción y observación de muestras

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1. De cada suspensión, tomar una muestra de aproximadamente 5 mL y colocarla en un tubo previamente etiquetadoque identifique la muestra.

2. Preparar frotis de cada muestra (microorganismo).

Lavar los portaobjetos, secarlos con papel y etiquetarlos.

Preparar los frotis de acuerdo al procedimiento descrito en la práctica 3 para cultivos líquidos (Figura 1).

3. Fijar los frotis con calor: pasar el frotis rápidamente 2-3 veces por la flama del mechero hasta la eliminación totaldel líquido.

4. Realizar tinción simple con azul de metileno, de acuerdo al procedimiento descrito en la práctica 3.

Cubrir el frotis con 1 gota de azul de metileno durante 60 segundos.

Eliminar el exceso de colorante con la piseta de agua destilada y dejar secar al aire.

5. Observación al microscopio:

Limpiar cuidadosamente los objetivos y el ocular del microscopio con papel seda y realizar la iluminación Kohler.

Colocar el portaobjetos con el frotis de cada muestra en la platina y localizar la preparación con el objetivo de10X, posteriormente pasar al de 100X. Antes de usar el objetivo de 100X, es importante colocar una pequeñagota de aceite de inmersión sobre la preparación.

NOTA: Al finalizar las observaciones, limpiar cuidadosamente el objetivo con papel seda para eliminar el excesode aceite y evitar incrustaciones que dañan estos sistemas.

Cuantificación de microorganismos

1. Con la muestra de cada suspensión, realizar la medición de densidad óptica y el conteo directo al microscopio.

2. Turbidimetría. Homogeneizar la muestra en vórtex y leer la densidad óptica (DO) de la suspensión a 560 nm. Calibrarel equipo con agua destilada. Si la DO es mayor a 0.8, deben hacerse diluciones con agua destilada. La dilución debeconsiderarse al registrar el dato de la concentración total de células/mL en el Cuadro 10. Recuerde que:

3. Cuenta directa al microscopio. Homogeneizar la muestra en vórtex, tomar un pequeño volumen con una pipetaPasteur y colocar una gota cuidadosamente en la cámara de Neubauer, debajo del cubreobjetos de acuerdo con lasinstrucciones del profesor (Figura 7).

Figura 7. Esquema de la observación de células en la cámara de Nuebauer

Limpiar cuidadosamente los objetivos y el ocular del microscopio con papel seda y realizar iluminación Kohler.

Colocar la cámara en la platina del microscopio y ubicar la cuadrícula con el objetivo 10X. Al observar el cuadrocentral en el objetivo 40X, éste se encuentra dividido en una cuadrícula de 5X5 cuadros más pequeños.

FD =V total de líquido (agua + muestra)

V muestra

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Las células se cuantifican en el objetivo de 40X, contando en diagonal las células de 9 cuadros (Fig. 7), a su vezdivididos en 16 cuadros más pequeños). En el caso de muestras muy concentradas, deberán hacerse diluciones(1:2, 1:5, 1:10 etc.). El factor de dilución (FD) debe considerarse para cada dilución realizada:

Para calcular el número de células/mL se utiliza la siguiente ecuación:

Células/mL = Número promedio de células x 25 cuadros x 104 x FD

El número promedio de células por cuadro (de 0.2 mm) se multiplica x25 para obtener el número total de célulasen un volumen de 0.1 mm3 (volumen de la cámara = 1 mm por lado x 0.1 mm de profundidad). Este valor debemultiplicarse por 104 para obtener el número de células/mL.

NOTA: Al finalizar, la cámara debe lavarse con agua destilada y secarse cuidadosamente con papel seda.


De acuerdo con la morfología microscópica (tamaño, forma) de las células observadas, indique el tipo demicroorganismo (bacteria, hongo, alga, protozoario) que contenía cada muestra y repórtelo en el Cuadro 9.

Reporte en el Cuadro 10 los datos de la densidad óptica para cada muestra original y discuta acerca de cómo puederelacionarse la DO de una muestra con el número de células que ésta contiene.

Discutir los resultados con base en la conveniencia de cada método para cuantificar la biomasa microbiana. ¿Esposible utilizar ambos métodos para los microorganismos en estudio? ¿Porqué? De acuerdo con la experiencia dela práctica ¿para qué tipo de células conviene usar cada método?

CUESTIONARIO

1. Explique las ventajas y desventajas del uso de cámaras de recuento para la cuantificación de microorganismos.2. Compare el método de dilución en placa con el método de cuenta directa en cámara de Neubauer para cuantificar

microorganismos. En qué casos conviene usar uno u otro.3. Ejemplifique 2 aplicaciones de estas metodologías (recuento directo en cámara y turbidimetría) en: a) alimentos y

b) microbiología industrial4. A partir de los siguientes datos encontrados en una suspensión microbiana después del conteo de células en una

cámara de Neubauer, calcule: a) el factor de dilución (FD), y b) el número de células/mL en el cultivo original.Recuerde que el número promedio de células, indica el número promedio de células por cuadro.

No. promedio decélulas

Vol. inicial demuestra (mL)

Vol. de agua paradilución (mL) Factor de dilución células/mL

25 0.5 235 1 15 2 6

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Cuadro 9. Observación morfológica y características generales de los microorganismos*.

CaracterísticaMuestra

Morfologíamicroscópica

Tamaño celular(μm)

Color de lascélulas

Movilidad(si/no)

Agrupación(si/no)

Características dela suspensión

Tipo demicroorganismo(bacteria, hongo...)

Justificación(¿cómo llegó aesa conclusión?)

Cuadro 10. Cuantificación de microorganismos por turbidimetría y conteo directo en cámara de Neubauer*.

MicroorganismoTurbidimetría Cámara de Neubauer

DO (560 nm) Número promediode células/cuadro DS FD Número de

células/mL

* DS: desviación estándar; FD: factor de dilución; DO: densidad óptica

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ANEXOS

A. SOLUCIONES Y COLORANTES

Reactivos de Gram

Cristal violeta. Este colorante se prepara de la siguiente manera:a. Solución A: en un vaso de precipitados de 50 mL, colocar 1 g de cristal violeta y disolver con 10 mL de alcohol

etílico.b. Solución B: en otro vaso de precipitados, disolver 0.4 g de oxalato de amonio en 40 mL de agua destiladac. Mezclar cuidadosamente las soluciones A y B. Guardar la mezcla en un frasco ámbar en la oscuridad durante 24

h.d. Filtrar con papel Whatman No. 1 o 4 y guardar la solución en frascos goteros.

Solución de lugol. En un matraz aforado de 50 mL colocar 20 mL de agua destilada y disolver 0.2 g de yoduro de potasio.A continuación agregar, poco a poco, 0.1 g de yodo, mezclar completamente y aforar con agua destilada. Guardar lasolución en un frasco gotero

Solución decolorante alcohol-acetona. Colocar en una probeta de 50 mL, 30 mL de alcohol etílico y 20 mL de acetona,mezclar perfectamente. Poner esta solución en un frasco gotero. Puede emplearse solamente alcohol.

Safranina. En un matraz aforado de 50 mL, colocar 5 mL de alcohol etílico y disolver 0.125 g de safranina. Aforar conagua destilada, filtrar y guardar la solución en un frasco gotero.

Colorantes y reactivos

Azul de metileno. Pesar 0.25 g de azul de metileno y disolverlo en 50 mL de agua destilada. Guardar la solución en unfrasco gotero.

Azul de metileno alcalino. Disolver 0.3 g de azul de metileno en 30 mL de alcohol etílico al 95% y mezclarlo con 100 mLde una solución de hidróxido de potasio al 0.01%.

Azul de lactofenol. Disolver cuidadosamente 10 g de fenol (cristales) en 20 mL de agua destilada, agregar lentamente 10g (16 mL) de ácido láctico y 40 g (31 mL) de glicerol. Mezclar en parrilla de agitación durante 10 minutos y agregar 0.05 gde azul de metilo o fucsina ácida

Verde de malaquita. Disolver 5.0 g del colorante verde de malaquita en 100 mL de agua destilada.

Solución salina isotónica. Disolver 0.9 g de NaCl en agua destilada y aforar a 100 mL.

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B. MEDIOS DE CULTIVO

1. Caldo nutritivo (CN)

Ingrediente (g/L)Peptona de caseína 5.0NaCl 8.0Extracto de carne 3.0pH 6.5-7.0

2. Agar de eosina - azul de metileno (EMB-agar)

Ingrediente (g/L)Peptona de gelatina 10.0Lactosa 5.0Sacarosa 5.0K2HPO4 2.0Eosina 0.4Azul de metileno 0.065Agar 15.0

3. Papa-Dextrosa Agar (PDA)

Ingrediente (g/L)Glucosa 20.0Extracto de papa 4.0Agar 15.0pH 5.6

academia de microbiología, departamento de...

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