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I
IDENTIFICACION DE MUTACIONES EN EL GEN IDURONATO 2 SULFATASA
(IDS) EN PACIENTES COLOMBIANOS CON SINDROME DE HUNTER
DEISY JOHANNA GALVIS RODRÍGUEZ
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Medicina, Departamento de Morfología
Bogotá, Colombia
2013
2
IDENTIFICACION DE MUTACIONES EN EL GEN IDURONATO 2 SULFATASA (IDS) EN PACIENTES COLOMBIANOS CON SINDROME DE HUNTER
DEISY JOHANNA GALVIS RODRÍGUEZ
Tesis o trabajo de investigación presentada(o) como requisito parcial para optar al
título de: Magister en Genética Humana
Director:
MD,MSc, ESP.HARVY MAURICIO VELASCO PARRA
Línea de Investigación:
Genética Clínica
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Medicina, Departamento de Morfología
Bogotá, Colombia
2013
3
A mi familia
4
AGRADECIMIENTOS
A los pacientes y sus familias
A la Asociación Colombiana de Pacientes con Enfermedades de Depósito Lisosomal
Al personal asistencial de las instituciones visitadas para la inclusión de los
pacientes y toma de muestras
A la compañía MRC-Holland por aportar el kit para la realización de MLPA y brindar
asesoría en el análisis de los resultados
A los diferentes especialistas tratantes de los pacientes, que enviaron muestras y/o
información clínica relevante para este trabajo
Al departamento de Nutrición y Bioquímica de la Pontificia Universidad Javeriana,
profesores Janneth González, George Barreto y el estudiante Daniel Torrente, por su
orientación en el tema computacional
Al Centro de Investigaciones Bioquímicas de la Universidad de Los Andes por el
aporte de resultados enzimáticos y muestras
Al laboratorio de Errores Innatos del Metabolismo de la Pontificia Universidad
Javeriana por el aporte de resultados enzimáticos
A mi compañero David Serrano, por su acompañamiento en el inicio de este trabajo
A la asistente de la Coordinación de Maestría, por su diligencia en materia de lo
administrativo
Al Director de esta investigación, por sus valiosas enseñanzas y su creciente
comprensión a lo largo del desarrollo de nuestro trabajo
A Tatiana Vinasco por su asesoramiento y apoyo en el laboratorio.
5
TABLA DE CONTENIDO
TABLA DE CONTENIDO ..................................................................................................................... 5
Resumen ...................................................................................................................................... 10
Abstract ........................................................................................................................................ 11
1. INTRODUCCION ............................................................................................................................. 12
2. JUSTIFICACION ............................................................................................................................... 13
3. OBJETIVOS ..................................................................................................................................... 15
3.1. Objetivo general .......................................................................................................... 15
3.2. Objetivos específicos ................................................................................................... 15
4. MARCO TEÓRICO ........................................................................................................................... 16
4.1. Definición ..................................................................................................................... 16
4.2. Reseña histórica de la enfermedad ............................................................................. 17
4.3. Epidemiología .............................................................................................................. 19
4.4. Manifestaciones Clínicas de la Mucopolisacaridosis tipo II ........................................ 21
4.5. Fenotipos de MPS II .................................................................................................... 26
4.5.1. Fenotipo Severo o Neuronopático (MPSII A) ............................................................. 26
4.5.2. Fenotipo Atenuado o No neuronopático (MPS II B) .................................................. 27
4.6. Diagnóstico .................................................................................................................. 28
4.7. Manejo de la MPS II .................................................................................................... 28
4.7.1. Soporte y manejo interdisciplinario .............................................................................. 32
4.7.2. Trasplante de médula ósea .......................................................................................... 33
4.7.3. Terapia de reemplazo enzimático ................................................................................ 35
4.7.4. Administración intratecal de Idursulfasa ..................................................................... 40
4.7.5. Terapia génica ................................................................................................................ 40
4.7.6. Herramientas de prevención y diagnóstico temprano .............................................. 42
4.8. Genética de la MPS II .................................................................................................. 43
6
4.8.1. Epidemiología genética ................................................................................................. 46
4.8.2. Correlación genotipo – fenotipo ................................................................................... 47
4.8.3. Herramientas de diagnóstico molecular ...................................................................... 50
4.9. Proteómica y biología celular de la IDS ...................................................................... 52
4.9.1. Estructura y función de la Iduronato 2 sulfatasa (IDS) ......................................... 52
4.9.2. Procesamiento diferencial de IDS ............................................................................... 55
4.9.3. Fisiopatología de la MPS II. .......................................................................................... 56
5. METODOLOGÍA .............................................................................................................................. 64
5.1. Tipo de estudio ............................................................................................................ 64
5.2. Tamaño de muestra .................................................................................................... 64
5.3. Ingreso al estudio ........................................................................................................ 64
5.4. Fase pre analítica ........................................................................................................ 64
5.4.1. Toma de muestra ........................................................................................................ 64
5.4.2. Extracción de DNA ......................................................................................................... 65
5.5. Fase analítica .............................................................................................................. 65
5.5.1. Detección de grandes deleciones y duplicaciones del gen por MLPA ............... 65
5.5.2. Secuenciación ............................................................................................................. 71
5.4.3. Análisis de recombinantes por RFLPs ........................................................................ 74
5.6. Fase Post Analítica ...................................................................................................... 77
5.6.1. Descripción de las variables y análisis estadístico ................................................... 77
5.6.2. Análisis bioinformático de la repercusión de las mutaciones en la estructura tridimensional de la IDS ............................................................................................................. 77
5.6.2.1. Modelamiento y Docking de las IDS mutantes halladas en el estudio ............... 79
5.7. Flujograma ................................................................................................................... 80
6. RESULTADOS ................................................................................................................................. 81
6.1. Características clínicas de los pacientes .................................................................... 81
6.2. Detección de grandes pérdidas o ganancia de material genético (rearreglos complejos) 91
6.3. Identificación de mutaciones por secuenciación directa ............................................. 94
7
6.4. Análisis de recombinantes por RFLPs ........................................................................ 98
6.5. Clasificación de las mutaciones encontradas ........................................................... 100
6.6. Frecuencia de las mutaciones encontradas en los pacientes MPS II ....................... 103
6.7. Estudio de portadoras ............................................................................................... 105
6.8. Predicción de la repercusión de las mutaciones en la estructura tridimensional de la IDS 109
6.8.1. Modelamiento de la hIDS tipo silvestre ..................................................................... 109
6.8.2. Docking Molecular de la hIDS tipo silvestre ............................................................. 112
6.8.3. Modelamiento y docking de las IDS mutantes ......................................................... 114
7. DISCUSIÓN ................................................................................................................................... 123
7.1. Características clínicas .................................................................................................. 123
7.2. Perfil mutacional y comparación con la literatura .......................................................... 129
7.3. Análisis bioinformático y repercusión de las mutaciones en la estructura tridimensional de la IDS 133
8. CONCLUSIONES ........................................................................................................................... 141
9. LIMITACIONES Y PERSPECTIVAS .................................................................................................. 143
10. BIBLIOGRAFÍA ............................................................................... ¡Error! Marcador no definido.
8
Lista de figuras
Figura 4-1 Posicion de los exones del gen IDS. Presencia del Peudogen IDSP1………………………45
Figura 4-2 Pasos en la degradación de GAGs…………………………………………….………………..55
Figura 4-3 Cambios secundarios en las neuronas encontrados en las enfermedades de depósito lisosomal.. ………………………………………………………………………………………..…………….59
Figura 5-4 Amplificación de sondas dependeinte de ligamiento en Múltiplex……………...……………66
Figura 5-5 Representación esquemática de los rearreglos complejos ……………………......……...…76
Figura 6-6 Deleción completa del exón 7 en el paciente MPSII012……………………..……………....93
Figura 6-7 Mutaciones privadas (nuevas) encontradas por secuenciación y MLPA.95
Figura 6-8 Digestión con HinfI (PCR1)……………………………… ……………………………………...97
Figura 6-9 Digestión con digestión con SacI, AcuI………………………………………………………....98
Figura 6-10 Fotografías pacientes MPSII012 y MPSII014………………………………………………..99
Figura 6-11 Distribución de frecuencias mutaciones privadas y reportadas………………………......103
Figura 6-12 Pedigree del paciente MPSII012 ………………………………………………………….....104
Figura 6-13 Portadoras parientes del paciente MPSII12……………………………………………..…..105
Figura 6-14 Exclusión de estado de portadora………………………………………………………..…..106
Figura 6-15 Estudio de portadoras parientes paciente MPSII002……………………………………....108
Figura 6-16 Modelo tridimensional de IDS…………………………………………………………….….109
Figura 6-17 Plot de Ramachandran. …………………………………………………………………..….110
Figura 6-18 Docking de hIDS tipo silvestre……………………………………………………………….112
Figura 6-19 a 6-25 Docking de las distintas IDS mutantes………………………………………………116
Figura 6-26 Modelamiento mutantes truncadas………………………………………………………..…121
Figura 7-27 Modelo propuesto para el mecanismo de recombinación en el intrón 3…………….…..130
9
Lista de tablas
Tabla 4-1 Actividd de la IDS en leucicitos, plasma y fibroblastos……………………………………...….33
Tabla 4-2 Resumen del diseño de estudio para los ensayos clínicos de fase I/II y II/III de Idursulfase……………………………………………………………………………………..……………..…37
Tabla 4-3 Transcriptos del gen IDS……………………………………………………………..……………45
Tabla 5-4 Condiciones para la Amplificación de fragmentos génicos…………………………………….71
Tabla 5-5 Set de primers para detección de rearreglos complejos ……………………………….…..….76
Tabla 5-6 RFLPs de los productos de PCR…………………………………………….…………………...76
Tabla 6-7 Características fenotípias de la muestra en estudio…………………………………….…..….84
Tabla 6-8 Edad al diagnóstico, niveles de actividad enzimática de los pacientes y administración de
Terapia de Reemplazo Enzimático …………………………………………………………………………..85
Tabla 6-9 Características clínicas de los pacientes………………………………………………..……….89
Tabla 6-10 Valores normalizados de la longitud de fragmentos de las diferentes regiones del gen IDS
analizadas por MLPA. Pacientes MPS 001 y 012………………………………………………………….92
Tabla 6-11 Resultados de genotipificación y MLPA…………………………………………….…………93
Tabla 6-12 Mutaciones identificadas por MLPA, secuenciación y RFLPs………………….………….100
Tabla 6-13 Clasificación de Mutaciones pacientes colombianos con MPSII……………….………….101
Tabla 6-14 RMSD y ASA calculados para cada modelo de las IDS mutantes……………..………….114
10
Resumen
El Síndrome de Hunter o Mucopolisacaridosis II es una enfermedad ligada X
heredada, causada por mutaciones en iduronato 2 sulfatasa (IDS). Esta enzima
cataliza la etapa inicial de la degradación de heparán y dermatán sulfato, por lo que
su deficiencia conduce al almacenamiento de estos glicosaminoglicanos. La MPSII
tiene heterogeneidad alélica, dificultando la correlación genotipo-fenotipo. Este
estudio evaluó las características clínicas y la frecuencia de mutaciones en un grupo
de pacientes MPSII colombianos y realizó una aproximación a la correlación
fenotipo-genotipo. Dieciocho pacientes fueron incluidos en este estudio, 11% no
neuronopáticos y 89% neuronopáticos, los cuales fueron sometidos a tres
metodologías moleculares: MLPA, secuenciación directa de exones y RFLPs. De un
total de 12 mutaciones identificadas, 6 eran nuevas (c.548_564dup16, c.477insT,
c.595_607del12, c. 549_562del13, c.182delC y deleción completa del exón 7). La
frecuencia de mutaciones recurrentes (R468Q, Q465X, K347Q, K236N, S71N y un
fenómeno de conversión) fue del 58%. En dos pacientes (11%) no fue posible
establecer la mutación. La mutación S71N fue recurrente en fenotipo atenuado,
mientras que las mutaciones de tipo frameshift privadas y rearreglos complejos
estaban presentes en pacientes con fenotipo severo. Se realizó Docking molecular
con las estructuras de la IDS silvestre y mutantes, encontrando cambios en las
interacciones enzima-sustrato para las mutantes de IDS.
Palabras clave:
Mucopolisacaridosis II, Sulfoiduronato sulfatasa, Análisis Bioinformático, Docking
molecular.
11
Abstract
Hunter Syndrome or Mucopolysaccharidosis II is an inherited X-linked disease
caused by mutations in the iduronate 2 sulfatase (IDS). This enzyme catalyzes the
initial stage of the degradation of heparan and dermatan sulfate, therefore its
deficiency leads to the storage of these glycosaminoglycans. MPSII has allelic
heterogeneity, challenging genotype-phenotype correlation. This study evaluated the
clinical characteristics and the frequency of mutations in a group of MPSII
Colombians patients and made an approach to phenotype-genotype
correlation. Eighteen patients were included in this study, 11% non-neuropathic and
89% neuropathic, which were subjected to three molecular methods: MLPA, direct
sequencing of exons and RFLPs. A total of 12 mutations were identified, 6 of them
were new (c.548_564dup16, c.477insT, c.595_607del12, c. 549_562del13,
c.182delC and complete deletion of exon 7). The frequency of recurrent mutations
(R468Q, Q465X, K347Q, K236N, S71N and a phenomenon of conversion) was
58%. In two patients (11%) the molecular diagnosis was not possible. The S71N
mutation was recurrent in attenuated phenotype, whereas new frameshift mutations
and complex rearrangements were present in patients with severe
phenotype. Molecular Docking was performed with the structures of wild type and
mutant IDS, finding substantial changes in enzyme-substrate interactions for IDS
mutants.
Keywords:
Mucopolysaccharidosis II, Sulfoiduronate sulfatase, Bioinformatic Analysis, Molecular
Docking.
12
1. INTRODUCCION
La Mucopolisacaridosis tipo II (MPS II) es una enfermedad genética de herencia
recesiva ligada a X. Está catalogada dentro de las “enfermedades raras”, lo que
indica que tiene una incidencia menor a 1 en 100.000. El defecto primario es
ausencia o inactividad de la enzima Iduronato 2 Sulfatasa (IDS), responsable de la
degradación mayoritaria de los glicosaminoglicanos (GAGs) dermatán sulfato y
heparán sulfato (también algo de condroitín sulfato) y su consecuencia patológica es
la acumulación de estos compuestos en los tejidos del cuerpo, incluyendo el tejido
neuronal.
En la actualidad en Colombia se ha diagnosticado un número creciente de casos
pero no hay datos exactos sobre la incidencia, prevalencia y la epidemiología
molecular de la MPS II. Además nuestro país carece de una metodología molecular
para el diagnóstico y abordaje genético de esta patología, hay total desconocimiento
sobre el perfil mutacional de la MPS II y sobre el estado de portadores de los
familiares que presentan esta patología.
Hasta ahora, desconocemos la presencia o ausencia de mutaciones privadas en el
gen IDS, la frecuencia de las mutaciones más comunes y no hay certeza de la
presencia o ausencia de correlaciones genotipo–fenotipo en nuestra población, por
lo que se hace clave el desarrollo de propuestas como la que describiremos para
entender el comportamiento molecular de este tipo de enfermedades en nuestras
poblaciones.
13
2. JUSTIFICACION
La Mucopolisacaridosis tipo II (OMIM 309900) o Síndrome de Hunter, es la única
MPS con herencia Recesiva ligada a X(Yatziv, Erickson, & Epstein, 1977). El defecto
primario de la patología es la ausencia o inactividad de la enzima lisosomal
Iduronato 2 Sulfatasa (IDS; EC 3.1.6.13) por mutaciones en el gen IDS que genera
en su fenotipo más severo (Hunter A), una alta mortalidad, cercana a 90% antes de
los 15 años, la cual es acompañada por discapacidad cognitiva severa,
visceromegalias, cardiopatías y enfermedades del sistema respiratorio (Yatziv, et al.,
1977).
Los estudios sobre incidencia y prevalencia del grupo de enfermedades de depósito
lisosomal incluida la MPS II han mostrado diferencias de una región a otra. Malm et
al. en población escandinava encontraron una incidencia combinada de las MPS de
4.24 a 7.06 por 100.000 nacidos vivos (Malm, Lund, Mansson, & Heiberg, 2008).
Nelson et al. en población australiana observaron una incidencia 3.43 por 100.000
nacidos vivos (Nelson, Crowhurst, Carey, & Greed, 2003) mientras que Baehner en
Alemania citó una incidencia de 3.43 por 100.000 (Baehner et al., 2005) y Lin et al.
encontraron una incidencia de 2.04 en 100.000 nacidos vivos de Taiwán (Lin et al.,
2009). No hay aún reportes al respecto en Latinoamérica ni en Colombia, lo cual va
de la mano con el desconocimiento de la epidemiología genética de las mutaciones
en IDS y su repercusión en los fenotipos del Síndrome de Hunter.
En la actualidad en Colombia se carece de una metodología molecular para el
diagnóstico y abordaje genético (incluyendo estudio de portadores) de esta patología
y hay total desconocimiento sobre el perfil mutacional de la MPS II en nuestros
14
pacientes. A la fecha no se encuentran estudios en pacientes colombianos sobre la
presencia o ausencia de mutaciones privadas en IDS y la frecuencia de las
mutaciones más comunes; tampoco hay certeza de la presencia o ausencia de
correlaciones genotipo – fenotipo, por lo que se hace clave el desarrollo de
propuestas como la que describiremos para entender el comportamiento molecular
de este tipo de enfermedades en nuestras poblaciones.
Conocer el perfil mutacional de IDS para MPS II permitiría mejorar el diagnóstico,
manejo y abordaje integral de este tipo de pacientes y sus familias, generaría
mejores herramientas en los procesos de asesoramiento genético, manejo de la
información, pronóstico y alcances terapéuticos individualizados (Wraith, Scarpa, et
al., 2008).
El presente estudio pretende ser el primero de identificación de las mutaciones en el
gen IDS en pacientes colombianos que presentan MPS II. El propósito es conocer
nuestro perfil mutacional, ofrecer a la comunidad clínica y a los familiares de
pacientes los servicios de genotipificación y estudio de portadores de mutaciones en
el gen IDS y aportar a la comunidad científica un mayor conocimiento sobre esta
entidad en población tan mezclada como la nuestra.
15
3. OBJETIVOS
Objetivo general
Identificar las mutaciones en el gen IDS en una muestra de pacientes colombianos
con MPSII y analizar las repercusiones de estos cambios en la proteína in silico.
Objetivos específicos
Caracterizar fenotípicamente los pacientes colombianos con Síndrome de
Hunter (MPSII) incluidos en el estudio.
Identificar la presencia de grandes deleciones/duplicaciones, mutaciones
puntuales y rearreglos complejos del gen IDS en los pacientes con Síndrome
de Hunter y establecer sus frecuencias.
Determinar la presencia de mutaciones comunes y nuevas en el gen IDS en
nuestra población a estudio y sus frecuencias.
Sugerir posibles mecanismos de origen de los grandes rearreglos
encontrados.
Estudiar la repercusión de las mutaciones comunes y privadas, sobre la
estructura de la proteína in silico.
16
4. MARCO TEÓRICO
Definición
La MPS II es una enfermedad genética de herencia Recesiva ligada a X. Está
catalogada dentro de las “enfermedades raras”, lo que indica que tiene una
incidencia menor a 1 en 10.000, tal como se contempla en la Ley de Enfermedades
Huérfanas(Ley 1349)(Cáceres, Otero, Gómez, & Rodríguez, 2010). El defecto
primario es la ausencia o inactividad de la enzima Iduronato 2 Sulfatasa (IDS),
responsable de la degradación de los GAGs dermatán sulfato (también algo de
heparán y condroitín sulfato) y su consecuencia patológica es la acumulación de
estos compuestos en los tejidos del cuerpo, incluyendo el Sistema Nervioso Central
(K. L. Jones & Smith, 2006).
Este síndrome tiene un espectro de presentación clínica que va desde un fenotipo
severo (Hunter A) hasta un fenotipo leve o atenuado (Hunter B) y su clasificación
clínica se obtiene teniendo en cuenta 3 variables:
1. La edad de inicio de síntomas
2. La presencia o ausencia de compromiso neurológico/cognoscitivo
3. El promedio de sobrevida (Neufeld & Muenzer, 2001).
Desde el aislamiento y caracterización del gen IDS por Wilson et al. en 1990 se han
podido utilizar herramientas moleculares para el diagnóstico de MPS II(Wilson et al.,
1990), de gran utilidad en el estudio de portadoras en familias en riesgo, en
diagnóstico prenatal y pacientes con edad inferior a 1 año(C. P. Chen et al., 2007).
17
Reseña histórica de la enfermedad
La primera descripción de la enfermedad fue realizada por el mayor Charles Hunter
en 1917(Hunter, 1917), que correspondía a dos hermanos de ascendencia británica
con macrocránea, fascies tosca, organomegalias, hipoacusia, infecciones faríngeas
a repetición, rigidez articular, anormalidades óseas, talla baja e inteligencia normal.
Dos años después, Gertrud Hurler reportó sobre dos pacientes femeninas con
características similares a las descritas por Hunter, pero además con retardo mental
y opacidad corneal (Hurler, 1919). Las dos entidades fueron consideradas una sola,
incluso denominadas Síndrome de Hurler-Hunter o Gargolismo hasta la elucidación
de la base bioquímica de cada enfermedad, casi 50 años más tarde (Brante, 1952).
En 1965 Danes y Bern cultivaron fibroblastos de pacientes con síndrome de Hurler o
síndrome de Hunter demostrando con azul de toluidina la presencia de gránulos
metacromáticos (Danes & Bearn, 1965), los cuales son el resultado de la
acumulación intracelular de GAGs, como se comprobaría en al análisis
químico(Danes & Bearn, 1966). Los mismos autores encontraron también en
relación con el síndrome de Hunter que los fibroblastos provenientes del padre
carecían por completo de gránulos metacromáticos, a diferencia de las condiciones
autosómicas recesivas Hurler y Sanfilippo, donde la alteración es evidente en
fibroblastos provenientes de ambos progenitores(Pennock & Barnes, 1976).
En la búsqueda de la causa de dicha acumulación de GAGs, Fratantoni, Hall y
Neufeld demostraron en 1968 la existencia de un “factor de corrección”: al mezclar
18
incidentalmente los cultivos de fibroblastos correspondientes a los síndromes de
Hunter y Hurler se produjo la corrección cruzada de los depósitos intracelulares en
ambos cultivos(Fratantoni, Hall, & Neufeld, 1968) .
Dos años más tarde Cantz et al. lograrían la caracterización inicial de la proteína, y
empleando el sustrato radioactivo proteodermatán [35S] sulfato se aclararía su
actividad sulfatasa sobre el grupo sulfato del residuo de ácido idurónico, en el primer
paso de la degradación de este GAG(Cantz, Chrambach, Bach, & Neufeld, 1972).
En 1974 el grupo de Lin, Neufeld y colaboradores, publicó un método radioactivo
para medir la actividad enzimática de la IDS empleando un sustrato marcado con
tritio (ácido O-a-L-idopiranosilurónico 2 sulfato), puesto que el sustrato con S35 era
propenso al error y no era confiable como prueba diagnóstica(Lim, Leder, Bach, &
Neufeld, 1974). Más tarde, Liebaers y Neufeld emplearían esta técnica para
determinar el estado heterocigoto de la MPSII encontrando que en la mitad de las
portadoras obligadas los valores de actividad se encontraban en límites normales,
concluyendo así que el ensayo de actividad enzimática no resultaba confiable para
identificación de portadoras(Liebaers & Neufeld, 1976).
La aproximación inicial a las bases moleculares de la MPS II fue realizada por
Upadhyaya y colaboradores mediante análisis de ligamiento con marcadores
microsatélites localizados distalmente en el brazo largo del cromosoma
X(Upadhyaya et al., 1986). El mismo grupo confirmó que el locus del gen
responsable del Síndrome de Hunter se hallaba entre un clúster de marcadores,
entre ellos F8C y DXS15, en Xq28.
19
En 1990 Wilson, Hopwood y colaboradores lograron el aislamiento y clonación del
cDNA del gen IDS empleando dideoxiterminadores y el fragmento Klenow de la DNA
polimerasa I(Wilson, et al., 1990).Con esta información disponible se inició la
búsqueda de mutaciones que explicaran el amplio espectro de severidad de la
MPSII encontrando en los primeros ensayos grandes deleciones o rearreglos del
gen (Wilson et al., 1991), (Wraith et al., 1991).
La presencia de un pseudogén corriente abajo del gen IDS explicaría luego la
susceptibilidad a eventos complejos de recombinación (Rathmann, Bunge, Steglich,
Schwinger, & Gal, 1995).
Epidemiología
El primer reporte sobre la incidencia del síndrome de Hunter fue realizado en 1971
en Columbia Británica, arrojando un estimado de 0,3 por 100.000 nacidos vivos
(Lowry & Renwick, 1971). En 1980 población judía de Israel, Schaap y Bach
calcularon 1 por 68.000 nacidos vivos (Schaap & Bach, 1980) y en la misma década
en el Reino Unido, Young y Harper reportaron una incidencia de 1 en 132.000
nacidos vivos con una prevalencia de 1 en 3,17 millones de habitantes (Young &
Harper, 1982a), (Young & Harper, 1982b).
Con el progreso en la identificación y diagnóstico de la MPSII aparece un mayor
número de datos epidemiológicos en la literatura. Nelson et al. en Irlanda reportaron
1 en140.000(Nelson, 1997), mientras que en Holanda se calculó en 0,67:100.000
nacidos vivos(Poorthuis et al., 1999).
20
Meikle et al. reportaron una incidencia de 0.62:100.000 nacidos vivos en Australia
(Meikle, Hopwood, Clague, & Carey, 1999). Nelson et al. en población de Australia
Occidental observaron una incidencia de MPS II de 1 en 165.000 varones nacidos
vivos(Nelson, et al., 2003). Baehner en Alemania citó una incidencia de 0,64 por
100.000 (Baehner et al., 2005). Malm et al. recopilaron registros de 25 años en
Noruega y 30 años en Suecia y Dinamarca, encontrando una incidencia de 0,13 a
0,27 por 100.000 nacidos vivos y una prevalencia entre el 2 a 6 por millón además
de rangos de supervivencia sin tratamiento entre los 2,5 a 58 años(Malm, et al.,
2008).
En Taiwan, los registros desde 1984 a 2004 muestran la más alta incidencia de
MPS II, de 1.07 por 100.000 nacidos vivos (2.05 por 100.000 varones nacidos vivos),
representando el 52% de todos los casos de MPS. La incidencia combinada de MPS
en esta población fue similar a la de las poblaciones occidentales, pero la proporción
de MPSII fue mayor en Taiwan (Lin, et al., 2009). Similar situación se reporta en
Japón, donde la incidencia de MPS II se ha estimado en 1:90.000, representando el
50% de todas las MPS (Ochiai et al., 2007).
Aún no se dispone de datos epidemiológicos de este tipo en Norteamérica ni
América Latina. Un estudio de Coelho et al. en 1997, sobre el diagnóstico de Errores
Innatos del Metabolismo (EIM) en Brasil reveló que las Enfermedades de Depósito
Lisosomal eran las más frecuentes entre los EIM (59.8% de todos los diagnósticos),
y las MPS representaron el 54% de las Enfermedades de Depósito
Lisosomal(Coelho, Wajner, Burin, Vargas, & Giugliani, 1997). La Rede MPS Brasilal
21
año 2008 registró 249 pacientes, de los cuales 82 pacientes corresponden a
MPSII(Vieira et al., 2008).
En Colombia en el año 2012 se registraron 33 pacientes con MPS II, según datos
aportados por la organización ACOPEL (Asociación Colombiana de Pacientes con
Enfermedades de Depósito Lisosomal). No se han realizado estudios sobre la
incidencia y prevalencia de la MPS II en nuestro país, sin embargo, la frecuencia
combinada de las MPS calculada en los departamentos de Cundinamarca y Boyacá
fue de fue de 1,98 casos por 100.000 nacidos vivos; la mayor frecuencia fue para el
tipo IV (0,68), mientras que la MPS II tuvo una frecuencia estimada de 0,45 por
100.000 nacidos vivos(Gómez, García-Robles, & Suárez-Obando, 2012).
Manifestaciones Clínicas de la Mucopolisacaridosis tipo II
Las características clínicas de la MPS II se deben a la acumulación de GAGs en
tejidos y órganos, lo que se traduce en una afección multisistémica con variabilidad
fenotípica(Winter & Barainster, 2001).Las principales son:
Macrocrania.
Epilepsia.
Hipoacusia.
Facies tosca (puente nasal deprimido, narinas antevertidas, labios y encías
gruesas, macroglosia y frente plana).
Ausencia de opacidad corneal.
Estenosis mitral o de aorta.
22
Hepatoesplenomegalia.
Hernia umbilical/inguinal.
Talla baja.
Múltiples disostosis óseas (hipoplasia de los metacarpianos, acortamiento
rizomélico de los dedos y platiespondilia).
Rigidez articular.
Camptodactilia
Retardo en el desarrollo neurológico(Winter & Barainster, 2001), (Neufeld &
Muenzer, 2001).
Exceptuando el compromiso del Sistema Nervioso Central (SNC), las anormalidades
sistémicas son similares independientemente de la severidad del fenotipo.
4.4.1 Características faciales
La característica más común que se presenta es un engrosamiento de los rasgos
faciales (fascies tosca), que se vuelve aparente entre 2 y 4 años de edad (Young &
Harper, 1983). Se observa una base y punta nasal ensanchada, labios gruesos,
arcos superciliares y mandíbula prominentes (Young & Harper, 1982), (Neufeld &
Muenzer, 2001).
4.4.2. Anomalías esqueléticas
El perímetro cefálico se encuentra por lo general sobre +2SD. Los pacientes tienden
a ser altos para su edad hasta aproximadamente 4 ó 5 años de edad, cuando
empiezan manifestar talla baja(Wraith, Scarpa, et al., 2008).
23
Los hallazgos esqueléticos se conocen colectivamente como disostósis múltiple. El
examen radiográfico revela grosor anormal de los huesos, y la osificación epifisaria
irregular en las articulaciones de la mano, el hombro y codo(Hunter, 1917). Las
manos adquieren forma de garra y en combinación con el síndrome del túnel
carpiano puede resultar una pérdida de la función de la mano (Norman et al. 1995),
Las costillas y clavículas están engrosadas y tienen una forma inusual. Los cuerpos
vertebrales aplanados (platispondilia) con superficies laterales irregularmente
dentadas. La movilidad está restringida debido a la rigidez de las articulaciones y
contracturas(Link et al., 2010).
4.4.3. Manifestaciones oculares
La opacidad corneal no es una característica del síndrome de Hunter, pero una
evaluación con lámpara de hendidura puede revelar discretas lesiones de la córnea
que no afectan la visión (Ashworth, 2006). Se pueden presentar cambios laterales en
la pigmentación de la retina y pérdida de campo de visión en algunos pacientes
(Topping et al., 1971).
4.4.4. Manifestaciones otorrinolaringológicas
En la mayoría de los pacientes se presentan frecuentes infecciones respiratorias
altas (Wraith, Scarpa, et al., 2008).La macroglosia, hipertrofia de adenoides y
amígdalas, sumado a cambios en la mandíbula y en el cuello, limitan la apertura de
la cavidad oral (Downs, 1995). La mayoría de los pacientes presentan infecciones
recurrentes del oído, y casi todos experimentan hipoacusia progresiva (Peck et al.,
1984). La pérdida de audición es causada tanto por déficit conductivo como
neurosensorial, y la efusión del oído medio es reconocido como un importante
24
contribuyente a la pérdida de audición en los pacientes con síndrome de
Hunter(Keilmann, Nakarat, Bruce, Molter, & Malm, 2012). Los dientes son de forma
irregular, y el tejido gingival es hiperplásico (Hopkins et al., 1973), (Downs et al.,
1995).
4.4.5. Sistema respiratorio
La obstrucción de la vía aérea es un hallazgo frecuente en el síndrome de
Hunter(Brama, Gay, Feinmesser, & Springer, 1986), (Shih, Lee, Lin, Sheu, &
Blickman, 2002). Factores que contribuyen a este fenómeno son: la estrechez y
forma anormal de la tráquea y los bronquios (Shih et al., 2002), macroglosia e
hipertrofia de amígdalas y adenoides, epiglotis prominente, infecciones frecuentes
del tracto respiratorio superior, neumonía recurrente y secreciones nasales y
traqueales(Morehead & Parsons, 1993).
El movimiento restringido de las articulaciones temporomandibulares, la rigidez de la
pared torácica y la distensión abdominal también alteran el patrón respiratorio
(Young & Harper, 1982). Una complicación común de la obstrucción de vía aérea en
el síndrome de Hunter es la apnea del sueño(Leighton, Papsin, Vellodi, Dinwiddie, &
Lane, 2001).
4.4.6. Sistema Cardiovascular
La afectación cardiaca está presente en casi todos los pacientes con síndrome de
Hunter y es una causa importante de muerte en esta población. Enfermedad valvular
mitral y/o aórtica, hipertrofia ventricular y falla cardíaca, son comúnmente
reportados(Dangel, 1998). En un estudio de 18 pacientes se reportó insuficiencia
mitral en 11 de ellos(M. R. Chen, Lin, Hwang, & Yu, 2005).
25
4.4.7. Sistema Nervioso
El compromiso del SNC se sospecha inicialmente por retraso y luego regresión en
los hitos del desarrollo, por ejemplo, en la sedestación, marcha y desarrollo del
lenguaje; estas manifestaciones se presentan en el fenotipo severo (MPS II A)
(Young, Harper, Newcombe, & Archer, 1982). La hidrocefalia comunicante moderada
a grave puede acelerar el deterioro neurológico(Yatziv & Epstein, 1977). La presión
intracraneal elevada puede causar edema del disco óptico y atrofia del nervio óptico.
Las convulsiones se presentan en más de la mitad de los casos con MPS II A que
llegan a la edad de 10 años, pero son poco frecuentes en la forma atenuada de la
enfermedad (Wraith et al., 2008).
El síndrome del túnel carpiano es común en los pacientes con MPS II (Norman-
Taylor et al., 1995),(Kwon et al., 2011).La compresión de la médula espinal puede
ocurrir debido a un estrechamiento del canal vertebral y la inestabilidad de la
articulación atlantoodontoidea (Neufeld & Muenzer, 2001).
Severas alteraciones del comportamiento, tales como hiperactividad, la obstinación
y la agresión, se observan con frecuencia en los pacientes severamente afectados
con el síndrome de Hunter, pero no se observa típicamente en las personas con la
presentación atenuada (Bax & Colville, 1995).
4.4.8. Afectación gastrointestinal
Debido al almacenamiento de GAGs se produce hepatomegalia y esplenomegalia,
resultando en distensión abdominal. Se han reportado frecuencias entre el 57% y el
90% de hepato y/o esplenomegalia(Pinto et al., 2006). La hernia umbilical se
observa comúnmente, y hernias inguinales se presentan en aproximadamente el
26
60% de los casos. La diarrea crónica es frecuente en pacientes con compromiso
neurológico, pero no es común en el fenotipo atenuado (Young et al., 1982).
4.4.9. Otras manifestaciones
Los pacientes con síndrome de Hunter pueden tener lesiones en piel consistentes en
pápulas blanco marfil que son de 2 a 10 mm de diámetro(Panine & Hashimoto,
1995), (Thappa et al., 1998).
Vejiga neurogénica y obstrucción urinaria han sido reportados(Koyama, Moda, Sone,
Tanaka, & Hino, 1994). Se estima que aproximadamente la mitad de los pacientes
severamente afectados controla esfínteres, pero desarrollan enuresis y encopresis a
medida que progresa la enfermedad(Martin et al., 2008).
Fenotipos de MPS II
La MPS II presenta dos fenotipos: uno severo (MPS II A) o neuronopático y el
fenotipo no neuronopático (MPS II B) o atenuado. Sus características e historia
natural se exponen a continuación.
4.5.1. Fenotipo Severo o Neuronopático (MPS II A)
Se caracteriza por retardo mental y se ha descrito que puede ser hasta 3 veces más
frecuente que el fenotipo atenuado (Young, et al., 1982), (Martin, et al., 2008).Los
pacientes con fenotipo neuronopático tienen un inicio temprano de la enfermedad,
exhiben un curso crónico, progresivo y con severo compromiso multiorgánico y del
SNC (Yatziv, et al., 1977), (Jones, et al., 2009).
La enfermedad es indetectable en la edad neonatal. La sintomatología más precoz
es la otitis media (1,2 años de edad en promedio) y la hernia umbilical (1,3 años)
27
(Wraith, Beck, et al., 2008). Sin embargo en un estudio llevado a cabo en Brasil, las
primeras manifestaciones ocurrieron a los 18 meses de edad en promedio (rango
intercuartil 6 – 24 meses), siendo más frecuentemente reportadas macrocefalia,
retraso en el lenguaje y alteraciones de la conducta, en el fenotipo severo. (Schwartz
et al., 2007).
HOS (Hunter Outcome Survey), es un instrumento de seguimiento observacional a
largo plazo, multicéntrico e internacional. Según los registros la media de edad al
diagnóstico es 3 años (rango intercuartil 1.3–8.0 años) (Jones, et al. 2009).
La afectación cardiaca, neurológica y respiratoria son los elementos que generan
más morbimortalidad (Wraith, Beck, et al., 2008), mientras que la obstrucción de la
vía aérea es la causa más frecuente de muerte en pacientes con MPS IIA(J.
Muenzer, 1986).
Según el análisis de HOS realizado por Jones et al., aquellos pacientes con
alteración cognitiva fallecen a edad más temprana, lo cual indica que el compromiso
neurológico se asocia a una menor expectativa de vida(S. A. Jones et al., 2009). La
media edad de muerte para este grupo es de 11,3 años (rango 11.0–19.0 años)(S.
A. Jones, et al., 2009).
4.5.2. Fenotipo Atenuado o No neuronopático (MPS II B)
El fenotipo atenuado o no neuronopático cursa con mínimo o ningún deterioro
cognitivo, aunque los pacientes experimentan todas las complicaciones somáticas
del síndrome (Young & Harper, 1982).
Al igual que la MPS II A, es indetectable en la edad neonatal. A diferencia del
28
fenotipo severo, se reporta una edad de inicio de síntomas mayor para la MPS II
B,de 3,25 años (39 meses, rango intercuartil 9,7- 60 meses) (Swartz, et al., 2007).
Las primeras manifestaciones más frecuentes son anomalías esqueléticas,
contracturas articulares e hipoacusia (Schwartz, et al., 2007).
Los pacientes con fenotipo no neuronopático son generalmente diagnosticados entre
los 4 y 8 años de edad (Jones et al., 2009), inclusive en algunos casos reciben el
diagnóstico bioquímico en edades postbuberales por sintomatología poliartropática y
deformidades esqueléticas (Neufeld& Muenzer, 2001). Tienen una sobrevida mayor
e incluso se han reportado casos con descendencia (DiFerrante & Nichols, 1972).
En relación con la morbilidad, es común el síndrome de túnel carpiano (Wraith,
Scarpa, et al., 2008). Presentan una alta incidencia de alteraciones cardíacas, que
son un importante causa de morbimortalidad (Wraith, Beck, et al., 2008). Según los
registros HOS la edad media de muerte es 14,1 años (en contraste con la más
temprana para el fenotipo A de 11,3 años) (Jones, et al., 2009), pero se reportan
casos de sobrevida hasta la quinta o sexta década (Neufeld & Muenzer, 2001).
Diagnóstico
Criterios clínicos
La presencia de signos y síntomas pueden orientar al diagnóstico, pero en edades
inferiores a un año se debe prestar atención a la forma sutil en que suelen estar
presentes e indagar por ejemplo sobre otitis media a repetición, hernia umbilical y
retraso en el desarrollo del lenguaje(Wraith, Scarpa, et al., 2008).
29
Las MPS representan el 32% de los Errores Innatos del Metabolismo, de ahí la
importancia de las pruebas bioquímicas que detectan la excreción de GAGs y que
pueden orientar al tipo específico de MPS (Neufeld & Muenzer, 2001).
Pruebas cuantitativas para mucopolisacáridos (GAGs) en orina
CPC (Cloruro de cetilpiridinio): El CPC es un compuesto de amonio
cuaternario que se une a los GAGs negativamente cargados precipitándolos.
Sus resultados se expresan en Unidades de CPC/gramo creatinina, cuyo
valor máximo es 262 U/g (DiFerrante, 1967), (Pennock, 1973).
Alcian blue: Es un colorante polivalente catiónico que bajo el mismo principio
del CPC precipita los GAGs. Los resultados se expresan en mgGAG/mol
creatinina y el valor máximo es 21,4mg/mol (Scott & Dorling, 1965),
(Whiteman, 1973).
Albúmina Acida: En esta prueba se precipitan los GAGs en un pH ácido y se
realiza una medición por espectrofotometría. Valores superiores a 0.040 se
consideran indicativos de excreción de GAGs.
Las pruebas cuantitativas no están exentas de error, un estudio de Mahalingam et
al. Reporta falsos positivos de 28% (n=26/91) y falsos negativos de 45%(n=60/219)
(Mahalingam, et al., 2004). Por esto es necesario realizarlas simultáneamente con
las pruebas cualitativas.
Pruebas cualitativas: electroforesis de GAGs
30
Establecer con precisión cuáles GAGs han sido excretados en la orina permite
clasificar al paciente dentro de los tipos de MPS (Leistner & Giugliani, 1998). El
exceso de heparán y dermatán sulfato es indicativo de MPS I, II y VI. Un patrón de
heparán sulfato solo sugiere MPS III, queratán sulfato solo sugiere MPS IV y
dermatan sulfato solo sugiere MPS VI (Neufeld & Muenzer, 2001).
Lo anterior se establece de acuerdo al patrón de migración de GAGs en una
electroforesis en gel de agarosa, aunque se prefiere la cromatografía en capa fina
(Humbel & Chamoles, 1972). La MPS II se caracteriza por la presencia de bandas
de migración correspondientes a dermatán y heparán sulfato, sustratos mayoritarios
de la IDS, aunque algunas veces también se observa algo de condroitín
sulfato(Kimura, Hayashi, & Tsurumi, 1980).
Tamizaje de actividad enzimática en papel de filtro
Una vez el paciente ha sido clasificado con posible diagnóstico de MPSII, se
procede a la medición de actividad enzimática de la Iduronato-2-sulfatasa en papel
de filtro como estudio de pesquisa (Martin, et al., 2008).
La técnica se desarrolló a partir de la necesidad de un alto rendimiento, menores
costos y disminución de las dificultades en el transporte de la muestra, logrando un
tamizaje adecuado y oportuno(Dean, Bockmann, Hopwood, Brooks, & Meikle, 2006).
Dean et al., reportaron falsos negativos del 5% (n=1) en una serie de 19 pacientes
con MPSII. De 64 controles se encontró 1 individuo con baja actividad pero que aún
era el doble del valor de la actividad residual más alta del grupo con MPSII, es decir,
no obtuvieron falsos positivos (Dean et al., 2006).
31
Confirmación del diagnóstico de MPS II
La medición de la actividad enzimática de la Iduronato-2-sulfatasa en plasma, cultivo
de fibroblastos o de leucocitos es la prueba confirmatoria o Gold standard para el
diagnóstico de la MPSII(Martin, et al., 2008).Los pacientes con MPS II presentan
niveles muy bajos o ausencia de actividad de la enzima contra el sustrato artificial
Metilumbeliferil-α-iduronato2-sulfato (Clarke, 2006).
El grupo de Voznyi y colegas fue el primero en desarrollar el ensayo fluorimétrico
en el año 2001, reemplazando así los métodos radioactivos anteriores(Voznyi,
Keulemans, & van Diggelen, 2001).
Para ello aislaron leucocitos a partir de muestras de sangre heparinizada y
cultivaron fibroblastos de piel obtenidos de pacientes con MPS II y controles sanos.
Tras la sonicación de las muestras, tomaron homogenados de 10uL y adicionaron
20uL de 1.25 nmo/L de Metilumbeliferil-α-iduronato2-sulfato en 0,1mol/L de acetato
de sodio a pH 4,8-5,0 e incubando por 4 horas a 37ºC (Voznyi et al., 2001).
La liberación de 4-Metilumeliferona (4MU) requiere la acción secuencial de IDS y la
alpha-iduronidasa, por eso se adiciona en un segundo paso, a un pH 4,5 y se incuba
por 24 horas. No realizar esta segunda incubación da lugar a falsos positivos. La
reacción se detiene llevando la solución a pH de 10,7 (Voznyi et al., 2001).
La reacción final produce sulfato y el fluoróforo 4MU. Los equipos para la medición
de la fluorescencia emplean una fuente de luz con intensidad capaz de excitar el
fluorocromo o fluoróforo de manera que libera fotones, los cuales chocan contra el
sensor. La frecuencia de luz censada es transmitida a la interfase digital que ha sido
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33
otorrinolaringológica, para detectar a tiempo las anomalías y manifestaciones
secundarias con el fin de brindar un tratamiento oportuno (Muenzer et al., 2009)
Es necesaria la corrección quirúrgica de hernias abdominales, así como de tejidos
orofaríngeos hipertróficos y de alteraciones dentales que por su severidad o riesgo lo
ameriten (Muenzer et al., 2009). Durante la anestesia general y la cirugía se debe
prestar especial atención en prevenir la luxación atlanto-odontoidea(Walker et al.,
1994).
En relación con la apnea del sueño se recomienda el uso de dispositivos tipo CPAP
(continous positive airway pressure) (Leighton et al., 2001). Si hay obstrucción
severa y persistente de la vía aérea se debe realizar traqueostomía permanente(J.
Muenzer et al., 2009).
En relación con el sistema neurológico, se indican anticonvulsivantes en caso de
epilepsia. La descompresión quirúrgica del Tunel carpiano tiene buenos resultados
en la mayoría de los pacientes (Norman-Taylor et al., 1995). No menos importantes
son las terapias física, ocupacional y del lenguaje (Muenzer et al., 2009).
4.7.2. Trasplante de médula ósea
Los experimentos de Neufeld en 1968 y de Kaplan en 1977 sentaron evidencia de
que la corrección in vitro de los fibroblastos deficientes se produce por captación de
enzimas lisosomales mediada por receptor. (Kaplan et al., 1977). Bajo este principio,
se realizaron los primeros transplantes de médula ósea alogénico o de células
madre hematopoyéticas (HSCT) en MPS I y VI. (McGovern et al., 1986, Shapiro et
al., 1995, Vellodi et al., 1992).
34
Bergstrom et al. reportaron en 1994 el primer trasplante de alogénico de médula
ósea en un paciente con MPS IIB quien durante 3 años de seguimiento presentó
mejoría en las manifestaciones somáticas de la enfermedad (Bergstrom et al., 1994).
Velodi y colegas trataron 10 pacientes con síndrome de Hunter, de los cuales dos
requirieron un segundo transplante. Dos murieron por sepsis y otros 3 por
enfermedad injerto contra huésped. Sólo tres pacientes sobrevivieron más de 7 años
post-procedimiento. En dos pacientes hubo progresión de la discapacidad física y
mental, mientras que un paciente mantuvo un desarrollo intelectual normal con leve
discapacidad física. Así, el porcentaje de éxito fue de 10%, con un fracaso de 90% y
mortalidad por el procedimiento de 50% (Vellodi et al., 1999).
El mismo estudio concluyó que no hubo mejoría neurológica para pacientes con
fenotipo severo y que el único caso que se benefició del tratamiento correspondía a
MPS IIB. Además la alta tasa de efectos secundarios (enfermedad injerto contra
huésped y sepsis) y la alta mortalidad podía atribuirse al uso de donantes no
relacionados (Vellodi et al., 1999).
Guffon et al., reportaron sobre ocho pacientes que recibieron entre los años 1999-
2000 el trasplante de médula ósea de donantes HLA-compatibles. La respuesta fue
adecuada, alcanzando 95% de proporción de células de donante después de 1mes
del trasplante, con mejoría en las visceromegalias, en las anomalías cardíacas y en
la rigidez articular. Sin embargo, los síntomas neurológicos tuvieron evolución
variable dependiendo del fenotipo (Guffon et al., 2009).
35
4.7.3. Terapia de reemplazo enzimático
La Terapia de reemplazo enzimático (TRE ó ERT por sus iniciales en inglés)
consiste en la administración intravenosa de la enzima recombinante humana
purificada Idursulfasa (Burrow& Leslie, 2008).
La Idursulfasa (Elaprase®), desarrollada y patentada por el laboratorio Shire®, es
una forma purificada de iduronato-2-sulfatasa producida en la línea celular HT-1080
(células humanas de fibrosarcoma) mediante tecnología de DNA recombinante. La
glicoproteína de 525 aminoácidos contiene 8 sitios de N-glicosilación que están
ocupados por 2-bis manosa-6-fosfato que contiene cadenas de oligosacáridos
(Muenzer et al., 2006).Estos manosa-6-fosfato (M6P) se unen a los receptores de
M6P de la superficie celular, permitiendo la subsiguiente internalización y transporte
a los lisosomas, donde la enzima es catalíticamente activa. La actividad la de
Idursulfasa es dependiente de la modificación postraduccional de la cisteína a C-
formilglicina dentro del sitio activo dela enzima. Esta modificación se demostró en
50% de las moléculas de la Idursulfasa (Muenzer et al., 2006). La molécula también
contiene glicanos complejos, altamente sialilados, que prolongan la vida media en
circulación (Muenzer et al., 2006).
García y sus colegas estudiaron los efectos de la Idursulfasa en un modelo de ratón
knock out (IDS-KO) (Muenzer et al., 2002). Realizaron infusiones en varias dosis
(0,1, 0,25, 0,5, y 1,0 mg / kg) y diferentes intervalos (una vez, semanal, cada dos
semanas, y mensual), lo cual resultó en una reducción de los niveles de GAGs en
orina y tejidos. Luego, los estudios de seguridad en monos Cynomolgus fueron
36
favorables, permitiendo continuar hacia la fase de ensayos clínicos en pacientes con
síndrome de Hunter (Muenzer et al., 2002).
La seguridad y eficacia de idursulfasa se evaluó en un ensayo clínico controlado
aleatorizado, doble ciego, contra placebo, de fase I / II (Muenzer et al., 2006). En
este estudio participaron 12 pacientes, en edades entre 6 y 20 años, sin incluir
aquellos severamente afectados. Las características del ensayo clínico controlado
se resumen en la tabla 2 (Glamuzina et al., 2011).
Tabla 2. Resumen del diseño de estudio y selección de pacientes para los ensayos
clínicos fase I/II y II/III
Fase I/II Fase II/ III
Número 12 pacientes 96 pacientes
Criterios de
inclusión
Edad >5 años, talla 119-151cm,
en capacidad de cooperar.
Diagnóstico clínico de MPSII
Edad 5-31 años, talla 122-130,6
cm. En capacidad de realizar
pruebas de función pulmonar,
FVC<80%
Diagnóstico clínico de MPSII
Criterios de
exclusión
Traqueostomía, Transplante de
médula ósea o severo
compromiso de SNC
Diseño del
estudio
6 meses placebo vs 0,15-0,5-1,5
mg/kg/semana de idursulfase
Estudio controlado aleatorizado
doble-ciego contra placebo
53 semanas con tres brazos:
Placebo vs idursulfase 0,5 mg/kg
quincenal vs igual dosis semanal
Estudio controlado aleatorizado
doble-ciego contra placebo
Puntos de
evaluación
primarios
% de cambio de GAG:Cr urinarios
desde línea de base y a las 5, 13
y 25 semanas
Score compuesto:
Test de marcha de 6 minutos
desde línea de base y %FVC
predicho.
Puntos de Ecocardiograma, distancia en el Cambios en: test de marcha,
37
evaluación
secundarios
test de marcha, función pulmonar,
MRI, arcos de movilidad de
articulaciones, polisomnografía,
tamaño de hígado y bazo medido
por MRI.
%FVC, volúmenes de hígado y
bazo por MRI, GAG:Cr, arcos de
movilidad articular.
FVC, capacidad vital forzada
Los resultados de la fase I/II se evaluaron a las 48 semanas de tratamiento. La
excreción urinaria de GAGs se redujo en 2 semanas de iniciar Idursulfasa, y
continuó siendo significativamente reducida después de 48 semanas de tratamiento
(p < 0,0001). La mayoría de los pacientes experimentaron reducciones de GAGs en
orina cerca de los niveles normales. El volumen de hígado y bazo se redujo
significativamente a las 24 y 48 semanas de tratamiento (p<0,01y p <0,001,
respectivamente). Sesenta y seis por ciento de los individuos con hepatomegalia y
todos los individuos con esplenomegalia experimentaron una normalización de los
volúmenes de estos órganos. La distancia de marcha aumentó en un promedio de
48 m(P <0,013) (Burrow & Leslie, 2008).
La fase II/III (Tabla 2) fue evaluada a las 53 semanas de tratamiento (Muenzer et al.,
2006). Los dos grupos de tratamiento con Idursulfasa exhibieron una mejoría
significativa en la variable combinada (marcha y FVC) contra placebo (p = 0,0049 yp
= 0,0416, respectivamente). Sin embargo, no hubo diferencias entre los dos grupos
de tratamiento. El grupo idursulfasa-semanal experimentó un incremento de 37 m de
distancia recorrida en la prueba de caminata de 6 minutos (p = 0,013) en
comparación con placebo. Además, el grupo idursulfasa-semanal experimentó un
38
aumento del 2,7% en% del valor de la CVF (p = 0,065) y un aumento de 160 ml en
absoluto CVF (p = 0,001) contra placebo (Muenzer et al., 2006)
Después de 53 semanas de tratamiento, los niveles de GAGs en orina disminuyeron
significativamente en ambos grupos de tratamiento contra placebo (p <0,0001). El
40,6% de los individuos experimentaron normalización de los niveles de GAGs en la
orina, mientras que en la mayoría de los pacientes estos niveles se aproximaron el
extremo superior de lo normal. El volumen del hígado y del bazo disminuyó
significativamente desde el inicio, en comparación con placebo (p <0,0001).
Aproximadamente el 80% de individuos con hepatomegalia que recibieron
tratamiento con idursulfasa (semanal y cada dos semanas) tenían volúmenes
normales del hígado después de 18 y 53 semanas de tratamiento (Muenzer et al.,
2006) (Burrow et al., 2008).
La FDA aprobó su uso en Julio de 2006. Se recomienda iniciar ERT en el curso
temprano de la enfermedad, sin embargo, dado que su paso a través de la barrera
hematoencefálica es errático, no se espera mejoría en relación con el compromiso
neurológico(Wraith, Scarpa, et al., 2008).
Con relación a la Farmacocinética, la concentración sérica de idursulfasa se ha
cuantificado usando un ensayo ELISA antígeno-específico. El área bajo la curva de
concentración-tiempo (AUC) aumentó de manera proporcional a la dosis cuando
esta se incrementó de 0,15 mg / kg a 1,5 mg/kg después de 1 hora de infusión de
Elaprase. (Muenzer et al., 2006). La vida media es de 44 +/-19 minutos su
39
eliminación es renal con un aclaramiento de 3 – 3,4 mL/min/kg (DrugBank
Database).
La dosis inicial recomendada es de 0,5 mg/kg administrados en infusión semanal. La
tasa inicial de infusión recomendada es de 8 ml/h durante los primeros 15 minutos,
que se puede aumentar en 8ml/hr a intervalos de 15 minutos para restringir la
aparición de reacciones adversas, a un máximo de 100 ml / hr. La duración total de
infusión es generalmente 1-3 horas, y no debe exceder de 8 horas. Las infusiones
pueden administrarse lentas, detenerlas temporalmente o interrumpirlas si se
producen reacciones a la infusión.
Las reacciones adversas que se pueden presentar son:
Cefalea (59-66%)
Nasofaringitis (53-59%)
Dolor abdominal (50-59%)
Artralgias (31-44%)
Prurito (19-31%)
Rash o Urticaria (16%)
Dispepsia (13%)
Ansiedad (6-13%)
Dolor torácico (13%)
Además, Elaprase se pueden causar reacciones anafilactoides en algunos pacientes
durante las infusiones. (Muenzer et al., 2006).
Anticuerpos IgG contra idursulfasa se detectaron en aproximadamente el 50% de los
pacientes después de 27 semanas de tratamiento. Sin embargo, sólo el 31,7% de
40
los pacientes mantiene positivos los anticuerpos después de 53 semanas de
tratamiento. No se ha informado sobre asociación alguna entre la presencia de
anticuerpos y los eventos adversos o las evaluaciones clínicas. (Muenzer et al.,
2006).
4.7.4. Administración intratecal de Idursulfasa
La Idursulfasa en su administración intravenosa no atraviesa la barrera
hematoencefálica y por ende no corrige las alteraciones del SNC en el fenotipo
severo de MPS II (Wraith, Scarpa, et al., 2008). La administración intratecal de la
enzima es un abordaje lógico que se ha ensayado con anterioridad en modelos
animales de otras Enfermedades de Depósito Lisosomal incluyendo MPSIIIA
(Hemsley et al., 2007) y MPS I (Kakkis et al., 2004).
La administración intratecal (IT) de Idursulfase en el ratón knock out de MPSII
resultó en mejoría del patrón histológico neuronal (Calias et al., 2010) al igual que en
perros Beagle (Calias et al., 2010)y por último en monos Cynomolgus (Felice et al.,
2011).
Una vez demostrada la seguridad de la idursulfase IT en monos Cynomolgus se
autorizó el ensayo clínico en humanos (Felice et al., 2011). Desde el año 2012 se dio
inicio a la fase de reclutamiento de pacientes con MPSII neuronopático al estudio,
con una versión modificada de la enzima recombinante para su administración IT
(Joseph Muenzer).
4.7.5. Terapia génica
41
El primer ensayo enfocado en corregir directamente el defecto genético en células
MPS II fue realizado Stroncek y colegas en 1999. Emplearon el vector retroviral
LS2N con el gen IDS incorporado con el fin de transfectar linfocitos cultivados
obtenidos de sangre periférica de pacientes MPS II, pero la proporción de células
que al final expresó IDS fue sólo 2.5% (Stroncek et al., 1999).
Cardone et al., reportaron el efecto de la terapia génica por medio del vector viral
adeno-asociado 2/8 recombinante (AAV2/8), el cual poseía un promotor específico
para su expresión en tejido hepático. Emplearon un modelo de ratón knockout con
deleción de exones 4 y 5 del gen IDS, y posterior a la administración del vector
recombinante observaron completo aclaramiento de los GAGs en los diferentes
órganos excepto en cerebro, donde el efecto fue parcial (Cardone et al., 2006).
Corradi-Perini y colegas realizaron la corrección genética de Células Madre
Mesenquimales (hMSC) obtenidas a partir de pacientes con MPS II empleando un
vector retroviral. Dichas células produjeron la corrección cruzada de fibroblastos
afectados in vitro. Esta técnica podría representar ventajas para transplante de
pacientes, empleando hMSC del mismo paciente y evitando así análisis de
histocompatibilidad con donantes (Corradi-Perini et al., 2008).
Jung et al. administraron AAV2/8 conteniendo el gen IDS a un nuevo modelo de
ratón knockout adulto observando mejoría de la actividad de la IDS. Dicho vector
poseía un promotor para expresión del gen en fibroblastos, células linfoides y otros
tejidos; sin embargo en cerebro la expresión fue deficiente. Concluyeron que este
vector podría ofrecer ventajas para estudios de terapia génica en pacientes con MPS
II, debido a su bajo potencial inmunogénico, su capacidad de entrar aún en células
42
que no estén en división e integrarse en un único sitio del genoma de su célula
huésped(Jung et al., 2010).
Otros ensayos en modelos animales
La IDS ha sido rediseñada como una proteína de fusión IgG-sulfatasa para lograr su
ingreso al SNC en un modelo de mono Rhesus. Dicha proteína de fusión posee un
anticuerpo monoclonal contra el receptor de insulina humana que se comporta como
un caballo de Troya molecular para su paso a través de la barrera hematoencefálica
(Lu et al., 2011).
4.7.6. Herramientas de prevención y diagnóstico temprano
El diagnóstico genético preimplantacional (PGD) permite la identificación de
embriones afectados antes de la implantación. Altarescu et al. presentaron el caso
de tres familias cuyas mujeres portadoras de mutaciones en el gen IDS fueron
sometidas a PGD. Realizaron el análisis genético en 1 ó 2 células de los
blastómeros por medio de seis marcadores microsatélites polimórficos. El resultado
final en todos los casos fue de neonatos sanos. Adicionalmente, este mismo grupo
desarrolló una línea de células madre embrionarias Hunter 46,XX la cual proponen
puede ser utilizada para ensayo de fármacos y en el estudio más detallado de la
patogénesis de este síndrome(Altarescu et al., 2011).
Se debe realizar una tamización en el recién nacido de alto riesgo (con antecedente
familiar de MPS II) si se desconoce el diagnóstico molecular de la gestante. Wolfe et
al. proponen el uso de espectrometría de masas en tándem (MS/MS) para medir la
actividad de IDS en neonatos a partir de manchas secas de sangre, empleando
43
como sustrato umbeliferyl-alfa-L-idurónido-2-sulfato cuya hidrólisis genera un
producto no sulfatado que es detectado por MSMS con ionización por electrospray y
se cuantifica con un estándar interno marcado con deuterio. Esta metodología sería
realizable a gran escala para tamización de MPSII(Wolfe et al., 2011).
Se han adelantado otros esfuerzos por detectar la MPS II precozmente a partir de
tejido placentario obtenido al nacimiento, hallando una discreta acumulación de
GAGs en algunas células endoteliales y pericitos (mas no en fibroblastos). Esto sin
embargo requiere confirmación con estudios que involucren un número razonable de
pacientes (Baldo et al., 2011).
Genética de la MPS II
El gen que codifica la IDS, clonado por primera vez por Wilson y colegas (Wilson et
al., 1990) está localizado en Xq27.3-q28. Mide cerca de 24Kb y consta de 9 exones
(Figura 1).
La localización exacta del gen en el cromosoma X es 148, 558, 521-148, 615, 470,
en la hebra antiparalela (ensembl.org). Presenta dos variables alélicas y se han
reportado 20 SNPs (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp_ref.cgi?locusId=3423).
La longitud del transcripto primario es de 7619pb. El splicing alternativo del mRNA
genera 10 transcriptos más, de los cuales 6se traducen en proteína (ensembl.org),
(Malmgren et al., 1995). Las diferencias entre los 11 transcriptos de IDS se observan
en la Tabla 3.
Tabla 3. Transcriptos del gen IDS.
44
Nombre Exones (codificantes)
Longitud (bp)
Longitud proteína (aa)
Biotipo
IDS-001 9 (9) 7619 550 codificante
IDS-004 8 (8) 1399 343 codificante
IDS-203 5 (4) 2635 339 codificante
IDS-002 3 (2) 1213 179 codificante
IDS-201 7 (4) 1156 312 codificante
IDS-202 2 (1) 1032 153 codificante
IDS-008 7 (1) 572 86 codificante
IDS-003 9 (5) 1529 312 Declinación mediada por mutación nonsense*
IDS-005 8 ( 3) 959 106 Declinación mediada por mutación nonsense*
IDS-006 7 (0) 945 - No codificante
IDS-007 3 (0) 537 - No codificante
*Se postula que estos transcriptos pasan por un sistema de detección de mutaciones missense que previene expresión de proteínas truncadas o erróneas
A. B.
45
Figura 1. A. Posición de los exones en el gen IDS.B. Presencia del Pseudogén
(IDSP1) corriente abajo, en orientación contraria al gen. C. Esquema en detalle de la
organización de IDSP1, precedido por la región LOC 7277913 con las regiones
homólogas a exones 2 y 3 e intrón 2 del IDS; LCR (low copy repeat) homólogo al
intrón 7. Regiones CXorf40A y repeticiones L1-Alu-L1 también están implicadas en
recombinaciones con el gen (modificado a partir de esquemas de Timms et al., 1997
y de Oshima et al., 2011)
Existe un pseudogén (IDSP1) localizado a ~25kb en dirección telomérica al gen,
documentado por primera vez por Rathmann y colegas en 1995 (Genbank-EMBL
AF011889.1)(Rathmann, et al., 1995).Consta de aproximadamente 1.6kb y su
orientación es inversa al gen. Posee regiones homólogas al exón 2, intrón 2 y exón 3
del IDS, además de una región que tiene 96% de homología con el intrón 7. Esta
últimaes una repetición de bajo número de copia (LCR)y se encuentra en forma de
intrón quimérico 3-7(Figura 1).
La presencia delIDSP1favorece rearreglos complejos, que imponen un reto durante
el análisis mutacional de los pacientes con Síndrome de Hunter (Bondeson,
Malmgren, Dahl, Carlberg, & Pettersson, 1995).Entre estos han descrito inversiones,
46
grandes duplicaciones, grandes deleciones y eventos de conversión (Bondeson et
al., 1995) (Lagerstedt et al., 1997) (Bunge et al., 1998), (Lualdi et al., 2005).
Un evento de conversión genera un gen IDS que contiene regiones recombinantes
con IDSP1 en los intrones 3 y 7. Una timina en la posición 292879 es el punto de
ruptura en el intrón 3 que es reemplazado por citosina del intrón quimérico 3-7. De
esta manera se yuxtapone también el intrón 7 con su homólogo del IDSP1 y por
medio de recombinación no recíproca se producen las regiones recombinantes en
los intrones 3 y 7 pero sin alterar los exones en IDS. La secuenciación directa de los
exones no puede detectar esta anormalidad (Birot et al., 1996), (Lualdi et al., 2005).
Adicionalmente otras regiones en las proximidades del gen y pseudogen como
CXorf40A y repeticiones Alu (Figura 1) se han visto implicadas en procesos de
recombinación (Oshima et al., 2011).
4.8.1. Epidemiología genética
A la fecha han sido descritas más de 350 mutaciones en el IDS (The Human
Mutation Gene Database http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php).Hay escasos
reportes de mutaciones recurrentes (Froissart et al., 2002; Rathmann et al., 1996;
Timms et al, 1997; Wilson et al., 1991; Vafiadaki et al., 1998; Lualdi et al., 2005;
Lagerstedt et al., 2000),por lo que se hace indispensable el abordaje de
secuenciación total del gen (J. Muenzer et al., 2012).
En cuanto a los tipos de mutaciones y su frecuencia global, se encuentra que el
82,6% corresponden a pequeñas alteraciones (Froissart, Da Silva& Maire, 2007). En
orden de mayor a menor magnitud dicho grupo comprende mutaciones puntuales –
missense y nonsense- (54,9%), pequeñas deleciones/inserciones (17,4%) y
47
mutaciones en sitios de splicing (10,3%). Las grandes alteraciones génicas y
rearreglos complejos representan un 17,4% (Froissart, Da Silva, & Maire, 2007).
En población Caucásica y de Japón se ha documentado una mayor frecuencia de
mutaciones en los exones 9, 3 y 8(Gort, Chabas, & Coll, 1998), (Froissart et al.,
1998), (Isogai et al., 1998). Un estudio de China que incluyó 38 pacientes con MPS
IIencontró además una importante frecuencia de mutaciones en el exón 2 (Zhang et
al., 2011), mientras que en Corea se encontraron con frecuencia mutaciones en los
exones 5 y 6 (Sohn et al., 2011).
Con relación a América Latina, el estudio de Liessens y colegas encontró en 4
pacientes de Argentina mutaciones en sitios del splicing en los exones 5 y 8, la
mutación S132W en el exón 3 y la mutación R468Q en el exón 9 (Liessens et al.,
1996). En Brasil, Swartz y colegas reportaron las mutaciones M488I y G498A en un
paciente fenotipo neuronopático, mientras que Quaio et al. reportaron la mutación
S77D (exón 2) en una familia con casos de fenotipo atenuado (Quaio et al., 2012), y
Brusius-Facchin et al. reportaron una gran deleción del gen IDS que involucraba
además los genes contiguos FRAXA y FRAXE en tres pacientes con fenotipo severo
(Brusius-Facchin et al., 2012).
4.8.2. Correlación genotipo – fenotipo
Debido a que el fenotipo algunas veces puede ser confuso, se requiere de
metodologías de laboratorio que puedan predecir el desarrollo de la enfermedad,
justo antes que las complicaciones aparezcan. El ensayo enzimático para Iduronato
2 Sulfatasa por sí solo no es suficiente para predecir la severidad de la MPS II, por lo
48
que se requiere de otras metodologías para este fin(Parkinson, Muller, Hopwood, &
Brooks, 2004).
En el caso de algunas MPS, determinadas mutaciones pueden colaborar en la
clasificación de los distintos subtipos, sin embargo en MPS II es más complicado.
Aunque la mayoría de las mutaciones para Hunter son puntuales, un gran porcentaje
de las mismas son privadas y en ellas no es posible la realización de correlaciones
genotipo-fenotipo (Moreira da Silva et al., 2001).
En términos generales con relación a las correlaciones genotipo fenotipo gran parte
de los autores postulan que:
Alteraciones genómicas a gran escala, deleciones totales (gen y pseudogen),
deleciones parciales, rearreglos gen pseudogen, y pequeñas deleciones o
inserciones que alteren el marco de lectura, están asociadas a un fenotipo
severo (Froissart, et al., 2007). A continuación se presentan ejemplos
destacados:
Las deleciones 1220delTT, 1269insCC, 383delAT, 596delAACA,
1148delC, 1063inscambian el marco de lectura y producen codones de
parada prematuros, todas identificadas en fenotipo severo (Li et al., 1999).
Froissart et al. en 2007 documentaron 21 pacientes con este mismo
fenotipo con deleciones R96del, S117del, T118del, R433_G435del,
S464_Y466del (Froissart et al., 2007).
Inversiones por fenómenos de recombinación fueron reportadas por
Lagerstedt et al., 1997 en un paciente, Alves et al. en un paciente y por
Lualdi et al. en 5 pacientes; todos presentaban fenotipo neuronopático.
49
En una serie de 155 pacientes europeos, se identificaron
inversiones/disrupciones en nueve pacientes (n=9), deleciones parciales
del gen (n=6), deleción total del gen (n=6), deleción de exones 4-7 (n=5)y
un caso con una gran inserción (kb) involucrando el IDSP1. Todos ellos
correspondían a MPS IIA (Froissart et al., 2007)
En una serie de 49 pacientes de Corea del Sur, todos aquellos con
recombinaciones IDS/IDSP1(n=9) tenían fenotipo severo (Sohn et al.,
2012).
Pacientes con síntomas atípicos como ptosis palpebral, progresión más
rápida semejante a un fenotipo Hurleriano y convulsiones pueden tener
deleciones a gran escala incluso afectando el gen FMR2(Probst et al., 2007).
Mutaciones missense y en sitios de splicing pueden tener efectos variables
en la actividad catalítica de la enzima, lo cual aunado a la baja frecuencia de
mutaciones recurrentes complica la correlación fenotípica (Barrager &
Cabrera, 2007).
La mutación A85T se ha encontrado tanto en fenotipo severo como
atenuado, lo cual sugiere variaciones en la transcripción o la influencia de
otros factores (Froissart et al., 2007).
Las mutaciones de splicing c.104−2A>G, c.241−2A>G, c.241−1G>A,
c.418+1G>A, c.880−8A>G dan lugar a proteínas truncadas y se han
reportado en relación con fenotipo severo (Alves et al., 2006).
La mutación c.1122 C>T (G374G) crea un sitio donador de splicing en el
exón 5 dando lugar a pérdida de 60 nucleótidos exónicos pero de manera
contradictoria conserva actividad catalítica residual (MPS IIB); similar
50
ocurre con c.542 A>T (N181I), encontrándose en fenotipo atenuado
(Froissart et al., 2007).
Mutaciones nonsense generalmente se asocian con fenotipo severo: Y234X,
E254X, Q298X, Y348X, G365X, Q396X, L482X, W502X, E521X (Froissart et
al., 2007) y Q465X (Alves et al., 2006). Como excepciones se encuentran
E177X yW475X, asociadas con fenotipo atenuado, y R443X identificada en
ambos fenotipos, severo y atenuado (Sukegawa et al., 1995), (Rathmann et
al., 1996), (Isogai et al., 1998).
4.8.3. Herramientas de diagnóstico molecular
La primera aproximación al diagnóstico molecular de la MPS II fue inmediata a la
clonación e identificación del gen. Mediante endonucleasas de restricción, Southern
blot y secuenciación directa por dideoxiterminadores (método de Sanger),fue posible
identificar grandes deleciones o rearreglos del gen(Wilson, et al., 1991), (Steén-
Bondeson et al., 1992) y en dos pacientes se documentó la deleción completa del
IDS(Wraith, et al., 1991).
Flomen et al. en Inglaterra, y simultáneamente Bunge et al. en Alemania
implementaron la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) más secuenciación de
Sanger, demostrando así las ventajas de esta metodología para la detección de
mutaciones puntuales (Flomen et al., 1992), (Bunge et al., 1992).
Oshima et al. emplearon MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification)
en el estudio de dos pacientes, uno de los cuales tenía MPSIIA (del segundo no hay
datos clínicos). Esta técnica presenta la ventaja de detectar duplicaciones, las cuales
no son detectables por secuenciación. En el primer caso se evidenció una
51
duplicación de ~49kb de la región distal al gen y en el segundo caso una gran
deleción que involucraba los exones 1 a 7; estos resultados fueron también
reproducibles por Hibridación Genómica Comparativa por Array. A partir de estos
hallazgos se plantearon los posibles mecanismos que generaron estos rearreglos
complejos, hallando los puntos de ruptura por PCR Primer Walking seguido de
secuenciación de los amplicones obtenidos(Oshima et al., 2011).
Wei et al.realizaron el estudio molecular de un paciente de origen chino por medio
de secuenciación masiva (next-generation sequencing) dirigida a los genes IDS e
IDUA (alfa L iduronidasa); estos genes fueron captados específicamente usando la
tecnología de chip de hibridación seguido de secuenciación por HiSeq2000
(Illumina®) generando así lecturas de 90pb. El análisis computacional resultado del
ensamblaje evidenció una mutación candidata en el gen IDS: una deleción en el
exón 9 (c.1270delG) cuya repercusión es un codón de parada prematuro y por
consiguiente una proteína truncada (se confirmó dicha mutación por secuenciación
de Sanger)(Wei et al., 2011).
Si bien hasta el momento hay escasos reportes de mujeres con Síndrome de Hunter,
se ha encontrado que pueden desarrollar la enfermedad si presentan una
inactivación sesgada del cromosoma X y la mutación se encuentra en el X
activo(Zhang et al., 2011). El Ensayo de Inactivación del Receptor de Andrógenos
(Kubotta et al., 1999) permite conocer cuál es la proporción de inactivación entre los
cromosomas X de origen materno y paterno. Dicho ensayo emplea enzimas de
restricción que cortan en sitios del gen activo pero no en el alelo inactivo (metilado),
se cuantifica la señal obtenida y se califica como sesgada una relación de 80:20 o
52
mayor. De esta manera se ha dilucidado la causa de la enfermedad en heterocigotas
(Kloska, Jakobkiewicz-Banecka, Tylki-Szymanska, Czartoryska, & Wegrzyn, 2011).
Proteómica y biología celular de la IDS
3.1.1. Estructura y función de la Iduronato 2 sulfatasa (IDS)
La Iduronato-2-sulfatasa humana (IDS) es una enzima lisosomal, monomérica, que
hace parte de la superfamilia de las sulfatasas, cuyos dominios son altamente
conservados no solo en una misma especie, sino también entre especies diferentes
(Diez-Roux & Ballabio, 2005).
La secuencia de aminoácidos de IDS corresponde a la traducción conceptual de
cDNA, reportada por Wilson et al.(Wilson, Meaney, Hopwood, & Morris, 1993). La
secuencia canónica de 550 aminoácidos corresponde a la isoforma1 (Tabla 3). La
isoforma 2 producida por splicing alternativo consta de 343 aminoácidos y el cambio
WALGEHG → FLMRTNT en el extremo C-terminal. Si bien el splicing alternativo
puede generar otras isoformas, falta evidencia experimental de dichas proteínas
(Malmgren et al., 1995).
Dado que la caracterización completa de la enzima está aún en desarrollo y que su
estructura no ha sido aún resuelta por cristalografía de rayos X, gran parte de la
información sobre su estructura y función se ha inferido por homología con otras
sulfatasas mejor caracterizadas(Miech, Dierks, Selmer, von Figura, & Schmidt,
1998). Los aminoácidos conservados en la IDS son Cys84, Pro86, Ser87, Arg88,
Val89, Ser90, Phe91, Leu (Met)92, Thr93, Gly94 y Arg (Lys/Leu)95 (los posibles
53
cambios en otras sulfatasas se indican entre paréntesis)(Dierks, Lecca,
Schlotterhose, Schmidt, & von Figura, 1999).
Posee un péptido señal de 25 aminoácidos seguido de 8 aminoácidos que son
removidos de la proproteína durante su procesamiento postraduccional, y además
ocho potenciales sitios de glicosilación (motivos NXS/T) en las posiciones 31, 115,
144, 246, 280, 325, 513 y 537. Estudios de expresión han mostrado que todos estos
sitios pueden ser utilizados y que no existe uno en particular que sea esencial para
la estabilidad de la IDS, aunque el sitio de N-glicosilación en la posición 280 es
importante para el transporte al lisosoma (Millat, Froissart, Maire, & Bozon, 1997).
La proteína monomérica está compuesta por dos dominios: un pequeño dominio C-
terminal y un gran dominio N-terminal que pertenece a la clase de proteínas α/β el
cual contiene el sitio activo. El sitio activo de IDS se caracteriza por poseer un catión
divalente (Calcio) y residuos críticos con mecanismos catalíticos que resuelven la
estructura intermediaria enzima-éster sulfato. Los aminoácidos presentes en el sitio
catalítico se predice son Asp45, Asp46, Cys84, Asp334 e His335, por homología
con el sitio activo de las Arilsulfatasas A y B (Dierks, et al., 1999),(Waldow, Schmidt,
Dierks, von Bulow, & von Figura, 1999). El residuo Cys84 se encuentra conservado
en todas las sulfatasas eucariotas y en la mayoría de sulfatasas procariotas (Dierks
et al., 1999).
Función de la IDS
El primer paso en la degradación de los GAGs dermatán (DS) y heparán sulfato
(HS) consiste en la remoción de los motivos 2-O sulfato del ácido urónico que forma
54
parte estos GAGs. Esta reacción es llevada a cabo en los humanos por la Iduronato-
2-sulfatasa. Al igual que las demás sulfatasas, la IDS requiere de un residuo de
Formilglicina (FGly) para ser catalíticamente activa. La formación de FGly es
resultado de la oxidación deCys84 por la enzima generadora de formilglicina, en el
retículo endoplasmático (Roeser et al., 2006).
Los pasos de la reacción llevada a cabo en el sitio activo se han establecido por
homología y aún no están del todo esclarecidos. Los aminoácidos del sitio catalítico
Asp45, Asp46, Asp334 e His335 poseen cargas positivas que hacen posible la
interacción con el sustrato, cargado negativamente. El residuo de FGly es clave en
la hidrólisis del O-2-sulfato del ácido urónico, el cual en DS corresponde al Acido L-
idurónico (IdoA) y en el caso del HS es Ácido Glucurónico (GlcA). El paso
intermediario es la formación de un enlace éster-sulfato, el cual es resuelto con la
participación de calcio como cofactor (Bond et al., 1997). Al final de la reacción se
libera SO4– y agua (Voznyi et al., 2001).
55
Figura 2. Pasos en la degradación de GAGs. Esquema modificado de Neufeld y
Muenzer de acuerdo a los hallazgos de su trabajo y el de Lawrence et al.
3.1.2. Procesamiento diferencial de IDS
Distintas formas moleculares de la IDS han sido reportadas en los diferentes tejidos
humanos, reflejando un procesamiento diferencial de la enzima. A partir de hígado
Bielicki et al. Purificaron la IDS encontrando dos formas de la enzima, de 42 y de
14kDa. Ambas formas mostraron ser activas contra sustratos derivados de heparina
56
y DS. En riñón, placenta y cerebro se detectó la forma de 42kDa (Bielicki et al,
1990).
En fibroblastos humanos, un precursor de 76 kDa es convertido en un precursor
fosforilado de 90kDa. Este precursor excretado al medio extracelular para luego ser
endocitado a través de la vía manosa-6fosfato. Pasa al aparato de Golgi donde, tras
la modificación de sus cadenas de oligosacárido, es procesado por escisión
proteolítica en pasos sucesivos hasta un intermediario mayor de 55kDa, con la
liberación de un polipéptido de 18kDa. Una tiol-proteasa realiza una última
proteólisis generando la forma madura de 45kDa, la cual contiene complejas
cadenas de oligosacáridos (principalmente glicanos ricos en manosa) (Froissart et
al., 1995).
4.9.3. Fisiopatología de la MPS II.
Desde los inicios del estudio de la MPSII, quedó claro que la acumulación de GAGs
es el principal responsable de las características clínicas del síndrome. Desde 1976
se reportaron los cambios vacuolares citoplasmáticos en hepatocitos, células
epiteliales del bazo, células foliculares de la tiroides, células de Sertoli, células
cromófobas de la pituitaria y otras células de las meninges, las válvulas cardíacas y
el periostio. El principal GAG acumulado en el hígado es heparán sulfato, mientras
en el riñón el dermatán sulfato(Nagashima et al., 1976).
En las MPS, las vías celulares y bioquímicas secundarias son afectadas por estos
cambios: La acumulación del HS extracelular interfiere con la unión de FGF-2 a su
receptor y altera la transducción de su señal(Pan et al., 2005). Por otro lado, en
modelos animales de MPS se ha reportado la activación de TLR4 (Toll-like
57
Receptor4) y su proteína adaptora MyD88, llevando a una producción aumentada de
citoquinas proinflamatorias (Ausseil et al., 2008), (Simonaro et al., 2008).
En el tejido neuronal se han estudiado los mecanismos fisiopatológicos involucrados
en las Enfermedades de Depósito Lisosomal (LSD) a través de ensayos in vitroy
modelos animales(Bellettato & Scarpa, 2010). Estos procesos van más allá del
depósito de los productos sensibles al defecto enzimático, pues ocurre
simultáneamente la acumulación de diferentes compuestos sin relación con el
defecto primario (Figura 3). En efecto, los gangliósidos GM2 yGM3 se acumulan en
neuronas afectadas en Niemann-Pick tipo C, MPS I, IIIA, IIIB, VII y Mucolipidosis,
pero en vesículas diferentes a las del producto de depósito primario (Walkley et al,.
2004).
En las LSD neuropáticas, las manifestaciones en el SNC son pronunciadas aún
cuando el almacenamiento es menor en el cerebro que en otros órganos, lo cual se
relaciona probablemente con la menor capacidad de regeneración y escasez de vías
metabólicas compensatorias en estas células (Futerman&Van Meer, 2004; Tardy et
al., 2004). Para la mayoría de LSDs (exceptuando por ejemplo, la Enfermedad de
Niemann-Pick) la patología produce más disfunción que pérdida de neuronas
(Santavuori et al., 1973; Walkley & Suzuki, 2004).
Las neuronas afectadas inicialmente exhiben el depósito del sustrato primario,
pudiendo sobrevivir por años mientras continúan secuestrando el material y
desarrollando lentamente cambios en la estructura (Walkley 2007). Las neuronas
muestran principalmente dos tipos de cambios morfológicos: meganeuritas y
esferoides axonales junto con edema somático (Figura 3).
58
Meganeuritas: son enormes ampliaciones del cono axonal que contienen
cuerpos de depósito típicos, que a menudo superan el volumen de pericario
adyacente. Dos clases de meganeuritas han sido reconocidas: (a) espinosa y
cubierto con espinas de tipo dendrítico, expansiones de neuritas y sinapsis, y
(b) lisa, sin ninguna evidencia de espinas dendríticas o nuevas formaciones
sinápticas. Las meganeuritas están asociadas con un aumento en la
expresión del gangliósido GM2 y se ha demostrado que desempeñan un
papel fundamental en la regulación de dendritogénesis en las neuronas
piramidales corticales (Roisen et al., 1981).
Esferoides axonales: son ensanchamientos distales al segmento inicial del
axón. Mientras que las meganeuritas contienen el sustrato primario, los
esferoides axonales contienen una variedad diferente de materiales con
características ultraestructurales que son semejantes a muchos tipos de LSDs
(Walkley, 1998). En el cono axonal también pueden surgir nuevas dendritas
(dentritogénesis ectópica), generando sinapsis asimétricas potencialmente
perjudiciales para la función de la neurona (Walkley y marzo de 1993). Los
esferoides pueden causar una interferencia significativa con la eficacia o el
tiempo de propagación del potencial de acción (March et al., 1997; Walkley et
al., 1991.). Además, se ha demostrado que los esferoides pueden inducir en
un bloqueo en la señalización lisosomal que transporta el complejo Factor de
Crecimiento-Receptor, crucial para la vida celular –esto explicaría la muerte
temprana de las células de Purkinje- (Walkley, 2004).
59
Figura 3. Cambios secundarios en las neuronas encontrados en enfermedades de
depósito lisosomal. (Bellettato & Scarpa, 2010).
El transporte axonal retrógrado es un importante mecanismo de recaptación de los
gangliósidos GM2 y GM3 por medio del endosoma de las terminales axónicas, para
ser reciclados (Walkley, 2009). En LSDs se plantea que los cuerpos de depósito en
el axón no permiten la fusión lisosoma-endosoma necesaria para la acidificación de
este último, alterando el transporte axonal retrógrado (Jeyakumar et al., 2005).
La autofagia en las neuronas es esencial para la supervivencia, puesto que
proteínas anómalas o agregadas y organelos disfuncionales pueden ser eliminados
por este sistema (Tooze & Schiavo, 2008). Se ha demostrado en modelos animales
de MPSIV que la autofagia se encuentra comprometida, ocasionando acumulación
60
de proteínas poliubiquitinadas y mitocondrias disfuncionales (Ballabio & Gieselmann,
2009; Tessitore et al., 2009).
Están reportadas ciertas anormalidades mitocondriales comunes a distintas LSDs
(grandes mitocondrias y acumulación de la subunidad C de la ATP sintasa). Las
neuronas son ricas en mitocondrias y son más sensibles que otros tipos celulares, a
su funcionamiento anormal (Lucke et al., 2004). Adicionalmente, las ineficientes
redes antioxidantes promueven la elevación de especies reactivas de oxígeno
(ROS), produciéndose estrés oxidativo y depleción de calcio del RE. Esta elevación
del calcio citoplasmático puede activar la UPR (Unfolded Protein Response) y vías
apoptóticas mediadas por C-aspasa1 (Breckenridge, 2003; Feng, 2003).
A la homeostasis alterada del Calcio, cuya elevación citoplasmática es neurotóxica
(Berridge et al., 2003), se suma la del Hierro, similar a lo hallado en enfermedad de
Parkinson y Alzheimer. El hierro en el cerebro juega un importante papel (formación
de mielina, producción de neurotransmisores como dopamina, norepinefrina,
serotonina y en la actividad gabaérgica) (Moos & Morgan, 2004). El material
extralisosomal depositado también altera los lípidos de membrana (Futermann &
vanMeer, 2004).
La inflamación en el SNC es la consecuencia secundaria más prominente y universal
del almacenamiento (Jeyakumar et al., 2005), debido a la activación del sistema
inmune innato, con células de la microglía y los macrófagos (Wada et al., 2000). La
activación de la microglía en la patogénesis LSDs se evidenció en el cerebro de
modelos de ratones de MPS I (síndromes de Hurler) y MPS IIIB (síndrome de
Sanfilippo tipo B) (Ohmi et al. 2003).
61
Las tauopatías son trastornos neurodegenerativos que tienen en común la
acumulación en las neuronas de proteína tau fosforilada, la misma presente en los
ovillos neurofibrilares característicos de la Enfermedad de Alzheimer (Duyckaerts &
Dickson, 2003). El aumento de proteína tau hiperfosforilada en un modelo de ratón
de síndrome de Sanfilippo tipo B (MPS III B), sugieren que la tauopatía es también
importante en algunos LSDs (Ohmi et al., 2009).
A excepción del SNC, cartílago y hueso, la fisiopatología de las MPS es
predominantemente relacionada con aumento en el tamaño de las células, tejidos y
órganos (Haskins et al., 2002).
Un prominente componente de las válvulas cardíacas es el Dermatán sulfato (Latif et
al., 2005). En el corazón la acumulación de GAGs dentro de las células valvulares
cambia su forma de fusiforme a redondeada, lo cual se refleja en el engrosamiento
de las valvas y cuerdas tendinosas causando estenosis, por lo general con
regurgitación. Comúnmente se han encontrado calcificaciones en la región anular de
la mitral (Yano et al., 2009; Braunlin et al., 2011).
También se ha observado el engrosamiento de la íntima de las arterias coronarias y
de grandes vasos (Oudit et al, 2007; Wraith et al., 2008). Una hipótesis de este
fenómeno es la activación de la vía del receptor Toll-like 4, que lleva a la
sobrerregulación de proteasas e inflamación (Simonaro, 2010)
62
En el hígado, los depósitos de heparán sulfato (HS) son abundantes no sólo en los
lisosomas de hepatocitos, sino también de macrófagos perivasculares y células
hepáticas sinusoidales, según lo observado en un modelo caprino de MPS IIID
(Jones et al., 2004). Por la carga negativa de estos GAGs, móleculas de agua entran
a las células causando gran edema. Se ha reportado fibrosis hepática en otros tipos
de MPS, pero no en MPS II (Walkley, 2009).
Las alteraciones en cartílago son evidentes incluso desde el período embrionario. En
un modelo de zebrafish se demostró mediante hibridación in situ la distribución
anómala de Sox10, Crestina y una significativa inducción de TGFβ como
consecuencia de la subrregulación por IDS, en el cartílago craneofacial en desarrollo
(Moro et al., 2010).
En los condrocitos, similar a lo ocurrido en SNC, la respuesta inflamatoria
desencadenada por el acúmulo de GAGs resulta en apoptosis y liberación de
metaloproteinasas, con consecuencias negativas sobre la placa de crecimiento
endocondral (Simonaro et al., 2005). La desorganización de la placa de crecimiento
ha sido observada en humanos con MPS I y en modelos animales de otras MPS
incluyendo MPS VII (Metcalf et al., 2009).
Durante el remodelamiento óseo normal, el cartílago es reemplazado por
osteoblastos durante el proceso de osificación, proceso en el cual se requiere de
osteoclastos para romper el cartílago. La catepsina K es una cisteín-proteasa que
juega un importante papel en la resorción ósea llevada a cabo por los osteoclastos
(Yasuda et al., 2005).
Li et al. demostraron que DS y HS compiten con el condroitín sulfato formando
complejos alternos con catepsina K que son colagenolíticamente inactivos (Li et al.,
63
2004). Sumado a esto, la vacuolización de los lisosomas en MPS impide el
transporte de los fragmentos de colágeno desde las lagunas de resorción hacia la
membrana apical, todo lo cual desencadena en un proceso anómalo de osificación
(Wilson & Bröme, 2010).
En relación con los tejidos de sostén, se demostró alteración en la vía endosomal-
lisosomal y en la fusión autofagosoma-lisosoma en fibroblastos embrionarios de
ratón con déficit múltiple de sulfatasas (Fraldi et al., 2010). Recientemente, un
estudio in vitro en fibroblastos MPS I, II, IIIA y IVA no evidenció activación de UPR,
sin embargo se observó la sobrerregulación de la proteína disulfuro isomerasa A5
(Pdia5), perteneciente a una familia de chaperonas. Esto explica por qué los
fibroblastos MPS no fueron más sensibles a apoptosis que los fibroblastos normales
64
5. METODOLOGÍA
Tipo de estudio
Descriptivo sin prueba de hipótesis.
Tamaño de muestra
Dieciocho (18) pacientes, colombianos con MPS II.
Ingreso al estudio
El centro de Investigaciones Bioquímicas de la Universidad de los Andes, ACOPEL y
algunos médicos tratantes, brindaron la información socio-demográfica de algunos
pacientes colombianos con MPS II. Ellos nos ayudaron a establecer el contacto con
cada uno de los pacientes y sus familias para invitarlos a participar de manera
voluntaria en este estudio. El paciente o los adultos responsables firmaron el
consentimiento informado, el cual contemplo adicionalmente la autorización para la
disposición futura de la muestra. El estudio fue evaluado y aprobado por el comité de
ética de la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional.
Fase pre analítica
5.1.1. Toma de muestra
Previa aceptación de ingreso al estudio, asentimiento del paciente, asepsia y
antisepsia, se procedió a toma única de muestra de sangre periférica de vena
65
braquial, 7 ml de sangre periférica en un tubo vacutainer de color lila (con
anticoagulante EDTA).
5.4.2. Extracción de DNA
La extracción de DNA genómico se realizó con el kit de extracción UltraClean Blood
DNA Isolation Kit® (MOBIO Laboratories, USA) a partir de una muestra de 300 µl de
sangre, según las instrucciones del fabricante. El DNA obtenido fue cuantificado por
espectrofotometría en un equipo Nanodrop2000®, ThermoScientific®.
Fase analítica
5.1.2. Detección de grandes deleciones y duplicaciones del gen por MLPA
Se empleó la técnica de MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification),
método que detecta números de copia anormal en una secuencia de DNA dada e
incluso distingue entre secuencias que difieren en un solo nucleótido(Schouten et al.,
2002). A todos los pacientes se les realizaron MLPA con la finalidad de detectar
grandes deleciones o duplicaciones de material genético en el IDS, ya que se
reporta en distintas series de pacientes que hasta un 20% presentan rearreglos
complejos caracterizados por este tipo de lesiones(Froissart, et al., 2007).
Para lo anterior se utilizó el kit SALSA® MLPA® P164 IDS, aportado por la
compañía MRC-Holland para esta investigación. Dicho kit consta de 11 sondas para
el gen IDS así como otras sondas para el pseudogen IDSP1 y FMR2, además
66
incluye 8 sondas de referencia que detectan diferentes localizaciones en el
cromosoma X.
MLPA es una forma especial de PCR múltiplex: utiliza dos sondas de
oligonucleótidos que hibridizan con la secuencia blanco en un ciclo inicial, después
se adiciona a la reacción una ligasa que une estos dos oligonucleótidos, uno de los
cuales está marcado con fluorescencia, luego se procede a un nuevo ciclo para la
amplificación específica de las mismas sondas (Figura 4) con un único par de
primers, ya que los extremos 5’ y 3’ de los oligonucleótidos son iguales. Los
productos son separados por electroforesis capilar; las cantidades relativas de los
productos de amplificación de las sondas producen picos de diferente altura que se
comparan con el DNA de referencia.
67
Figura 4. Amplificación de Sonda dependiente de Ligamiento, en Múltiplex (Shouten,
2002)
Esta técnica presenta la ventaja de detectar duplicaciones de material genético, las
cuales no son detectables por secuenciación directa. Además permite la
cuantificación de hasta 40 secuencias diferentes en una sola reacción. Es altamente
sensible (desde 20ng de DNA genómico humano pueden ser empleados) y
reproducible.
El procedimiento de laboratorio se desarrolló según instrucciones del fabricante
siguiendo el nuevo protocolo de 1 tubo, de la siguiente manera:
Día 1, reacción de hibridización.
Paso de denaturación con 5uL de DNA (100ng por reacción), por 5 minutos a
98ºC, en termociclador.
Preparación de master mix: 1,5 ul buffer MLPA y 1,5 uL de probe mix
(sondas) por reacción.
A la muestra de DNA a 25ºC adición de 3uL de master mix, para volumen final
8uL por reacción.
En el termociclador, se continuó incubación 1 minuto 95ºC seguido de 17
horas a 60ºC.
Día 2, reacciones de ligamiento y PCR
Preparación de master-mix Ligasa: 3uL buffer A, 3 uL buffer B, 25 uL de
dH2O y 1 uL de Ligasa-65 por reacción.
En el termociclador se llevaron las muestras a 54ºC y adicionó en este punto
32 uL de mix Ligasa a cada tubo para un volumen final de 40uL.
68
El programa se continuó 15 minutos a 54ºC para la reacción de ligamiento,
seguido de 5 minutos a 98ºC para inactivación de la enzima, luego
mantenimiento de las muestras a 4ºC.
Preparación de master mix para la reacción de PCR con 7,5 uL dH2O, 2uL de
SALSA PCR primer mix y 0,5uL de SALSA polimerasa. Nota: SALSA PCR
primer mix contiene primers marcados con el fluorocromo FAM.
A temperatura ambiente, se adicionaron 10 uL de la mix para PCR a cada
tubo, para un volumen final de 50uL.
Se continuó el programa en termociclador, consistente en 35 ciclos de 30
segundos 95ºC, 30 segundos 60ºC, 1 minuto 72ºC. Finalización 20 minutos a
72ºC y pausa a 15ºC.
Se conservaron las muestras a 4ºC en caja protegida de la luz, por un
máximo de 5 días para ser llevadas a electroforesis capilar.
Se empleó un mínimo de 5 muestras de DNA de pacientes y 3 DNA de controles
sanos en cada experimento, y usando la misma cantidad de DNA (100ng) por
reacción. También en cada experimento se usó un tubo sin DNA como control de
calidad.
La electroforesis capilar se realizó en un equipo ABI-Prism 310. La mezcla de
inyección consistió en 0,75 uL de producto de PCR (conteniendo flurocromo FAM),
0,5 uL LIZ size standard, 0,75 uL dH2O y 13,5uL de formamida. Se usó un voltaje de
inyección de 1.6 kV por 15 segundos, polímero POP4. Incubación a 80ºC por 2
minutos y luego rápido enfriamiento.
En el programa Genemapper® se procesaron los datos crudos en formato .FSA
provenientes de la electroforesis capilar para asignar los tamaños a los picos que
69
representan los fragmentos. Además se realizó una inspección visual de los
electroferogramas buscando los siguientes criterios de calidad de los resultados:
a. Presencia de fragmento de 92 nt (dependiente de ligamiento) y productos de
amplificación presentes.
b. Ausencia de picos de los fragmentos Q en las muestras (los fragmentos Q de
62, 68, 74 y 80 nt son indicativos de baja concentración de DNA y son los
únicos que deben aparecer en la muestra sin DNA).
c. Señal adecuada de los fragmentos D de 88 y 96 nt (si los productos son
mucho más bajos que los de 92 nt, indican denaturación incompleta).
d. Altura adecuada de los picos (no menor del 5% de la máxima señal detectada,
ni demasiado altos o fuera de escala).
e. Ausencia del efecto “ski slope” o declive: picos de las sondas más grandes de
MLPA tres veces menores a las sondas más cortas.
f. Ausencia de picos extra.
g. Ausencia de grandes diferencias en las áreas relativas de los picos que no
tienen sentido.
h.
Las muestras que cumplieron estos criterios fueron llevadas al análisis informático
en el software Coffalyser y las que no, se repitieron nuevamente en otro
experimento hasta que cumpliesen el control de calidad inicial.
El análisis de los fragmentos obtenidos por electroforesis capilar fue realizado en el
programa Coffalyser versión 8. Se cargó en el programa la hoja de la mix P164-B1
lote 0110, que contiene las longitudes de los fragmentos clonados por el
fabricante.Luego se importaron los datos crudos de los pacientes y los controles, en
70
formato GENEMAPPER.TXT (multiple runs). La verificación de los electroferogramas
y archivos .txt de las muestras control permitió identificar y ajustar en el programa la
longitud de los fragmentos de X, de Y, de denaturación y de ligamiento para esta
población.
La opción Autobin on References de Coffalyser ajustó y estableció los fragmentos de
los controles como referencia en esta poblaciónse verificó que la desviación
estándar para dichos controles fuera menor o igual 0,1.El filtro de los datos arrojó
una tabla con los parámetros de control de calidad: concentración de DNA, número
de sondas, ligamiento, género (masculino/femenino), fragmentos DD.
El programa realiza la normalización dividiendo el área del pico de cada producto por
el área del pico de las sondas de referencia. El método de análisis empleado fue
population analysis (LS), el cual primero define si hay fragmentos de tamaños
extremos sobre todas las muestras y luego somete los demás fragmentos no
extremos a un método de regresión, esperando la caída de señal sea linear. Cada
sonda se usa separadamente para determinar una razón y la media de todas las
razones es la relación final.
Cocientes normales (Dosage Quotient) se encuentran entre 0,85 y 1,15. Valores
entre 1,35 - 1,55 indican duplicación heterocigota; valores entre 1,7 - 2,2 duplicación
homocigota. Entre 0,35 - 0,65 indica deleción heterocigota. Valores fuera de estos
intervalos representan número equívoco de copia.
71
Simultáneamente todos los pacientes fueron llevados a secuenciación para la
detección de mutaciones puntuales.
5.1.3. Secuenciación
Se realizó secuenciación directa de los 9 exones para IDS, teniendo en cuenta su
alta heterogeneidad alélicay por los datos arrojados por varios grupos (Froissart et
al., 2002; Rathmann et al., 1996; Timms et al, 1997; Wilson et al., 1991; Vafiadaki et
al., 1998; Lualdi et al., 2005; Lagerstedt et al., 2000) quienes indican que la gran
mayoría de las mutaciones son privadas y hay escasas alteraciones génicas
recurrentes.
Se emplearon los primers descritos en la tabla 4 modificados a partir de los reportes
iníciales de Froissart et al. (Froissart et al., 1998) y Lin et al. (2006) para la
amplificación de segmentos génicos y limites intrón - exón de los 9 exones para IDS.
En este estudio no se evaluaron los segmentos 5´UTR ni 3´UTR y tampoco las
alteraciones epigenéticas (metilación) del gen por limitaciones presupuestales y de
cronograma.
Tabla 4. Condiciones para la Amplificación de Fragmentos Génicos
Exón Primer Secuencia Annealing (ºC)
MgCl2 Amplifi-
cado (pb) Fuente
1 1 F GCAAAAAGACGGGTAACTGC 57 1.5 548 (Alves S. et al, 2006)(Alves, et al., 2006)
1R AGGGAGGAAGGGAGAAGAGA
(Alves S. et al, 2006)
2 2F AGGACTCAGGCTTCCTCCTC 56.5 1 429 (Lau KC y Lam CW, 2008) (Lau & Lam, 2008)
2R AACAAGATGTCCCGCACAAT (Lau KC y Lam
72
CW, 2008)
3 3F TGGTTTGAGCTCTGCATGAC 57 1.5 409 (Lau KC y Lam CW, 2008)
3R AGAGGGCTCTGCAAAGACAG
(Lau KC y Lam CW, 2008)
4 4F GTTCCACTTGCCCATTTGTT 57 1.5 275 (Alves S. et al, 2006)
4R ACCAGCTTCACAGAACATGC
(Alves S. et al, 2006)
5 5F CGTGAAGGGCTGATTATGTG 57 1.5 393 (Alves S. et al, 2006)
5R ATGTAGCCACCTTCCCTGTG
(Alves S. et al, 2006)
6 6F ACGTGGGGAATGCTAGTGAG 57 1.5 397 (Alves S. et al, 2006)
6R
GGTGGAGTTGTGTCTACTGAGAA
(Alves S. et al, 2006)
7 7F GATTGGGAGAGATGCACAGG 57 1.5 335 (Alves S. et al, 2006)
7R CCACTGGTTCACAAAAGAGAA
(Alves S. et al, 2006)
8 8F ACAAGCTGTGGTATGATGAT 50.5 1 280 (Alves S. et al, 2006)
8R TAAAGGTGATCTTACTGTCAA
(Alves S. et al, 2006)
9 9F AGGTGGTGTTTCTAAACGTCTG 57 1.5 705 (Alves S. et al, 2006)
9R CAAAACGACCAGCTCTAACTC
(Alves S. et al, 2006)
La amplificación de dichas regiones se llevó a cabo en una PCR convencional en un
volumen final de 25 uL conteniendo Buffer 1X, MgCl2 1 mM ó 1.5 mM dependiendo
del par de primers a utilizar (Tabla 4), 0,2mM de cada uno de los primers, 0,25 mM
dNTPs, 1 U de Taq polimerasa (Invitrogen®) y 120 ng de gDNA por reacción.
En un termociclador MyClycler®(BIORAD) se emplearon las siguientes condiciones:
un primer paso de desnaturalización a 95ºC por 4 minutos, un segundo paso de 35
repeticiones de desnaturalización a 95ºC por 30 segundos, hibridación a diferentes
temperaturas de acuerdo al par de primers (ver tabla 4, annealing) por 30 segundos
y extensión a 72ºC por 40 segundos. Paso de extensión final a 72ºC por 10 minutos.
73
Los amplicones obtenidos se verificaron en electroforesis en gel de agarosa al 1,7%,
80 V por 40 minutos y utilizando el marcador de peso molecular Mass Ruler® DNA
ladder Low Range Se empleó el agente intercalante SYBR Safe® para la
visualización de los productos.
Con el kit Pure Link® (Invitrogen) se realizó la purificación de los amplicones partir
de producto de PCR, empleando para ello 23 uL de producto de reacción, 92 uL de
Binding Buffer con isopropanol adicionado (4 volúmenes de producto), se trasladó el
volumen total a una columna de sílica del kit y se centrifugó a 10.000g por 1 minuto.
En un segundo paso se utilizaron 600 uL de Wash Buffer (+etanol) para lavado de la
columna, centrifugando 1 minuto a 10,000 g. Tras evacuación del tubo colector se
repitió el centrifugado a 15.000 g por 2 minutos para retirar por completo cualquier
residuo de etanol. Finalmente se adicionaron al centro de la columna 35 uL de buffer
de elusión (Tris) dejando incubar por 2 minutos a temperatura ambiente para luego
centrifugar a máxima velocidad (16.000 g) por 2 minutos, obteniendo finalmente el
producto purificado para secuenciar.
Para la secuenciación se emplearon por reacción 10uL de producto purificado más
1,2 uL de primer (forward o reverse). Por ende, por cada amplicón se enviaron 2
muestras para realizar secuencia forward y reverse, utilizando el kit de
secuenciación Big Dye Terminator 3.1 (Applied Biosystems®), siguiendo
instrucciones del fabricante. Los productos de la reacción se secuencia se
purificaron nuevamente usando el kit Big Dye® XTerminator™ Purification kit
(Applied Biosystems) y fueron analizados en un secuenciador ABI prism 3500
(Applied Biosystems).
74
Con el programa BioEdit Sequence Alignment Editor (Hall, 1999) se revisaron en
detalle las secuencias obtenidas verificando así su calidad e idoneidad para los
posteriores análisis, procediendo a la edición de cada secuencia y obtención de los
respectivos formatos FASTA.
Las secuencias FASTA fueron sometidas a comparación contra el genoma de
referencia mediante la herramienta BLASTn, para así identificar las mutaciones.
Empleando la herramienta Translate de Proteomics tools (ExPASy) se obtuvo la
secuencia de aminoácidos de las diferentes mutantes encontradas.
5.4.3. Análisis de recombinantes por RFLPs
En aquellos pacientes en que los rsultados de MLPA y secuenciación fueron
negativos se aplicó el método rápido de PCR y RFLPs reportado por Lualdi y
colaboradores para detección de los cuatro tipos de recombinantes IDS/IDSP1 más
frecuentes (Lualdi et al., 2005) (Figura 5). Este método consiste en dos PCR
intercaladas por la digestión con enzimas de restricción que reconocen puntos de
ruptura donde ocurren dichs recombinaciones (Tabla 5).
75
Figura 5. Representación esquemática de los cuatro rearreglos. La numeración es
arbitrariamente designada a partir del 1er nt del intrón 3 del pseudogen IDSP1 (IDS2
en la figura, barras blancas). El gen IDS está representado por barras negras. La
caja de líneas verticales es región exclusiva del pseudogen. Las flechas indican los
sitios de reconocimiento de las enzimas de restricción, Rec A, B, C o D son los
posibles patrones que se identifican con esta técnica (tomado del trabajo de Lualdi et
al., 2005)
Tabla 5. Set de primers. Tomado del trabajo de Lualdi y colaboradores (Lualdi, et al.,
2005).
76
En la tabla 6 se observan las enzimas para la digestión de los productos de la
primera y segunda PCR y los probables resultados de acuerdo al tipo de
recombinación presente. El producto de la primera PCR es digerido con HinfI para
evaluar punto de ruptura y recombinación en el intrón 7. Las recombinaciones en
este punto generan fragmentos de 556, 397, 271, 71 y 15 bp. La digestión con SacI
también evalúa recombinación en el intrón 7 en diferente punto de ruptura (Tabla 6).
Tabla 6. RFLPs de los productos de PCR. Primera PCR
Enzima Mismatch IDSP1>IDS
Posición Fragmentos de restricción
Producto 1315 (WT)
HinfI GAATC>AGAGG 451, 397, 271, 110, 71, 15
Producto 1310 (recombinante)
HinfI GAATC>AGAGG 1865-1869 556, 397, 271, 71, 15.
SacI T>C 1344 -1310 (Rec tipo A o D) - 679,631(Rec tipo B ó C)
Segunda PCR
Producto 1300 (recombinante)
Eco57I (AcuI)
C>T 243 771, 403, 126 (Rec tipo A, B o C) 1174, 126 (Rec tipoD)
La digestión de los productos de la segunda PCR permite analizar eventos de
conversión en intrón 3. Si el intrón 3 está normal, la digestión con Eco57I (AcuI)
genera fragmentos de 771 y 403 bp. La presencia de mismatch IDS2-C>IDS-T causa
la pérdida de un sitio de reconocimiento de Eco57I (AcuI), produciendo un fragmento
de 1174 bp además de los fragmentos 771 y 403 bp. lo que indica un evento de
conversión (ver sección 4.8. Genética de la MPS II y Figura 5) (Birot et al., 1996;
Bunge et al., 1998; Lualdi et al., 1995).
77
Fase Post Analítica
5.6.1. Descripción de las variables y análisis estadístico
Se planteó una descripción de las principales variables clínicas de los pacientes. En
el caso de variables discretas se estimó la frecuencia y el porcentaje entre los
pacientes. Para variables continuas se realizó el mismo paralelo pero expresado en
medidas de tendencia central y dispersión.
Se realizó la prueba no paramétrica de Kolmogorov-Smirnov de una sola muestra
para conocer si los valores de actividad enzimática tienen distribución normal
(hipótesis nula o Ho). El nivel se significancia para rechazo de la Ho fue 0,05 (CI 95).
Una vez cumplida esta condición se realizó test Chi cuadrado (χ2) para evaluar si los
datos obtenidos presentan variaciones, aceptando la hipótesis nula (Ho) de la
existencia de diferencias estadísticamente significativas cuando p<0,05, con 9
grados de libertad.
Para todo lo anterior, se empleó el paquete estadístico SPSS free trial versión 21.
5.1.2. Análisis bioinformático de la repercusión de las mutaciones en la estructura
tridimensional de la IDS
Dado que no se dispone de una estructura cristalizada de la Iduronato 2 Sulfatasa
humana, en primer lugar se realizó el modelamiento tridimensional de la enzima
mediante herramientas bioinformáticas. Las plantillas o templetes para este
modelamiento se obtuvieron partir de la búsqueda y selección de los mejores
homólogos en la base de datos Protein Databank (PDB) mediante la herramienta
78
BLASTp, introduciendo en el campo de búsqueda la secuencia de aminoácidos de la
IDS en formato fasta. Para esta búsqueda se empleó la secuencia de la forma
madura (residuos de la posición 34 a la 550 inclusive) de la IDS humana (hIDS)
depositada en Uniprot bajo el código de acceso P22304.
El modelamiento se realizó por threading. Se empleó el paquete de software MOE
(Molecular Operating Environment) v.2010("Molecular Operating Environment
(MOE), 2010.10; Chemical Computing Group Inc., 1010 Sherbooke St. West, Suite
#910, Montreal, QC, Canada, H3A 2R7, 2010.,") en las instalaciones del laboratorio
de biomoléculas de la Pontificia Universidad Javeriana, institución que posee licencia
para uso del programa. El grupo de investigación en Macromoléculas de la PUJ
brindó el soporte necesario para la realización de todas las simulaciones in silico. El
campo de fuerza empleado en MOE fue Amber99, parametrizado para simulaciones
en medio acuoso; de aquellos modelos generados por el procedimiento aleatorizado
de Boltzmann se seleccionó el mejor para ser sometido a minimización de energía
por el programa.
La calidad energética del modelo obtenido de la hIDS tipo silvestre se evaluó
mediante la herramienta Structure Assessment del servidor Swiss-Model. La calidad
geométrica y estereoquímica se examinó por plots de Ramachandran generados por
el programa RAMPAGE (Lovell et al., 2003). La medición de la desviación de la raíz
media cuadrática (RMSD) se llevó a cabo en MOE frente al templete empleado, para
evaluar la precisión del modelo; valores totales de RMSD (promedio de la distancia
entre dos átomos de dos proteínas sobrelapadas) de 1,0 o cerca a ese valor
representan moléculas con alta similitud estructural.
79
Con la estructura de la hIDS tipo silvestre se realizó el docking molecular contra sus
sustratos Heparán y Dermatán Sulfato cuyas estructuras fueron obtenidas de la base
de datos PubChem. Para ello se empleó el programa Autodock Vina (Trott & Olson,
2010). Con el fin de simular la modificación post-traduccional del residuo C84 se
convirtió a FGly con la herramienta Builder en Pymol. Se evaluó este modelo
modificado para asegurar que no se generen alteraciones estéricas o de energía. El
resultado del docking se analizó mediante el programa LigPlot+ (Laskowski &
Swindells, 2011).
5.6.2.1. Modelamiento y Docking de las IDS mutantes halladas en el estudio
Con las secuencias de aminoácidos de todas las mutantes encontradas en este
estudio (excepto el fenómeno de conversión) se realizó en MOE el modelamiento de
cada una empleando como plantilla el modelo tridimensional de la hIDS obtenido en
este estudio. Se midieron los RMSD en cada caso frente a la proteína de tipo
silvestre. RMSD totales que con un resultado mayores de 1.5 Å o inferiores a 0.5 Å
indicaron un cambio estructural. Además se realizó el cálculo del Área Accesible a
Solvente (ASA) empleando el servidor Getarea. El docking molecular se llevó a
cabo con Autodock Vina y su evaluación con LigPlot+, con cada uno de los modelos
de las enzimas mutantes, y se analizaron las diferencias respecto al docking
realizado con el modelo tipo silvestre.
La visualización de los resultados se realizó en PyMol™ versión 1.3 de uso
académico (Schrodinger, 2010).
80
Flujograma
FASE PREANALÍTICA FASE ANALÍTICA
FASE POST ANALITICA
RECLUTAMIENTO DE PACIENTES Y TOMA DE MUESTRA Única muestra de sangre periférica máx. 7mL, en tubo EDTA.
EXTRACCIÓN DNA UltraClean Blood DNA Isolation Kit®, según instrucciones del fabricante
DETECCIÓN DE GRANDES DELECIONES Y/O REARREGLOS GENÓMICOS
MLPA a todos los pacientes, con el kit SALSA® MLPA® P164 IDS
SECUENCIACIÓN Secuenciación de los 9 exones y límites intrón-exón. Condiciones de primers en Tabla 1.
EVALUACIÓN DE RECOMBINANTES
ANÁLISIS BIOINFORMÁTICO Predicción de la repercusión de las mutaciones en la estructura terciaria.
Descripción de variables sociodemográficas y clínicas de los pacientes. Acercamiento a una correlación Fenotipo-Genotipo.
81
6. RESULTADOS
6.1. Características clínicas de los pacientes
Un total de 18 pacientes colombianos fueron incluidos en el estudio, con una edad
promedio de 10.8 años (SD ±7.8 años), todos de género masculino. Los individuos
MPS II 006, 016 y 017 son los únicos pertenecientes a una misma genealogía, todos
los demás fueron pacientes no relacionados.
En cuanto a sus características fenotípicas, se observó que el Síndrome de Hunter
de tipo neuronopático (Hunter A) el más frecuente, correspondiendo al 86.6% de los
casos (n=16), mientras el fenotipo no neuronopático se presentó en el 13.3% de los
pacientes (n=2).
La media de la edad de inicio de síntomas para todos los pacientes fue de 2.5 años
(SD±1.55 años), siendo el síntoma más frecuente el retraso del desarrollo del
lenguaje (66.7%), seguido de rigidez de grandes articulaciones (26,5%) y neumonía
recurrente (20%) (Tabla 7). El paciente MPSII002 falleció durante la fase de
reclutamiento por razones inherentes a la enfermedad.
Para el fenotipo neuronopático (MPS II A) la edad promedio de aparición de
síntomas fue 3.5 años con una SD±1.85 años y los síntomas iníciales más
frecuentemente referidos en este grupo fueron retraso en el desarrollo del lenguaje
(81%) y rigidez articular (18,8%). Para el fenotipo no neuronopático (MPS II B) fue
82
de 0.88 años (SD±0.17), refiriendo como primeras manifestaciones neumonía,
visceromegalias y rigidez articular (Tabla 7).
83
Tabla 7. Características fenotípicas de la muestra en estudio.
CÓDIGO Edad (años)
ANTECED.FAMILIAR
MPSII
Edad inicio
síntomas
(años)
PRIMER SÍNTOMA FENOTIPO PROCEDENCIA
MPSII001 5 0.83 Retraso del lenguaje Neuronopático Bogotá
MPSII002 18 2 Retraso del lenguaje Neuronopático Florencia (Caquetá)
MPSII003 8 1 Macrocránea/
Retraso del lenguaje
Neuronopático San Gil (Santander)
MPSII004 14 Tío materno 2 Retraso del lenguaje /Fascies tosca
Neuronopático La Dorada (Caldas)
MPSII005 2 0.71 Retraso del lenguaje Neuronopático Duitama (Boyacá)
MPSII006 17 Primos, tío
materno 1.5 Retraso del lenguaje Neuronopático Cúcuta (Norte de
Santander)
MPSII007 6 0.75 Neumonía /Visceromegalias No neuronopático Bogotá
MPSII008 10 Hermano 5 Retraso del lenguaje /Fascies tosca
Neuronopático Bogotá
MPSII009 14 3 Retraso del lenguaje Neuronopático Bogotá (padres origen
84
Boyacá)
MPSII010 13 3 Neumonía/Rigidez articular Neuronopático Girardot (Cundinamarca)
MPSII011 13 Tío materno 3 Retraso del lenguaje /Rigidez articular.
Neuronopático Bogotá
MPSII012 8 Tío y primo 1.5 Macrocránea/ Retraso del lenguaje
Neuronopático Bogotá (madre origen Villavicencio-Meta)
MPSII013 7 1.5 Hipoacusia/rigidez articular Neuronopático Bogotá
MPSII014 1 0.25 Neumonía Neuronopático Bogotá (madre origen Huila)
MPSII015 31 Sobrino 1 Rigidez articular No neuronopático Bogotá (madre origen Huila)
MPSII016 16 Primos, tío 2.5 Retraso del lenguaje Neuronopático Cúcuta (misma familia MPS II006)
MPSII017 6 Primos, tío 1.5 Retraso del lenguaje Neuronopático Cúcuta (misma familia MPS II006)
MPSII018 16 1.1 Retraso del lenguaje /Rigidez articular
Neuronopático Manizales (Caldas)
85
86
La media de la edad al diagnóstico fue de 6 años (SD ±4.38 años). El 94,4% (n=17)
recibió Terapia de Reemplazo Enzimático (TRE) y actualmente el 83% (n=15) asiste
a la administración de TRE en dosis semanal. Tres pacientes no continuaron el
tratamiento debido a severo compromiso multisistémico y de la vía aérea en etapas
avanzadas de la enfermedad.
Tabla 8. Edad al diagnóstico, niveles de actividad enzimática de los pacientes y
administración de Terapia de Reemplazo Enzimático (actual o previamente).
CÓDIGO EDAD INICIO
SÍNTOMAS
(años)
EDAD AL DIAGNÓSTICO
(Años)
FENOTIPO ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
(LEUCOCITOS)
1
TERAPIA DE REEMPLAZO ENZIMÁTICO
MPSII001 0.83 1 N 0.71 SÍ
MPSII002 2 5 N 0.24 SÍ
MPSII003 1 5 N 0.32 SÍ
MPSII004 2 13 N 0.19 SÍ
MPSII005 0.71 2 N 1.10 SI
MPSII006 1.5 13 N 0.40 SÍ
MPSII007 0.75 5 No N 0.00 SÍ
MPSII008 5 10 N 1.6 *(papel filtro)
NO
MPSII009 3 11 N 1.8 2 SÍ
MPSII010 3 3 N 0.47 SÍ
MPSII011 3 6 N 0.85 SÍ
MPSII012 1.5 2 N 26** (papel filtro)
SI
MPSII013 1.5 3 N 1.34 SI
87
MPSII014 0.25 1 N 0.47 SI
MPSII015 1 9 No N 9.46***(papel filtro)
SI
MPSII016 2.5 12 N ND SÍ
MPSII017 1.5 2 N ND SÍ
MPSII018 1.1 10 N 22.27**(papel filtro)
SI
Controles: 17.5-55.1 nmol/mg Proteína/hora. 2 48-118 nmol/mg Proteína/hora. Actividad
IDS en papel filtro: *ref 12-23, **ref 57 – 149, ***ref71-187 (umoles/l.h). ND: no disponible.
Los niveles de actividad enzimática (Tabla 8) fueron analizados por medio del
estadístico no paramétrico Kolmogorov-Smirnov, encontrando que siguen una
distribución normal con una media de 0,54 y desviación típica 0,41, con un nivel se
significancia de 0,674 (no se rechazó Ho=distribución normal de la muestra). La
prueba de Chi (χ) cuadrado para una sola muestra arrojó un valor de p = 0.818, con
lo cual se rechaza Ho y se concluye que no existen diferencias estadísticamente
significativas en los niveles de actividad enzimática en este grupo de pacientes de
ambos fenotipos.
Los pacientes de este estudio tuvieron una talla sobre +2 SD en los primeros años
de vida, que se normalizó hacia los 8 años de edad. Las características comunes a
todos los pacientes fueron macrocránea, fascies tosca y hernia umbilical. El 88%
presentaba hepatoesplenomegalia.
88
La frecuencia de manifestaciones clínicas relacionadas con mayor morbilidad en los
pacientes se distribuyó de la siguiente manera: movilidad articular disminuida 88,8%
(n=16/18); hipoacusia 83,3% (n=15/18); infecciones recurrentes de vía aérea
superior 72,2% (n=13/18); otitis media aguda 55,6% (n=10/18); convulsiones 44,4%
(n=8/18).
La frecuencia de anomalías relacionadas con mayor mortalidad fue la siguiente:
neumonía a repetición (>2 episodios) 66.7% (n=12/18); hipertrofia de amígdalas y
adenoides (relación con obstrucción de la vía aérea superior) 61% (n=11/18);
cardiopatía 55,6% (n=10/18). Dentro de las cardiopatías los defectos más frecuentes
fueron la afección de la válvula mitral (insuficiencia n=2, mixoma n=1, displasia n=1)
que representó el 40% de los defectos cardiacos (n=4/10), seguido de la hipertrofia
ventricular izquierda, 20%, (n=1/10) (Tabla 9).
89
Tabla 9. Características clínicas de los pacientes.
PE
SO
(K
g)
Pes
o –p
ara
talla
(S
D)
TA
LLA
(cm
)
Tal
la (
SD
)
perí
met
ro c
efál
ico
PC
(D
S)
perí
met
ro a
bdom
inal
Mac
rocr
anea
Fac
ies
tosc
a
Con
vuls
ione
s
Hip
oacu
sia
Com
prom
iso
visu
al
(n ó
ptic
o)
Ano
mal
ías
dent
ales
Infe
ccio
nes
va s
uper
ior
(EP
ISO
DIO
S)
Otit
is m
edia
(E
PIS
OD
IOS
)
IInfe
ccio
nes
vía
aére
a in
ferio
r
Hip
ertr
ofia
am
ígda
las/
ad
enoi
des
Car
diop
atía
Her
nia
umbi
lical
Hep
ato-
espl
enom
egal
ia
Cifo
sis
dors
al
Ines
tabi
lidad
cer
vica
l
Mov
ilida
d ar
ticul
ar
dism
inui
da
MPSII001
21 +1 111 0 55 +2 50 SÍ SI NO NO NO SI 2 2 1 DESC ND S SI NO no SI
MPSII002
28 +3 116 <-3 56,5 +2 62 SÍ SI SI SI SI SI >5 0 1 SI* hipertrofia VI S SÍ SÍ NO SÍ
MPSII003
22 +1 104 <-3 57 +2 ND SI SI NO NO NO SI >5 0 >5 SI Insuficiencia mitral trivial
S SI SI NO SI
MPSII004
36 0 127 <-3 58 +2 ND SI SI SI SI NO SI 0 5 >5 SI displasia mitral y aorta
S NO SI SI SI
MPSII005
16,9
+2 94 +2 54 +2 58 SI SI NO ND NO SI 2 1 2 DESC Engrosamiento valvas mitrales
S SI NO NO SI
MPSII006
30 0 117 -3 57 +2 ND SI SI SI SI NO SI >5 2 3 SI SANO S SI SI NO SI
MPSII007
16 +1 97 -3 50,5 0 53,5
NO SI NO NO NO SI 2 1 4 DESC SANO S SI NO NO SI
MPSII 31 0 118 -3 57 +2 78 SI SI NO SI NO SI >5 0 0 DES ND S SI NO NO SI
90
008
MPSII009
31 0 114 <-2 56 +2 66,7
SI SI SI SI NO SI >5 2 >5 SI* SANO S SI SI NO SI
MPSII010
30 0 112 <-2 57 +2 66 SI SI SI SI NO SI >5 3 >5 SI hipertrofia VI, estenosis aórtica
S NO SI NO SI
MPSII011
19,5
+1 111 <-2 56 +2 65,8
SI SI SI SI NO SI >5 4 1 SI SANO S SI SI NO SI
MPSII012
28 +2 123 -1 57,5 +2 76 SI SI NO SI **
SI SI >5 5 3 SI Mixoma de v mitral + prolapso
S SI SI NO SI
MPSII013
32 +3 124 0 59 +2 67 SI SI NO SI NO SI >5 5 0 SI leve hipertrofia VI
S SI NO NO +/-
MPSII014
14 +2 85 +3 51 +2 50 SI SI NO NO NO SI 4 0 >5 DESC hipertensión pulmonar leve
S NO SI NO +/-
MPSII015
54 0 152 <-2 57 +2 ND SI SI NO SI NO SI 0 1 1 NO Insuficiencia aórtica leve
S SI SI NO SI
MPSII016
25 +2 110 <-2 56 +2 ND
SI SI SI SI NO SI >5 2 2 SI SANO S SI SI NO SI
MPSII017
24 +2 110 -1 56 +2 ND SI SI NO NO NO SI >5 1 0 DESC ND S SI SI NO SI
MPSII018
32 0 135 <-2 55 +2 73 SI SI SI SI NO SI >5 >5 0 SI Insuf. tricuspídea trivial
S SI SI NO SI
ND: no disponible. DESC: desconocido. *Requirieron traqueostomía (MPSII 002 y 009). ** confirmada neurosensorial y conductiva.
6.2. Detección de grandes pérdidas o ganancia de material genético
(rearreglos complejos)
Por la técnica de MLPA (Multiplex Ligation-dependent probe amplification) se logró
en dos pacientes la detección de dos distintos tipos de mutaciones. En el paciente
001 se identificó ganancia en el exón 4 y en el pseudogen (Tabla 10) En el
paciente MPSII012 se identificó ausencia de señal para el exón 7, indicando una
deleción total de dicho exón (Tabla 10 y Figura 6).
Estos pacientes fueron analizados simultáneamente por secuenciación directa,
encontrando en el primer caso la inserción de un nucleótido en el exón 4, que se
describe en detalle en la siguiente sección; mientras que en el segundo caso no se
produjo amplificación con primers específicos para el exón 7.
La verificación en las bases de datos X Chromosome gene database® y Human
Gene Mutation Database® de Biobase, aclaró que la deleción del exón 7 es una
mutación no reportada.
Recuérdese que ambos pacientes son hemicigotos para el cromosoma X. El
paciente MPSII 001 presenta valores superiores a 1,3 pero sin representar
duplicación (punto de corte para duplicación> 1,7). Obsérvese la deleción
homocigota de MPS II 012, casilla en color rojo, valor 0 (cero). Valores normales:
0,85 – 1.15.
92
Tabla 10. Valores normalizados de la longitud de fragmentos de las diferentes
regiones del gen IDS analizadas por MLPA. Pacientes MPS 001 y 012.
Sample name
MPSII001 MPSII012
MV36
Recommen
ded Order
Length (nt)
Ratio Ratio
X-146.8 FMR1 1 Normal (0,84) Normal (0,94)
X-147.6 AFF2 2 166 Normal (0,95) Normal (1)
X-147.6 AFF2 3 337 Normal (0,92) Normal (0,99)
X-148.4 IDS Exon 10 4 355 Normal (1,17) Normal (0,99)
X-148.4 IDS Exon 09 5 265 Normal (1,03) Normal (0,99)
X-148.4 IDS Exon 08 6 238 Normal (1,15) Normal (1,11)
X-148.4 IDS Exon 07 7 212 Normal (1,04) HO Loss (0,02)
X-148.4 IDS Exon 06 8 184 Normal (0,93) Normal (0,97)
X-148.4 IDS Exon 05 9 328 Normal (1,09) Normal (1,03)
X-148.4 IDS Exon 04 10 310 Gain (1,31) Normal (1,08)
X-148.4 IDS Exon 03 11 276 Normal (0,92) Normal (0,99)
X-148.4 IDS Exon 02 12 256 Normal (1,17) Normal (1,01)
X-148.4 IDS Exon 01B 13 229 Normal (1,21) Normal (0,93)
X-148.4 IDS Exon 01A 14 205 Normal (1,02) Normal (0,98)
X-148.4 IDSP1 Intron 10 15 148 Normal (1,26) Normal (0,94)
X-148.4 IDSP1 Exon 10 16 292 Gain (1,4) Normal (1)
17 319 Normal (0,99) Normal (0,92)
18 301 Normal (0,85) Normal (0,92)
19 190 Normal (0,84) Normal (1,05)
20 247 Normal (1,05) Normal (1)
21 136 Normal (0,95) Normal (0,97)
22 373 Normal (1,03) Normal (1,08)
23 198 Normal (1,11) Normal (1,04)
24 220 Normal (1,01) Normal (1)
Figur
técnic
líneas
Abajo
cocie
(cero)
Ratio
ra 6 .Delec
co (Techni
s roja y a
o: diagram
ntes o índ
).
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1 2 3
ción comp
cal Chart)
marilla, in
a de barra
dices norm
3 4 5 6 7
leta del ex
, el rombo
dica la no
as, en el e
malizados,
7 8 9
10
11
MLPA ‐M
xón 7 en e
o azul muy
o amplifica
eje X los f
el fragme
11
12
13
14
15
Mapview
MPSII012
l paciente
y por deba
ación de la
fragmentos
ento del ex
15
16
17
18
19
MPSII012
jo de los p
as sondas
s específic
xón 7 (7)
19
20
21
22
23
2. Arriba:di
puntos de
s para el e
cos y en e
sin señal
23
24
93
agrama
corte –
exón 7.
el eje Y
alguna
94
6.3. Identificación de mutaciones por secuenciación directa
Por medio de primers modificados de de Froissart et al. (1998) y Lin et al. (2006) se
realizó la secuenciación de los 9 segmentos génicos (exones y límites intrón-exón).
El alineamiento de las secuencias frente al genoma de referencia permitió
identificar las mutaciones puntuales, que se resumen en la tabla 11. Estas fueron
verificadas en las bases de datos X Chromosome Gene Database® y Human
Gene Mutation Database® de Biobase, aclarando de esta forma si se trababa de
mutaciones ya reportadas o privadas.
En los pacientes MPS II 004, 013 y 014 no se detectó anormalidad en el MLPA y
las secuencias de los exones y regiones flanqueantes fueron normales. Por lo tanto
estos pacientes fueron llevados a análisis de recombinantes.
Tabla 11. Resultados de genotipificación y MLPA.
CÓDIGO MUTACIÓN (DNA) Fen. Reporte
MPSII001 c.477 insT N PRIVADA
MPSII002 c.548_564dupTTGCCCTGTGGATGTG N PRIVADA
MPSII003 c.1403 G>A N
Whitley (1993); Villani (2000);
Sukegawa-Hayasaka (2006)
MPSII004 MLPA y secuenciación normales (se llevó a
análisis de recombinantes) N
MPSII005 c.708G>C N Gucev (2011)
MPSII006 c.1393C>T N Li (1996) J Inherit Metab Dis 19, 93
95
MPSII007 c. 212G>A
( polimorfismo c.438 C>T) No N
Froissart (1998) Clin Genet 53,
362
MPSII008 c.1403 G>A N Whitley, Villani.
MPSII009 c.1039A>C N Lissens (1997) J Inherit Metab Dis
20, 453
MPSII010 c.595_607delACAGAGCACTGA N PRIVADA
MPSII011 c. 549_562delTGCCCTGTGGATG N PRIVADA
MPSII012 Deleción exón7 N PRIVADA
MPSII013 MLPA y secuenciación normales (se llevó a
análisis de recombinantes) N
Lualdi (2005). Hum Mut 25,491)
MPSII014 MLPA y secuenciación normales (se llevó a
análisis de recombinantes) N
MPSII015
c. 212G>A
(polimorfismo c.438 C>T)
No N Froissart (1998) Clin Genet 53,
362
MPSII016 c.1393C>T N Li (1996) J Inherit Metab Dis 19, 93
MPSII017 c.1393C>T N Li (1996) J Inherit Metab Dis 19, 93
MPSII018 c.182 delC N PRIVADA
96
Figura 7. Mutaciones privadas (nuevas) encontradas por secuenciación y MLPA.
MPSII 010: N;
c.596_608delACAGAGCACTGA
Del Q200-E203
WT190 VPEGTLPDKQSTEQAIQL
Mut 190 VPEGTLPDK----QAIQ
97
- MPSII018; N. c.182 delC. P62QfsX67
Wt:C T G G T G A G G T C C C C A A A T A T T G A C C A A C T G G
*publicación de fotografías de los pacientes con autorización por escrito de sus
padres. Todos los pacientes de este grupo presentaban fenotipo neuronopático.
98
Ladder(bp)
500
350
300
250
200
100
6.4. Análisis de recombinantes por RFLPs
Dado que el análisis con MLPA y secuenciación directa de exones no permitió
establecer el diagnóstico molecular en los pacientes MPSII 004, 013 y 014, se
llevaron al método de PCR de Lualdi y colegas (Lualdi et al., 2005).
El producto de la primera PCR fue digerido con HinfI para evaluar punto de ruptura
y recombinación en el intrón 7. Las recombinaciones en este punto generan
fragmentos de 556, 397, 271, 71 y 15 bp. Ninguno de los pacientes presentó este
tipo de recombinación (Figura 8). La digestión con SacI también evalúa
recombinación al mismo nivel y en concordancia con lo obtenido con HinfI, el
resultado fue negativo para recombinación en el intrón 7 en estos pacientes
(Figura 9).
Figura 8. Digestión con HinfI (PCR1). L: ladder. C: control sano.Se usó al paciente
018 como control adicional, pues tiene mutación puntual. Todos fueron negativos
para este tipo de rearreglo involucrando el intrón 7.
L C 004 013 014 018 L
451
397 271
99
La digestión de los productos de la segunda PCR permitió analizar eventos de
conversión en intrón 3. Si el intrón 3 está normal, la digestión con Eco57I (AcuI)
genera fragmentos de 771 y 403 bp. La presencia de mismatch IDS2-C>IDS-T
causa la pérdida de un sitio de reconocimiento de Eco57I (AcuI), produciendo un
fragmento de 1174 bp además de los fragmentos 771 y 403 bp. Para el paciente
MPSII013 se logró identificar este tipo de recombinación en el intrón 3, que sugiere
un evento de conversión (Figura 9).
1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
Figura 9. Izquierda digestión de PCR 1 con SacI, generando únicamente
fragmentos de 1310 bp (ladder de 1000 bp), es decir, negativo para recombinación
en intrón 7. Derecha: digestión de productos de PCR 2 con AcuI. 1, control
negativo; 2, MPSII004; 3, MPSII013; 4, MPSII014; 5 y 6 controles negativos.
Obsérvese el producto de 1174 bp en canal 3, correspondiente a MPSII013.
Ladder 1000 pb.
Por tanto se establece que el paciente MPSII013 presentó un evento de
conversión, previamente reportado por Birot et al. en 1996, Bunge et al. en 1998 y
luego por Lualdi y colaboradores (Lualdi et al., 2005).
Los
enzim
nmol/
(MPS
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MLPA,
ción de
En 18
s cuales
aciones
1 fue de
101
tipo recombinación. Se encontraron 6 mutaciones nuevas en este estudio, 5 de
tipo frameshift y 1 con deleción de 4 aminoácidos, sin alteración en el marco de
lectura. Llama la atención que la mayoría de mutaciones nuevas se localizan en
el exón 5. Ninguna de las mutaciones nuevas fue de tipo missense. (Tabla 13).
Tabla 12. Mutaciones identificadas por MLPA, secuenciación y RFLPs.
CÓDIGO MUTACIÓN (DNA) Fen. Reporte
MPSII001 c.477 insT N PRIVADA
MPSII002 c.548_564dupTTGCCCTGTGGATGTG N PRIVADA
MPSII003 c.1403 G>A N
Whitley (1993); Villani (2000);
Sukegawa-Hayasaka (2006)
MPSII004 Técnicas MLPA+Secuenciación+RFLPs no
detectaron lesión N
MPSII005 c.708G>C N Gucev (2011)
MPSII006 c.1393C>T N Li (1996) J Inherit Metab Dis 19, 93
MPSII007 c. 212G>A
( polimorfismo c.438 C>T) No N
Froissart (1998) Clin Genet 53,
362
MPSII008 c.1403 G>A N Whitley, Villani.
MPSII009 c.1039A>C N Lissens (1997) J Inherit Metab Dis
20, 453
MPSII010 c.595_607delACAGAGCACTGA N PRIVADA
MPSII011 c. 549_562delTGCCCTGTGGATG N PRIVADA
MPSII012 del. exón7 N PRIVADA
MPSII013 Conversión por recombinación en intrón 3 N Lualdi (2005).
102
Hum Mut 25,491)
MPSII014 Técnicas MLPA+Secuenciación+RFLPs no
detectaron lesión N
MPSII015
c. 212G>A
(polimorfismo c.438 C>T)
No N Froissart (1998) Clin Genet 53,
362
MPSII016 c.1393C>T N Li (1996) J Inherit Metab Dis 19, 93
MPSII017 c.1393C>T N Li (1996) J Inherit Metab Dis 19, 93
MPSII018 c.182 delC N PRIVADA
Tabla 13. Clasificación de Mutaciones pacientes colombianos con MPSII.
CÓDIGO PACIENTE MUTACIÓN (DNA)
MUTACIÓN A NIVEL DE PROTEÍNA
Fen. EXÓN
MISSENSE
MPSII003
MPSII008 c.1403 G>A R468Q N 9
MPSII006
MPSII016
MPSII017
c.1393C>T Q465X N 9
MPSII009 c.1039 A>C K347Q N 8
MPSII005 c.708G>C K236N N 5
MPSII007
MPSII015 c. 212G>A S71N No N 2
103
FRAMESHIFT
MPSII001 c.477 insT P160S fsX4 N 4
MPSII002 c.548_564dup TTGCCCTGTGGATGTG
D190PfsX13 N 5
MPSII011 c. 549_562del TGCCCTGTGGATG
P185WfsX23 N 5
MPSII018 c.182 delC
P62QfsX67 N 2
MPSII012 Del. Exón 7 R294GfsX2 N 7
PERDIDA DE AMINOÁCIDOS SIN CORRIMIENTO DE MARCO DE LECTURA
MPSII010 c.595_607del
ACAGAGCACTGA Del
Q200_E2003(QSTE)N 5
RECOMBINACIÓN IDSP1/IDS
MPSII013 Conversión, intrón 3 - N -
Nota: todas las mutaciones missense y la recombinante son reportadas. Las
demás fueron privadas de este estudio.
6.6. Frecuencia de las mutaciones encontradas en los pacientes MPS II
Se identificaron mutaciones recurrentes en el 58% de los 14 alelos que recibieron
diagnóstico molecular, mientras que en el 42 % restante se identificaron
mutaciones privadas (Figura 11). La mutación R468Q se identificó en dos alelos
difere
prese
Figur
A la i
otros
perten
grupo
media
entes (dos
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104
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dividuos
o. En el
ontrado
105
6.7. Estudio de portadoras
Familia MPSII 0012
Se realizó estudio de portadoras en tres mujeres de la genealogía del paciente
MPSII012 (Figura 12), confirmando el estado de portadoras en III.5 y III.8 (Figura
13). Para la pariente III.4 el resultado de MLPA fue normal, excluyendo el estado
de portadora (Figura 14). Por ultrasonografía de tercer trimestre se confirmó que
IV.2 es femenina.
Figura 12. Pedigree del paciente MPSII012.
Figur
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3 5 7
3 5 7
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17
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107
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108
Figura 15. Estudio de portadoras (A., madre; B. y C., hermanas del probando).
Como la mutación se encuentra corriente arriba del exón 5 se analizaron las
lecturas reverse para obtener la mayor longitud posible de secuencia no mezclada,
verificando así la confiabilidad del experimento. Nótese que la secuencia
3’CACATCCACAGGGCAA 5’ es la complementaria de la región duplicada y que
justo después de ella se observa “sobrelapamiento” de los picos.
109
6.8. Predicción de la repercusión de las mutaciones en la estructura
tridimensional de la IDS
6.8.1. Modelamiento de la hIDS tipo silvestre
El modelamiento de la IDS se realizó por threading. La búsqueda en PDB arrojó
como mejores plantillas las estructuras 3ED4 y 1AUK.A, homólogas de la IDS.
Mediante el empleo del software MOE al realizar el modelamiento se encontró que
1AUK.A (cadena A de la Arilsulfatasa humana A) presenta una disposición espacial
de alfa hélices y hojas beta que se superpone con mayor precisión a la IDS
humana y a pesar de su cobertura de 44% e identidad de 40% los residuos
catalíticamente activos se encuentran cubiertos por completo por esta plantilla. La
superposición de la arquitectura del sitio activo tuvo una precisión y un RMSD
mejor que el obtenido con 3ED4.
La figura 16 muestra la estructura resultante superpuesta con su 1AUK.A. El
RMSD fue 0.97, indicando una alta precisión del modelo.
110
Figura 16. hIDS (azul) y el molde 1AUK.A (Amarillo). Molecular Operating Environment v.2010.
La herramienta Structure Assessment tool (Swiss-Prot/ ExPASy) fue empleada
para la evaluación estereoquímica y energética del modelo. El plot de Anolea
111
(packing quality of the models) mostró que 85% de los residuos tienen valores
negativos (energías favorables), mientras GROMOS (empirical force field energy)
dio un 75%. La energía del modelo por Dfire fue -644, lo que sugiere una
conformación nativa. El QMEAN6 Z-score fue -8.46, (valores para estructuras
resueltas por difracción entre 0 y 1) lo que podría estar explicado por el porcentaje
de cobertura del template.
El plot de Ramachandran (Figura 17) muestra que 75% de los residuos están en la
región favorable, 16.3% en la región permitida y 8.3% en la región desfavorable.
Los resultados indican que los ángulos diedros φ y ψ en el modelo de la hIDS son
razonablemente acertados.
Figura 17. Plot de Ramachandran. RAMPAGE.75% de los residuos en la región
favorable, 16.3% permitida y 8.3% desfavorable. Los resultados indican que los
ángulos diedros φ y ψ en el modelo de la hIDS son razonablemente acertados.
112
6.8.2. Docking Molecular de la hIDS tipo silvestre
La hIDS fue sometida a docking molecular contra su sustrato Heparán sulfato (HS).
El modelo 1 fue seleccionado por su mejor energía global (-8.5 kcal/mol) y su
orientación espacial dentro del pocket catalítico. La evaluación con Ligplot+
permitió identificar las interacciones proteína-sustrato, que fueron principalmente
de tipo electrostático. Las interacciones significativas involucran el O-2 sulfato del
Ácido Glucurónico (GlcA) con Cys84, Tyr165, Leu244 y Arg297. Interacciones
electrostáticas fueron también vistas entre el grupo carboxilo de GlcA y Asn106
(Figura 18). En la porción externa del pocket, tres puentes de hidrógeno se
observaron entre un monómero diferente de GlcA, Leu189 y Asp187.
El resultado del docking realizado contra Dermatan sulfato (DS) fue muy similar a
lo descrito para HS, involucrando al Acido idurónico (IdoA) en lugar de GlcA.
Figur
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113
os en el
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3.6 Å de
114
6.8.3. Modelamiento y docking de las IDS mutantes
Cada mutante fue modelada independientemente en MOE, empleando como
plantilla la estructura obtenida de la hIDS silvestre. En la tabla 14 se resumen los
RMSD y ASA para cada uno de los modelos.
Tabla 14. RMSD y ASA calculados para cada modelo de las IDS mutantes,
empleando los programas MOE y Getarea, respectivamente.
MUTACIÓN A NIVEL DE PROTEÍNA
Fenotipo RMSD (Å)
ASA
Å2 x 103
Wild type - - 2,15
R468Q N 0,18 2,3
Q465X N 0,28 2,0
K347Q N 0,13 2,2
K236N N 0,21 2,1
S71N No N 0,19 2,33
P160S fsX4 N 0,38 2,25
D190PfsX13 N 0,27 3
P185WfsX23 N 0,34 3
P62QfsX67 N 0,17 3,3
R294GfsX2 N 0,24 3
Del Q200_E2003(QSTE) N 0,62 2,4
Se describen a continuación las características de los modelos generados y el
docking de cada mutante por separado.
115
R468Q
La alteración del procesamiento postraduccional de esta mutante ha sido
demostrada experimentalmente: en un Western blot del extracto protéico obtenido
a partir de células COS7 transfectadas con esta mutante, sólo fue encontrado el
precursor de la enzima (75kDa) (Charoenwattanasatien et al., 2012). Por
consiguiente, la secuencia del precursor de 550aa fue empleada para construir el
modelo.
La figura 19 ilustra las interacciones, el grupo O2-sulfato del ácido urónico del
sustrato interactúa principalmente con Arg 297 formando con éste un puente de
hidrógeno; otras interacciones electrostáticas fueron con Tyr105 y Asn106. Es de
resaltar que Cys84 interactúa con el O3, mas no con el sulfato a ser removido.
Figur
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117
Figura 20. Docking de Q465X. Arg 297 es el único residuo que figura también en el
docking de hIDS silvestre. No aparece Cys84 en el resultado de esta simulación.
K347Q
En el docking de K347Q, el O-2 sulfato del ácido forma puentes de hidrógeno con
Asp45 y Arg297 (Figura 21).
Figur
en el
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en el doc
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el. Exón 7
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minoácido
o Leu240.
doA/GlcA e
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s como
en lugar
121
Figura 25. R294GfsX2 (Del. Exon 7). No se observaron interacciones
electrostáticas importantes con el O-2 sulfato del ácido urónico. Con otros grupos
de IdoA/GlcA interactúan Cys84, Ala82, Val83 y Asp45.
Las nuevas mutaciones tipo frameshift (con corrimiento del marco de lectura)
P160SfsX4, D190Pfs13, P185GfsX2 y P62QfsX67 pierden la gran mayoría del
sitio catalítico y tienen menos de 203 aminoácidos. El docking molecular en estos
casos no tiene utilidad y las estructuras de estas proteínas truncadas se muestran
en la Figura 26.
122
Figura 26. Verde, P160SfsX4; azul, P185GfsX2; magenta, D190Pfs13X.
Obsérvese la severa distorsión de la geometría de estas estructuras y gran
cantidad de coils. Pymol v 1.3.
123
7. DISCUSIÓN
7.1. Características clínicas
Este estudio incluyó un total de 18 pacientes colombianos con Síndrome de Hunter
para su caracterización fenotípica, genotípica y realización de un análisis
bioinformático sobre las repercusiones de las mutaciones sobre la estructura
tridimensional de la enzima. Es el primer estudio en América en realizar el análisis
molecular de la MPSII con tres metodologías de laboratorio disponibles para esta
patología y en llevar a cabo simulaciones in silico con las mutaciones encontradas.
Otros tipos de MPS han sido estudiados en América Latina, incluyendo MPS VI -
Maroteaux-Lamy- en pacientes de Argentina (Garrido et al., 2007), MPS IVA en
pacientes latinoamericanos (Tomatsu et al., 2004.,) y pacientes del área andina
con MPS I(Matte et al., 2001), (Velasco, Pineda, et al., 2011; en evaluación),
aportando al conocimiento del perfil mutacional de las MPSs.
El Síndrome de Hunter de tipo neuronopático (Hunter A) fue el más frecuente,
correspondiendo al 88% (n= 16) de los casos, mientras el fenotipo no
neuronopático (Hunter B) se presentó en el 11% de los pacientes (n=2). Los
criterios para establecer el subtipo de enfermedad fueron clínicos, basados en las
características del neurodesarrollo y el lenguaje observadas en la historia clínica y
durante el examen físico. Los dos pacientes no neuronopáticos presentaron un
nivel de escolaridad esperado para la edad (el individuo adulto es profesional
124
universitario), mientras que los 16 pacientes restantes presentan retraso global del
desarrollo (<5 años) o retraso mental de moderado a grave (>5 años).
Según una revisión europea sobre los aspectos epidemiológicos y clínicos de la
MPS II, dos tercios de los pacientes presentan fenotipo neuronopático (75%), lo
cual es similar a lo encontrado en nuestra población (Wraith, Scarpa, et al., 2008).
En una serie de 77 pacientes de Brasil los investigadores clasificaron a los
pacientes sin deterioro cognitivo como no neuronopáticos únicamente si contaban
con 10 años de edad o más al momento de la inclusión en el estudio(Schwartz, et
al., 2007). Por otro lado, reporte inicial del Hunter Outcome survey (HOS) que
incluyó población de Europa, Norteamérica, Latinoamérica y Asia no clasificó la
población en los dos fenotipos, severo y atenuado (Wraith, Beck, et al., 2008).
Todo lo anterior dificulta la comparación de las frecuencias de fenotipos con dichas
poblaciones.
Adicionalmente, carencia de instrumentos de clasificación mundialmente avalados
para síndrome de Hunter dificulta el diagnóstico preciso entre los dos subtipos de
la enfermedad. La hipoacusia y otros trastornos sensoriales podrían dar lugar a
interpretaciones falsas de retraso en el desarrollo cognitivo. Por otro lado, la MPS
IIB puede cursar con retraso mental leve. El estudio de Schwartz y colegas en
Brasil también alude a la necesidad de desarrollar instrumentos de clasificación
confiables (Schwartz, et al., 2007). Se hace necesario el seguimiento y evaluación
en el tiempo de nuestros pacientes para corroborar si la clasificación aquí mostrada
es acertada.
125
La media de la edad de inicio de los síntomas fue de 2.5 años (SD±1.55 años) para
todo el grupo, siendo en promedio 2.7 años para los neuronopáticos y 0.88 para los
no-neuronopáticos. El síntoma más frecuente fue retraso del desarrollo del
lenguaje (66.7%), seguido de rigidez de grandes articulaciones (26,5%) y
neumonía recurrente (20%).
El estudio de Young y Harper reportó en una serie de 84 pacientes en Gales una
edad promedio de inicio de síntomas de 2.47 años para fenotipo severo y 4.3 años
para la forma atenuada(Young, et al., 1982). En el reporte HOS se observaron
edades de 24 y 39 meses en promedio para el fenotipo severo y atenuado,
respectivamente; la otitis media y la hernia abdominal fueron los síntomas más
tempranos(Wraith, Beck, et al., 2008).
Schwartz et al., en Brasil reportaron que la media de edad de inicio de síntomas es
18 meses (1.5 años) para el fenotipo neuronopático, siendo las primeras
manifestaciones retardo en el lenguaje (90%), rigidez articular, macrocránea y
fascies tosca (Schwartz, et al., 2007). En este mismo estudio, la edad de inicio de
síntomas para el fenotipo no neuronopático fue 39 meses (3.7 años).
Los datos arriba anotados en relación con la edad de inicio muestran una relación
inversa a lo encontrado en nuestros pacientes, en los cuales el fenotipo
neuronopático tuvo una edad de inicio de síntomas más tardía según lo referido por
los padres. Esto se debe a la presencia de un dato extremo en uno de nuestros
126
pacientes con una edad de inicio de síntomas de 5 años, lo cual probablemente
sea atribuible a un sesgo de recuerdo.
La media de la edad al diagnóstico en la población estudiada fue de 6.06 años
(SD±4.35). Un resultado similar fue encontrado en población de Brasil (n=77), con
una edad promedio al diagnóstico de 6 años para todos los pacientes MPS II. El
mismo estudio observó que los pacientes con fenotipo atenuado eran
diagnosticados a una edad promedio de 14 años, más tardíamente que los de
fenotipo severo (7 años de edad en promedio) con una diferencia estadísticamente
significativa (p<0,001) (Schwartz, et al., 2007). El estudio multicéntrico HOS arrojó
un promedio de 4.1 (SD±3,2) años de edad al diagnóstico(Wraith, Beck, et al.,
2008),(S. A. Jones, et al., 2009).
La similitud con los datos arrojados por Schwartz y colegas para la edad al
diagnóstico indica que ha mejorado en nuestro país el conocimiento de los
profesionales sobre las MPSs y la reciente disponibilidad de herramientas de
diagnóstico en laboratorios de referencia en el ámbito bioquímico.
Los pacientes de nuestra población tuvieron una talla sobre +2 SD en los primeros
años de vida, que se normalizó hacia los 8 años de edad y luego se produjo un
descenso en el crecimiento inferior a -3 SD en la adolescencia. Similares
resultados se observaron en el reporte HOS, con normalización de la talla entre los
9 y 19 años de edad (Wraith et al., 2008).
127
En nuestra población de estudio las manifestaciones más frecuentes asociadas a
morbilidad fueron movilidad articular disminuida 88,8% (n=16/18); hipoacusia
83,3% (n=15/18); infecciones recurrentes de vía aérea superior 72,2% (n=13/18);
otitis media aguda 55,6% (n=10/18) y convulsiones 44,4% (n=8/18).
En la serie HOS se encontró frecuentemente rigidez articular (84%) y otitis (74%),
la prevalencia de otras manifestaciones se agruparon por órganos o sistemas,
complicaciones asociadas al oído/audición disminuida, 90%; sistema neurológico
83%; y vía aérea superior 77% (Wraith et al., 2008).
En nuestros pacientes, comorbilidades como la hipertrofia de amígdalas y
adenoides 61% (n=11/18) y cardiopatía 55,6% (n=10/18) tienen diferente
frecuencia a lo reportado en la serie HOS: hipertrofia amígdalas/adenoides 79%
afección cardiovascular 81% (Wraith et al., 2008).
La neumonía a repetición se presentó en 66.7% (n=12/18). En los registros HOS
se reporta un 80% de prevalencia de alteraciones pulmonares incluida la
neumonía, la cual es una causa menos frecuente de muerte (Wraith et al., 2008).
Dentro de las cardiopatías el defecto más frecuente en nuestros pacientes
colombianos fue la afección–insuficiencia, mixoma o displasia- de la válvula mitral
(40%; n=4/10), lo cual concuerda con la serie HOS, donde las anomalías
valvulares sumaron 53% (Wraith et al., 2008). En la serie de Brasil, la regurgitación
mitral se presentó en el 63% y el engrosamiento de la válvula se documentó en
36.8% (Scwartz, et al., 2007).
128
Hallazgos en las neuroimágenes tales como ventriculomegalia, alteración de la
sustancia blanca y del parénquima cerebral y adelgazamiento del cuerpo calloso
han sido descritos en las MPSs (Calleja et al., 2012). También se encuentra
reportada la presencia de lesiones quísticas principalmente en cercanía o dentro
del cuerpo calloso (Shinomiya et al., 1996) pero no hay reportes de lesiones en
SNC que sean distintivas de MPSII.
7.1.1. Características enzimáticas
La medición de la actividad enzimática en muestra de sangre seca en papel de
filtro es un estudio de pesquisa, mientras que el ensayo en cultivo de fibroblastos o
leucocitos es la prueba confirmatoria(Martin, et al., 2008). El 82% de los individuos
en este estudio fue confirmado por actividad medida en leucocitos. Un 12% tiene
hasta la fecha sólo el resultado en papel filtro pero las manifestaciones clínicas y la
genotipificación son prueba del diagnóstico de MPSII.
La razón principal por la cual estos cuatro pacientes carecen aún de análisis
enzimático en cultivo de leucocitos o fibroblastos son las limitaciones económicas
y/o geográficas de las familias para trasladarse directamente al laboratorio de
referencia, ya que se requiere muestra fresca para dicho análisis.
Parkinson et al. reportan que ni la cantidad ni la actividad de la IDS se
correlacionan con la severidad del fenotipo(Parkinson, et al., 2004). En este estudio
no se observaron diferencias estadísticamente significativas entre los valores de
129
actividad enzimática en el grupo de pacientes incluyendo ambos fenotipos, lo cual
es congruente con lo anotado por expertos: la actividad de la IDS es igualmente
deficiente en ambas formas de la enfermedad (Scarpa et al., 2011).
7.2. Perfil mutacional y comparación con la literatura
Con el empleo de MLPA, genotipificación y RFLPs se logró en este estudio la
confirmación del diagnóstico molecular en el 88% de los pacientes (n=16/18).
Las mutaciones en los pacientes 002, 010 y 011 involucraron un número
importante de nucleótidos (deleciones e inserciones de 12 a 20 nt) pero no fueron
detectadas por MLPA. Esto ocurrió porque las sondas X-148.4 específicas para el
exón 5 hibridan corriente abajo de la alteración hallada en el exón 5, sin flanquear
esa región en todos los tres casos.
Al analizar los datos genotípicos observamos una alta frecuencia de mutaciones
privadas (42%). En una serie de 155 pacientes europeos provenientes
principalmente de Francia, Portugal, Túnez y Suiza se reportó hasta un 64% de
mutaciones privadas (Froissart, et al., 2007). Otra serie de 38 pacientes en China
tuvo un 45% de mutaciones nuevas (Zhang, et al., 2011).
Dentro de las mutaciones recurrentes en individuos no relacionados de fenotipo
neuronopático (Hunter A), la más frecuente fue R468Q (pacientes MPSII003 y
008), en la cual hay una transición de Guanina a Adenina en la posición 1403 del
130
cDNA ocasionando en la proteína la sustitución de Arginina, aminoácido cargado
positivamente, por una Glutamina, con carga neta cero.
La mutación R468Q se ha reportado en series de pacientes de Japón (Sukegawa
et al., 1995), (Isogai et al., 1998), Reino Unido (Vafiadaki et al., 1998), Estados
Unidos (Li et al., 1999), Taiwan (Lin et al., 2006), Francia (Froissat et al., 2007) y
China (Zhang et al., 2011).
En cuanto a las demás mutaciones, cada uno de los pacientes tuvo una única
mutación individual, y todas fueron puntuales (Q465X, K347Q, K236N).Sus
implicaciones funcionales se discutirán más adelante.
Tres pacientes en los cuales no se pudo establecer el diagnóstico molecular por
MLPA y secuenciación directa fueron llevados al método de RFLPs para detección
de rearreglos IDSP1/IDS, demostrando la presencia de un fenómeno de conversión
en el paciente MPS II 013.
Este evento de conversión que involucró al intrón 3 ha sido reportado previamente
en un paciente alemán (Bunge et al., 1998) y en un paciente italiano (Lualdi, et al.,
2005). Ambos tenían fenotipo neuronopático. Este evento de conversión genera un
gen IDS que contiene regiones recombinantes con IDSP1 en los intrones 3 y 7.
Una timina en la posición 292879 es el punto de ruptura en el intrón 3 que es
reemplazado por citosina del intrón quimérico 3-7 (Figura 27). De esta manera se
yuxtapone también el intrón 7 con su homólogo del IDSP1 y por medio de
recombinación no recíproca se producen las regiones recombinantes en los
intrones 3 y 7 (Figura 5) (Birot et al., 1996, Bunge et al., 1998, Lualdi et al., 1995).
131
Figura 27. Modelo propuesto para el mecanismo de recombinación en el intrón 3, a
partir de los datos de Lualdi et al., 2005. En azul IDSP1 con la hebra invadiendo la
región del gen a partir del punto de ruptura T 292879>C y recombinación no alélica
por yuxtaposición de regiones homólogas de exón 3 (barra amarilla) e intrón 7
(triángulo).
En total se observaron 2 mutaciones consistentes en rearreglos complejos: la
conversión en el intrón 3 y la deleción del exón 7 detectada por MLPA la cual no
ha sido reportada previamente, representando el 16% de las mutaciones en
nuestra población colombiana. Esto es similar a lo reportado en la literatura, donde
se refiere un 20% de estos fenómenos de recombinación, en población de Suecia
(Steen-Bondeson, et al., 1002), Alemania (Bunge et al., 1998), Italia (Lualdi et al.,
2005), Francia (Froissart et al., 2007).
Las mutaciones privadas fueron mayoritariamente pequeñas inserciones y
deleciones con corrimiento del marco de lectura, sumando éstas el 38% del total de
los alelos y todas pertenecientes a pacientes con fenotipo neuronopático. Llama la
atención que la mitad de estas (3/6) se presentaron en el exón 5, el cual hace
codifica los aminoácidos desde la posición 171 a 239, del dominio N-terminal,
adyacentes al core catalítico.
132
Nosotros encontramos 2 mutaciones en el exón 9 (R468Q y Q465X). Una mayor
frecuencia de mutaciones en el exón 9, en su mayoría tipo missense y recurrentes
ha sido reportada en series de Corea (Sohn et al., 2012), y China (Zhang et al.,
2011).En este grupo de pacientes colombianos sólo hubo una mutación en el exón
2 y ninguna en el exón 3. Sin embargo se observa una lata frecuencia de
mutaciones en exones 2 y 3 en población de Europa (Froissart et al., 2007),
además de Corea (Kim et al., 2003) y China (Zhang et al., 2011). El estudio de
Sohn et al. en población coreana encontró un número importante de mutaciones en
el exón 5 (Sohn, et al., 2012), similar a lo encontrado en nuestro estudio.
Los dos pacientes no relacionados de fenotipo no neuronopático (Hunter B)
presentaron la misma mutación S71N, la cual ha sido publicada hallándose en
pacientes europeos con este mismo fenotipo(Froissart, et al., 1998).
En este estudio no se identificaron mutaciones en sitios del splicing, ni deleción
completa del gen IDS o de más de un exón. En un estudio de Portugal se reportó
una importante incidencia de mutaciones en sitios del splicing (seis mutaciones
intrónicas y dos exónicas de sitios de splicing) , lo cual generaba transcriptos
aberrantes, involucrando exones 2 y 3, intrón 2, y rara vez el intrón 3 (Alves et al.,
2006). Estas diferencias en la distribución de las mutaciones, probablemente se
deban al acervo étnico – genético interpoblacional.
En dos casos no se pude establecer el diagnóstico molecular por las técnicas
arriba mencionadas. Filocamo et al. reportaron en Italia que hasta un 17% de la
muestra puede ser negativa a pesar del diagnóstico clínico y bioquímico
133
confirmado (Filocamo et al., 2001). Una de las posibles causas de este hallazgo es
que los pacientes presenten eventos de recombinación no incluidos en los cuatro
rearreglos tamizados aquí (Lualdi et al., 2005), o a la presencia de una mutación
intrónica o alteraciones en el patrón de metilación.
Existe un reporte de una mutación intrónica, distante de la región flanqueante del
exón, en un paciente de origen alemán. Esta mutación fue identificada en el intrón
7, y crea un sitio de splicing que ocasiona la inclusión de 78 bp intrónicos en el
mRNA (Rathmann et al., 1996).
Por otro lado, Tomatsu et al., demostraron que las islas CpG el exón 3 de
pacientes varones sanos están hipometiladas mientras que en pacientes con
MPSII se encuentra hipermetilada. Los investigadores postularon este estado de
hipermetilación como factor predisponente para transiciones y por ende
mutaciones (Tomatsu et al., 2006), pero aún no se ha demostrado la existencia de
anomalías de metilación aisladas en como defecto genético primario en MPSII.
7.3. Análisis bioinformático y repercusión de las mutaciones en la estructura
tridimensional de la IDS
Se puede observar, tal como lo han demostrado estudios moleculares en otros
países, que la MPS II tiene una alta heterogeneidad alélica y la correlación
genotipo/fenotipo es difícil de establecer. Por otro lado, existen pocos reportes
sobre ensayos in vitro que evalúen la expresión y grado de afectación de la enzima
con estas mutaciones. Nosotros realizamos una aproximación inicial para un mayor
134
entendimiento de la repercusión de las mutaciones identificadas sobre la estructura
de la IDS empleando herramientas bioinformáticas.
La estructura tridimensional de la hIDS obtenida fue empleada para simular la
interacción enzima-sustrato (docking molecular) encontrando que el HS/DS se une
a la enzima en un pocket catalítico conservado, como se muestra en la figura 18.
Kato et al. realizaron en 2005 el modelamiento tridimensional de la IDS y
reportaron que los residuos que hacen parte del sitio catalítico son Asp45, Asn46,
Cys84, Arg88, Lys135, His138, Asp334, His335 y Lys347, pero este grupo no
realizó simulaciones tipo docking. En contraste, la simulación aquí presentada
encontró además de Cys84, los residuos Arg297, leu244, Tyr165 y Asn106 como
parte del sito catalítico. Probablemente la unión del metal catiónico requerida para
la actividad catalítica induzca cambios en los aminoácidos presentes en el pocket,
pero este tipo de simulaciones están fuera de los alcances de nuestro trabajo.
El residuo de Cys84 mostró en este análisis una interacción electrostática con el
grupo O-2 sulfato del ácido urónico, lo cual está en concordancia con la función
biológica de la enzima. El puente de hidrógeno formado a la entrada del pocket
podría servir como punto de fijación entre la enzima y el sustrato durante la
reacción bioquímica (Negishi, Dong, Darden, Pedersen, & Pedersen, 2003).
Respecto a las mutantes de IDS, el docking reveló que incluso una mutación
puntual puede alterar toda la estructura tridimensional de la proteína. Todos los
valores de RMSD indicaron alteración estructural, ya que presentaban valores muy
inferiores a 0.5Å. Esto se explica porque al superponer cada proteína mutante con
135
su plantilla (IDS wild type), la distancia entre los átomos de ambas estructuras
varía de tal manera que se obtienen RMSD con valores muy diferentes al
esperado, es decir, cercano a 1 Å para proteínas con alta similitud estructural. En
contraste, al superponer a IDS wild type con su homólogo 1AUK.A se obtuvo un
RMSD de 0,97. Las diferencias en los valores de ASA indican que en cada mutante
los cambios estructurales acarrean consigo diferencias en los aminoácidos
expuestos a la interfase hidrofílica.
En la mutación R468Q un residuo cargado positivamente (Arginina), es
sustituidopor uno polar no cargado (Glutamina), lo cual podría resultar en un
cambio en la afinidad por el sustrato y no sólo en la estructura terciaria. El
fraccionamiento subcelular demostró que la mutante R468Q tiene además un
pobre transporte a los lisosomas (Villani, Daniele, Balzano, & Di Natale, 2000)
Un trabajo publicado por Kato et al. plantea la hipótesis de que la mutación no
conservativa en R468 podría afectar el campo electrostático para la entrada del
sustrato en la cavidad del sitio activo, generando una enzima inactiva (Kato et al.,
2005). Los resultados del Western blot publicados más tarde por el mismo grupo
mostraron sólo precursores primarios, indicio indirecto de cambios estructurales en
la proteína (Sukegawa-Hayasaka et al., 2006).
La mutación Q465X, como la anterior, se asocia con fenotipo neuronopático. Hay
escasos reportes acerca de esta mutación recurrente, y ninguno de estos contiene
abordajes computacionales (Li et al., 1999). El docking realizado en este trabajo
mostró ausencia de Cys84 en el core catalítico (Figura 22). Aunque los residuos en
el extremo carboxilo-terminal no tienen directa participación en el sitio catalítico, los
136
cambios conformacionales que resultan de la interrupción de la secuencia primaria
podrían alterar los aminoácidos presentes en él. Adicionalmente, el codón de
parada causa la pérdida de dos potenciales sitios de glicosilación –N513 y N537-
con potenciales consecuencias en el transporte subcelular (Millat, et al., 1997).
Sukegawa et al. demostraron in vitro que todas las mutantes por ellos estudiadas y
asociadas con fenotipo severo sintetizan únicamente formas precursoras, lo cual
sugiere que los cambios estructurales de estas mutaciones tienen consecuencias
sobre los eventos postraduccionales (Sukegawa-Hayasaka et al., 2006)
En la mutante K347Q un aminoácido cargado positivamente (Lisina) es sustituido
por uno polar no cargado (Glutamina). Se encuentra reportado que Lys347 se
encuentra adyacente al sitio activo. Esta mutación no conservativa podría modificar
severamente el core catalítico. A pesar de que Cys84 aparece en el docking, las
diferencias en las interacciones atómicas podrían estar explicando la deficiente
actividad enzimática.
Por otro lado, K236N es una mutación sólo reportada una vez en un paciente de
Bulgaria, y no existen por ahora más estudios sobre ella(Gucev et al., 2011)
La muestra de pacientes estudiada incluye solo dos pacientes con fenotipo no
neuronopático y en ambos la mutación S71N (recurrente) fue identificada. Tanto en
el modelo silvestre como en el mutante, el residuo en la posición 71 se observó
distante del core catalítico. Otras mutantes reportadas en asociación con este
mismo fenotipo han sido estudiadas in vitro, encontrando que R48P y W337R no
siguen un proceso de maduración normal (evidenciado por el precursor de 73-
137
75kDa en el Western blot), mientras que A85T sí se procesa a la forma madura de
55-45kDa. No existen hasta la fecha estudios similares sobre la mutante S71N, así
que nosotros realizamos el modelamiento y docking de esta mutante con ambas
formas (madura y precursor) encontrando los mismos resultados, que se explican
en la sección correspondiente.
El resultado del docking de S71N fue muy similar a lo encontrado en el wild type
excepto por la formación de puentes de hidrógeno con el grupo O-2sulfato del
ácido urónico. Propondriams que este cambio dentro del sitio catalítico dificulta la
resolución del intermediario éster-sulfato y por lo tanto la actividad catalíca, pero
queda sin explicar lo que ocurre con la enzima en el SNC de estos pacientes con
inteligencia normal. Hay pocos reportes acerca de la corrección de mutaciones a
nivel traduccional, en especial en casos de presentación atenuada de la
enfermedad (Bunge et al., 1993) (Lualdi et al., 2010). Se requiere mayor
investigación de esta mutante c.212G>A (S71N) buscando posibles eventos de
corrección del mRNA o cualquier otro fenómeno traduccional o de procesamiento.
Del.Q200_E203 y R294GfsX2 (Del. exón 7) son dos nuevas mutantes
encontradas en este grupo de pacientes. El análisis de docking mostró unas
interacciones marcadamente distorsionadas dentro del pocket, especialmente en el
caso de R294GfsX2, la cual pierde 254 aminoácidos y con ello gran parte del core
catalítico.
El análisis estructural indicó que las mutantes privadas P160SfsX4, D190Pfs13X y
P185GfsX2 pierden la mayoría de la estructura del dominio catalítico, ya que
138
carecen de 386, 347 y 363 aminoácidos respectivamente (más del 50% de la
proteína), así que se puede inferior de ello que estos polipéptidos distorsionados
no retendrán actividad enzimática y el docking molecular no tiene utilidad en este
caso.
7.4. Potenciales implicaciones en el tratamiento de la MPSII
La identificación de las mutaciones en la MPSII tiene utilidad en la detección de
portadoras con el fin de brindar un adecuado asesoramiento genético. Sin
embargo, a pesar de la disponibilidad de estrategias como la fertilización asistida
con óvulos de donante y el diagnóstico preimplantacional, la prevención de nuevos
casos de MPS II no siempre es posible en nuestro medio.
El conocimiento de la mutación en una familia permitiría dar a la paciente gestante
la información de la probabilidad de que su hijo, en caso de presentar MPSII,
pueda cursar con fenotipo neuronopático o no neuronopático, y esto tiene
implicaciones en el tratamiento del paciente.
Guffon y colegas realizaron seguimiento a ocho pacientes con MPS II sometidos a
transplante de médula ósea, concluyendo que sólo la forma no neuronopática
podía beneficiarse con este tratamiento, sin embargo, al momento de la
intervención los pacientes tenían entre 3 y 16 años de edad.
139
Un trabajo reciente de Tanaka y colegas en Japón empleó transplante de células
madre hematopoyéticas (HSCT) en pacienes con MPSII a edad más temprana
observando mejoría en el compromiso del SNC en los pacientes con fenotipo
neuronopático (Tanaka et al., 2012).
Basados en este último estudio, la intervención temprana con transplante de HSC
al paciente en quien se ha identificado una mutación relacionada con fenotipo
neuronopático tendría una posibilidad de 85% de mejoría en el aspecto cognitivo,
además de los beneficios en las manifestaciones somáticas (Tanaka et al., 2012).
En el paciente en el cual se identifique una mutación asociada con fenotipo no
neuronopático, la Terapia de Reemplazo Enzimático con Idursulfase sería la opción
más acertada (Muenzer et al., 2012).
La Terapia con Chaperonas Farmacológicas es un campo emergente en las
enfermedades de depósito lisosomal y se encuentran disponibles para enfermedad
de Fabry y Gaucher en estudios clínicos fase 3 y 2, respectivamente (Valenzano et
al., 2011).
En relación con las MPS, los síndromes de Sanfilippo tipo C y Morquio B poseen
chaperonas farmacológicas en fase preclínica de investigación (Feldhammer,
Durand, & Pshezhetsky, 2009),(Schitter et al., 2010),(Fantur et al., 2010). El
conocimiento acerca de la distribución de las mutaciones en la IDS y sus efectos
funcionales sobre sus propiedades catalíticas o su estabilidad podrían tener
implicaciones en el diseño y desarrollo de nuevos agentes terapéuticos.
140
Las mutaciones periféricas (presentes en la interfase hidrofílica de la proteína y
distantes del core catalítico) como R468Q, Q465X y S71N podrían ser susceptibles
de terapia con chaperonas farmacológicas, a través del rescate del sistema de
control del retículo endoplasmático, corrección del procesamiento y del transporte,
para finalmente lograr la translocación de una enzima activa dentro del lisosoma.
141
8. CONCLUSIONES
El presente estudio constituye el primer acercamiento colombiano a la
genotipificación del gen Iduronato 2 sulfatasa en pacientes con MPSII.
En nuestra población se observó una edad de inicio de síntomas de la MPS II
con un comportamiento inverso a lo reportado en la literatura para los fenotipos
neuronopático y no neuronopático, pero la edad al diagnóstico fue similar a lo
reportado en Brasil (6 años). Así mismo, coincide con la literatura la alta frecuencia
del retraso del lenguaje como síntoma inicial en el fenotipo neuronopático.
Las características fenotípicas tales como rigidez articular, hipertrofia de
adenoides/amígdalas y otitis media tuvieron similares frecuencias a las descritas
en la literatura, igualmente ocurrió con los factores de morbimortalidad como las
cardiopatías y el compromiso del SNC.
El estudio de genotipificación presentó una considerable complejidad, ya que
requiere la implementación de al menos tres metodologías para lograr una
sensibilidad del 88%. Similares hallazgos se han reportado en otras poblaciones.
El diagnóstico molecular es de crucial importancia en la identificación de
portadoras, ya que, como se observó en dos mujeres portadoras y en la literatura,
el análisis enzimático puede resultar en falsos negativos.
142
La frecuencia de mutaciones nuevas (42%) es similar a lo reportado en
pacientes de China y la alta frecuencia de mutaciones nuevas en el exón 5
coincide con los datos de un estudio en pacientes coreanos. Por otro lado, la
ocurrencia de rearreglos complejos fue similar a lo observado en series de Europa
y Asia.
El uso de herramientas bioinformáticas fue de gran utilidad para predecir las
repercusiones de las distintas mutaciones sobre la estructura tridimensional de la
IDS humana, encontrando que mutaciones puntuales como R468Q, Q465X ó S71N
alteran su conformación, lo que se reflejó en un cambio en los RMSD totales. El
docking molecular permitió conocer los cambios a nivel del sitio catalítico de cada
mutante, pudiendo observar interacciones enzima-sustrato con diferencias
respecto al tipo silvestre de la enzima.
143
9. LIMITACIONES Y PERSPECTIVAS
A pesar de haberse realizado Secuenciación, MLPA y RFLPs, aún quedaron sin
diagnóstico molecular dos pacientes (MPSII004 y 0014). Es necesario por lo tanto
el análisis de los transcriptos y eventualmente, la búsqueda de alteraciones
intrónicas o en los patrones de metilación del gen IDS en estos dos casos, lo cual
no fue posible en este estudio por limitaciones presupuestales y del cronograma.
Las perspectivas de este trabajo son en primera instancia el ofrecimiento de
herramientas para diagnóstico molecular temprano para los pacientes, de manera
que se pueda establecer con prontitud la clasificación del fenotipo de MPS II y
poder anticipar el manejo adecuado, además de tener a disposición la información
para el estudio de portadoras y brindar un asesoramiento genético integral a las
familias.
Por último, se requiere el diseño de estudios funcionales in vitro para estudiar la
repercusión de las mutaciones nuevas sobre la actividad de la enzima.
144
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