9como medimos aw 9si todos los componentes están en...

Como medimos aw?Si todos los componentes están en equilibrio, en el sitio

mas facil: En la fase vapor.A bajas presiones (gases ideales), aw es el cociente de

la presión parcial del agua en el vapor a la presión de vapor del agua pura a la misma temperatura.

0ppaW =

A presiones por encima de 5 bar, la termodinámica se hace mas complicada para la fase vapor, porque en vez de presiones debemos usar fugacidades.

Prof. J. M. Sánchez-Montero, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM


Caracterización del comportamiento de una enzima con agua en un disolvente orgánico puro.

La cantidad de agua unida a las enzimas en disolventes orgánicos es muy similar a la unida a las enzimas en aire a la misma aw, al menos a bajos valores.

Para caracterizar el comportamiento del sistema, debemos usar las isotermas de adsorción de agua.

P2O5

SECADO QUÍMICO DE LA ENZIMA

Cuando la enzima está seca, se pone rapidamente en el sensor de

humedad, y se rehidratalentamente


EFECTOS ESTRUCTURALES SOBRE LA SOLVATACIÓNUna variedad de observaciones hechas cuando las enzimas son rehidratadas desde el estado anhidro al estado de disolución han asociado cambios de hidratación con cambios en interacciones proteina-agua y dinámicas de proteínas. Basadoprincipalmente en un detallado trabajo sobre lisozima, el proceso parece conllevarcuatro etapas. PRIMERA ETAPAde 0 a 0.07 h=(gramos de agua por gramo de proteina), hay una redistribuciónprotónica (i.e., los grupos ionizables se ionizan) y las moléculas de aguainteracccionan con los grupos ionizables. Esto corresponde a una relación molar de 0 a 55 moleculas de agua por molécula de enzima. Si aceptamos que la superficie de la lisozima está completamente cubierta por »400 moléculas de agua,entonces esto se corresponde del 0% al 15% de la superficie de la enzima


. ..

Actividad de agua aw

g H2O / g enzima

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.00

0.07


En la segunda parte (0.07 a 0.30 h, corresponde a unarelación molar de 55 a 250, o 15%–65% cubierto), el agua se une a los sitiospolares y cargados.

. ..


g H2O / g enzima

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

0.070.30


En la tercera parte, entre 0.30 y 0.50 h, interacciones débiles. La superficie está cubiertahasta la monocapa de aguaLa formación es completa a 0.50 h.

. ..


g H2O / g enzima

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

0.500.30


. ..


g H2O / g enzima

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

0.500.30

En la cuarta etapa, por encimade 0.50 h, está construida la capa de hidratación, y la enzima muestra propiedadestermodinámicas en disolución. AGUA LIBRE EN DISOLUCIÓN


En que zona debemos trabajar?Dependerá del tipo de reacción química que queramos

catalizar.g H2O / g enzyme

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0. ..

0

Si no se ha liberado agua en el medio, hasta la etapa 3

Si se ha liberado agua en el medio, trabajamos a bajos valores.



Pero es mejor controlar el valor de actividad de agua, y no dejar que varíe

En cualquier caso, debemos trabajar a valores de aw fijosEsto puede hacerse usando pares de sales.


Dos formas:


Sánchez-Montero et al., Biotechnol. Letters, (1996), 18: 13-18.Sánchez-Montero et al., Biotechnol. Letters, (1997), 4: 303-306.

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0Aw

0.0

0.5

1.0

1.5

mg

de a

gua/

g de

mue

stra

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

g de

agu

a/m

l de

diso

lven

teLCRC en aire

LCRC en isooctano

Isooctano

50 1500 100Time (h)

20

60

0

40

Este

r Yie

ld (%

)

aw=1.0

aw=0.8

aw=0.2

aw=0.0

Esterificación deR, S-Ibuprofeno con lipasa de C. rugosa

aw=0,9aw=0,8aw=0,2aw=0,0


No es necesario inmovilizar para reusar: la filtración essuficiente.

Adsorción sobre soportes baratos (celita, sílice) essuficiente.

Es el camino más facil

No se produce desorción

Podría ser conveniente para dispersar la enzima, haciendo mayor la velocidad de reacción.

Un control de aw es necesario.


Bell et al., Biocatalyst behaviour in low-water systems. Tibtech 1995, 13, 468-473

El uso de actividad de agua simplifica la interpretación cuando el soporte y la enzima compiten por el agua. Efecto sobre la actividad catalítica de la Lipasa de C. rugosa inmovilizada en función de (a) actividad de agua (aw) y (b) Contenido en agua. El soporte usado fue poliamida (cruz), polipropileno (circulos huecos) o resinas de intercambio aniónico (circulos llenos)


Biotechnology Techniques, (1996), 4: 263-266

0 40 80 120 160Time (hours)

0

5

10

15

20

25

Est

er Y

ield

(%)

Preequilibrated reactions

aw=1

aw=0.9

aw=0.85

aw=0.75

aw=0.6

aw=0.4

aw=0.1

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0aw

0.0

0.4

0.8

1.2

1.6

mg

wat

er/g

sol

idAdsorption isotherms ofCALB silica derivative

in air

in isooctane

Fig. 3 Adsorption isotherms of CALB immobilizedon silica. Conditions for measurements: 200 mg ofderivative (ion air); 200 mg of derivative with 1mlof isooctane (in solvent).

Fig. 4 Esterification of ibuprofen catalyzed by immobilized CALB on silica-TCT. Conditions66 mM acid +66 mM 1-propanol; 37 º C; 300 rpm; 200 mg of derivativeml isooctane (15.6 mg SP525/g derivative).

Esterificación de Ibuprofeno racémico con 1-propanol


Qué disolvente debería ser usado?

En orden a proveer una medida de la compatibilidad de un disolvente orgánico con una alta actividad enzimática, se han propuestos algunos parámetros fisico-químicos que describan la hidrofobicidad del disolvente.

Los resultados mas fiables se han obtenido usando log P, logaritmo del coeficiente de partición de un disolvente dado entre 1-octanol y agua


-1.0 1.0 3.0 5.0-2 0 2 4log P

10

30

50

0

20

40

60

Este

r Yie

ld (%

)

Isooctane

Cyclohexane

1,1,1 TrichloroethaneToluene

Isobutyl-methyl KetoneDiethyl

etherAcetonitrile

CRSL

Enzyme Microbial Technology, (1999), 24: 182-190.


Sin embargo, algunos trabajos han descrito que no hay efectos de log P sobre la acividad enzimática o enantioselectividad.

Incluso la inversión de la enantioselectividad ha sido descrita cambiando el disolvente.

Hirose Y, Kariya K, Sasaki I, Kurono Y, Ebiike H, Achiwa K.Tetrahedron Lett 1992; 33:7157–60.


Michels, P. C., Dordick, J. S. & Clark, D. S. Dipole formation and solvent electrostriction in subtilisin catalysis. J. Am. Chem. Soc. 1997 119, 9331–9335.

ENZIMAS EN DISOLVENTES ORGÁNICOS: DESVENTAJASActividad inferior comparada a disoluciones acuosas.


Existen métodos para incrementar la actividad de las enzimas en disolventes orgánicos ?

1. Cambiando de catálisis heterogénea a homogénea.

HACER LAS ENZIMAS SOLUBLES EN DISOLVENTES ORGÁNICOS

Primeros estudios: en los 50 y 60.La solubilidad de la proteína depende drásticamente

del disolvente.Solo unos pocos disolventes disuelven proteínas a un

nivel de 1 mg/ml o mayor.


d.- Enzimas modificadas covalentemente e.- Enzimas solubilizadas por surfactantes.

f.-Enzimas solubilizadas por polímeros. g.-Enzimas solubilizadas por microemulsión


d.- Enzimas modificadas covalentemente

Unión covalente de polímeros:a.-SINTÉTICOS O SEMISINTÉTICOS:Polietilenglicol (PEG)Poliacrilatos y polimetacrilatosPolistirenoPolivinilpirrolidonaPolietilen lauril eter (Brij35)

b.- POLIMEROS NATURALES:α ay β-glucanosMaltodextrinas, amilosa, soluble almidónDextranos

SINTÉTICOS O SEMISINTÉTICOS : Los ANFIPÁTICOS presentan una interfase entre la superficie hidrofílica de la enzima y el medio orgánico hidrofóbico

POLIMEROS NATURALES: Añade un escudo hidrofílico extra a la superficie de la enzima debido a su naturaleza HIDROFÍLICA.

Mas usados


ALGUNOS DISOLVENTES:alcohol tamílicoBencenoCloloroformoCiclohexanoDioxanoAcetato de etiloTolueno

PROBLEMAS:

El nivel de modificación (PEG) debe ser cuidadosamente controlado

ALTOS NIVELES o ALTOS PESOS MOLECULARES

Disminución en actividad


Biotechnology and Bioengineering,(1997), 55: 252-260

Table 1. Modification of semipurified lipase from Candida rugosa

aProtein concentration was determined by the hartree method using bovine serum albumin as standard (13). In all cases (CRSL, CRSL-pNPCF, CRSL-CC, CRSL-TNM) was prepared the same amount of the derivative (1g). The protein content was referred at final mass of the derivative.

Derivative % Modification (w/w)

% Proteina (w/w)

Number of residue

modified

Residue modified

CRSL 0 56 0 - CRSL-pNPCF-1/5 60 30 11 Lys CRSL-pNPCF-1/10 68 23 13 Lys CRSL-pNPCF-1/20 73 20 14 Lys CRSL-pNPCF-1/30 77 19 15 Lys CRSL-CC-1/5 72 20 14 Lys CRSL-CC-1/10 80 18 15 Lys CRSL-CC-1/20 87 15 17 Lys CRSL-CC-1/30 91 12 17 Lys CRSL-TNM 70 46 14 Tyr

N

NN

Cl

Cl

ClPEG-OH

N

NN Cl

PEG O

PEG O

E NH2

N

NN NH E

PEG O

PEG O

NO2 O CO

ClPEG-OH

NO2 O CO

PEGE NH2

CC PEG

pNPCP PEG

Figure 1. Diagram of PEG modification methodologies: (1) cyanuric chloride activated PEG;(2) p.nitrophenyl clhroformate activated PEG

PEG O CO

NH E


Enzyme and MicrobialTechnology,(1999), 24, 181-190

20 600 40 80Time (h)

10

30

50

0

20

40

60

Este

r Yie

ld (%

)

CRLA-pNFCF-1/20, aw=0.2

CRLB-pNPCF-1/20, aw=0.2

CRLA-pNPCF-1/20, aw=1.0

CRLB-pNPCF-1/20, aw=1.0

Esterification of (R,S) Ibuprofeno catalyzed by Lipase of C. rugosa A and B modified withpNFCF at aw 0,2 and 1. We compare your behaviour with pure lipases.

Table 4. Enantioselectivity of modified pure lipases from Candida rugosa (CRLA and CRLB) on the esterification of (R, S) ibuprofen.

aConversion to ester. bEnantiomeric excess [S (+) < R (-)] of the remaining acid. Experimental Conditions: 66 mM acid + 66 mM 1-propanol in 5 ml of isooctane; 30 º C; 10mg ml-1 of derivative; 300 rpm

Derivative Aw C(%)a Time (h) ee (%)b CRLA 0.2 3 24 1.8 CRLA 1.0 47 24 >98 CRLA-PEG-1/20 0.2 48 24 >98 CRLA-PEG-1/20 1.0 5.5 24 >98 CRLB 0.2 2 24 1.4 CRLB 1.0 49 24 >98 CRLB-PEG-1/20 0.2 40 24 >98 CRLB-PEG-1/20 1.0 3.6 24 2.2

Biotechnology and Bioengineering,(1997), 55: 252-260

Modificación con dextranos

EN GENERAL

Moderado incremento en la

actividad en comparación al

costo y problemas de purificación.


ESTERIFICACIÓN DE IBUPROFENO

CON n-PROPANOL.Preparado enzimático: LCRS/dextrano

(40/10 p/p).

(5 μL de agua/mg de preparado).

0 100 200 300t(h)

0

20

40

60

Con

vers

ión

(%)

0

5E-3

0.01

1.5E-2

0.02

mol

est

er/m

g pr

otei

na

μ

Dextranos

6 KDa

12 KDa

25 KDa

50 KDa

LCRC

LCRS

Cantidad de dextranos (w/w) en el complejo enzima-dextrano

Dextrans (MW)

Ratio Enzyme/dextran

Dextran (%)

Protein (%)

40/10 23.6 17.7

6,000 40/20 29.9 16.3

40/30 34,4 15.2

40/10 19,4 18.7

12,000 40/20 32,5 15.6

40/30 41,2 13.6

40/5 11,9 20.4

25,000 40/10 24,9 17.4

40/20 30,0 16.2

40/5 12,8 20.2

50,000 40/10 14,4 19.9

40/15 27,4 16.8 Biotechnology Letters, (1999), 4: 123-128Enzyme Microbial Technology. (2002), 30: 30-40


e.- Enzimas solubilizadas por surfactantes.

ENZIMAS RECUBIERTAS CON SURFACTANTES IÓNICOS.

IDEA BASICA: Reemplazo de los iones contrarios sobre la superficie enzimática con detergentes iónicos, en los que las cabezas no polares interactuan con los disolventes orgánicos.

ESTIMACIÓN: eficiencia con aproximadamente 30 moléculas de surfactante por molécula de enzima.

SURFACTANTES:Dodecil sulfato de sodio (SDS) para disolventes miscibles en agua, y bis(2-etil hexil)sulfosuccinato de sodio (AOT) para disolventes inmiscibles.

Este método conduce a enzimas activas y estables.

Dificultad para reciclar el catalizador.


f.-Enzimas solubilizadas por polímeros.

ENZIMAS RECUBIERTAS CON POLÍMEROS.

IDEA BASICA: Interación espontánea entreuna proteína y el agente que recubre, almismo tiempo protege la enzima del disolventeorgánico.

Técnica muy fácil, que no requiere ningunamodificacion previa y/o ninguna activación dela enzima ni del agente que recubre.

AGENTES DE RECUBRIMIENTO: Compuestos anfipáticos (para los que son inmiscibles en agua).

Una elección adecuada de la relación agente de recubrimiento/enzima es crucial. Ejemplo: Lipasa de Pseudomonas cepacia (PCL) recubierta con PEG = buenos resultados a bajas concentraciones de enzima (20 µg/ml) y PEG/relacionesmoleculares de enzima mayores de 150. Secundo et al., Biotechnol Bioeng 1999 62, 554–561.


AGENTES DE RECUBRIMIENTO: Polielectrolitos (para disolventes miscibles en agua)

Basados en la formación de múltiples interacciones electrostáticas e iónicas entre las cargas eléctricas del agente de recubrimiento y grupos ionizados de la enzima.Como la concentración de los disolventes orgánicos aumenta, la constante dieléctrica del medio disminuye por lo que las interacciones iónicas y electrónicas vienen a ser mayores.

Problema: El agente de recubrimiento es demasiado polar para ser usado en disolventes orgánicos puros.

f.-Enzimas solubilizadas por polímeros.


AGENTES DE RECUBRIMIENTO: Lípidos

Enzimas solubles y activas en disolventes hidrofóbicos y sistemas bifásicos.

Se ha estimado que son suficientes 150 moléculas de lípido para cubrir la proteína con una capa lipofílica.

Biotechnol Bioeng 2001, 76, 157–163.

LIPASA

Enzima recubierta de lípido


g.-Enzimas solubilizadas por microemulsiones

ENZIMAS EN MICROEMULSIONES.

Las proteínas son limitadas a un entorno sumamente estructurado de agua

El tamaño y la forma se gobierna por wo, relación molar agua / surfactante

disoluciones no reales, sino micro-emulsiones

No son realmente homogéneas, al menos desde el punto de vista de la composición microscópica

Problema: Son sistemas dinámicos, No son muy adecuados para propósitos industriales.


EXPLICACIÓN RACIONAL?

Simulaciones de Dinámica molecular (MD) de subtilisina BPN’solubilizada en surfactante en tres diferentes medios orgánicos, n-octano, tetrahidrofurano, y acetonitrilo, y saturados en agua.

Enzima Subtilisin BPN’ solubilizada en surfactante AOT


•Verde:residuos hidrofóbicos.

•Rojo:Maquinaria catalítica.

•Amarillo: S-ketoprofeno

•Azul: Residuos que cierran el hueco

DINÁMICA MOLECULAR DEL S-KETOPROFENO

SIMULACIÓN A 800 º K

SIMULACIÓN


La flexibilidad de la enzima completa y esqueleto, así como los residuos individuales, no muestran diferencias significativas entre agua y los tres disolventes orgánicos en una escala de tiempo de varios nanosegundos normalmente accesibles en simulaciones de dinámica molecular a gran escala.


El factor clave que distingue detalles a nivel molecular en diferentesmedios es la partición del agua de hidratación entre, la enzima y el disolvente utilizado. Dinámicas del agua en mediosorgánicos obtenidos de simulationes de DM .

Moléculas de agua pueden ser clasificadas en trescategorías: fuertemente unida(rojo), debilmente unida (azul), y movil (amarillo).Mientras que la mayoría de lasmoleculas de agua permanecencerca de la enzima en OCT, en THF son expulsadas de la superficie de la enzima, y en mucho mayor grado en ACN


El agua eliminada se acompaña por la penetración de moléculas de tetrahidrofurano y acetonitrilo en las cavidades de la superficie de la enzima y especialmente en el centro activo.

Disolventes orgánicos máspolares (THF y ACN) reemplazan moléculas de agua debilmente unidas y móviles en el centro activoy dejan el aguafuertemente unida en esaregión

Esferas grandes azules = moléculas de aguaestructural fuertementeunidas.Extensión de pequeñasesferas azules = moléculasde agua debilmente unidas o movil en la región del centroactivo

Pérdida de agua eliminada en octano = hidratación eficiente del centro activo uniformemente por agua móvil y débilmente unida = agua estructural similar a esta en disolución acuosa.


9como medimos aw 9si todos los componentes están en...

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