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Universidad Nacional del Nordeste Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

y Agrimensura

CTEDRA:

HEMATOLOGA CLNICA

TRABAJOS PRCTICOS

ALUMNO: GRUPO:....... AO: 2012

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INTEGRANTES DE LA CTEDRA: PROFESORA RESPONSABLE: BQCA. MARIA CRISTINA GUEVARA JTP ORDINARIA: BQCA. RINA MARINA TEJADA DE MARTNEZ AUXILIAR DOCENTE ORDINARIA: BQCA. ALENJANDRA SNCHEZ JTPs ADSCRIPTOS: BQCO. GONZALO ADRIN OJEDA - BQCA. CLAUDIA PATRICIA SERRANO - BQCA. VICTORIA IVAN AYUDANTES ALUMNOS: FLORES EZEQUIEL, TOANES CYNTHIA, DE FRACESCHI CRISTINA, HOCHMUTH INGRID, RADOVANCICH VIRGINIA, ARECHAVALA MILAGROS NMINA DE TRABAJOS PRCTICOS TP1: HEMOGRAMA 1 (HTO, HEMOGLOBINA, VSG, COLORACION MGG) TP2: HEMOGRAMA 2 (FRMULA NORMAL, RECUENTO DE GB) TP3: FRMULA PATOLGICA-ALTERACIONES SERIE BLANCA (MICROSCOPIA) TP4: ANEMIA ARREGENERATIVAS (MICROSCOPIA) TP5: ANEMIAS REGENERATIVAS (MICROSCOPIA Y RETICULOCITOS) TP6: INMUNOHEMATOLOGA (GRUPO Y FACTOR, COOMBS D e I) TP7: ELECTROFORESIS DE HEMOGLOBINA TP8: CITOQUMICA (MPO-PERLS-KLEIHAUER BETKE) MEDULOGRAMA (MICROSCOPIA) TP9: LMA (MICROSCOPIA) TP10: LLA-SLPC (MICROSCOPIA) TP11: LMC-SLPC (MICROSCOPIA) TP12: HEMOSTASIA PRIMARIA (RECUENTO DE Pq, TIEMPO DE SANGRA, TIEMPO DE COAGULACIN, RETRACCIN DE COGULO) TP13: HEMOSTASIA SECUNDARIA (TP, KPTT, MTODOS MANUALES Y AUTOMATIZADOS)

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MODELO DE INFORME (EL INFORME ES INDIVIDUAL) TP N GRUPO DE LABORATORIO: FECHA NOMBRE Y APELLIDO 1-ACTIVIDADES REALIZADAS (detallar en forma resumida las actividades realizadas) 2- RESULTADOS HALLADOS Determinacin Valor hallado Mtodo Valores de referencia 3- ELEMETOS OBSERVADOS Para los TPs de microscopia especificar cada uno de los elementos observados (coloracin y aumento) as como tambin, en caso de disponer de ellos, datos referentes al cuadro en que fue encontrado (edad, datos de hemograma, patologa, tratamiento, etc). Ej. Se observ un frotis con anisocitosis moderada (MGG 40x), correspondiente a un cuadro de anemia ferropnica en recuperacin (Nio 8 aos, GB: 7300 cel/mm3 GR: 4,18 x 106 cel/mm3 Hb 11,2 g%, Hto: 37 %, VCM: 87,3 fL, HCM 26,7 pg, CHCM 30,2 g%, RDW 18 %, Pq 323x103 /mm3, Tratamiento: Hierro oral) Ej. Se observaron numerosos esferocitos (MGG 100x) en un frotis perteneciente a un paciente con AHAI. 4- DISCUSION DE RESULTADOS (variaciones fisiolgicas, patolgicas, posibles causas de error, procedimientos para la validacin del resultado)

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TRABAJO PRCTICO N 1

HEMOGRAMA 1 (HTO, HEMOGLOBINA, VSG, COLORACION MGG) Ojetivos Generales - Puesta en prctica de normas de bioseguridad bsicas. - Prctica de los pasos para la obtencin de muestras de sangre venosa para la realizacin de las determinaciones incluidas en el hemograma. - Aplicacin de los criterios necesarios para la eleccin de anticoagulantes en funcin de las determinaciones a realizar. - Manejo del material necesario para las prcticas a desarrollar. - Interpretacin de resultados. 1 -Instructivo para la obtencin de sangre perifrica por puncin venosa 1. Durante la toma de muestra deben guardarse las ms estrictas normas de higiene. 2. El material descartable a usar se abrir slo al momento de su utilizacin y, una vez

manipulado, no podr guardarse nuevamente an cuando se lo considere nuevo. 3. Una vez realizada la toma de muestra, descartar inmediatamente los materiales usados en

recipientes para ese fin. 4. Al momento de hacer la extraccin colocarse los guantes desechables, los cuales se

mantendrn puestos durante todo el procedimiento. 5. Antes de iniciar la toma de muestra, tener TODO el material preparado. 6. Elegir una vena bien visible en el antebrazo, localizndola visualmente y por palpacin.

Colocar el lazo y volver a palpar la vena, indicarle al paciente que abra y cierre el puo para facilitar la extraccin.

7. Una vez identificada la vena, limpiar el rea circundante con algodn empapado en alcohol. Dejar secar.

8. En este momento se romper el sello de garanta de la aguja, se la colocar en la jeringa sin tocar con los dedos, controlando el correcto funcionamiento del mbolo.

9. La aguja se insertar en la vena elegida con el bisel hacia arriba, dejando que la sangre fluya en la jeringa aspirando suavemente con el mbolo. La escala de la jeringa debe estar visible (hacia arriba).

10. Despus de la toma, se le indica al paciente que abra la mano, se retira el torniquete y luego la aguja, presionando el lugar de la puncin con un trozo de algodn seco.

11. LA AGUJA SE DESCARTAR EN EL CONTENEDOR DESTINADO PARA ESE FIN.

12. La sangre que est en la jeringa se descargar en los tubos o frascos que contienen los anticoagulantes correspondientes, evitando hacer espuma y homogeneizando inmediatamente por inversin suave.

13. Rotular los tubos o frascos con los datos del paciente. 14. En el sitio de la puncin se pondr un apsito despus de controlar que no haya ms

sangrado. 15. La persona que hace la extraccin deber quitarse los guantes al finalizar la toma de muestra

y desecharlos inmediatamente. NO REUTILIZARLOS. 16. Si hay algn dato que haya interferido con el procedimiento, aclararlo en el registro de

muestras.

2 - Descripcin de los anticoagulantes usados en Hematologa Los anticoagulantes se utilizan para obtener plasma o muestras de sangre total para estudiar las caractersticas morfolgicas y realizar los recuentos celulares. Deben intentar que las clulas sanguneas a estudiar se encuentren en el estado ms parecido al fisiolgico. Para ello los anticoagulantes no deben alterar la morfologa de los leucocitos, el tamao eritrocitario, no producir hemlisis e impedir la agregacin plaquetaria, posibilitando al mismo tiempo el

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mximo perodo de conservacin de la muestra (generalmente no ms de 24 horas incluso refrigerada a 4 C).

Los anticoagulantes ms utilizados son:

EDTA (C10H16N2O8) o sal disdica, dipotsica o tripotsica del cido

etilendiaminotetraactico, actua mediante un efecto quelante sobre el calcio (Ca++), impidiendo el proceso de la coagulacin al fijarlo. ES EL ANTICOAGULANTE DE ELECCIN PARA HEMOGRAMA. Este anticoagulante se utiliza fundamentalmente para la realizacin de recuentos celulares, sobretodo en los autoanalizadores y permite adems la realizacin del hematocrito y del frotis sanguneo hasta dos horas despus de la extraccin de la muestra al mismo tiempo que impide la aglutinacin de las plaquetas. Las sales de potasio tienen la ventaja, respecto a las de sodio, de ser ms fcilmente solubles en sangre cuando las usamos a partir del producto slido, sin embargo , las tres sales afectan el tamao del eritrocito, especialmente despus del almacenamiento de la sangre anticoagulada por espacio de algunas horas. El International Council for Standardization in Hematology (ICSH) recomienda la sal dipotsica como anticoagulante para recolectar muestras sanguneas destinadas al recuento y caracterizacin del tamao celular y especialmente cuando los valores del hematocrito se requieren para la calibracin de los contadores automticos. El K2EDTA . 2H2O posee un peso molecular relativo de 404,1g; 1g quela 100 mg de calcio inico y el pH para una solucin al 1% es de 4.8 1,0. La cantidad de EDTA dihidratado agregada a la sangre debe ser de 1.5-2.2 mg/mL. de sangre total. Esta cantidad es un compromiso entre la cantidad requerida para evitar la coagulacin y la cantidad a la cual se producen las alteraciones celulares. Los productos habitualmente comercializados consisten en una solucin equilibrada de sales sdicas y potsicas de EDTA (0,342 mol/l) pH 7,2, con estas la proporcin recoemendad es 1/100 Ej: 10 L de anticoagulante para 1 mL de sangre (990 L estrictamente hablando).

HEPARINA SDICA. HEPARINA DE LITIO, es un anticoagulante fisiolgico que acta

impidiendo que la protrombina se transforme en trombina. Estructuralmente es un mucopolisacrido cido. Los frotis realizados con muestras sanguneas anticoaguladas con heparina producen en las tinciones panpticas un color azulado y una pseudovacuolizacin celular por lo tanto no se lo recomienda para tal fin. La proporcin adecuada es de 15-20 UI (0.1-0.2 mg) de heparina por ml de sangre.

CITRATO TRISDICO, C6H5O7Na3, acta impidiendo que el calcio se ionice, evitando

as la coagulacin. Se utiliza para realizar las pruebas de Hemostasia en una proporcin sangre: anticoagulante 9:1 (Por Ej.:2mL sangre con 250L anticoagulante); as como para la velocidad de eritrosedimentacin en una proporcin sangre: anticoagulante 4:1 (Por Ej.: 2 mL sangre con 500 L anticoagulante).

ACD se emplea fundamentalmente en Bancos de Sangre para conservar las unidades de

sangre y estudios metablicos eritrocitarios por permitir una buena conservacin de los hemates. Se utiliza en una proporcin de un volumen de ACD por cada cuatro volmenes de sangre. La proporcin de la mezcla del anticoagulante es de: Acido Ctrico 0.9 g, Citrato disdico 2 g, Dextrosa 2 g, H2O destilada 120 mL.

3 - Recuento de hemates RECUENTO MANUAL

Consiste en hacer el recuento en una dilucin de sangre entera anticoagulada. Es un mtodo poco usado debido al elevado error que presenta.

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Lquido diluyente: solucin fisiolgica o citrato de sodio 3,8%., o Solucin de Hayem (HgCl2 0,25%, Na2SO4 2,5%, NaCl 0,5%) La dilucin empleada es de 1/200, para lo cual se mide exactamente: Solucin fisiolgica o citratada: 3,98 mL Sangre: 0,02 mL El recuento se realiza en la cmara de Neubauer (40X) cuyo esquema es el siguiente:

El recuento de hemates se realiza en el cuadrado central, se eligen 5 de los cuadrados que se encuentran subdivididos en 16 cuadrados pequeos, como se muestra a continuacin:

Las lneas reforzadas, o triples, sirven nicamente como lmites de cada cuadrado que contiene los 16 cuadrados pequeos. Se deben contar 5 de estos cuadrados. La superficie de este cuadrado es de 1 mm2 y la cmara tiene una profundidad de 0,1 mm.

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Con la dilucin indicada, luego de agitar adecuadamente, se carga la cmara y se cuentan los glbulos rojos de los 80 cuadrados pequeos (zona sombreada). La cmara puede ser cargada con un capilar, evitando que queden burbujas y que la misma quede cargada uniformemente. Considerando entonces, que el retculo tiene 400 cuadrados pequeos en total, el clculo que se debe hacer es el siguiente:

N x D x FC x ST TC

= n de glbulos rojos/mm3

Donde: N: nmero de eritrocitos contados. D: Ttulo de la dilucin realizada (200). FC: Factor de correccin de la profundidad, para llevar a 1 mm3 (10). ST: Total de cuadrados pequeos en la superficie de 1 mm2 (400). TC: Total de cuadrados pequeos contados. Causas de error en el recuento en cmara de Neubauer El recuento manual de eritrocitos tiene un error del 10%, el cual puede deberse a: 1. Errores de extraccin: dilucin o hemoconcentracin. Coagulacin parcial. Hemlisis. 2. Mala homogeneizacin por agitacin insuficiente de la sangre. 3. Utilizacin de material mal calibrado, sucio o hmedo. 4. Falta de suficiente agitacin de la sangre diluida. 5. Cmara de Neubauer mal ajustada, sucia o mojada. 6. Llenado incompleto de la cmara Neubauer. 7. Empleo de cubreobjetos deformable, no rgido. 8. Clulas mal distribuidas en el fondo de la cmara. 9. Errores del operador al realizar el recuento. 10. Errores al efectuar los clculos. VALORES DE REFERENCIA

Edad Sexo Intervalo de referencia Recin nacidos ambos 4,7x1012/L - 6,3x1012/L Nios (2-12 aos) ambos 4,0x1012/L - 5,3x1012/L

mujeres 4,1x1012/L - 5,1x1012/L Adultos jvenes (12-18 aos) varones 4,5x1012/L - 5,3x1012/L mujeres 4,1x1012/L - 5,2x1012/L Adultos jvenes (19-60 aos) varones 4,6x1012/L - 5,9x1012/L

4 - Hematocrito DEFINICION El hematocrito (Hto) es la relacin existente entre el volumen de eritrocitos y el volumen total de sangre, expresado como porcentaje. Est directamente relacionado con la concentracin de hemoglobina, por lo que su determinacin constituye el procedimiento ms simple para el diagnstico de anemia. As, un descenso del Hto es indicativo de anemia, mientras que el aumento lo es de poliglobulia.

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El mtodo de referencia para la determinacin del Hto es la centrifugacin de sangre total en tubo capilar (micromtodo), es una tcnica sencilla, barata y accesible a laboratorios de baja complejidad. En la actualidad, todos los autoanalizadores hematolgicos suministran, dentro del contexto del hemograma automatizado, un valor de Hto que resulta de un clculo electrnico a partir del Volumen Corpuscular Medio (obtenido por conductividad o campo oscuro) y la concentracin de eritrocitos. Obviamente este valor obtenido electrnicamente difiere del obtenido por centrifugacin en que no considera el efecto del plasma atrapado entre los eritrocitos ni el efecto de las restantes clulas sanguneas, por lo que es siempre algo inferior (1-3 %). Tanto el Hto. obtenido por microcentrifugacin o por mtodos automatizados, son un buen parmetro del estado de la serie eritroide. El Hto refleja la concentracin y no la masa total de glbulos rojos. Por Ej., un paciente en estado de shock acompaado de hemoconcentracin, el Hto. puede ser normal o alto, an cuando la masa eritrocitaria total disminuye por la prdida de sangre. Por lo tanto no es confiable como indicador de anemia poco despus de una hemorragia o una transfusin. METODO MANUAL Micromtodo (microhematocrito) Es una tcnica muy utilizada, por necesitar muy poca cantidad de sangre, muy sencilla y poderse realizar en gran nmero de muestras a la vez y en muy poco tiempo. Se utilizan tubos capilares de vidrio de 7 a 7,5 cm. de longitud por 1mm. de dimetro interno. Heparinizados o no, dependiendo del tipo de muestra (sangre entera anticoagulada o sangre capilar). Si se utiliza sangre capilar, se desechar la primera gota despus de la puncin. Se llena el tubo capilar hasta tres cuartas partes de su capacidad con la sangre (aproximadamente 50 L). El llenado de los tubos se realiza por capilaridad, favoreciendo el proceso inclinando el capilar hacia abajo a medida que se va llenando. Limpiar con papel o gasa el capilar y tapar el extremo limpio con plastilina o sellndolo a la llama del mechero. Una vez cerrados se colocan los capilares en la centrfuga con el extremo del capilar cerrado hacia fuera y de modo que quede perfectamente equilibrada. Se centrifugan durante cinco minutos a 12.000 rpm. Tan pronto se detiene la centrfuga se extraen los capilares y se procede a su lectura. Esta se puede realizar con los lectores de hematocrito (ABACO), que nos darn el resultado directamente, o con una regla milimetrada, aplicando la siguiente regla de tres:

A------- 100 x: hematocrito en tanto por ciento B------- x A: longitud total B: longitud de la parte corpuscular La determinacin del Hto debe realizarse por duplicado y la diferencia entre los dos valores obtenidos no debe ser nunca superior a 0,01%. Causas de error Las fugas de muestra al no quedar bien sellado los capilares producen una disminucin en

el valor, al perderse mayor proporcin de clulas que de plasma. El uso de anticoagulantes lquidos provoca un error por dilucin de la muestra En muestras capilares no descartar la primer gota, produce una mezcla con los lquidos

tisulares que provoca hemodilucin.

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En muestras de sangre venosa, el lazo colocado durante un cierto tiempo produce hemoconcentracin.

La lectura no inmediata de los capilares, provoca que el sedimento de hemates vaya tomando forma de bisel si el capilar permanece en posicin horizontal.

VALORES DE REFERENCIA ( x 2 DE) El valor de Hto vara con la edad y el sexo.

Edad y sexo Hematocrito % Fraccin Recin Nacidos 54 10 0,54 0,1 Nios (hasta 10 aos) 38 5 0,38 0,05 Mujeres (18-50 aos) 42 5 0,42 0,05 Embarazadas 39 5 0,39 0,05 Varones (18-50 aos) 45 5 0,45 0,05

5 - Determinacin de hemoglobina: mtodo de la cianmetahemoglobina FUNDAMENTO Este mtodo tiene como fundamento la transformacin previa de la hemoglobina en cianmetahemoglobina (HiCN), que es muy estable y posee un color caracterstico cuya absorbancia a 540 nm puede ser cuantificada comparndola con la de varias soluciones de concentraciones conocidas de hemoglobina preparadas a partir del patrn de referencia (curva de calibracin). Los distintos compuestos de hemoglobina, excepto la sulfohemoglobina que casi nunca es significativa, se transforman en HiCN segn el siguiente proceso: Hemoglobina + [K3 Fe(CN) 6] metahemoglobina Metahemoglobina + [CNK] cianmetahemoglobina MATERIAL 1. Espectrofotmetro o fotocolormetro: Estos instrumentos deben ser calibrados

peridicamente mediante la solucin patrn de HiCN, preparada de acuerdo a las especificaciones del International Committee for Standardization in Haematology (ICSH)

2. Tubos: 12 x 100 mm. 3. Sangre venosa total: anticoagulada con EDTA-Na2 (1,5 mg/ml) o con heparina (10 UI/ml).

Puede emplearse sangre capilar. 4. Pipetas volumtricas: de vidrio y de 5 mL. 5. Pipetas automticas: de 20 L, debidamente calibradas. 6. Reactivo de Cianmetahemoglobina:

Composicin (pH 7-7,4)

Ferricianuro potsico [K3 Fe(CN) 6] 200 mg Cianuro potsico [CNK] 50 mg Fosfato monopotsico [KH2PO4] 140 mg Detergente no inico* 1 mL Agua destilada hasta 1000 mL

Detergentes no inicos: Tritn X-100, Nonic 218, Nonidet/40, Quolac Nic 218.

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El detergente no inico facilita la solubilizacin de protenas insolubles y acelera la transformacin de la hemoglobina en HiCN, de forma que aquella se completa en 3 min. Este reactivo debe tener un color amarillo plido, ser completamente transparente y tener un pH entre 7 y 7,4. La lectura de absorbancia a 540 nm utilizando agua destilada como blanco debe ser igual a cero. Para su conservacin utilizar botellas de vidrio de borosilicato opacas y mantener a temperatura ambiente (el fro modifica el color del reactivo).

7. Patrn de referencia (solucin comercial): Es una solucin de HiCN cuya absorbancia

corresponde a una determinada concentracin de hemoglobina. Todo patrn de HiCN debe cumplir las especificaciones del llamado patrn primario de HiCN.

METODO Se determinar la concentracin de Hemoglobina de una muestra problema siguiendo los pasos detallados a continuacin: 1. Conectar el espectrofotmetro. 2. Homogeneizar bien la sangre mediante agitacin suave con un sistema automtico

(rodillos/disco giratorio) durante un tiempo mnimo de 5 min o manualmente por inversin del tubo 20 veces.

3. Pipetear (CON PROPIPETA) 5 ml de reactivo de Drabkin en un tubo de ensayo limpio. 4. Mediante la micropipeta aadir 20 l de sangre homogeneizada al tubo que contiene 5 ml

de reactivo de Drabkin. Al realizar esta operacin, es fundamental eliminar el exceso de sangre que pueda quedar en las paredes externas del capilar antes de introducirlo en el reactivo y procurar asimismo que no quede sangre adherida a las paredes internas de la pipeta.

5. Agitar el tubo mediante inversin (4 o 5 veces) con el fin de conseguir homogeneizar bien la mezcla sangre-reactivo y esperar un mnimo de 5 min para que se produzca la hemlisis total y se complete la transformacin de toda la hemoglobina en cianmetahemoglobina.

6. Leer la A de la solucin a 540 nm, utilizando agua destilada como blanco. 7. Para calcular la concentracin de hemoglobina es recomendable disponer de una curva de

calibracin. Curva de calibracin de hemoglobina Se toma un Kit. de calibracin con estndar de CC. Normal, de una CC. Alta y otro de una CC .baja, y se miden las absorbancia de cada una de ellas o se toma un Standard de CC. conocida y se hacen diluciones mayores y menores que el normal y se miden las absorbancia y se determina un factor que es el promedio de las tres diluciones. Teniendo que A= . b. C y como b=1 cm => A/ = C para facilitar el calculo A . (1/ ) = C donde (1/ )= F y es la inversa de la pendiente de la curva tendremos que C= F . A. Dicho en otras palabras la recta se ajusta a una ecuacin del tipo y=ax+b. Grafico:

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De esta manera controlo: La linealidad del equipo El deterioro que sufre el reactivo

Puedo trabajar con un estndar diario, procesado por cada operador que realiza la determinacin de hemoglobina, como si fuese una muestra ms y determino el factor del estndar. Procesando un estndar todos los das:

CONTROLO EL DETERIORO QUE PUEDE SUFRIR EL REACTIVO DESDE EL DIA QUE SE LO PREPARO Y SE REALIZ LA CURVA.

CONTROLO EL FACTOR HUMANO

CAMBIOS EN LA TENSIN DE LA RED O DESGASTE DE LA LMPARA DEL FOTOCOLORMETRO Causas de error en la determinacin de la concentracin de hemoglobina La determinacin de hemoglobina est sometida a posibles errores que deben ser tenidos en cuenta. Algunos de ellos obedecen a caractersticas peculiares del espcimen como la presencia de hiperlipemia o leucitocitosis intensa (50 x 109/l). No obstante, la mayora de las veces los errores se deben a defectos tcnicos en la manipulacin y el anlisis del espcimen. Errores en la obtencin del espcimen de sangre: 1. Errores de extraccin 2. Empleo de anticoagulantes no recomendados 3. Coagulacin parcial de la sangre Errores de la dilucin: 1. Empleo de pipetas automticas descalibradas u otras pipetas sucias o hmedas 2. No eliminacin del exceso de sangre adherida a las paredes externas del capilar antes de

introducirlo en el reactivo 3. Dilucin incompleta de la sangre en el reactivo

Errores de la transformacin de la hemoglobina en HiCN: 1. Empleo de reactivo de Drabkin mal preparado o vencido 2. Lectura antes del tiempo necesario para la completa transformacin de la Hb en HiCN Errores de la determinacin: 1. Empleo de instrumentos no calibrados 2. Cubetas sucias o deterioradas 3. Soluciones turbias de HiCN Errores en la conservacin del reactivo: 1. Congelacin del reactivo, lo que produce transformacin de K3 Fe(CN) 6 en K4 Fe(CN) 6 y

una oxidacin parcial de la Hb. Conservacin del reactivo en botellas de polietileno: se pierden grupos CN con formacin exclusiva de metahemoglobina, en vez de HiCN, con lo que los valores de concentracin de Hb obtenidos son inferiores a los reales.

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6 - Velocidad de sedimentacin globular (VSG) o Eritrosedimentacin FUNDAMENTO El test de velocidad de sedimentacin globular (VSG) mide la sedimentacin de eritrocitos en su plasma nativo. VSG es un test no especfico que puede ser utilizado para detectar un amplio rango de enfermedades y para monitorear el curso evolutivo de ciertas enfermedades crnicas como los procesos inflamatorios crnicos (artritis reumatoidea, polimialgia reumtica y tuberculosis) o la respuesta a la terapia, por ejemplo con citostticos (enfermedad de Hodgkin, linfomas y mieloma mltiple). Sin embargo en ocasiones cuadros tan graves como neoplasias y la cirrosis pueden presentar una VSG normal. Constituye uno de los tests ms utilizados como screening en el laboratorio clnico. Se trata de un mtodo sencillo para realizar y que requiere equipamiento simple. MECANISMO El mecanismo por el cual se produce la eritrosedimentacin no est completamente dilucidado, pero parece obedecer a interacciones electrostticas entre la superficie de los GR y diversas protenas del plasma que favorecen (fibringeno y globulinas) o disminuyen (albmina) la agregabilidad de estas clulas. Desde el punto de vista fsico, este fenmeno depende de los siguientes factores: a. Tamao de los GR b. Diferencia de densidad entre los eritrocitos y el plasma, c. Viscosidad del plasma. d. Temperatura. Estos factores se hallan relacionados entre s a travs de la ley de Stokes si se considera al GR como una esfera suspendida en un medio infinito (relacin entre la resistencia R que encuentra una partcula esfrica de radio r al desplazarse en el seno de un fluido de viscosidad a una velocidad v: R = 6vr La sedimentacin ocurre en 3 etapas: 1) una etapa en que se produce la aglutinacin de los GR con formacin de agregados en forma de "pilas de monedas", 2) un perodo durante el cual los agregados de GR sedimentan a velocidad constante, y 3) una etapa final donde la velocidad de sedimentacin se hace ms lenta al mismo tiempo que los GR se acumulan en el fondo del recipiente. La etapa ms importante es la primera o de aglutinacin, ya que de ella depender la velocidad de todo el proceso. As, cuanto ms pequeo sean los agregados, ms lentamente se producir la sedimentacin y viceversa. Dado que, como se mencion ms arriba, el test tambin est influenciado por la forma y el tamao de los GR, ste resulta poco confiable como un ndice de enfermedad en la anemia falciforme o cuando hay una marcada poiquilocitosis. La velocidad de sedimentacin se incrementa por las altas concentraciones de fibringeno y otras protenas de fase aguda e inmunoglobulinas. La albmina retarda la VSG. El mecanismo por el cual el fibringeno y las globulinas facilitan la aglutinacin de GR no se conoce fehacientemente aunque se cree que actan disminuyendo la fuerza de repulsin que normalmente existe entre GR debido a su carga superficial o potencial zeta. El potencial zeta es producido por una intensa carga negativa a nivel de la superficie de los GR, lo que explica que

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estas clulas se mantengan separadas. La intensidad del potencial zeta depende en gran medida de la composicin proteica del plasma y especialmente de la relacin entre las concentraciones de albmina, globulinas y fibringeno. As, mientras la albmina tiende a aumentar el potencial zeta, las globulinas y sobre todo el fibringeno tienden a disminuirlo. Ello obedece a que tanto el fibringeno como las globulinas tienen un mayor peso molecular y una conformacin menos esfrica que la albmina, lo que aumenta la constante dielctrica del plasma y reduce el potencial zeta eritrocitario. La disminucin del potencial zeta de los GR tiene como consecuencia una mayor tendencia de stos a agregarse y formar las llamadas pilas de moneda. De acuerdo con este mecanismo, el valor normal de la VSG resulta del equilibrio entre las principales protenas plasmticas. METODOLOGIA Existen dos mtodos comnmente utilizados para medir la VSG: el mtodo de Westergren y el mtodo de Wintrobe. Ambos mtodos poseen limitaciones. El mtodo de Westergren es menos sensible a pequeos aumentos de los factores que causan la sedimentacin de los GR y as puede ser levemente menos confiable como un procedimiento de screening. El mtodo de Wintrobe, por el otro lado, puede dar lecturas bajas incorrectas cuando la VSG Westergren es marcadamente elevada. Ambos mtodos son altamente sensitivos a la relacin entre el plasma y los GR en la muestra, y un bajo hematocrito causa un aumento no especfico de la VSG probablemente acelerando la agregacin y reduciendo las fuerzas de friccin entre los agregados en sedimentacin. Se trataron de aplicar factores de correccin para anemias, pero no resultaron confiables. Tradicionalmente, la VSG se ha determinado ms frecuentemente por el mtodo de Westergren que fue propuesto como mtodo de referencia por el International Council for Standardization in Hematology (ICSH). Durante los ltimos aos, han aparecido sistemas semiautomticos para medir la VSG que emplean soportes especiales y pipetas de material plstico desechable. Estos sistemas, aunque reproducen exactamente el mtodo de Westergren, se diferencian de ste por su carcter cerrado (recogida de los especmenes en tubos al vaco que incorporan una cantidad precisa de anticoagulante) y por el empleo de material complementario (bombas aspirativas) que aumentan la rapidez y precisin del llenado de las pipetas. MTODO DE WESTERGREN Es el mtodo de referencia para medir la VSG. Sin embargo, continua siendo un mtodo poco reproducible y sometido a diversas variables difciles de controlar, como es la necesidad de prediluir la sangre. A. MATERIALES. A.1 Anticoagulante Si utiliza citrato trisdico dihidratado (Na3C6H5O7.2H2O) en solucin acuosa 32,08 g/l. A.2 Tubo de sedimentacin Se utilizan tubos de vidrio especialmente diseados de una longitud de 300 + 1.5 mm y de un dimetro de 2.55 + 0.15 mm. El dimetro del tubo debe ser uniforme (+ 0.05 mm) todo a lo largo del tubo y ste debe poseer una escala graduada con exactitud en mm numerada de 200 mm en el fondo hasta 0 mm. Los tubos estandarizados que cumplen las especificaciones de ICSH deben aprobados por Comits de Estandarizacin en los diferentes pases.

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Los tubos deben ser cuidadosamente limpiados en acetona-agua. No se recomienda el uso de detergentes o dicromatos para la limpieza. Tubos plsticos descartables: Se fabrican tubos plsticos descartables segn las especificaciones, los cuales son provistos limpios y secos por el fabricante. Algunos plsticos resultan inadecuados pues unen GR siendo as ms susceptibles a los problemas de taponamiento. Otros tubos plsticos se manufacturan recubiertos de agentes que eliminan hongos o contienen componentes que interactuan con la sangre. A.3 Gradillas Las gradillas o dispositivos de sostn estn diseados para sostener los tubos en una posicin vertical inmvil. Un dispositivo de burbuja niveladora debe formar parte integral de la gradilla para asegurar que la posicin de los tubos sea vertical dentro de un lmite de 1. La misma debe estar construida de modo tal que no existan prdidas de sangre cuando el tubo est colocado en ella. B. TCNICA A) La sangre se obtiene por puncin venosa, evitando contaminacin con materiales utilizados

para la higiene de la piel. La sangre se agrega en proporcin de 4 Vol de sangre a 1 Vol de solucin de citrato de sodio, por ejemplo 2 ml de sangre en 0,5 ml de anticoagulante. El test debe ser realizado dentro de las 2 hs si la sangre es mantenida a temperatura ambiente, o dentro de las 6 hs. si es mantenida a 4C.

B) Si la sangre citratada se equilibra a temperatura ambiente, se mezcla por inversin repetidas

veces, y se sumerge un tubo de Westergren en la muestra dejando que la sangre ascienda por capilaridad. El nivel de la sangre se ajusta a cero.

C) El tubo es colocado en la gradilla en posicin estrictamente vertical a temperatura ambiente

(18-25C), sin exposicin a la luz del sol directa, libre de vibraciones y corrientes de aire, mantenindolo exactamente 60 min.

D) Una vez transcurrido el tiempo, se lee la distancia entre la superficie del menisco de la

columna eritrocitaria y la parte superior de la columna de sangre situada a nivel de la marca cero de la escala graduada. El valor de esta distancia, expresado en mm, corresponde al de la VSG durante la primera hora (mm/hora).

C. VALORES DE REFERENCIA

EDAD (aos) Valores de referencia (mm) Lmite superior de la normalidad

Nios mayores y jvenes

0-15 5 a 10 15

Varones adultos 17-50 4 3 10 51-60 6 3 12 61-70 6 4 14 Mujeres adultas 17-50 6 3 12 51-60 9 5 19 61-70 10 5 20

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Factores tcnicos capaces de modificar la VSG Causas de aumento Desviacin de verticalidad de la pipeta Incremento de la longitud y el dimetro de la pipeta Elevacin de la temperatura ambiente Dilucin de la sangre Causas de disminucin: Reduccin del dimetro de la pipeta Utilizacin tarda de la sangre (especimen envejecido) Cambio de anticoagulante D. INTERPRETACION DE RESULTADOS Los valores de referencia de la VSG se expresan exclusivamente en mm/h y varan fundamentalmente con el sexo y en cierto grado tambin con la edad (ver valores de referencia), el ciclo menstrual, y las medicaciones (corticosteroides, contraconceptivos orales, etc.) La VSG no parece estar influenciada por las ingestas o por los ritmos circadianos. Las determinaciones de la VSG a la segunda hora o a las 24 hs, muy utilizadas anteriormente, han demostrado ser poco fiables y de escasa significacin clnica, por lo que no se recomienda su empleo. Existen numerosas patologas con alteraciones proteicas del plasma que cursan con modificaciones del valor de VSG. Se observan aumentos de VSG en un amplio espectro de enfermedades principalmente relacionadas a las protenas de fase aguda, y tambin en el embarazo normal y el puerperio. Un 10% de los nios normales tambin presentan VSG aumentadas. La VSG es especialmente baja (0-1 mm) en la policitemia, vera anormalidades de GR (hemoglobinopatas, esferocitosis hereditaria, anemia falciforme, etc.), hipofibrinogenemia, defectos cardacos congestivos, y ocasionalmente sin causa aparente. Adems de estas condiciones que pueden tender a ocultar una alta VSG, es inusual obtener falsos negativos, por ende, un valor normal de VSG generalmente asegura que no existe enfermedad orgnica. Para muestras peditricas o cuando el volumen a obtener ser escaso se puede utilizar las pipetas de Chattas, estas requieren un volumen de sangre mucho menor (40 L), la tcnica se realiza de la misma manera pero los resultados deben ser corregidos utilizando un nomograma o tabla para conversin.

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NOMOGRAMA DE CHATTAS Chattas (mm)

Westergren (mm)

Chattas (mm)

Westergren (mm)

Chattas (mm)

Westergren (mm)

1 a 10 1 a 10 21 31 32 95 11 12 22 34 33 106 12 13 23 38 34 120 13 14 24 42 35 >120 14 16 25 47 36 >120 15 18 26 53 37 >120 16 20 27 59 38 >120 17 22 28 65 39 >120 18 24 29 71 40 >120 19 26 30 77 20 28 31 84 7-OBTENCIN DEL FROTIS DE SANGRE Sobre un portaobjetos perfectamente limpio, se coloca en un extremo una gota pequea de sangre (1-2 mm) recin obtenida, ya se trate de puncin digital, o del taln (en pediatra) o de la ltima gota de sangre extrada con la jeringa y que se encuentra en la luz de la aguja. Evitar usar sangre con anticoagulantes porque altera la morfologa de las clulas. Por medio de otro portaobjetos de borde pulido y al cual se le ha quitado los ngulos (extensor), se realiza la extensin de la gota de sangre: conservando un ngulo menor de 45 respecto al portaobjetos horizontal, el extensor se apoya delante de la gota de sangre y retrocediendo hasta tocarla, una vez que la misma se extiende a lo largo del borde de contacto por capilaridad, se avanza con firmeza y no muy rpidamente. As se obtiene una fina pelcula de sangre que representa integralmente a la gota de sangre que se extiende.

Secar rpidamente el extendido al aire para evitar el deterioro de las clulas. Un extendido as obtenido poseer tres reas de diferente espesor y con distribucin tambin distinta de leucocitos: 1. Zona excesivamente gruesa: Se encuentra en la regin inmediata al punto de partida de la extensin (cabeza). En ella hay siempre un aumento del nmero de linfocitos. 2. Zona excesivamente fina: Corresponde al final de la extensin (cola) y en sta se observa un exceso de granulocitos y monocitos. 3. Zona ideal: Regin central (cuerpo), en ella hay un reparto equilibrado de las clulas.

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Para que un frotis sea valido:

1) No debe ser demasiado grueso (los elementos estarn retenidos y no sern identificados. 2) No debe ser demasiado delgado (ser muy pobre en elementos lo que impedira una

lectura conveniente). 3) No debe alcanzar los bordes ni las extremidades del porta (se perderan los elementos

mas voluminosos). La gota debe agotarse sobre el porta. 4) No debe presentar agujeros (utilizacin de portas mal desengrasados) ni estras o flecos

(provocados por un extensor de bordes no esmerilados, irregulares). Conviene elegir el extensor observando sus bordes en el microscopio para asegurarse de que sean bien lisos.

5) Debe ser regular (si no, el reparto de elementos es heterogneo y por tanto el recuento variara segn los campos examinados).

6) Debe ser secado correctamente (un secado defectuoso produce artefactos: hemates festoneados por ejemplo).

Existen algunas sutilezas que es necesario cuidar: El tamao de la gota debe ser el adecuado y esto lo enseara la experiencia. Si ha cado un exceso de gota limpiar el porta con gasa o algodn. Repetir el procedimiento

las veces que sea necesario hasta que la cantidad de sangre sea la adecuada. Si tuvieran que elegir entre un extendido largo, y uno corto, es preferible el segundo, pero lo

ideal es que ocupe partes de la lamina. Se prefieren en general los frotis delgados pero el excesivamente fino tiene muchos

inconvenientes: los hemates aparecen poligonales con su claridad central desaparecida, las plaquetas se destruyen y los leucocitos resultan rotos o distorsionados.

Nunca debe llevarse la gota de sangre por delante del extensor porque producira erosin de las clulas.

Un buen frotis debe constar de una zona inicial gruesa (cabeza), una zona central mediana (espesor ideal para la lectura) y la cola delgada terminada suavemente en un borde convexo sin estras prolongadas que hablan de un extensor defectuoso. Un buen extendido luce como una pincelada sobre el vidrio.

Aun cuando el frotis sea ideal y el reparto homogneo no se puede evitar una cierta segregacin de los elementos. Los linfocitos (mas pequeos) predominan en el centro de la extensin. Los polimorfonucleares y los monocitos son atrados hacia los bordes y cola.

FROTIS ARRASTRADOS: todos los elementos estn en la cola. Deben rechazarse para la formula.

Defectos observados en frotis con sangre anticoagulada:

1) Impide agrupacin de plaquetas. 2) Los ncleos de los monocitos aparecen como con lbulos, inclusive pueden estar

desintegrados o coloreados ms homogeneamente, ms compactos que con sangre fresca, el citoplasma puede aparecer vacuolado.

1

3 2

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Importante: Lavar y secar bien el extensor entre una y otra extensin Los portas nuevos deben ser desengrasados con agua jabonosa, enjuagados minuciosamente. 8-COLORACIN DEL FROTIS DE SANGRE La coloracin se realiza por el mtodo de May Grnwald-Giemsa. Fundamento Prcticamente todos los mtodos empleados para teir las clulas de la sangre se basan en el empleo de una mezcla de eosina y azul de metileno. Estos colorantes son muy sensibles a las variaciones de pH de las diferentes estructuras celulares, de modo que las que tienen carcter bsico fijan en mayor medida la eosina (colorante cido), mientras que las que poseen propiedades cidas fijan principalmente el azul de metileno (colorante bsico). Esto explica que ciertas estructuras basfilas presentes en el ncleo (nuclolo) o en el citoplasma (ribosomas) se coloreen de azul, mientras que otros componentes acidfilos como la hemoglobina adquieren color rosado. De esta manera, la diferente afinidad de ciertas granulaciones citoplasmticas por dichos colorantes permite clasificar los leucocitos polimorfonucleares en: neutrfilos, en los que la granulacin especfica posee compuestos neutros que fijan ambos colorantes simultneamente, resultando en un color pardo; eosinfilos, en los que la granulacin especfica contiene sustancias de intenso carcter bsico que fijan fundamentalmente los colorantes cidos, dando un color rojo-naranja; y los basfilos, cuya granulacin especfica posee sustancias de carcter cido, que fijan colorantes bsicos dando un color azul oscuro. Reactivos Solucin May Grnwald : eosinato de azul de metileno en metanol. Solucin Giemsa: azul de metileno (clorhidrato de tetrametiltionina), su derivado oxidado

en medio alcalino: el azur II, y eosina (tetrabromofluorescena). Mtodo Cubrir el frotis de sangre seco con solucin May Grnwald. Dejar 3 minutos. A continuacin, agregar buffer fosfato pH 6.8 o una mezcla de agua de canilla con agua destilada en partes iguales, en proporcin igual a la de colorante. Homogeneizar soplando suavemente con una pipeta o moviendo el portaobjetos con un movimiento de vaivn. Dejar 3-5 minutos. Volcar, enjuagar bajo chorro de canilla suave y cubrir el preparado con una solucin de Giemsa, obtenida a razn de dos gotas del colorante por ml de agua (1/10). Dejar 10- 12 minutos. Lavar con agua, limpiar la cara inferior del portaobjeto con un algodn y secar al aire.

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TRABAJO PRCTICO N2

HEMOGRAMA 2 (FRMULA NORMAL, RECUENTO DE GB) Objetivos generales -Familiarizarse con el uso de la cmara de Neubauer -Adquirir destreza en la preparacin de diluciones y manejo de muestras de sangre entera -Adquirir destreza en el manejo del microscopio y la cmara de Neubauer para el recuento de glbulos blancos -Delinear los criterios para la identificacin de glbulos blancos en preparados coloreados con MGG -Realizar frmulas leucocitarias en muestras de pacientes sanos -Interpretacin y validacin de resultados 1- RECUENTO DE LEUCOCITOS Mtodo manual 1) Agregar 20 l de sangre anticoagulada a un tubo de Kahn conteniendo 0,38 ml de solucin

de Trk. Esta solucin contiene acido actico al 1 % en agua destilada y el agregado de una punta de esptula de azul de metileno. DILUCION 1/20

2) Homogeneizar la mezcla. 3) Cargar la cmara de recuento 4) Ubicar el reticulado de la cmara con bajo aumento (10X), constatar la ausencia de burbujas

y que la distribucin sea regular. 5) Proceder al recuento de los elementos presentes en los cuadrados angulares grandes (4) de

la cmara. Las cuentas de los cuatro cuadrados no deben diferir entre s en ms del 20%. En caso contrario debe cargarse nuevamente la cmara.

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La lectura se realiza en los cuatro campos L. Adems de los leucocitos contados dentro de cada uno de los cuadrantes, se deben contar todos los leucocitos adheridos en la lnea horizontal superior y vertical exterior, o de lo contrario, todos los leucocitos adheridos a la lnea horizontal inferior y vertical interior.

Si el valor obtenido (leucocitos/mm3 de sangre) es menor de 2500, se practica nuevamente el recuento empleando una dilucin 1:10. Si por el contrario el nmero resulta notablemente elevado se emplean diluciones 1:100 o 1:200. 6) Clculo:

m x 10 x d n = N de leucocitos/ mm

3

Donde: m=nmero de leucocitos contados en n (4) cuadrados de 1 mm de superficie y d=dilucin utilizada, n= nmero de cuadrantes contados. Valores de referencia

Adultos 4.000 - 11.000 / mm3 Recin nacidos 10.000 - 25.000 / mm3

Nios de 1 ao 6.000 - 18.000 / mm3 Nios de 4 a 7 aos 6.000 - 15.000 / mm3 Nios de 8 a 12 aos 4.500 - 13.000 / mm3

2- DETERMINACIN DE LA FRMULA LEUCOCITARIA: RECUENTO DIFERENCIAL DE LEUCOCITOS En todo frotis coloreado con M.G.G. debe colocarse una delgada capa de aceite de inmersin, aun para el pequeo aumento a seco. Si no se cumple este requisito la refringencia de los elementos impide una buena observacin. Para esto es suficiente depositar una gota en un extremo, aplicar de plano sobre ella otro portaobjetos que puede contener otro extendido en cuyo caso se harn coincidir ambas caras que los contengan y desplazarlos suavemente unos contra otros. La observacin debe hacerse al principio de manera panormica con objetivo de 10X para ver la dispersin de los elementos. Con este aumento se observaran la presencia de clulas grandes como los linfocitos hiperbasofilos de la mononucleosis. Por ello debe evitarse la tendencia a usar e comienzo la inmersin. Luego se pasa a 40 X aumento que resulta til para evaluar alteraciones de tamao de los glbulos rojos y finalmente se pasa a 100X para el recuento diferencial de los glbulos blancos y para la observacin detallada de los elementos sanguneos. Un extendido correctamente realizado poseer tres reas de diferente espesor y con distribucin tambin distinta de leucocitos: 1. Zona excesivamente gruesa: Se encuentra en la regin inmediata al punto de partida de la

extensin (cabeza). En ella hay siempre un aumento del nmero de linfocitos. 2. Zona excesivamente fina: Corresponde al final de la extensin (cola) y en sta se observa un

exceso de granulocitos y monocitos. 3. Zona ideal: Regin central (cuerpo), en ella hay un reparto equilibrado de las clulas.

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Formas de recorrer el preparado

Contar por lo menos 100 leucocitos anotando la cantidad de cada uno de ellos para establecer los porcentajes. Refiriendo al valor de recuento de glbulos blancos se puede expresar cada tipo de leucocitos en valores absolutos por mm3 de sangre. Siempre que sea posible se deben contar 100 elementos, recordar que se est haciendo una estimacin porcentual de las poblaciones, el recuento de 100 elementos resulta relativamente sencillo en pacientes con valores absolutos de GB dentro de los valores de referencia. Distinto es el caso de pacientes leucopnicos con recuento bajos por ej: 1500 GB / mm3 en estos casos resultar muy tedioso llegar a encontrar 100 elementos para poder expresar en % , por ello es aconsejable expresar literalmente lo que se vi al observar el preparado por ej: se realiza la frmula leucocitaria en un paciente leucopnico y solo se logr contar 80 elementos ( pueden ser 70, 90 dependiendo del tiempo utilizado y del grado de leucopenia del paciente) entonces lo aconsejable es expresar los resultados de la siguiente manera: DE 80 ELEMENTOS CONTADOS x son Neutrfilos, y son eosinfilos, z son linfocitos, etc, etc, es decir se expresa cuantos elementos de cada serie se observ en el total de GB contados Y NO EN PORCENTAJE! FORMULA LEUCOCITARIA EN ADULTOS SANOS LEUCOCITOS (%) ABSOLUTO (cel / mm3) CAYADOS 0 1% 100 - 250 NEUTROFILOS SEGMENTADOS 55 70 % 3000 - 5000 EOSINOFILOS 1 4 % 20 - 350 BASOFILOS 0 1 % 10 - 60 LINFOCITOS 20 40 % 1500 - 4000 MONOCITOS 4 8 % 100 - 500 No hay variacin de la frmula segn el sexo, pero s segn la edad. Nacimiento: 70% de neutrfilos. Primera semana: 50% de neutrfilos y 50% de linfocitos.

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Segunda semana: 65% de linfocitos y 25% de neutrfilos3-4 aos: 50% de linfocitos y 50% de neutrfilos.

10-12 aos: valores de referencia del adulto. Descripcin de cada uno de los elementos que componen una frmula normal 1. Neutrfilos: Ncleo lobulado (2-5 lbulos). Los lbulos estn unidos entre s por filamentos

cromatnicos muy delgados. La cromatina es condensada. Es una clula terminal. Mide aproximadamente 12 m. El citoplasma es abundante y rosado, cubierto por una granulacin fina especfica de color pardo rojiza.

2. Eosinfilos: Mide aproximadamente 13 m. El ncleo es segmentado, con predominio del bisegmentado en forma de anteojo aunque pueden aparecer con ms lbulos. El citoplasma es abundante y est cubierto de granulaciones esfricas de mayor tamao que las del neutrfilo y que se colorean de anaranjado.

3. Basfilos: Mide aproximadamente 10 m. El ncleo est irregularmente lobulado. La cromatina es densa. La masa nuclear es voluminosa con relacin al citoplasma. Las granulaciones son groseras y muy irregulares en forma y tamao pudiendo quedar superpuestas al ncleo, cubrindolo parcialmente.

4. Linfocitos: Es una clula generalmente pequea (7 m), pero puede llegar hasta 12 m. La forma ms pequea posee slo un escaso anillo de citoplasma color celeste. Alrededor de un 10% de los linfocitos circulantes son clulas ms grandes y con citoplasma ms abundante. El ncleo por lo general es redondo, pero puede tener una escotadura. La cromatina es densa.

Monocito: Es el leucocito normal de mayor tamao (18-24 m). El ncleo presenta forma irregular y variada, la cromatina se esponjosa. La proporcin ncleo-citoplasma es aproximadamente semejante. El citoplasma se tie de celeste plomizo y no presenta granulaciones.

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TRABAJO PRCTICO N 3:

ELEMETOS SANGUNEOS NORMALES Y PATOLGICOS ALTERACIONES DE LA SERIE BLANCA

Objetivos Generales -Identificar los diferentes elementos sanguneos normales y patolgicos -Desarrollar criterios para la clasificacin de elementos patolgicos -Correlacionar los elementos encontrados con diferentes patologas y datos de contador hematolgico. GLOBULOS ROJOS: PROERITROBLASTO (1): Clula voluminosa (20-30 um. de dimetro) Ncleo: ocupa la mayor parte de la clula. Cromatina con aspecto de esponja uno o dos nucleolos teidos de rosa por el giemsa. Citoplasma: intensamente basfilo por el gran contenido de ARN. Presenta sobre uno de los costados del ncleo una formacin redondeada que se destaca por su coloracin rosada: el arcoplasma que corresponde al APARATO DE GOLGI y CENTRO CELULAR. Hay numerosos ribosomas. Escasos organoides membranosos, excepto mitocondrias.

ERITROBLASTO BASOFILO (1): Tamao: menor (15-18 um.) Ncleo: menor tamao nuclear. Desaparicin de los nucleolos. Cromatina condensada en grumos. Citoplasma: intensamente basfilo. El halo perinuclear es menos notorio. Contiene mitocondrias. Ferritina en mayor cantidad formando acumulos.

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ERITROBLASTO POLICROMATFILO (2): Tamao: se sigue reduciendo 11-13 um. Ncleo: menor tamao, se va condensando la cromatina. Citoplasma: comienza a cargarse de un tinte lilaceo, debido a la superposicin de la basofilia ribosmica con la acidofilia de la hemoglobina. A medida que los estadios progresan predominan los tintes rojizos sobre los azulados. Presentan mitocondrias donde se metaboliza el HEM. Ferritina en acumulos groseros (siderosomas). ERITROBLASTO ORTOCROMTICO (2): Perdi la capacidad de divisin. Tamao: alrededor de 10 um. Ncleo: picnotico, retrado. Citoplasma: acidofilo (rosado).Menos mitocondrias y ribosomas. Gran cantidad de siderosomas. RETICULOCITO: Es la clula anterior que ha perdido el ncleo por expulsin o lisis (aunque se acepta ms lo primero). Contiene todava algunos ribosomas y mitocondrias. En un extendido coloreado con Giemsa aparece de tamao algo mayor que el glbulo rojo maduro y con una ligera policromatofilia. Pero con una coloracin supravital (colorea los elementos vivos, fuera del organismo) el colorante precipita los ribosomas, formando una sustancia retculo-filamentosa, que toma distintos aspectos segn la cantidad de ARN que contienen, siendo los mas maduros aquellos que contienen menos ARN. GLOBULO ROJO MADURO, ERITROCITO O HEMATIE:

Es un residuo celular desprovisto de ncleo en todos los mamferos. Forma: disco bicncavo. Dimetro: 7,5 um. Esta recubierto por una membrana cuya estructura responde al modelo de mosaico fluido, al igual que todas las unidades de membrana biolgicas. Tiene forma de disco bicncavo

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GRANULOPOYESIS: Durante la maduracin de la serie granuloctica se suceden una serie de cambios morfolgicos que consisten en la desaparicin de los nuclolos, la reduccin de la relacin ncleo/citoplasma, la condensacin de la cromatina, la desaparicin de la basofilia citoplasmtica, la aparicin de las granulaciones primarias o azurfilas en el estadio de promielocito y de las secundarias o especficas a partir del estadio de mielocito. Por ltimo en esta serie de cambios morfolgicos se va a comenzar a producir la segmentacin nuclear que se puede apreciar en el metamielocito, para dar origen al polimorfonuclear en banda o cayado y por ltimo a la clula ms madura de esta serie, el polimorfonuclear segmentado. MIELOBLASTO: Elemento iniciador de la progenie. Tamao: aproxim. 20 um. Ncleo: de gran tamao, ocupa casi toda la clula, con una fina membrana nuclear lisa y delgada y una cromatina muy fina, muy delicada que no hace condensacin cerca de la membrana nuclear. Suele tomar el aspecto de una red o tamiz. Contiene uno o dos NUCLEOLOS. Citoplasma: se colorea de celeste claro, es apenas un halo alrededor del ncleo tan voluminoso. Con el microscopio comn no se observan granulaciones. Sin embargo el microscopio electrnico detecta la presencia de lisosomas que en otras etapas van a constituir las granulaciones inespecficas.

PROMIELOCITO: Tamao: mayor que el anterior (25-30 um.) Ncleo: grande, pero la relacin ncleo citoplasma es menor. Puede ser redondo u ovalada, generalmente es excntrico. La cromatina todava es laxa, aunque algo menos que en el anterior. Presenta NUCLEOLOS.

Citoplasma: presenta una zona clara perinuclear llamada arcoplasma (corresponde a la zona del complejo de golgi y centro celular). Sigue siendo basfilo y ya son visibles con el microscopio ptico numerosas granulaciones inespecficas (se llaman as porque no permite identificar a la clula como precursora de neutrofilo-eosinofilo-basfilo). Tambien son llamadas primarias. Contienen enzimas y la ms caractersticas es a mieloperoxidasa. Los grnulos primarios son lisosomas rodeados por lo tanto de unidades de membrana.

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MIELOCITO (1): Tamao: 20-25 um. Ncleo: ya no muestra NUCLEOLOS. La cromatina comienza a mostrar condensaciones. Citoplasma: es todava basfilo, pero adems de las granulaciones primarias presenta en la zona del arcoplasma, granulaciones especficas que permiten hablar de mielocito neutrofilo-eosinofilo-basfilo segn el contenido de sus grnulos especficos o secundarios. El mielocito es el ltimo elemento en el cual se presenta divisin.

METAMIELOCITO: Tamao: algo menor que el mielocito. Ncleo: de forma arrionada con cromatina en forma parcelada, mostrando zonas condensadas. No presenta nucleolos. Citoplasma: policromatofilo (intermedio entre azul y rosado). Predominan las granulaciones especficas. Las granulaciones primarias son escasas y van poco a poco perdiendo su coloracion. GRANULOCITO EN BANDA O CAYADO: Tamao: menor que el metamielocito. Ncleo: en forma de C (bastn o cayado) S o en una banda. Con cromatina condensada, disposicin parcelada. Citoplasma: acidofilo (rosado) con granulaciones especficas o secundarias. Las granulaciones primarias ya no son visibles al microscopio comn. De acuerdo a los grnulos que presenta ser neutrofilo, eosinofilo o basfilo. GRANULOCITO MADURO: granulocito con ncleo segmentado.

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GRANULOCITO NEUTRFILO: Es el elemento ms abundante del frotis normal de un adulto Ncleo: lobulado o segmentado. Presenta de 2 a 5 lbulos que se van formando a partir de estrangulaciones en el ncleo del granulocito en cayado, que se van profundizando de manera que van quedando los segmentos o lbulos unidos por filamentos de cromatina. La cromatina tiene una disposicin en mosaico, con zonas de cromatina muy condensada y otras de cromatina extendida. La mayor cantidad de lbulos indica mayor madurez de la clula. Tamao: de 12 a 14 um. Citoplasma: rosado con granulaciones especficas muy finas, que toman tanto los colorantes cidos como los bsicos (de all el nombre de neutrfilos) y aparecen de color violeta. Contienen enzimas como la fosfatasa alcalina y sustancias de accin bactericida. GRANULOCITOS EOSINFILOS: Tamao: 12-15 um. Ncleo: predomina el ncleo bilobulado, semejante a un anteojo. Disposicin de la cromatina en mosaico. Citoplasma: cubierto de granulaciones esfricas de mayor tamao que las neutrfilos, coloreadas de color naranja (o pardo rojizo) por la eosina. Prcticamente cubren todo el citoplasma y se consideran lisosomas. GRANULOCITO BASFILO: Tamao: 10-12 um. Ncleo: irregularmente lobulado. Cromatina muy densa, masa nuclear voluminosa en relacin al citoplasma. Citoplasma: rosado. Contiene granulaciones grandes, irregulares en forma y tamao, de color azul oscuro, casi negro, que a veces, por el aspecto esfrico de la clula viva, cuando se transforma en disco por la desecacin (al realizar el frotis) quedan superpuestas al ncleo cubrindolo parcialmente. Son solubles en agua, por eso muchas se disuelven durante

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la coloracin. Contiene heparina e histamina. ORIGEN DE LOS MONOCITOS: Se acepta como nico lugar productor de monocitos en el organismo, la mdula sea.

MONOBLASTO: Tamao: aproximadamente 20 um. Es muy parecido al mieloblasto, se diferencia de el en que el ncleo presenta una ligera indentacion (que hace recordar al monocito maduro) presenta tambien varios nucleolos. La otra

diferencia es que el citoplasma es ligeramente grisceo y a veces marca pliegues. PROMONOCITO: Tamao: algo mayor que el monoblasto. Cromatina nuclear: con aspecto de fina red. Queda restos de nucleolos. Ncleo de contorno irregular con indentaciones. Citoplasma: de un color grisceo mas basfilo que su predecesor. MONOCITO:

Clula de mayor tamao en el extendido (18-24 um) Forma: irregular. Ncleo: con lobulaciones incompletas como si se replegara sobre si mismo, de modo que recuerda las circunvoluciones del cerebro. A veces forma arrionada. Con forma abigarrada en herradura, indentado o doblado. Cromatina laxa, delicada, condensada en grumos, dando un aspecto como de pinceladas desparejas. No presenta nucleolos. Citoplasma: grisceo. No presenta grnulos pero si un

polvillo muy fino, en el limite de visibilidad del microscopio y pequeas vacuolas. Ese polvillo esta constituido por acumulos de lisosomas. LINFOPOYESIS: Se originan en mdula sea y luego sufren procesos de maduracin y diferenciacin en rganos linfticos secundarios.

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LINFOBLASTO:

Tamao: aproxim. 20 um. Ncleo: grande, con membrana nuclear gruesa debido a que la cromatina se condensa cerca de la membrana. Esto permite diferenciarlo de un mieloblasto y monoblasto. Citoplasma: basfilo. Sin grnulos. Es escaso porque el ncleo ocupa gran parte de la clula.

PROLINFOCITO: Tamao: 15-18 um. Ncleo: algo ms pequeo, cromatina ms condensada. Generalmente es excntrico. Todava se identifican nucleolos. Citoplasma: mas abundante que en el linfoblasto. Sin grnulos. LINFOCITO MADURO:

Podemos encontrarlo como linfocito pequeo o linfocito mediano y grande. LINFOCITO PEQUEO: Tamao: aprox. 9 a 14 um. Ncleo: color prpura, cromatina muy condensada. A veces puede atisbarse algn nucleolo. Ocupa casi toda la clula. Generalmente es redondo. A veces presenta una escotadura. Citoplasma: azul celeste muy escaso.

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LINFOCITO GRANDE: Tamao: mayor 12-15 um. (A veces tamao de un monocito). Ncleo: cromatina densa. Se ubica oralmente en forma excntrica. Citoplasma: ms abundante que en el pequeo y mediano. Color celeste. Suele contener algunas granulaciones muy pequeas de color prpura.

CELULA PLASMATICA: Representa el 1-4% de las clulas nucleadas de MO en un sujeto normal y es el estadio final de la maduracin y transformacin del linfocito B maduro. Es una clula redonda u ovalada que mide entre 11 y 15 um. de dimetro. Se caracteriza por el ncleo redondo, denso y excntrico con la heterocromatina dispuesta en masas groseras de disposicin radial (en rueda de carro). Por lo general no presentan nuclolo. El citoplasma puede tener frecuentemente bordes de apariencia irregular y se tie de azul violceo muy intenso, indicio de su riqueza en RNA con una zona clara cercana al ncleo denominada "arcoplasma". Normalmente no contienen granulaciones, pero pueden mostrar vacuolas o cuerpos de inclusin plida o rosa, que corresponden a acumulos de inmunoglobulinas (cuerpos de Russell). Cuando estas inclusiones son muy numerosas,

el aspecto de la clula es el de una mrula (clula de Mott). En algunos procesos reactivos que cursan con estimulacin antignica crnica (por ej. artritis reumatoidea activa) pueden aparecer en SP en un pequeo nmero. Se pueden observar tambin plasmocitos con inclusiones que representan acumulos de inmunoglobulinas en la cisterna perinuclear con la subsecuente invaginacin dentro del ncleo, que da la apariencia de ser intranucleares. Estas estructuras se conocen como cuerpos de Dutcher. En algunos pacientes con mielomas IgA se pueden observar clulas plasmticas flameadas caracterizadas por una coloracin eosinofilica en la periferia o a veces en el citoplasma completo. En raras ocasiones se pueden observar plasmocitos multinucleados o clulas plasmticas inmaduras (plasmoblastos) en aspirados de MO normal. SERIE MEGACARIOCITICA-PLAQUETARIA En la serie megacarioctica las divisiones nucleares no son seguidas de divisiones citoplasmticas, lo que da lugar a la existencia de clulas poliploides de gran tamao. Se

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distinguen cuatro estadios evolutivos: el megacarioblasto, el promegacariocito, el megacariocito granular y el megacariocito formador de plaquetas o maduro.

MEGACARIOBLASTO: Es la clula descendiente de la SC, con orientacin plaquetognica. Su tamao oscila entre 10 - 25 micras. El ncleo generalmente tetraploide u octaploide es nico, grande, ovalado o bilobulado con cromatina laxa y numerosos nuclolos. El citoplasma, es intensamente basfilo, agranular y puede presentar algunas prolongaciones a modo de seudpodos muy caractersticos.

PROMEGACARIOCITO: Mide 30 a 50 micras y se identifica fcilmente en MO por su gran tamao y por el aspecto caracterstico de su citoplasma que posee bordes mal limitados y emite numerosas prolongaciones. El ncleo es multilobulado, su cromatina es densa y no posee nuclolos. En el citoplasma persiste su tonalidad basfila, con numerosas granulaciones azurfilas que cubren distintas zonas. MEGACARIOCITO GRANULAR:

Es caracterstico su gran tamao (80 micras o ms) y su elevada ploida. Su citoplasma amplio no posee basofilia y est totalmente cubierto por granulacin azurfila rojo rosada. El ncleo es multilobulado o segmentado con cromatina condensada sin nuclolo.

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MEGACARIOCITO MADURO ACTIVO: En este estadio el ncleo sigue siendo lobulado pero ms compacto. Finalizada la sntesis de ADN se inicia en el citoplasma la granulognesis que dar origen a las plaquetas. Los grnulos azurfilos se distribuyen especialmente en la periferia, en pequeos agregados rodeados por una zona hialina citoplasmtica correspondiente a las membranas de demarcacin que irn delimitando las futuras plaquetas. Las plaquetas son finalmente liberadas como fragmentos citoplasmticos por fusin de las membranas de demarcacin. FORMULA LEUCOCITARIA NORMAL Valores de referencia para adultos sanos Valor relativo (%) Valor absoluto (x109/L) Cayados 0 2 0 0,2 Neutrfilos Segmentados 50 70 2,3 6,5 Eosinfilos 1 5 0,05 0,5 Basfilos 0 1 0 0,1 Linfocitos 25 40 1,5 4,0 Monocitos 3 8 0,1 0,8 ALTERACIONES CUANTITATIVAS Se refiere a una variacin en la cantidad de los diferentes tipos leucocitos o bien a variaciones en el recuento total. Se evalan mediante un conteo total de leucocitos y conteo diferencial de cada uno de ellos. Pueden ser trastornos malignos o benignos. Los trastornos malignos pueden ser ocasionados por transformacin neoplsica de clulas progenitoras Los trastornos benignos pueden ser adquiridos o hereditarios. 1-ALTERACIONES FISIOLGICAS Son todas aquellas alteraciones desencadenadas por causas diferentes a la enfermedad subyacente del paciente, son transitorias y no necesitan tratamiento ya que NO constituyen un parmetro de enfermedad. Edad Embarazo Stress emocional Ejercicio Raza (algunas personas de raza negra tienen tendencia a leucopenia) 2-ALTERACIONES PATOLGICAS

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2.1-LEUCOCITOSIS: >11.0 x 109/L (Neutrofilia, eosinofilia, basofilia, linfocitosis, monocitosis) 2.2-LEUCOPENIA: < 4.0 x 109/L (Neutropenia, eosinopenia, monocitopenia, linfopenia) 2.3-REACCIONES LEUCEMOIDES entre 20.0 50.0 x 109/L 2.1 LEUCOCITOSIS Neutrofilia: > 6.5 x 109 /L Aumento absoluto de los neutrfilos La causa ms comn es la infeccin bacteriana. Mecanismo: La invasin bacteriana estimula los precursores en la M.O, esto intensifica la proliferacin, el pool marginal se desplaza hacia el pool circulante; reflejndose en la sangre como leucocitosis y neutrofilia. Tambin es causada por quemaduras, medicamentos, lesiones, y leucemia mieloide crnica. (LMC). Los corticoides, actividad fsica intensa, situaciones de stress pueden manifestarse con neutrofilias sin desviacin a la izquierda. Eosinofilia: > 0.5 x 109 /L Puede verse en infecciones con parsitos metazoarios, trastornos alrgicos, cncer y estados inflamatorios crnicos. Se observa tambin en el sndrome de Loeffler, el cual parece ser producido por una reaccin alrgica. Una causa comn es la migracin del parsito Ascaris lumbricoides a travs del tracto respiratorio. Otros parsitos de la familia Ascaris tambin pueden producir el sndrome. Entre las posibles causas adicionales se puede incluir la alergia a medicamentos, por ejemplo antibiticos sulfonamida. Tambin se puede presentar en coexistencia con tumores slidos. Basofilia: > 0.1 x 109 /L Aumento absoluto de los basfilos. Est vinculada con reacciones de hipersensibilidad inmediata y afecciones mieloproliferativas crnicas (LMC). Se observa tambin en enfermedades inflamatorias del intestino, el mixedema y despus de la exposicin a la radiacin Linfocitosis: > 4 x 109/ L Incremento absoluto en el nmero de linfocitos. Generalmente responde a una infeccin viral. Un marcado incremento en el nmero de linfocitos puede estar asociado a una leucemia linftica crnica. Monocitosis: > 0.8 x 109/ L Incremento absoluto del nmero de monocitos. Este estado se encuentra asociado a perodos largos y crnicos de infeccin bacteriana (brucelosis, tuberculosis, fiebre tifoidea) Se presenta en la etapa de recuperacin de las infecciones agudas. Otras causas son leucemia monoctica y enfermedades del colgeno 2.2 LEUCOPENIAS Neutropenias: < 2.3 x 109/L Disminucin en la produccin medular: aplasia medular, agentes citotxicos que deprimen la divisin celular (sulfamidas, cloranfenicol), hematopoyesis ineficaz. Exceso de destruccin por Ac antineutrfilos, por medicamentos como la fenotiazina. Se observa en enfermedades virales, bacterianas y protozoarias (paludismo, tifo, etc) Fase inicial de la infeccin: la salida de los PNN a los tejidos es mayor que la salida medular (gran demanda tisular). Eosinopenia: < 0.05 x 109/L

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Disminucin en la cantidad de eosinfilos. Difcil de establecer debido a su bajo recuento. La ACTH aumenta los PMN circulantes pero disminuye los eosinfilos circulantes. Se presenta en situaciones estresantes agudas, reacciones inflamatorias y con la administracin de glucocorticoides. La infeccin bacteriana puede causar disminucin debido a una marginacin creciente y a la migracin de estas clulas a los tejidos, pero la recuperacin se puede acompaar de eosinofilia leve Monocitopenias: < 0.1 x 109/L Se encuentra en trastornos de las clulas progenitoras como en la anemia aplsica, en las leucemias, y despus de la terapia con glucocorticoides. En la fase inicial de procesos infecciosos. Linfopenias: < 1.5 x 109/L Disminucin en el nmero de linfocitos Puede originarse por: falla en la produccin, exceso en su destruccin, o prdidas celulares a travs de los conductos linfticos del intestino. Las linfopenias por defectos en la produccin son caracterstica de algunas IDP, tales como: inmunodeficiencia severa combinada, sndrome de DiGeorge completo, hipoplasia cartlago-pelo, inmunodeficiencia comn variable, SIDA 2.3 - REACCION LEUCEMOIDE Reaccin benigna de leucocitos caracterizada por leucocitosis con muchos precursores inmaduros de leucocitos circulantes. Esta respuesta puede ser linfoctica, eosinoflica, as como neutroflica. Puede producir un cuadro sanguneo indistinguible de la leucemia mieloctica crnica. Es transitoria y desaparece cuando el estmulo desencadenante se elimina, por ejemplo extirpacin del tumor y control de la infeccin. Como sucede con la leucemia, la persona que presenta una reaccin leucemoide presenta una proliferacin desorganizada de glbulos blancos inmaduros en la sangre y en la mdula sea. REACCION LEUCEMOIDE NEUTROFILICA Se encuentra aumento de los PNN, acompaados de mielocitos y metamielocitos. Causas:

Neoplasias Broncopulmonares y gstricas Tumores malignos de mama y prstata Algunas infecciones bacterianas: Osteomielitis, tuberculosis.

ALTERACIONES CUALITATIVAS 1-ALTERACIONES NUCLEARES Anomala de Pelger Het Es un trastorno nuclear hereditario autosmico dominante o adquirido debido a quimioterapia, sndromes mieloproliferativos agudos o crnicos, quemaduras, reacciones a frmacos e infecciones. Hay una falla en el desarrollo del ncleo durante la diferenciacin terminal, el ncleo es en forma de nuez o man. Hay hipercondensacin de la cromatina. Se observa hiposegmentacin nuclear .No hay prdida de la funcin celular.

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Hipersegmentacin Nuclear Trastorno hereditario (autosmico dominante) o adquirido. Se debe a una anormalidad en la maduracin del ncleo (sntesis de DNA). Presentacin de PMN con 6 o ms lbulos. Clulas de mayor tamao que las normales. Se observa asociada a la eritropoyesis megaloblstica. Tambin puede estar asociado a infecciones crnicas o a dficit de vitamina B12, folatos, etc. 2-ALTERACIONES CITOPLASMATICAS Sndrome de Chediak Higashi. Esta rara enfermedad autosmica recesiva se caracteriza por albinismo parcial, grnulos lisosmicos gigantes en la mayora de las clulas granulosas (aunque tambin se observan en linfocitos y monocitos), y mayor susceptibilidad a las infecciones. Es fcil observar las clulas sanguneas anormales en los frotis sanguneos de rutina. La enfermedad se diagnostica por lo general en nios. Hay diversas anomalas en los neutrfilos incluyendo neutropenia moderada, reduccin en la quimiotaxis de neutrfilos. Adems, en estudios microbicidas, se observa que los grnulos primarios gigantes se degranulan con lentitud, y por lo tanto, se retarda la muerte de las bacterias fagocitadas. Anomala de Alder Reilly. Trastorno de tipo autosmico. Presencia de grnulos azurfilos agrupados en racimos en el citoplasma de granulocitos, monocitos y linfocitos. Se diferencian de las granulaciones txicas ya que se presentan en otras clulas diferentes a los neutrfilos y la ausencia de vacuolas txicas. Esta asociada a mucopolisacaridosis. Anomala de May Hegglin. Trastorno autosmico dominante. Asociado con hemorragias leves, macroplaquetas con escasos grnulos y trombocitopenia. Se caracteriza por aparicin en los neutrfilos segmentados de unos cuerpos de inclusin muy similares a los cuerpos de Dhle; se observan coloreados azul plido, con la diferencia que por lo general no estn hacia la periferia de la clula sino distribuidos indistintamente en el citoplasma. Cuerpos de Dhle. No son exclusivos de los neutrfilos, igualmente se pueden encontrar en el citoplasma de los monocitos, se observan como inclusiones redondeadas basfilas nicas o mltiples que se depositan en la periferia de las clulas y son poco ntidos. La presencia de estas inclusiones indica hiperactividad celular. Se encuentran en condiciones txicas tales como Fiebre escarlatina, sepsis, quemaduras, embarazo y tuberculosis Granulaciones Txicas. Las granulaciones txicas de los segmentados neutrfilos son grnulos hipertrofiados que le dan un aspecto hipergranular al citoplasma de los neutrfilos que junto con las vacuolas y los cuerpos de Dhle se encuentran en condiciones txicas como infecciones, septicemia, quemaduras. Son grnulos primarios que debido a algn desbalance en la maduracin del neutrfilo no lograron ser eliminados eficazmente. Cuerpos o bastones de Auer. Inclusiones intracitoplasmticas en forma de varilla o de bastn que se observa en los mieloblastos, promielocitos y monoblastos. Se cree que son grnulos azurfilos que se fusionan,

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tienen afinidad por la eosina. Se encuentran en la leucemia mieloide aguda y durante la crisis blstica de la leucemia mieloide crnica. Linfocitos atpicos Llamados tambin clulas linfomonocitoides, linfocitos activados, inmuncitos, etc. Miden de 15m a 30m, ncleo irregular, indentado, excntrico y puede observarse nucleolos. El citoplasma es amplio, color azul tenue o intenso, y puede presentar grnulos azurfilos y vacuolas. Estas clulas pueden observarse en mononucleosis infecciosa, hepatitis viral, herpes zoster, enfermedades autoinmunes y normalmente pueden hallarse hasta en 5%. Vacuolas Se pueden presentar en el citoplasma de neutrfilos txicos, monocitos, eosinfilos y menos frecuentemente linfocitos. Al MO se observan como puntos blancos en sacabocado. En frotis realizados del frasco de hemograma estas vacuolas se pueden presentar en muestras envejecidas por fagocitosis de las sales del anticoagulante, por lo tanto para su confirmacin resulta imprescindible el extendido de punta de aguja. Degranulacin Neutrfilo sin granulaciones, citoplasma limpio, indicativo de hemopatas severas, SMD y SMP. Sepsis de mala evolucin, etc.

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TRABAJO PRCTICO 4 Y 5

ALTERACIONES SERIE ROJA - ANEMIAS HEMATIES NORMOCTICOS - NORMOCRMICOS Discos cuya biconcavidad hace que aparezcan con cierta palidez central. Miden aproximadamente de 7,2 m a 7,4 m. Las alteraciones eritrocitarias se dividen en: Alteraciones en tamao (Anisocitosis) Alteraciones en su forma (Poiquilocitosis) Alteraciones de color (Anisocroma) Inclusiones anormales. Alteraciones en el tamao. Pueden ser de dos tipos: Macrocitos: Hemates que presentan un tamao superior al normal (ms de 9 m) y su expresin mxima es el megalocito. Suelen aparecer en la anemia megaloblstica debida a dficit de vitamina B12 o cido flico. Se suele observar cuando hay un aumento de la actividad eritropoytica, como un mecanismo de compensacin a la prdida de los hemates, sea por anemia severa o hemorragias. En la sangre perifrica se pueden observar como hemates grandes policromatfilos o reticulocitos. Microcitos: Hemates que presentan un tamao inferior al normal (menos de 6 m) y se encuentran en pacientes con anemia ferropnica y talasemias. Alteraciones en la forma Esferocitos: Son hemates esfricos, no son bicncavos, presentan un dimetro inferior al normal pero ms grueso. Su vida media es de 14 das, producen taponamiento de los vasos sanguneos. Se encuentran en la esferocitosis hereditaria o enfermedad de Mihkowski-Chauffard (defecto congnito de la membrana eritrocitaria). Tambin pueden ser adquiridos por factores extraeritrocitarios (autoanticuerpos, quemaduras extensas, etc.) Codocitos o Target cells: Llamados tambin dianocitos. En la regin central presentan un rea con mayor contenido hemoglobnico (zona densa). La interfase entre la membrana celular y el centro es transparente. Se encuentran en hemoglobinopatas (Hb C), talasemias, anemia ferropnica y en algunas hepatopatas crnicas con aumento de colesterol y fosfolpidos. Drepanocitos: Son hemates con HbS precipitada. Su apariencia es propia del estado homocigoto de la hemoglobina S, aunque tambin se puede presentar en estados de heterocigozis. Eliptocitos: Los hemates son alargados (ovalocitos). Se encuentran en la eliptocitosis hereditaria. Su presencia se debe a una alteracin congnita de la membrana del hemate, aunque puede ser adquirida en caso de una anemia megaloblstica, ferropnica o arregenerativa. Equinocitos: Son aquellos que presentan membrana ondulante e irregular. Se encuentran en algunas anemias hemolticas. Este fenmeno puede ser inducido in vitro exponiendo los

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hemates a una solucin hipertnica. Tambin se pueden encontrar en pacientes con IRC, hepatopatas, dficit de PK, etc. Acantocitos: Las prominencias de la membrana eritrocitaria son ms aguzadas (alargadas) y distribuidas irregularmente. Se encuentran en la acantocitosis que se caracterizan por la ausencia de lipoprotenas plasmticas. Tambin pueden encontrase en pacientes con hepatopatas, dislipidemias, hipotiroidismo, etc. Dacriocitos: Son hemates en forma de lgrima. Se encuentran en la anemia ferropnica, anemia megaloblstica y talasemia. Tambin se encuentran en situaciones en las que la MO padece alguna patologa severa (SMD, MFI, etc) y en esplenomegalia. Esquistocitos: Son fragmentos hemticos. Se encuentran en anemias hemolticas microangiopticas (SUH, PTT, etc.), quemaduras, etc. Estomatocitos: Son hemates que en lugar de una deplecin central clara tienen una banda plida central que les da un aspecto de boca. Se hereda como carcter autosmico dominante. Esta enfermedad es causada por anormalidad hereditaria de la membrana eritrocitaria. Tambin se pueden encontrar en pacientes con hepatopatas y dislipidemias. Excentrocitos: Son hemates con distribucin irregular de la hemoglobina. Su tamao es inferior al normal y se caracteriza por poseer contornos parcialmente arrugados, pero adems se observa una distribucin irregular de la hemoglobina que aparece desplegada de la parte interna hacia uno de los extremos. Knocitos: Son hemates que presentan un estoma o boca en la regin central completamente coloreada y lo dems incoloro. Morfolgicamente es todo lo contrario a las caractersticas del estomatocito. Se encuentran en algunas anemias como las ferropnicas. Alteraciones de color Aqu observamos las diferentes tonalidades de color de los hemates dependiendo del contenido hemoglobnico u otros. Tenemos: Hipocroma: Son hemates con disminucin del contenido de la hemoglobina y dependiendo de la cantidad de este pigmento es que observamos a los hemates con diferentes caracteres de color. Aqu estn incluidos los anulocitos, que son hemates en forma de anillo en que solo la membrana eritrocitaria est coloreada y que se traduce en una hipocroma de grado severo (+++). Pseudo - Hipercroma: Son hemates vidos de hemoglobina. Pueden encontrarse en caso de enfermedades como la policitemia vera o la policitemia fisiolgica y esferocitosis hereditaria Policromatofilia: Presencia de hemates con tonalidad (azul y rojo) morada. Se le relaciona con inmadurez celular, clulas nucleadas, presencia de reticulocitos, macrocitos, etc. Esto debido a su elevada cantidad de ARN. Anisocroma: Diferentes tonalidades de color como hemates hipocrmicos, hipercrmicos, normocrmicos y policromatfilos. Se encuentran en ciertas anemias refractarias. Inclusiones anormales Punteado basfilo: Son grnulos basfilos presentes en el citoplasma de los hemates. Indica una alteracin de la eritropoyesis ms que un aumento de la misma. Se produce en muchas enfermedades sanguneas: talasemia, anemias megaloblasticas, infecciones, hepatopatas,

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intoxicacin por plomo y otros metales pesados, hemoglobinas inestables y deficiencia de pirimidina-5-nucleotidasa. Actualmente el consumo de ciertos frmacos tambin puede producir este fenmeno. Cuerpos de Heinz: Son formaciones redondeadas de hasta 3 m de dimetro localizadas habitualmente en la periferia de la clula. Se observan con colorantes para reticulocitos. Estos cuerpos son abundantes en sujetos esplenectomizados. Anillos de Cabot: Se cree que sean restos de membrana nuclear eritroblstica o restos despus de una mitosis anormal. Se observan en forma de anillo u ocho invertido. Pueden ser precipitados de ARN o protena carente de importancia diagnstica. Su presencia indica severas signos de diseritropoyesis. Cuerpos de Howel-Jolly: Son restos de cromatina nuclear, resultados de la prdida del ncleo por parte del eritroblasto ortocromtico hasta la conversin del hemate. Se les considera signos de regeneracin celular. Pueden observarse (habitualmente aislados) en un pequeo porcentaje de hemates en la anemia perniciosa. Las clulas que los contienen aparecen habitualmente tras la esplenectoma y cuando se ha producido una atrofia esplnica. En general, solo se encuentran unas cuantas clulas de este tipo, pero pueden ser muy numerosas en los casos de enfermedad celiaca, en la que hay una atrofia esplnica y una deficiencia de folato concomitante. Cuerpos de Pappenheimer: Los cuerpos de Pappenheimer son pequeas inclusiones eritrocitarias basfilas (casi negras) dispuestas perifricamente. Habitualmente, solo hay una pequea cantidad en el interior de la clula. Estn formados por hemosiderina y su presencia se relaciona con una sobrecarga de hierro y con hipoesplenismo. A veces, se encuentran en la mayora de los hemates circulantes. Su naturaleza puede confirmarse por medio de una tincin de Perls. Corresponden a los grnulos sideroticos de los siderocitos y nunca se encuentran en grandes cantidades en el interior de las clulas, como el clsico punteado basofilo. Sin embargo, en una sola clula se pueden encontrar ambos elementos, es decir, el punteado basofilo y los cuerpos de Pappenheimer. Con la tincin de Perls, los primeros de estos grnulos se tien de rosa mientras que los ltimos lo hacen de azul. Siderocitos: Son hemates con contenido de hierro libre no hemoglobnico de color verde azulado. Grnulos de Shuffner: Son grnulos que presentan algunos hemates en caso de parasitismo por plasmodium vivax. Grnulos de Maurer: Son grnulos de color violeta oscuro que se encuentran en pacientes con parasitismo por plasmodium falciparum. ANEMIA: Se define anemia como la incapacidad de la sangre para transportar oxgeno. Segn la definicin de la OMS se acepta que existe Anemia cuando la concentracin de HEMOGLOBINA se halla por debajo de los lmites establecidos en funcin de la edad y el sexo; independientemente de que la concentracin de eritrocitos se encuentre normal o incluso elevada. EDAD CONCENTRACION DE HEMOGLOBINA (g/dL) MENOR A . Recin nacidos (a termino) 14,0 Nios de 3 meses 9,0 Nios de 2 aos 11,0 Mujeres (no embarazadas) 11,5 Varones 12,0 Mujeres embarazadas 11,0

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CLASIFICACION MORFOLGICA: Se debe recordar que el VCM se correlaciona con la HCM (que informa el contenido medio hemoglobnico de los eritrocitos circulantes) de forma que disminuir la HCM al hacerlo el VCM (anemia microctica hipocrmica) y aumenta cuando aumente el VCM (anemia macroctica hipercrmica). Siempre se debe recordar que en determinadas situaciones el VCM puede estar afectado por factores no debidos al tamao de los eritrocitos, como alteraciones en la forma o la deformabilidad celular, lo que obedece a los mtodos automatizados para medir el VCM por lo tanto, siempre que analicemos un histograma, debemos tener en cuenta que el VCM es un valor medio y no informa sobre la homogeneidad celular y es necesario correlacionarlo con el ndice ADE y hacer una inspeccin al microscopio del frotis para que una posible anisocitosis no pase desapercibida.

a) ANEMIAS MICROCITICAS (VCM< 82 fl)

Anemia Ferropnica. Deficiencia de Hierro. Talasemias. Defectos en la sntesis de Hemoglobina. Anemia secundaria a enfermedades crnicas. Mala disponibilidad del hierro

orgnico. Anemia Sideroblstica. Defectos en la sntesis del grupo HEM.

b) ANEMIAS NORMOCITICAS (VCM: 82 98 fl)

Anemias hemolticas. Aplasia Medular. Invasin Medular. Anemia secundaria a enfermedades crnicas. Anemia secundaria a procesos hemorrgicos agudos. Anemias tempranas de otras anemias.

c) ANEMIAS MACROCITICAS (VCM> 98 fl)

i. HEMATOLOGICAS. (VCM > 115 fl)

Anemias megaloblsticas. Deficiencia de folato o vit B12 Anemias aplsicas. Anemias hemolticas con crisis reticulocitaria. Sndromes mielodisplsicos.

ii. NO HEMATOLOGICAS. (VCM < 115 fl)

Anemia secundaria a abuso de alcohol Anemia secundaria a Hepatopata crnica Anemia secundaria a Hipotiroidismo Anemia secundaria a Hipoxia.

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CLASIFICACIN FISIOPATOLOGICA DE LAS ANEMIAS ANEMIAS ARREGENERATIVAS: En este tipo de Anemias tambin llamadas Arregenerativas, la medula sea no presenta una capacidad regenerativa normal y no se cumple una relacin inversa entre la disminucin de la concentracin de la hemoglobina y el aumento de Reticulocitos. Esto es, la Medula sea no puede responder adecuadamente al grado de anemia.

Defecto de proliferacin y diferenciacin de stem cells: aplasia medular, leucemia, mielodisplasias.

Defecto de proliferacin y diferenciacin de progenitores de los GR: aplasia roja pura, insuficiencia renal, enfermedades endocrinas, etc.

Defecto en sntesis de DNA: deficiencia de vitamina B12 y folatos. Defecto en sntesis de Hemoglobina: deficiencia de fierro, talasemias. Mecanismos mltiples o desconocidos: anemia de enfermedades crnicas,

infiltracin medular (metstasis), anemias sideroblsticas.

ANEMIAS REGENERATIVAS: En general, obedecen a una perdida perifrica de eritrocitos por hemorragias o hemlisis. Son anemias regenerativas, es decir que la medula presenta una capacidad de respuesta normal y existe una relacin inversa entre el grado de anemia y el aumento de Reticulocitos.

DEFECTOS INTRNSECOS: - De membrana: esferocitosis, acantocitosis, etc. - De enzimas: deficiencias de G-6-PD, piruvato kinasa, etc. - De globinas: enfermedad de las clulas falciformes (HbS), Hemoglobinas inestables, etc.

DEFECTOS EXTRNSECOS: - Mecnicos: microangiopata, prtesis, etc. - Qumicos o fsicos: hemlisis por drogas, venenos. - Infecciones: clostridium, malaria, otras septicemias... - Anticuerpos: autoinmune, aloinmune, drogas. - Hiperactividad monocito-macrfago: hiperesplenia. - Prdida de sangre: hemorragia aguda.

RECUENTO DE RETICULOCITOS Los Reticulocitos son eritrocitos no nucleados, inmaduros, que contienen ARN y que continan sintetizando hemoglobina despus de la prdida del ncleo.

El carcter regenerativo o arregenerativo de una anemia puede conocerse a travs del recuento de Reticulocitos. Adems, el recuento de Reticulocitos sirve para el seguimiento en el tratamiento de ciertas anemias. Por ejemplo, la respuesta de los reticulocitos en el da 6 despus

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de la terapia confirma la respuesta a la terapia con folato o con B12 siempre que slo se hayan dado dosis bajas, en una anemia por dficit de folato o cabalamina. Podemos observar los reticulocitos al microscopio ptico mediante la tincin con colorantes vital, azul de metileno o azul brillante de cresilo. Estos colorantes dan lugar a la precipitacin de los restos de ARN, y se observan como filamentos de color azul intenso en el interior de la clula. El nmero de reticulocitos en sangre circulante es, probablemente el mejor y ms sencillo indicador de la eritropoyesis. Un aumento puede interpretarse como indicacin de una elevada demanda de nuevos eritrocitos y un correcto funcionamiento de la mdula sea. Por el contrario cuando la demanda disminuye o la mdula sea falla en sus funciones, la cifra de reticulocitos baja. Segn el grado de maduracin que posea el reticulocito presentar un modelo de reticulocito distinto, de ovillo denso en el caso de los ms inmaduros o de grnulos escasos para los ms maduros PROCEDIMIENTO:

1) Se prepara un tubo que ya contenga el colorante (azul brillante de cresilo). 2) La sangre debe ser anticoagulada con EDTA-Na2. (Debido a que los Reticulocitos

tambin maduran in vitro, es aconsejable que la sangre utilizada se haya extrado recientemente, como mximo 6 horas antes de su anlisis). Aadir 2 gotas de sangre a uno de los tubos ya preparados que contienen 100 ul de colorante.

3) Mezclar e incubar durante 10-15 minutos a 37C. 4) Volver a mezclar la suspensin 5) Realizar un extendido 6) Dejar secar al aire 7) Una vez realizado todo esto observar al microscopio con el objetivo de 100x con aceite

de inmersin. En la coloracin, los hemates se tien de color verde amarillento y los Reticulocitos se diferencian porque presentan en su interior unos hilos finos de color azul.

50 hemates Luego se procede a contar los Reticulocitos en 5 campos, por ejemplo: Tambin se pueden contar 10 campos homogneos y luego sacar un promedio y se obtiene as el porcentaje. Si se utiliza esta tcnica conviene moverse aleatoriamente por el preparado buscando zonas de distribucin homognea realizando el recuento cada 2 o 3 campos. Recordar que los campos en los que no se encuentran reticulocitos deben considerarse en el clculo final. As por ejemplo para un paciente sano podramos tener:

X= 5 campos

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2 + 1 + 0 + 1 + 2 + 1 + 0 + 1 + 2 + 2 = 1,1 % 10 Los Reticulocitos pueden expresarse de diferentes maneras:

PORCENTAJE DE RETICULOCITOS: El porcentaje de Reticulocitos se determina en al menos 1,000 hemates. El recuento de Reticulocitos se determina multiplicando el porcentaje de Reticulocitos por el recuento de hemates. Los adultos normales muestran un recuento de Reticulocitos de 0.5 a 2 %. En los recin nacido