8740321 pruebas optativas para liquido seminal[1]

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LIQUIDO SEMINAL-ESPERMATOBIOSCOPIA

PRUEBAS COMPLEMENTARIASRECOLECCION DE MUESTRA SEGÚN LA OMS

DATOS MUESTRA:• Nombre del paciente• Periodo de abstinencia, fecha, hora de recolección• Se analizan 2 muestras de semen (tiempo transcurrido no debe ser menor 7 ni mayor de 3

semanas).OBTENCIÓN DE LA MUESTRA:MASTURBACIÓN

• Recoge en un consultorio o en el laboratorio• Después de 48 hrs de abstinencia sexual

SE RECOGE EN UN FRASCO DE:Vidrio de boca ancha, limpio, facilitado por el laboratorioLa muestra debe recibirse lo antes posibleEn ningún momento depuse de más de 2 o 3 hrs de su tomaSe coloca en recipiente (debe estar tibio el recipiente para evitar la motilidad de los

espermatozoides)Condones específicos (no de látex, alteran la viabilidad de los espermatozoides)

CARACTERÍSTICA DE LA MUESTRA:La muestra debe ser completaSe protege de temperaturas extremas (-20°C ni + 40°C)

Elaboro químico clinico Willians Sanchez Rodriguez 1


MORFOLOGIA

ANÁLISIS DE LAS CARACTERISTICAS MORFOLÓGICA DE LOS ESPERMATOZOIDES• Defectos de cabeza• Defectos del cuello y pieza mediana• Defectos de cola

Kruger y col. Informaron que si se realiza la evaluación morfológica del semen utilizando los criterios estrictos desarrollados en el Hospital de Tygerberg este método es de gran valor predictivo en fertilidad. Según estos autores se debe considerar como normal a aquel espermatozoide cuya cabeza tenga una configuración oval con un acrosoma bien diferenciado que ocupe entre el 40 % y el 70 % de la cabeza espermática.De acuerdo a este sistema de clasificación se comprobó que la población de hombres normales posee valores que están por encima del 14 % de formas morfológicamente normales.



MORFOLOGÍA.• Normales: Mayor de 50 % • Macrocéfalos: Menor a 0.5% • Microcéfalos : Menor a 1.5% • Cabezas dobles : Menor a 1.5% • Cabezas dobles : Menor a 1.5% • Cabezas ausentes :: Menor a 5% • Amorfos : Menor a 40%

VITALIDADA ESPERMATICA POR EXCLUSIÓN DE COLORANTE

• Es la proporción de espermatozoides vivos de acuerdo al criterio de exclusión de algún colorante vital mediante la expresión de su capacidad osmoreguladora cuando se le expone a condiciones hipoosmóticas.

• Esto debe ser determinado el % de espermatozoides inmóviles superen el 50%.

AGLUTINACIÓN:

• Consiste en que los espermatozoides se adhieren entre ellos.• Se debe a la existencia de una causa inmunológica de infertilidad• Se evalúa también para determinar la motilidad

INTERPRETACIÓN: La aglutinación debe ser informada:Por ejemplo:

• Cabeza, con cabeza, cola con cola como



ESACALA SEMICUANTITATIVA:• Sin aglutinación• +++ agrupamiento masivo

INMUNOLOGIAPBAS PARA LA DETECCIÓN DE ANTICUERPOS UNIDO IMNUNOBEADS

Los anticuerpos anti espermáticos son detectados microscópicamente usando "inmunobeads", pequeñas esferas de resinas a las que se acoplan anticuerpos. Si los anticuerpos anti espermáticos se hallan unidos a la superficie de los espermatozoides, las células espermáticas se unirán a las "inmunobeads".

Espermatozoides negativos por este método son mezclados con el suero o el moco cervical a evaluar, posteriormente se examina la unión a "inmunobeads".

UTILIDAD CLINICA

En algunos casos, factores inmunológicos pueden jugar un papel importante en la infertilidad. Los anticuerpos anti espermáticos pueden ser producidos por el hombre y/o la mujer. El hombre puede desarrollar anticuerpos anti espermáticos contra sus propios espermatozoides, y la mujer puede generar anticuerpos contra los espermatozoides de su pareja.

Los anticuerpos anti espermáticos pueden contribuir a la infertilidad de varias maneras:

• Inmovilizar los espermatozoides antes de que éstos alcancen el moco cervical. • Si se encuentran localizados en el moco cervical, los anticuerpos anti espermáticos pueden

atrapar las células espermáticas en la estructura del moco, impidiendo su migración en el útero. • Interfieren de manera directa durante el proceso de interacción entre el ovocito y el

espermatozoide, impidiendo la fertilización. • El ensayo de evaluación de anticuerpos anti espermáticos se utiliza para detectar anticuerpos en

el semen, suero y moco cervical.

Inmunobeads Directo:

• Este ensayo demuestra la presencia de Anticuerpos antiespermatozoides unidos a la superficie de las gametas del paciente con esterilidad autoinmune.

Inmunobeads Indirecto:

• Se evalúa la presencia de Anticuerpos antiespermatozoides del tipo IgG en suero sanguíneo, plasma seminal, moco cervical, secreción endometrial y líquido folicular.



PRUEBA MIXTA DE ANTIGLOBULINAS

• Para IgG y Ig A se mezclan con semen fresco, se utilizan partículas de látex• Formación de aglutinados máximos entre las partículas• Diagnostico de infertilidad inmunológica es probable cundo en 50% de espermatozoides

tienen partículas adheridas.

MOST: • Evalúa la resistencia de los espermatozoides al someterlos a aun estrés térmico, y su efecto en la

movilidad de los mismos.

PRUEBA DE HINCHAZÓN (TEST HIPOSMOTICO)

• Se basa en la semipermeabilidad de la membrana celular intacta que causa que los espermatozoides se hinchen en condiciones hipoosmoticas, cuando la entrada de agua produce expansión en el volumen de la célula.

PROCEDIMIENTO: La prueba de hinchazón de espermatozoides en medio hipo-osmótico (HOS) 4.en la cual se incubaron 100 ul de semen con 1 ml de solución hipo-osmótica durante 1 hora; luego se cuentan los espermatozoides que incorporaron la solución (evidenciado por hinchazón de la cola).

1. ESPERMATOBIOSCOPIA POR EQUIPO AUTOMATIZADOSPERM QUALITY ANALYZER (SQA)

Es un instrumento electrooptico que realiza una evaluación objetiva, segura y cuantitativa de la calidad del semen, proporcionando un método infinitamente más objetivo en comparación con el método tradicional, pudiendo llegar a un diagnóstico más efectivo del potencial fertilizador del paciente.



El equipo está basado en la digitalización de las oscilaciones de la densidad óptica, que los espermatozoides móviles producen en una celda fotoeléctrica. Todo el proceso de lectura, interpretación de los datos y la obtención de cada uno de los parámetros es controlado y procesado mediante algoritmos matemáticos patentados por Medical Electronic Systems Ltd de Israel.

En la valoración de la calidad espermática el analizador reportará; aspecto, volumen, ph, viscosidad, licuefacción, leucocitos, y además, mediante el equipo SQA se reportarán otros seis parámetros que son:

1- Concentración total de espermas:Corresponde a la concentración total de espermas (vivos, muertos, inmaduros) y el resultado se expresa en millones/ml.

• Poca cantidad: Menos de 20 millones/ml• Regular: de 20 a 60 millones/ml• Buena cantidad: Más de 60 millones/ml

2- Motilidad:Parámetro que corresponde al porcentaje de espermatozoides móviles.

• Poca cantidad: De 0 a 30% de espermatozoides móviles• Regular: Del 30% al 50% de espermatozoides móviles• Buena cantidad: Más del 50% de espermatozoides móviles

3- Morfología:Este parámetro mide el porcentaje de espermatozoides con morfología normal. La morfología va de acuerdo al tipo de movimiento, la deformidad del espermatozoide hace que se mueva con patrones irregulares. La morfología por lo tanto es medida indirectamente, pero correctamente, hay una relación bien establecida entre la morfología y su movimiento.

• Poca cantidad: De 0 a 20% de espermatozoides con morfología normal• Regular: Del 20% al 30% de espermatozoides con morfología normal• Buena cantidad: Más del 30% de espermatozoides con morfología normal

4- Espermatozoides funcionales:El concepto de “espermatozoides funcionales” está descrito por la OMS como aquellos espermatozoides que presentan movilidad progresiva útil y morfología normal. Proporciona una medición directa y cuantitativa de la capacidad de fertilización, clasificando al semen como:

• Poca cantidad: 0-3 millones• Media cantidad: 3-13 millones• Buena cantidad: 13 o más millones

5- Concentración de espermatozoides móviles:



Mide la cantidad de espermatozoides con motilidad progresiva, que la que le confiere capacidad fertilizadora.

• Valores esperados: Más de 26 millones/ml

6- Indice de motilidad del esperma (SMI)Numerosos estudios clínicos han demostrado claramente que los valores del SMI se correlacionan perfectamente con los potenciales fertilizadores de las muestras estudiadas. El SMI es un nuevo parámetro que no ha sido considerado en los análisis convencionales de espermas.

• Mala calidad: 0-80• Media calidad: 80-160• Buena calidad: 160-350

Estudios amplios han demostrado claramente que las lecturas efectuadas por el SQA reflejan de manera fiable el potencial de fertilización del semen examinado.

ESPERMOGRAMA COMPUTARIZADO

Este estudio comprende, la evaluación computarizada del semen a través de un Sistema CASA además de la determinación de parámetros seminales que han sido previamente establecidos en sus correspondientes manuales por la Organización Mundial de la Salud.

La incorporación de los Sistemas CASA como metodología diagnóstica, significó un progreso real en la estandarización del manejo del semen. El Sistema suministra un método objetivo de excelente reproducibilidad, a través de un análisis directo de imágenes. El hecho de no utilizar muestras diluidas y ser a la vez de rápida evaluación, permite una disminución en la variabilidad de los resultados que pueden producirse utilizando otro tipo de metodología.

Además este Sistema suministra parámetros seminales que no pueden obtenerse, a través de estudios no computarizados. Como por ejemplo determinar la velocidad media espermática en micrones por segundo, la linearidad, velocidad promedio y velocidad rectilinea, y otros parámetros de la cinemática espermática de gran importancia para el conocimiento de la gameta masculina.

VENTAJAS:• Alta precisión• Provisión de datos cuantitativos sobre la cinética de loe espermatozoides

2. CULTIVO DE SEMEN• El cultivo de semen consiste en analizar el semen en busca de infecciones causadas por

bacterias, hongos, etc...• En la mayoría de los casos, esta prueba se solicita en pacientes con síntomas de prostatitis u

orquitis.



Toma de muestra:

Todas las muestras deben tomarse con 72 hs de abstinencia sexual y retención urinaria mínima de 3 horas. La abstinencia sexual permite detectar la mayor concentración de MO infectantes en las vías espermáticas y glándulas anexas, como así también minimiza la contaminación con los MO de la flora normal o colonizantes transitorios de la compañera sexual. El paciente, en el momento de la realización del estudio, no debe presentar secreción uretral ni infección urinaria.

Interpretación de resultados:

Se considera una muestra positiva aquella cuyo recuento de colonias es ³ 103 UFC/ml de bacterias de pato-genicidad reconocida o ³ 104 UFC/ml de bacterias potencialmente patógenas y solamente una especie aislada.

La infección por micoplasma puede asociarse a de una reducción de la motilidad de los espermatozoides, la producción de anticuerpos antiespermáticos y una penetración anormal en el óvulo. Se requieren estudios clínicos controlados para determinar específicamente cualquier vínculo entre una infección por micoplasma y la infertilidad en el hombre.

Separación de espermatozoides por migración-sedimentación (M/S, “jumping”):

Con esta técnica se recuperan los espermatozoides móviles que migran al compartimiento interno del tubo de Jondet7 Para cada muestra de semen se valoró la motilidad y la concentración antes y después de la separación.

3. TEST DE NARANJA DE ACRIDINA

El ensayo naranja de acridina mide la susceptibilidad del ADN del espermatozoide al ácido inducido por la desnaturalización in situ por cuentificación del cambio metacromático del naranja de acridina fluorescente del verde (ADN natural) al rojo (ADN desnaturalizado).

El naranja de acridina fluorescente se intercala entre las dobles cadenas de ADN como un monómetroy liga las cadenas simples del ADN como un agregado.El naranja de acridina monométrico vira al ADN natural o verde fluorescente mientras que el naranjade acridina agregado al ADN desnaturalizado vira a rojo fluorescente49. El naranja de acridina puede usarse tanto con el microscopio de fluorescencia como con citometría de flujo.

• Tinciones con naranja de acridina muestran una diferencia significativa entre los varones fértiles y aquellos que son infértiles por diferentes patologías andrológicas.

• El valor de corte entre varones fértiles e infértiles varía entre el 20 y el 50%.



PROCEDIMIENTO:

Los espermatozoides pre y postseparación se incuban durante 5 minutos con 6 ug/ml de naranja de acridina (Naranja de Acridina, Sigma chemical Co.), posterior a esta incubación se observaron 100 espermatozoides en el microscopio de fluorescencia. La fluorescencia verde en la cabeza indica DNA de doble cadena y el DNA de cadena simple, que está desnaturalizado emite fluorescencia roja.

UTILIDAD CLÍNICA: • Control de calidad de donantes de semen para bancos de esperma. • Diagnóstico en pacientes con fertilidad reducida y espermograma aparentemente normal. • Chequeo espermático para procedimientos de FIV. • Evaluación de causas posibles en abortos recurrentes.

SIGNIFICACIÓN CLÍNICA: Se basa en el principio que la naranja de acridina se enlaza al DNA doble cadena normal dando fluorescencia verde y al DNA simple cadena desnaturalizado dando fluorescencia roja. Un alto porcentaje de cabezas espermáticas rojas puede asociarse a un potencial de fertilidad disminuido.

VALOR DE REFERENCIA: ³ 45% de células verdes

4. ENSAYO COMET

El ensayo comet, también conocido como electroforesis de células únicas para el análisis del ADN de una sola célula, fue introducido por primera vez por Ostling y Johanson en 1984 y fue modificado posteriormente en 1988. Cuando se descondensa el ADN del espermatozoide en el seno de un gel y se



somete a la acción de un campo eléctrico, las moléculas de ADN se desplazan y generan una imagen en forma de cometa (de ahí el nombre de ensayo comet).

La presencia de daño en el ADN se cuantifica midiendo la longitud de la cola. A su vez pueden utilizarse también otros parámetros de medida, tales como el “momento de la cola”, que es el producto de la longitud de la cola por su intensidad (fracción del total del ADN de la cola).

5. ENSAYO TUNEL (Terminal deoxinucleotidyl transferase- mediated deoxyUridine triphosphate-Nick End Labeling) es uno de los más utilizados para medir las anomalías del ADN. En varios estudios se ha demostrado una correlación inversa entre el porcentaje de espermatozoides con ADN fragmentado y la movilidad, la concentración y la morfología del eyaculado. En diversos estudios que han utilizado este ensayo TUNEL se ha abordado su utilidad como predictor del éxito en las técnicas de reproducción asistida.

El ensayo TUNEL se basa en el principio de que la desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) incorpora dUTP en roturas de cadenas dobles o simples del ADN. En concreto, en el ensayo se incorpora desoxiuridina biotinilada al 3’OH del ADN. La biotina actúa como señal y puede ser detectada fácilmente, por ejemplo, a través de técnicas fluorescentes. Cuantas más roturas tenga el ADN mayor será la señal resultante.

En los espermatozoides con ADN normal sólo se detecta fluorescencia de fondo, mientras que los espermatozoides con ADN fragmentado (múltiples 3’-OH terminales) se tiñen con una fluorescencia intensa. La fluorescencia puede detectarse tanto por citometría de flujo como a través de microcopia fluorescente

6. TEST DE CROMATINA

Evalúa el grado de condensación de la cromatina en los espermatozoides. A partir de una suspensión de espermatozoides se hacen extendidos y se colorean con Azul de Anilina. Los espermatozoides que NO se colorean tienen una buena condensación de la cromatina, los que SI se colorean, tienen una mala condensación.

PRUEBAS DE INVESTIGACION

PRUEBAS FUNCIONALES DEL ESPERMATOZOIDE:1. Especies de oxigeno reactivo e infertilidad masculina2. Prueba de unión a la zona pellucida humana3. Prueba penetración del ovocito de hámster sin zona pellucida

REFERENCIAS:



Federico, A. Manual De análisis clínicos, 4ª edición, 1997, Editorial medica panamericana, Mexico.Henry J.B., Diagnostico clínico y tratamiento clínico, 9ª edición, 2000, Edutorial masson, México.Kolmer,J.A. Diagnostico clínico por análisis del laboratorio, 3ª edición, 1963, Editorial interamericana.Manual de laboratorio de la OMS para el examen de semen humano y interacción entre semen y moco cervical, 4ª Edición, 2001, editorial panamericana.http://www.aam.org.ar/consenso%20esterilidad%202.phphttp://www.fertilityspain.com/spain/treatment/The_Doctors_Visit/Male_Specialist_Tests/Culture_of_Semen.jsphttp://www.urologiaavanzada.com/cultivo.htmhttp://www.carpermor.com.mx/publicaciones/C5-Espermatobioscopia_Automatizada.pdfhttp://www.mes-ltd.com/products_bulls.asphttp://www.zdlinc.net/productcart/pc/viewPrd.asp?idproduct=56&IDCategory=35http://scu.org.co/revistas/dic2003/Evaluacion%20funcional%20en%20eyaculados.pdfhttp://www.clevelandclinic.org/reproductiveresearchcenter/docs/agradoc185.pdfhttp://www.cigorcentro.com.ar/lab_andro.htmhttp://www.centrodefertilidad.com/lab_fertil2.htm

Pruebas Funcionales

Test de Hiperactivación

Por medio de este test, es posible determinar los cambios en el modelo de movimiento de los espermatozoides, luego de incubar las muestras en un medio de cultivo capacitante.Utilizando un software desarrollado por Hamilton-Thorne Research es posible conocer la velocidad curvilinea, la velocidad rectilinea, la linearidad porcentual de las gametas en estudio y el desplazamiento lateral de la cabeza espermática.

Test de Sobrevida

Permite conocer el porcentaje de espermatozoides que mantienen su movilidad luego de 24 hs de incubación, bajo condiciones controladas. Este test se suele solicitar como parte de los estudios de pacientes que participan en un programa ded reproducción asistida de alta complejidad.

Determinación de ATP

A través de una técnica bioluminiscente, es posible detectar cantidades muy pequeñas de ATP en las células. Esta valoración permite conocer la fuente primaria de energía, utilizada por el espermatozoide para mantener la movilidad.

Estudio de la Condensacion Nuclear de la Cromatina o Test de Azul de Anilina.


http://www.centrodefertilidad.com/lab_fertil2.htm

http://www.cigorcentro.com.ar/lab_andro.htm

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http://www.fertilityspain.com/spain/treatment/The_Doctors_Visit/Male_Specialist_Tests/Culture_of_Semen.jsp

http://www.aam.org.ar/consenso esterilidad 2.php


Es un test simple de estudio del núcleo espermático. Dado que las cabezas de las gametas inmaduras contienen histonas ricas en lisina, es posible teñirlas con una solución ácida de azul de anilina que permite su fácil diferenciación de las gametas normales.

Test de Naranja Acridina

Este test denominado también de heterogeneidad de la cromatina, determina el estado de integridad de la cromatina nuclear espermática, permitiendo una mejor diferenciación de la capacidad fertilizante.

Triple Coloración

A través de esta técnica tricrómica que utiliza azul tripán, marron bismark y rosa de bengala, ha sido posible estudiar la morfología espermática antes y después de la capacitación y de la reacción acrosómica

Test Hiposmotico

Esta valoración se aconseja para completar el estudio de la integridad anátomo-funcional de la membrana plasmática. La técnica se basa en la capacidad del espermatozoide maduro normal, de hincharse en una solución hiposmótica

LPOp

Test que determina la injuria producida por los radicales libres sobre la membrana plasmática. Ha sido incorporado dentro de los tests de función espermatica, ya que permite conocer el stress oxidativo producido por las sustancias oxígeno reactivas.

ROS (Sustancias oxígeno reactivas)

La causa de daño peroxidativo in vivo, podría demostrarse por la capacidad de los espermatozoides humanos de generar sustancias oxígeno reactivas, como el anión superóxido o el peróxido de hidrógeno. Ambas pueden iniciar el daño peroxidativo con la consiguiente pérdida de la función espermática

MOST (Stress Test Modificado)



La pérdida de la movilidad espermática está asociada con el envejecimiento de las gametas y la peroxidación lipídica endógena. Este test estudia la movilidad post swim up o percoll y se lo ha relacionado con una peroxidación lipídica forzada. El MOST permite predecir fertilización y correlaciona significativamente con anormalidades relacionadas a las gametas masculinas.

Reacción Acrosomica

El estudio de la reacción acrosómica (RA) por medio de diferentes lectinas, ha demostrado ser un método muy eficaz como prueba de la función espermática. Generalmente se estudia la RA espontánea conjuntamente con la inducida por ionóforo de calcio.

Bacteriología

Esta sección del laboratorio tiene el cometido de completar los estudios diagnósticos y ofrecer una gama más completa de determinaciones que están relacionadas con la fertilidad. Se incluyen entre otras las determinaciones de ureaplasma urealyticum y chlamydia trachomatis, además de la tipificación de gérmenes comunes

Estudios Inmunológicos

Varios tests han sido desarrollados para demostrar la presencia de anticuerpos antiespermatozoides en suero sanguineo, plasma seminal y moco cervical. A los métodos de Isojima (anticuerpos espermoinmovilizantes) y Kibrik (anticuerpos espermoaglutinantes), se incorpora el Friberg test que requiere el uso de un microscopio invertido y trabajando en microescala.

Mar Test

Este ensayo demuestra la presencia de anticuerpos antiespermatozoides unidos a la superficie de las gametas del paciente en estudio. El Mar Test permite revelar la presencia de IgG e IgA sobre la superficie de los espermatozoides del semen fresco.

Inmunobead

Se utiliza para la detección de anticuerpos de superficie, frente a anti – inmunoglobulina humana adsorbida sobre partículas de poliacrilamida. El test permite conocer no solo la existencia de



inmunoglobulinas de superficie, sino su localización sobre las gametas. En este caso, el test permite conocer la existencia de IgG, IgA e IgM, que tienen importantes implicancias funcionales.

Tanto el estudio del Mar –test como Immunobead, pueden realizarse en forma indirecta sobre moco cervical, plasma seminal y suero sanguíneo del varón o mujer empleando en estos casos una suspensión de espermatozoides normales.

Recuperación

Separación de espermatozoides

Se realizan también las técnicas de swim up, swim down o percoll, de acuerdo a la metodología utilizada en los buenos laboratorios de la especialidad. La duración de las pruebas es de aproximadamente 3 horas y las mismas consisten en seleccionar los espermatozoides traslativos rápidos, que a su vez se capacitan en un medio de cultivo apropiado, manteniéndolos en una estufa a 37º C y en ambiente de CO2 al 5 %.

Recuperación de espermatozoides en eyaculación retrograda

Realizamos el método de recuperación de espermatozoides en la orina post-eyaculación modificando la acidez urinaria y lavando los espermatozoides con posterior swim up de los mismos.

Bacteriología

Esta sección del laboratorio tiene el cometido de completar los estudios diagnósticos y ofrecer una gama más completa de determinaciones que están relacionadas con la fertilidad. Se incluyen entre otras las determinaciones de ureaplasma urealyticum y chlamydia trachomatis, además de la tipificación de gérmenes comunes.


8740321 pruebas optativas para liquido seminal[1]

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