VALORACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE EXTRACTOS Y FRACCIONES OBTENIDAS DEL

Divi Divi (Caesalpina spinosa.)

CLAUDIA DELGADO DELGADILLO LUISA MARGARITA PLATA CUADROS

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BARCELONA DIPLOMATURA DE POSTGRADO

MEDICINA ANTI ENVEJECIMIENTO

BARCELONA JULIO 2011

TABLA DE CONTENIDO Pag.

1. INTRODUCCIÓN ........................................................................................................... 5

2. MARCO TEÓRICO ........................................................................................................ 7

2.1. ANTIOXIDANTES NATURALES ................................................................................. 7

2.1.2 .Clasificación Química .............................................................................................. 7

2.1.3 Funcionamiento – Inhibidores ................................................................................... 9

2.1.4. Acción y Aplicación ................................................................................................ 10

2.1.5. Método del DPPH .................................................................................................. 11

2.2. GENERALIDADES SOBRE EL ESTRÉS OXIDATIVO; ANTIOXIDANTES ............... 13

2.2.1 La defensa antioxidante y su relación con diferentes enfermedades....................... 14

2.3. IMPORTANCIA DE LOS ANTIOXIDANTES DIETARIOS EN LA DISMINUCIÓN DEL ESTRÉS OXIDATIVO ...................................................................................................... 15

2.4. ACCIÓN ANTIOXIDANTE DE LOS FLAVONOIDES ................................................. 17

2.5. FLAVONOIDES Y CARCINOGÉNESIS .................................................................... 19

2.6. ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE LA CESALPINIA ................................................... 20

2.7.DIVIDIVI (CAESALPINIA SPINOSA), GENERALIDADES .......................................... 20

2.7.1 Distribución geográfica del Dividivi (Caesalpinia Spinosa ....................................... 21

2.7.2 Descripción botánica ............................................................................................... 21

2.7.3. Composición química ............................................................................................. 22

2.7.4 Actividades reportadas .......................................................................................... 25

2.8. TANINOS VS. CÁNCER ........................................................................................... 27

2.8.1 Capacidad protectora de cybopogon citratus (dc) stapf ante el daño genético inducido por estrés oxidativo ........................................................................................... 30

2.9. ACTIVIDAD CAPTADORA DE RADICALES LIBRES Y CITOTOXICIDAD DE PLANTAS COLOMBIANAS DE LA FAMILIA ANNONACEAE .......................................... 31

3. METODOLOGÍA .......................................................................................................... 33

3.1 OBJETIVO GENERAL ............................................................................................... 33

3.2 OBJETIVO ESPECÍFICOS ........................................................................................ 33

4. MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................................ 34

4.1 OBTENCIÓN DE LOS EXTRACTOS Y FRACCIONES ............................................. 34

CONCLUSIONES PRELIMINARES 37 BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................................ 38

LISTA DE FIGURAS

Pag.

Figura 1 Oxidación de hidroquinona 8 Figura 2 Oxidación d p-aminofenol 8 Figura 3 Oxidación de β, β’ – ditiodipropionico 9 Figura 4 Actividad antioxidante 12 Figura 5 Planta de Dividivi 22 Figura 6 Radicales que conforman las estructuras presentes en C.spinosa 24 Figura 7 Estructura propuesta para el ácido pentagaloil quinico para C. spinosa 25 Figura 8 Estructuras típicas de taninos hidrolizables y condensados 28

LISTA DE TABLAS

Pag.

Tabla 1 Composición de Taninos presentes en Caesalpinia 23 Tabla 2 Compuestos químicos presentes en Caesalpinia Spinosa 24 Tabla 3 Actividad anticarcinogénica de algunos taninos 28

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1. INTRODUCCIÓN La medicina ha progresado espectacularmente en el diagnóstico y tratamiento de muchas enfermedades, ofreciendo una mayor esperanza de vida. Como resultado de este aumento en la expectativa de vida enfermedades como las cardiovasculares, reumática, cánceres, demencia senil son cada vez más frecuentes. Este inconveniente revela que no todo consiste en alargar la vida, sino que es preciso añadir salud y bienestar a los años, lograr sumar años sin restar calidad de vida. Éste es el objetivo de la medicina del bienestar o anti envejecimiento, ofrecer vivir más y mejor. A diferencia de las otras condiciones, el envejecimiento afecta a todos los hombres y mujeres del planeta. El envejecimiento es la suma de las alteraciones estructurales celulares y degeneración de los órganos aparentemente inevitables que ocurren con el paso del tiempo aumentando el riesgo de enfermedad y por lo tanto de muerte. El Dr. Denham Harman, el ―padre‖ de la teoría de los radicales libres, ha definido el envejecimiento ―como la probabilidad aumentada de muerte cuando aumentan la edad y los cambios fisiológicos adversos de un organismo, el medio interno celular se altera, las funciones y la estructura de las células comienzan a perderse, dejan de aprovechar los nutrientes necesarios de manera adecuada, la capacidad de mantenerse y regenerarse es sobrepasada por los procesos nocivos, conduciendo al envejecimiento de los órganos‖1. El envejecimiento biológico está ligado a procesos de oxidación a nivel molecular originados por la producción de radicales libres que son átomos o moléculas inestables, altamente reactivos que atacan los enlaces de proteínas de los tejidos, los fosfolípidos poliinsaturados de las membranas celulares, los carbohidratos, y los ácidos nucleicos de las células. Al actuar, activan una reacción en cadena que podría incluso llevar a la muerte celular. La adopción de una serie de hábitos de vida que minimicen la producción de estos radicales libres y su neutralización mediante tratamientos dietéticos y/o farmacológicos (los denominados antioxidantes) prevendrán y aminorarán los daños producidos en nuestro organismo por esta excesiva oxidación tanto a nivel celular como a nivel molecular, en proteínas, lípidos y ADN. Y en esto se basa, fundamentalmente, la medicina anti envejecimiento: contrarrestar, con una detección precoz, el envejecimiento celular, para poder prevenir y corregir

1HARMAN Denham, MD, Ph.D.: la investigación pionera de envejecimiento de cinco décadas”. Salud.

Universidad de Nebraska en Omaha. 2003., p. 23

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enfermedades, consigue frenar este deterioro vital con tratamientos que disminuyen la producción de radicales libres. En la actualidad se están realizando numerosas investigaciones en busca de antioxidantes naturales con la finalidad de ser usados en la industria de alimentos, cosméticos y en la atención de la salud para prevenir, aliviar y/o curar procesos degenerativos, como consecuencia de la presencia de radicales libres en nuestro organismo. La región andina y amazónica del país posee, muchas especies vegetales con reconocida actividad benéfica para la salud, gracias a la riqueza en cuanto a la Biodiversidad de la Flora Colombiana y en general de nuestro continente. En el afán de contribuir a la búsqueda de fuentes de antioxidantes naturales se seleccionaron plantas procedentes de estas regiones con el objetivo de determinar las especies vegetales que presentan mayor actividad antioxidante es así como el estudio y la caracterización de los efectos farmacológicos de los extractos de plantas basados en el conocimiento popular, constituye un tema de interés actual en la comunidad científica internacional. La medicina tradicional ha sido clásicamente considerada como la medicina de nuestros antepasados, las plantas han sido utilizadas como medicina por cientos de años. El conocimiento popular con respecto a la actividad farmacológica de las plantas ha sido la base del descubrimiento de medicamentos ampliamente utilizados en el presente; el uso de plantas en la medicina ha involucrado el aislamiento de componentes activos, comenzando con el aislamiento de la morfina a partir del opio a comienzos del siglo XIX. El descubrimiento de plantas medicinales involucra diversos campos, comenzando con la botánica, etnobotánica y etnofarmacología, saberes que colectan e identifican las plantas de interés. El reto del país y de las autoras en particular es el de participar en el fortalecimiento de una comunidad científica que busque adaptar los avances de una tecnología y de la ciencia al estudio de nuestros problemas y con ello favorecer el control de nuestros recursos y la evaluación de las posibilidades de explotarlos en forma racional, sostenible y en beneficio del país y de los pacientes. Teniendo en cuenta lo anterior, el objetivo principal del presente trabajo fue evaluar el efecto antioxidante de los extractos y fracciones de Dividivi Caesalpina spinosa mediante una revisión bibliográfica y en una segunda fase obtener de manera biodirigida extractos y fracciones para ser analizados desde el punto de vista fitoquimico y evidenciar aquel con más actividad antioxidante.

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2. MARCO TEÓRICO

2.1. ANTIOXIDANTES NATURALES Los antioxidantes están universalmente distribuidos en el mundo vegetal y animal desempeñando un papel importante y esencial en la regulación de los procesos metabólicos en todos los seres vivos. ―se encuentran tocoferoles que son antioxidantes de tipo fenólico, en pequeñísimas cantidades en las grasas animales en cantidades que oscilan entre 0.02 y 0.10% en casi todos los aceites vegetales. Hay también antioxidantes peculiares de ciertos aceites, como el gosipol en el aceite bruto de la semilla del algodón, por otro lado están los antioxidantes del caucho bruto los cuales son de dos grupos fenólicos y amino aromáticos‖2. Algunos productos contienen una concentración de antioxidantes naturales suficientes para ser útiles industrialmente como preservativos entre ellos están las resinas de guayaco, benjuí y otras resinas y gomorresinas vegetales, taninos, destilados de la madera dura y destilados de aceites vegetales. ―Los antioxidantes naturales se han preferido desde hace largo tiempo para proteger alimentos, puesto que, en general su toxicidad es pequeña, mientras que los sintéticos se usan en la industria del caucho, del petróleo y en una multitud de aplicaciones que tienen estos productos. Algunos antioxidantes usados en la gasolina y caucho se han adaptado con gran éxito a los alimentos después de haberse encontrado que su toxicidad es pequeña o absolutamente nula en animales de ensayo y en el hombre‖3. 2.1.2 .Clasificación Química. En general los antioxidantes son de carácter fenólico o amínico, aunque en algunos casos se usan compuestos con azufre: Compuestos Fenólicos: Son una de las clases de antioxidantes más importantes de antioxidantes, la hidroquinona es un ejemplo de ellos, esto debido a que se oxida reversiblemente a quinona.

2RAYMOND E. Kirk, DONALD F. Othmer Enciclopedia de tecnología química, Tomo II, Primera edición,

Unión topográfica editorial hispano-americana, México. UTEHA, 1961. 234 p. 3Ibid., p. 45

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Figura 1 Oxidación de hidroquinona

Fuente: Raymond, E., Donald, F., 1961

Solo son antioxidantes eficaces los polifenoles que tienen dos hidroxilos en posición orto (o) o para (p). Los compuestos meta (m), que no pueden experimentar la transformación hidroquinona-quinona, son casi inertes. Así, el catecol es un oxidante potente, mientras que el resorcinol no lo es; tampoco lo es el fenol puesto que solo tiene un grupo hidroxilo. Sin embargo los bencenos sustituidos, los compuestos aromáticos que contiene más de un anillo bencénico y los compuestos heterocíclicos pueden ser antioxidantes aunque no contengan dos hidroxilos en el núcleo de la molécula, su estructura es comparable a la de los compuestos hidroxilados o- y p- que tienen una configuración electrónica semejante. Los compuestos de hidroxibenceno pierden su propiedad antioxidante cuando está completamente sustituido el anillo, sin embargo, la sustitución limitada en el anillo bencénico no perjudica la actividad de algunos compuestos. Por otro lado los compuestos amínicos aromáticos antioxidantes son en general, semejantes a los antioxidantes fenólicos, a excepción que los hidroxilos libres en el núcleo bencénico están reemplazados totales o parcialmente por aminos, un ejemplo de este grupo es el p-aminofenol que se oxida para dar una quinonimina de manera similar a la hidroquinona, así: Figura 2 Oxidación d p-aminofenol

Fuente: Raymond, E., Donald, F., 1961

En los que respecta estas dos clases de antioxidantes aromáticos, puede decirse que la actividad antioxidante reside principalmente en el núcleo bencénico o- ó p- sustituido, y que no puede aumentarse mucho más por una construcción más grande de la molécula.

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Compuestos orgánicos de Azufre: Una tercera clase de antioxidantes potentes son ciertos compuestos orgánicos azufrados, como el ácido β, β’-ditiodipropionico en la cual la oxidación puede suponerse que se produce de la siguiente forma: Figura 3 Oxidación de β, β’ - ditiodipropionico

Fuente: Raymond, E., Donald, F., 1961

Entre los diversos compuestos que se han utilizados como antioxidantes materias no saturadas como aceites, figuran: mono-, di- y trietanolaminas, aminas de azucares y sus derivados, ácidos carboxílicos aldehídos compuestos de cianamida y aminoácidos alifáticos. 2.1.3 Funcionamiento – Inhibidores. La auto-oxidación de moléculas orgánicas en fase líquida o en solución es un proceso en cadena mediante un radical. La iniciación de la reacción requiere de la producción de un radical libre, ya sea por ataque directo del oxígeno, fotoquímicamente o por un agente agregado. La reacción en cadena comprende tres pasos: iniciación, propagación y terminación, que puede representarse por las siguientes ecuaciones R-H+ iniciador _____ Radical libre R— R- +O2___________ROO- ROO- +R-H_______ROO + R- R- + R___________Productos inertes. R-+ ROO___ _____Productos inertes. ROO-+ ROO ____ ___Productos inertes. En donde RH= hidrocarburo, aldehído, etc. Las reacciones que forman ROO- y ROOH tienden a autoperpetuarse y son los pasos de propagación de la autooxidación. Los antioxidantes reaccionan con los radicales libres continuadores de la cadena para formar productos inertes en uno de los pasos de terminación. Los radicales de peróxido ROO- prevalecen posiblemente en este paso terminal, puesto que los radicales libres hidrocarbonatos reaccionan muy fácilmente con oxígeno molecular.

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En general, los antioxidantes dan fin a las reacciones de oxidación en cadena en las formas siguientes: por donación de un electrón a un radical de peróxido, por donación de un átomo de hidrogeno a un radical de peróxido, por adición a un radical de peróxido antes o después de oxidarse parcialmente y por otro medios donde es posible que intervengan radicales de hidrocarburos en vez de radicales de peróxido, sin embargo, estos no se han determinados aún. Esto puede generalizarse en varios modos de funcionamiento, unos beneficiosos y otros perjudiciales; el ataque directo del oxígeno sobre el antioxidante puede producir radicales que inicien cadenas de oxidación, la iniciación por este medio parece ser más importante con aminas que con fenoles. El antioxidante puede participar en el paso de propagación por un mecanismo de transferencia de cadena; las aminas parece ser más propensas que los fenoles a esto, sin embargo los fenoles son más activos que las aminas para retardar la oxidación mediante un mecanismo de interrupción de la cadena4.

Destructores de Peróxidos: Otro mecanismo para proteger un sistema contra la oxidación es la descomposición catalítica del hidroperóxido inicialmente presente en el sistema o formado posiblemente como resultado del ataque directo del oxígeno sobre el sustrato o el inhibidor. Un carácter importante de este proceso de descomposición es que los productos estables primario no son radicales libres; esto excluye naturalmente que la descomposición de lo peróxido pueda ser debida a metales como cobre, cobalto o hierro. Los compuestos de azufre son los más efectivos destructores de peróxidos, los inhibidores de radicales libres en ausencia relativa de peróxidos confieren en general estabilidad por un cierto tiempo que esta aproximadamente en razón directa a su concentración, mientras que los destructores de peróxidos más de la concentración. 2.1.4. Acción y Aplicación. Los radicales libres son protagonistas de numerosas enfermedades que provocan reacciones en cadena, estas reacciones solo son eliminadas por la acción de otras moléculas, en estos procesos tóxicos en el organismo, los llamados sistemas antioxidantes defensivos. En estudios realizados por Ramos, E.; Castañeda, B.; y Ibañez, L. (2008). ―Se ha demostrado que el organismo posee un número de mecanismos a través de los cuales produce y a la vez limita la producción de especies reactivas de oxígeno. Un exceso de radicales libres suele iniciar el daño de la pared vascular y en este proceso se encuentra implicado el colesterol LDL; se ha demostrado en la

4MATILL HA (1987). Antioxidants. Annu Rev Biochem 16: 177–178.

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incidencia de enfermedades cardiovasculares con suplementos individuales de antioxidantes‖5. Las especies oxigénicas reactivas producen diversas acciones sobre el metabolismo de los principios inmediatos, que pueden ser el origen del daño celular. Actúan sobre los lípidos poliinsaturados de las membranas celulares, produciendo pérdida de fluidez y lisis celular como consecuencia de la peroxidación lipídica (PL); sobre los glúcidos, alterando las funciones celulares tales como las asociadas con la actividad de las interleuquinas y la formación de prostaglandinas, hormonas y neurotransmisores; sobre las proteínas produciendo inactivación y desnaturalización; sobre los ácidos nucleicos mediante la modificación de bases produciendo mutagénesis y carcinogénesis. En la actualidad son muchos los procesos relacionados con la producción de radicales libres como son: mutagénesis, transformación celular, cáncer, arteriosclerosis, infarto de miocardio, procesos de isquemia/reperfusión, diabetes, asfixia de neonato, enfermedades inflamatorias, trastornos del sistema nervioso central, envejecimiento, entre otros. Además, un creciente número de estudios soportan la teoría que el estrés oxidativo está envuelto en la progresión de VIH6; también ha sido asociado a la patogénesis de muchas enfermedades humanas, es por ello que el uso de antioxidantes en farmacología es estudiado de forma intensiva, particularmente como tratamiento para accidentes cerebrovasculares y enfermedades neurodegenerativas. Los antioxidantes encuentran muchos usos y aplicaciones; entre los productos estabilizados se encuentran preparados para evitar el eritema solar, aceite de corte, materiales de empaque, formulas anticorrosivos, piensos, soluciones para ondular el cabello, caroteno, concentrados vitamínicos, forrajes, jabones, insecticidas, polímeros, plastificantes, aceites para trasformadores, aceites para turbinas, combustibles industriales y de motores, productos de caucho fabricados con caucho natural y caucho sintético, parafina, intermediarios de colorantes, aceites esenciales, hortalizas, verduras y frutas rebanadas, envoltura de gelatina para carnes entre otros muchos. 2.1.5. Método del DPPH. Los métodos de medición de la actividad antioxidante muestran extrema diversidad; muchos procedimientos usan una acelerada oxidación involucrando un iniciador para manipular una o más variables en el sistema de prueba; tales iniciadores incluyen adición de un metal de transición

5RAMOS, E.; CASTAÑEDA, B.; IBAÑEZ, L. (2008). Evaluación de la capacidad antioxidante de plantas

medicinales peruanas nativas e introducidas. Revista académica Perú salud. 15 (1), 42-46. 6KOLEVA, I., VAN BEEK, T., LINSSEN, J., Groot, A., Y EVSTATIEVA, L. (2002). Proyección de las

plantas y la actividad antioxidante de los extractos: un estudio comparativo de tres métodos de prueba.

Fitoquímica . p. 8-17.

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como catalizador, exposición a la luz para promover oxidación fotosensitizada por oxígeno singlete, y fuentes de radicales libres. Por otra parte según Mosquera, O., Niño, J., Correa, Y., Buitrago, D., (2005). ―La evaluación de actividad antioxidante a través de fuentes generadoras de radicales libres en el sistema de prueba, asume que la oxidación es inhibida en un alto porcentaje por la captura de estos; por tanto se enfoca en monitorear la capacidad de aditivos y extractos para la captura de radicales o la inhibición de su formación. Este es el principio de los métodos más modernos de ensayo DPPH (1,1-difenil-2- picrilhidrazilo)‖7. Figura 4 Actividad antioxidante

Fuente: MOSQUERA, O., NIÑO, J., CORREA, Y., BUITRAGO, D., (2005). Estandarización del método de captura de radicales libres para la evaluación de la actividad antioxidante de extractos vegetales.

El fundamento del método desarrollado por Brand-Willams DPPH, consiste en que este radical tiene un electrón desapareado y es de color azul-violeta, decolorándose hacia amarillo pálido por la reacción de la presencia de una sustancia antioxidante, siendo medida espectrofotométricamente a 517 nm. Por diferencia de absorbancia se determina el porcentaje de captación de radical libre DPPH a una concentración de 20 mg/L8. La solución del radical libre 1,1-difenil-2-picril-hidrazilo (DPPH*) en metanol se almacena a 0º C, en recipiente ámbar recubierto con papel aluminio para mayor protección contra luz. Se realiza seguimiento a las reacciones del extracto con la

7MOSQUERA, O., NIÑO, J., CORREA, Y., BUITRAGO, D., (2005). Estandarización del método de captura

de radicales libres para la evaluación de la actividad antioxidante de extractos vegetales. Scientia et Technica

Año XI, No 27, Abril 2005. Pag 231-234. 8CASTAÑEDA, Benjamín, IBÁÑEZ Vásquez, Lucy A. Evaluación de la capacidad antioxidante de plantas

medicinales peruanas nativas e introducidas. Rev Acad Peru, Salud. 15(1), 2008

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solución de trabajo del radical libre DPPH, a través de la técnica fotometría visible9.

2.2. GENERALIDADES SOBRE EL ESTRÉS OXIDATIVO; ANTIOXIDANTES Según estudios realizados por Martínez Coyuela (1995).Los radicales libres de oxígeno causan daño oxidativo y este se ha visto implicado en la etiología o patología de más de cien enfermedades diferentes, entre las que se encuentran distintos tipos de cáncer, enfermedades cardíacas y vasculares, diabetes y desórdenes neurovegetativos10. Un radical libre es cualquier molécula que contiene uno o más electrones no pareados11. En las células aeróbicas existen diversas vías que conducen a la producción de radicales libres derivados del oxígeno. Las fuentes principales son las enzimas asociadas al metabolismo del ácido araquidónico, como la cicloxigenasa, la lipoxigenasa y la citocromo P-450. La presencia y ubicuidad de enzimas (superóxido dismutasa, catalasa y peroxidasas) que eliminan productos secundarios de la vía univalente en las células aeróbicas sugieren que los aniones superóxidos y el peróxido de hidrógeno son productos secundarios importantes del metabolismo oxidativo. Las especies de oxígeno reactivo pueden lesionar macromoléculas como el ADN, los hidratos de carbono y las proteínas. Estas especies de oxígeno citotóxico pueden clasificarse en 2 tipos: a) Los radicales libres, como el radical superóxido (O2) y el radical hidroxilo (OH) y b) las especies de oxígeno no radicales, como el peróxido de hidrógeno (H2O2), el oxígeno singlete (O1), que resulta una especie muy tóxica, el peroxinitrito (ONOO) y el ácido hipocloroso (HOCL)12. Los radicales inestables atacan componentes celulares causando daño sobre los lípidos, proteínas y ADN, los cuales pueden iniciar una cadena de eventos que dan como resultado lesión celular. ―Estos procesos reductivos son acelerados por la presencia de metales de transición como el Fe y el Cu y enzimas específicas, como las monoxigenasas y ciertas oxidasas‖13.

9MOLYNEUX, P. (2004). The use of the stable free radical diphenylpicrilhydrazyl (DPPH) for estimating

antioxidant activity. Songklanakarin J. Sci. Technol., volúmen 26 Número 2. Pág. 211-219 10

MARTÍNEZ Coyuela M. Oxygen free radicals and human diseases. Biochemic 1995;77,147-61. 11

Ibid., p 63. 12

ALDERSHVILE J, Ambrosio G, Bayés de Luna A, Badimon L, Bertrand ME, Cleand J, et al (1998) Estrés

oxidativo (especies de oxígeno reactivo), patología cardiovascular (Parte I) Eur Cardiol J 1998;3(72): 13

SAHNOUN Z, JAMOUSSIE K, ZEGAL Km. Free radicals and antioxidants:human physiology and

therapeutic aspects. Therapics 1997;52(4):251-70.

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Los radicales libres se producen continuamente en el organismo por medio de reacciones bioquímicas de oxidación-reducción con oxígeno (REDOX), que tienen lugar por el metabolismo normal de las células, por los fagocitos, en una reacción inflamatoria controlada y también en ocasiones, como respuesta a la exposición de radiaciones ionizantes, rayos ultravioletas, contaminación ambiental, humo de cigarrillos, hiperóxia y exceso de ejercicio e isquemia. 2.2.1 La defensa antioxidante y su relación con diferentes enfermedades. Los radicales libres son protagonistas de numerosas enfermedades que provocan reacciones en cadena; estas reacciones solo son eliminadas por la acción de otras moléculas que se oponen a este proceso tóxico en el organismo, los llamados sistemas antioxidantes defensivos. ―Un primer grupo trabaja sobre la cadena del radical inhibiendo los mecanismos de activación, un segundo grupo neutraliza la acción de los radicales libres ya formados, por tanto detiene la cadena de propagación. En este grupo pueden encontrarse enzimas detoxificadoras notables como la su-peróxido dismutasa y la catalasa, que producen peroxidasas particularmente importantes como la glutatión peroxidasa‖14. Las enzimas utilizan en su mayoría elementos trazas como cofactores para sus reacciones. Muchas de estas moléculas las podemos encontrar en la fase lipídica, otras por el contrario son lipofóbicas. El sistema antioxidante protege a los tejidos de los efectos de los radicales libres. Los antioxidantes se clasifican en primarios, secundarios y terciarios, en dependencia de su función. En el primer grupo, los enzimáticos, se encuentran fermentos que protegen al organismo contra la formación de nuevos radicales libres, entre los que se encuentran:

Superóxido dismutasa (SOD) que transforma el oxígeno en peróxido de hidrógeno.

Glutatión peroxidasa (GPX) que convierte el peróxido de hidrógeno y los peróxidos lipídicos en moléculas inofensivas antes de que puedan formar radicales libres.

Proteínas de unión a metales (GR) que frenan la disponibilidad del Fe, necesario para la formación del radical OH.

En el segundo grupo de antioxidantes, los secundarios no enzimáticos hay 2 subgrupos:

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SAHNOUN Z, Jamoussie K, Zegal KM. Free radicals and antioxidants:human physiology and therapeutic

aspects. Therapics 1997;52(4):251-70.

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Antioxidantes hidrofílicos: entre los que se encuentran la vitamina C, (ascorbato), ácido úrico, bilirrubina y albúmina.

Antioxidantes lipofílicos: entre los que se encuentran la vitamina E (alfatoco-ferol), carotenoides y las ubiquinonas.

Dentro de los antioxidantes terciarios, encargados de reparar bio moléculas dañadas por los radicales libres se incluyen las proteasas reparadoras de ADN y la metionina sulfóxido reductasa. Según Cespedes-Cabrera, (2000). La defensa antioxidante, enzimática y no enzimática protege al organismo contra el daño oxidativo, pero no con el 100 % de eficiencia15.

2.3. IMPORTANCIA DE LOS ANTIOXIDANTES DIETARIOS EN LA DISMINUCIÓN DEL ESTRÉS OXIDATIVO Los antioxidantes obtenidos a través de la dieta, pueden actuar de dos formas: primero, previniendo la generación excesiva de radicales libres, evitando así que se produzca el daño celular por efecto del estrés oxidativo. Y segundo, después de que se ha producido el daño, los antioxidantes pueden controlar los niveles de radicales libres evitando que el daño continúe avanzando y con ello algunos síntomas de las enfermedades producidas por el efecto del estrés oxidativo pueden disminuir (Nuttall, et al., 1999; Uttara, et al., 2009). El daño oxidativo puede ser prevenido por moléculas antioxidantes, las cuales son capaces de donar electrones para estabilizar a los radicales libres y neutralizar sus efectos dañinos, éstas pueden ser de origen endógeno (sintetizados por el organismo) y exógeno (provenientes de fuentes externas) (Uttara, et al., 2009). Entre los antioxidantes endógenos, se encuentran: la superóxido dismutasa (SOD) que cataliza la dismutación del O2·- para dar origen al H2o2 (Markesbery, 1997),ácido tióico o lipoico, los cofactores (cobre, zinc manganeso, hierro y selenio) que son necesarios para la actividad del sistema enzimático endógeno y la coenzima Q, (Halliwell, 1996; Mohseni Salehi Monfared SS, et al., 2009; Venereo, 2002). Algunos reportes muestran a la terapia antioxidante como una alternativa para prevenir y contrarrestar a las diversas enfermedades asociadas al estrés oxidativo, manteniendo el balance entre la formación y neutralización de los radicales libres (Nutall et al., 1999; Mohseni Salehi Monfared SS, et al., 2009).

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CÉSPEDES Cabrera Teresita, SÁNCHEZ Serrano Daniel. Algunos aspectos sobre el estrés oxidativo, el

estado antioxidante y la terapia de suplementación. Rev Cubana Cardiol 2000;14(1):55-60

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Según (Nuttall, et al., 1999; Uttara, et al., 2009), los antioxidantes obtenidos a través de la dieta, pueden actuar de dos formas: primero, previniendo la generación excesiva de radicales libres, evitando así que se produzca el daño celular por efecto del estrés oxidativo. Y segundo, después de que se ha producido el daño, los antioxidantes pueden controlar los niveles de radicales libres evitando que el daño continúe avanzando y con ello algunos síntomas de las enfermedades producidas por el efecto del estrés oxidativo pueden disminuir16. Los efectos nocivos del estrés oxidativo, sobre la salud humana, pueden ser reducidos a través de la ingesta de antioxidantes dietarios, presentes en diversos alimentos, principalmente las frutas y verduras. Logrando además un aumento en la esperanza y calidad de vida de las personas. El H2o2 es descompuesto en oxígeno y agua por la catalasa (CT), mediante la siguiente reacción17 (Agudo, et al., 2007; Murray, et al., 1994; Perl- Treves y Perl, 2002): 2H O2H O + O 2222 La glutatión peroxidasa (GHX), dependiente de selenio que cataliza la reducción del H2o2 (Cisneros, et al., 1997; Halliwell, 1996). La glutatión (GHS), quien contribuye con la GHX, para reducir el H2o2 a agua (Elejalde, 2001), así mismo neutra- liza al OH· cediéndole un electrón. Además recicla antioxidantes como la vitamina C, reduciéndolos para que puedan continuar neutralizando a los RL (Guido y Aalt, 1983). Por otra parte, los antioxidantes exógenos se encuentran en los alimentos naturales (Tabla i), entre estos están las vitaminas A, E y C, los b-carotenos, luteína, flavonoides, licopenos, el ácido tióico o lipoico, los cofactores (cobre, zinc manganeso, hierro y selenio) que son necesarios para la actividad del sistema enzimático endó- geno y la coenzima Q, (Halliwell, 1996; Mohseni Salehi Monfared SS, et al., 2009; Venereo, 2002). Algunos reportes muestran a la terapia antioxi- dante como una alternativa para prevenir y contrarrestar a las diversas enfermedades asociadas al estrés oxidativo, manteniendo el balance entre la formación y neutralización de los radicales libres (Nutall et al., 1999; Mohseni Salehi Monfared SS, et al., 2009).

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NUTALL, S. L, KENDALL M. J. Antioxidant therapy and the prevention of crdiovacular disease quarterly.

Journal of medicine. 1999 p. 239-244 17

AGUDO Cabrera, L. Amiano, P. ARDANAZ, E. BARRICARTE, A. BERENGUER, T. CHIRLAQUE,

M.D. DO RRONSORO, M. LARRAÑAGA, N. MARTÍNEZ, C. NAVARRO, C. QUIRÓS, J.R. SÁNCHEZ,

M.J. TORMO, M.J. GONZÁLEZ, C.pean Prospective Investigation into Cancer and American Journal

Clinical Nutrition. 2007 85 -6

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2.4. ACCIÓN ANTIOXIDANTE DE LOS FLAVONOIDES La capacidad de los polifenoles vegetales para actuar como antioxidantes en los sistemas biológicos fue ya reconocida en los años treinta; sin embargo, el mecanismo antioxidante fue ignorado en gran medida hasta hace poco tiempo. El creciente interés en los flavonoides se debe a la apreciación de su amplia actividad farmacológica. Pueden unirse a los polímeros biológicos, tales como enzimas, transportadores de hormonas, y ADN; quelar iones metálicos transitorios, tales como Fe2+, Cu2+, Zn2+, catalizar el transporte de electrones, y depurar radicales libres. Debido a este hecho se han descrito efectos protectores en patologías tales como diabetes mellitus, cáncer, cardiopatías, infecciones víricas, úlcera estomacal y duodenal, e inflamaciones. Otras actividades que merecen ser destacadas son sus acciones antivirales y anti alérgicas, así como sus propiedades anti-trombótica y antiinflamatoria. Los criterios químicos para establecer la capacidad antioxidante de los flavonoides, son:

Presencia de estructura O-dihidroxi en el anillo B; que confiere una mayor estabilidad a la forma radi- cal y participa en la deslocalización de los electrones.

Doble ligadura, en conjunción con la función 4- oxo del anillo C41-42.

Grupos3-y5-OHconfunción4-oxoenlosani- llos A y C necesarios para ejercer el máximo poten- cial antioxidante.

Siguiendo estos criterios, el flavonoide quercitina es el que mejor reúne los requisitos para ejercer una efectiva función antioxidante. Su capacidad antioxidante medida como Trolox es de 4,7 mM, lo que resulta 5 veces mayor al demostrado por las vitaminas E y C y tiene una hidrosolubilidad similar a la de la vitamina E. La función antioxidante de la quercitina muestra efectos sinérgicos con la vitamina C. El ácido ascórbico reduce la oxidación de la quercitina, de manera tal que combinado con ella permite al flavonoide mantener sus funciones antioxidantes durante más tiempo. Por otra parte, la quercitina protege de la oxidación a la vitamina E, con lo cual también presenta efectos sinergizantes. Así, se ha demostrado que el flavonoide inhibe la fotooxidación de la vitamina E en la membrana celular de las células sanguíneas en presencia de hematoporfirina como fotosensibilizador18.

18

BORS W, Heller W, Christa M y cols. Flavonoids as antioxidants: determination of radical-scavenging

efficiencies. Methods Enzymol, 1990, 186:343-355.

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Los flavonoides retiran oxígeno reactivo especialmente en forma de aniones superóxidos, radicales hidroxilos, peróxidos lipídicos o hidroperóxidos. De esta manera bloquean la acción deletérea de dichas sustancias sobre las células. Sus efectos citoprotectores son, por ejemplo, bien patentes en fibroblastos de la piel humana, queratinocitos, células endoteliales y ganglios sensoriales cultivados en presencia de sulfoxina-butionina, un inhibidor irreversible de la glutatión sintetasa. Diversos flavonoides han mostrado su eficiencia para eliminar los procesos de peroxidación lipídica del ácido linoléico o de los fosfolípidos de las membranas, la peroxidación de los glóbulos rojos o la autooxidación de los homogeneizados de cerebro. Asimismo, se ha comprobado su potente capacidad de inhibir in vitro la oxidación de las lipoproteínas de baja densidad (LDL) por los macrófagos y reducir la citotoxicidad de las LDL oxidadas46, 47. De hecho, las poblaciones que consumen productos ricos en flavonoides estadísticamente presentan menores riesgos de afecciones cardiovasculares. En estudios epidemiológicos se ha demostrado que con el consumo incrementado de frutas y vegetales se experimenta una reducción del 50% en el riesgo de cánceres digestivos y de las vías respiratorias. Así, la genísteina bloquea el desarrollo de tumores al prevenir la formación de nuevos vasos impidiendo con ello la llegada del oxígeno y nutrientes a las células neo tumorales. También modula la reacción de los estrógenos ligándose a sus receptores con lo que disminuye el riesgo de cáncer de mama. De hecho, se ha puesto de manifiesto que diversos flavonoides pueden inhibir monooxigenasas dependientes del citocromo P-450, lo que indicaría un papel potencial en la regulación de la activación de carcinógenos y que chalconas y flavononas en concreto son inductoras de las quinonas reductasas y podrían tener un papel preventivo en la progresión de los hepatomas19. Los flavonoides protoantocianídicos pueden ser absorbidos por las membranas celulares y protegerlas de la acción de los radicales libres. Tienen la ventaja de ser liposolubles e hidrosoluble. Por eso, en contraste con otros antioxidantes que no poseen esa doble cualidad, son capaces de atravesar la barrera hemáto encefálica y pueden proteger a las células cerebrales, que son muy sensibles a las lesiones producidas por los radicales libres. Además combaten la inflamación y las alergias y aumentan la efectividad de las células natural killer del sistema inmunológico20. La capacidad antioxidante de los flavonoides depende, entre otros factores, de su capacidad de eliminar el hierro, y de hecho se ha comprobado recientemente en células U937 tratadas con el agente tóxico terbutilhidroperóxido

19

http://www.arbolmaguey.com/es/producto/contenido-y-beneficios/compuestos-fenolicos-y-flavonoides -

Consulta realizada 15 de Junio de 2011 20

PALOU A y SERRA F. 2000. Perspectivas europeas sobre alimentos funcionales. Alimentación, Nutrición

y Salud. 7 (3): 76-9 Zeisel S. 1999. Regulation of "nutraceuticals". Science 285: 1853-1855.

19

que aun a muy bajas concentraciones son capaces de evitar la rotura y la oxidación del ADN y que una parte importante de su potente acción protectora está relacionada directamente con su lipofilicidad21.

2.5. FLAVONOIDES Y CARCINOGÉNESIS Un número creciente de sustancias naturales se han identificado como moduladoras del proceso de carcinogénesis; entre ellas se encuentran los flavonoides que han demostrado poseer efectos antimutagénicos y anticarcinogénicos. Diversos datos experimentales han demostrado la acción anti proliferativa y anti- carcinogénica, así como el papel de agente quimio preventivo de los flavonoides22. Entre los numerosos fenómenos que tienen lugar durante el proceso carcinogénico y que ofrecen opción para la modulación mediante factores externos, se encuentran la formación de metabolitos carcinógenos, que se forman por la acción de enzimas citosólicas y microsómicas. Estas enzimas controlan este paso crítico en el proceso carcinógeno. Estudios in vivo e in vitro han demostrado que los flavonoides pueden modular su actividad. En experimentos in vitro se ha confirmado el papel protector de la quercitina, la cual ejerce efectos de inhibición frente a células cancerígenas en humanos: en colon, glándula mamaria y ova- rio, en región gastrointestinal y en la leucemia. Una posible explicación a estos efectos anticancerígenos podría derivarse del incremento que algunos flavonoides producen en las concentraciones intra celulares de glutatión a través de la regulación de la expresión de la enzima limitante en su síntesis. Asimismo, en lo que respecta a la prevención del cáncer de mama, podría deberse a su potente capacidad de inhibir la actividad de la aromatasa evitando de esta forma la conversión de andrógenos en estrógenos. No obstante, los flavonoides no constituyen un grupo homogéneo de compuestos y las mismas propiedades que caracterizan su actividad antioxidante, determinan que puedan presentar efectos pro-oxidantes. Los mecanismos moleculares que determinan la actividad de los flavonoides en ese sentido, se basan en la formación de un radical aroxilo lábil o de un complejo flavonoide hierro redox lábil. En el primer caso, la autooxidación del radical aroxilo genera anión superóxido (0 -) que, siguiendo la secuencia conocida, genera el dañino radical hidroxilo (HO.). Estos mecanismos pueden constituir la base de las acciones mutagénicas y citotóxicas descritas para algunos flavonoides. 21

AMERICAN DIETETIC ASSOCIATION. Position of the American Dietetic Association: Functional Foods. J.

Am. Diet. Assoc.1999: 1278-1285. 22

BORS W, Heller W, Christa M y cols. Flavonoids as antioxidants: determination of radical-scavenging

efficiencies. Methods Enzymol, 1990, 186:343-355.

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Debe destacarse que las propiedades pro-oxidantes y mutagénicas de los flavonoides se hallan unidas a la acción de eliminar radicales libres que tienen estos compuestos. Sin embargo, lo que determina el carácter antioxidante o pro-oxidante de esta reacción inicial es, como ya se mencionó previamente, la estabilidad/labilidad redox del compuesto radical formado a partir del flavonoide original. La autotooxidación del radical aroxilo o la formación de compuestos ternarios entre el ADN, el cobre y los flavonoides, son posibles explicaciones de la mutagenicidad mediada por los flavonoides.(Yoshida M, Sakai T y Hosokawa N ).

2.6. ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE LA CESALPINIA En los últimos años la atención se ha enfocado en el rol de la bio transformación de moléculas en metabolitos altamente activos los cuales inician toxicidad celular. Muchos componentes incluyendo drogas útiles en la clínica pueden causar daño celular, mediante la activación celular de especies altamente reactivas químicamente como son los radicales libres, carbonos y nitratos CCl4 han sido probablemente estudiados más exhaustivamente bioquímicamente y patológicamente más que cualquier otra hépato toxina. Estos radicales tricomertilos mostraron ser altamente reactivos, capaces de atacar lípidos microsomales llevándolos a peroxidación. Esto convalida procesos bioquímicos secundarios los cuales en últimas la causa del desarrollo de un panorama de consecuencias patológicas del metabolismo de CCi4 (Wei, 1998). Caesalpinia digyna es tradicionalmente utilizada para el tratamiento de la diabetes y de enfermedades de origen inflamatorio, los radicales libres ROS son la causa de estas enfermedades free radical y lo antioxidantes de naturaleza CDM comprobados en este estudio pueden tal vez en parte contribuir a esta actividad. El estudio también arroja pruebas y usos etno médicos y su relación con la etno farmacología de estas especies. En conclusión el presente estudio revela claramente que los CDM tiene potentes in vitro radicales libres y muestra una actividad antioxidante inhibiendo la peroxidación y aumentando los niveles de las enzimas antioxidantes tales como SOD y CAT in CCl4, se continúan realizando estudios que nos lleven a aislar la fracción indicada que contenga el principio activo responsable de esta acción antioxidante.. (Antioxidant activity of Caesalpinia digyna root, 26 June 2007)

2.7.DIVIDIVI (CAESALPINIA SPINOSA), GENERALIDADES A continuación se presentan las características del Dividivi (Caesalpinia Spinosa)

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Droga o parte utilizada: frutos deshidratados y pulverizados deCaesalpinia spinosa (Molina) Kuntze.

Nombre científico actualizado: Caesalpinia spinosa (Molina) Kuntze

Sinónimos: Tara victoria Molina, Poinciana spinosa Molina, Tara spinosa (Molina) Britton & Rose.

Clasificación taxonómica (Cronquist, 1981).

Reino: Vegetal

Subreino: Spermatophyta

División o phyllum: Magnoliophyta

Clase: Magnoliopsida (dicotiledóneas)

Sub clase Rosidae

Orden: Fabales

Familia: Caesalpiniaceae

Género: Caesalpinia

Especie: Caesalpinia spinosa (Molina) Kuntze. 2.7.1 Distribución geográfica del Dividivi (Caesalpinia Spinosa). En Colombia está presente en climas fríos (18-24 °C) y bosque seco premontano (bs-PM), con un promedio anual de lluvias de 500 a 1.000 mm. y pertenece a la subregión o provincia de humedad Subhúmedo. (Espinal, 1972). 2.7.2 Descripción botánica. Arbolito de 3-5 m., o árbol hasta de 10 m. de alto, muy ramificado casi desde la base, espinas fuertes, agudas, rojizas de 4 mm. de largo hojas 8-pinnadas, 9-13 cm. de largo, sésiles, raquis leñoso puberulento, rojizo, con espinas a cada lado de la inserción de las pinnas, 2mm. de largo; pinnas oblongo- elípticas, glabras, brillantes con el nervio medio muy pronunciado, ápice redondeado, marginado, base decidua 2.5-3.6 mm. de largo, 1-1.5 cm. de ancho; inflorescencia racimosa, 16 cm. de largo, con muchas flores vistosas, primeramente amarillas luego toman un color rojizo; cáliz tubular pubérulo con los segmentos obtusos cortamente aserrados, 3 mm. de largo; pedicelos puberulentos

22

5 mm. de largo, articulados; pétalos con filamento pubescente, pistilo más largo que los estambres; fruto oblongo ligeramente falciforme, indehiscente, membranoso con exocarpo amarillo rojizo, liso, mesocarpo esponjoso arenoso (muy rico en proteínas) 4-6 semillas, aovadas, con el funículo hendido, linear, testa dura de cloro marrón, 13 mm. de largo, 8 mm. de ancho con el arilo dulce (García Barriga, H. 1975). Figura 5 Planta de Dividivi . Fuente: www.backyardnature.net

Tal como se puede observar en la figura anterior la planta presenta la siguiente conformación fisiológica:

Oblonga: órganos (hojas, frutos, etc.) de forma alargada, la base más ancha que el ápice, generalmente agudo.

Falciforme: en forma de media luna.

Indehiscente: no abre (para expulsar o dejar expuestas las semillas) en la madurez.

Exocarpo: tejido o capa externa del fruto.

Mesocarpo: tejido interno medio correspondiente a la pulpa de los frutos carnosos.

Aovadas: en forma de huevo, ovoide.

Funículo: filamento que une la placenta del fruto a las semillas

Arilo: excrescencia o tejido jugoso que se adhiere a las semillas como p. e. en el fruto de la curaba.

2.7.3. Composición química. La mayoría de los autores reportan la presencia de taninos en los frutos de Caesalpinia spinosa (García Barriga, Glasby). Galvez y col

23

en 1997 encontraron por el método de Hide-powder (método basado en la afinidad que tienen los taninos por las proteínas) que los frutos de ésta especie contienen un 59.7% de taninos. Por otra parte, por el método de Stiasny (método que se basa en la capacidad que tienen los compuestos con estructuras tipo flavonoides de reaccionar con el formaldehído) encontraron un contenido de taninos igual a 25.5%. Adicionalmente, por métodos espectrofotométricos, hallaron el contenido de galotaninos y elagitaninos. El resumen de estos resultados se muestra en la tabla 1. Tabla 1 Composición de Taninos presentes en Caesalpinia

Fuente Analytical Studies on Tara Tannins, Galvez et al (1997) En siguiente tabla figura se enumeran los compuestos químicos, especificando los radicales que conforman su estructura (Rn) y la masa molecular (M), reportada por Clifford y Col en el 2007.

24

Tabla 2 Compuestos químicos presentes en Caesalpinia Spinosa

Figura 6 Radicales que conforman las estructuras presentes en C.spinosa

Por otra parte, es importante destacar que Parr y Col reportaron la presencia de un ácido pentagaloil quinico y propusieron la siguiente estructura química con una figura:

25

Figura 7 Estructura propuesta para el ácido pentagaloil quinico para C. spinosa

2.7.4 Actividades reportadas. Se ha reportado que el extracto etanólico de los frutos de C. spinosa presenta actividad antimicrobiana tanto en bacterias gram positivas como gram negativas. Entre las bacterias gram positivas se encuentran Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Enterococcus faecalis y Staphylococcus epidermidis y frente a las gram negativas Bacteroides fragilis. (Kloucek, 2005). De igual forma, en la especie Caesalpinia mimosoides se han obtenido algunas fracciones con actividad antimicrobiana. (Chanwitheesuk, 2007). Adicionalmente, está misma actividad también ha sido demostrada para cuatro galatos del ácido quínico aislados del dividivi, y se demostró que estos compuestos intensificaron la susceptibilidad del Staphylococcus aureus a la oxacilina. (Kondo, 2006). De acuerdo con Gali-Muhtasib y col (2000), taninos hidrolizables extraídos de los frutos de C. spinosa disminuyeron significativamente los marcadores bioquímicos asociados a cáncer de piel inducido por radiación UV-B. También se ha reportado actividad antitumoral del ácido gálico y del metil- galato aislados de Caesalpinia ferrea (Nakamura, 2002).

26

Un gran número de propiedades han sido descritas para el ácido gálico: antioxidante, antialérgico, antimutagénico, anticarcinogénico y antiinflamatorio. (Gandhi, 2005) Serrano y col en 1998, encontraron que el ácido gálico y sus derivados (metil, propil, octil y lauril esteres) inducen apoptosis en diversas líneas celulares tumorales dentro de las cuales se mencionan diferentes tipos de leucemias, linfomas y mielomas. Adicionalmente, se ha reportado actividad importante para los metil, propil y octil esteres del ácido gálico, sobre la línea celular tumoral HeLa (Adenocarcinoma de cérvix humano) y su relación estructura-actividad (Fiuza, 2004). 17 Estudios encaminados a determinar la actividad antitumoral del ácido gálico y sus derivados (esteres) han demostrado su efecto citotóxico sobre la línea celular tumoral L1210 (Leucemia) según ensayos de MTT e inducción de apoptosis según ensayos de fragmentación del DNA en geles de agarosa. (Locatelli, 2008). Los cuales se enuncian a continuación:

BRUNETON, J. 1991. Elementos de fitoquímica y farmacognosia. Editorial Acribia, S.A. Zaragoza, España. p.p. 177-184.

CASCALES, M. 2003. Bases moleculares de la apoptosis. Real Acad Nal Farm. 69:36-59.

CASTAÑEDA, D.M. 2006. Evaluación de la actividad inductora de apoptosis de los extractos obtenidos a partir de Petiveria alliacea sobre líneas de células tumorales. Tesis de pregrado. Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de Ciencias. Bogotá, Colombia. 83p.

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CHANWITHEESUK, A., Teerawutgulrag, A., Kilburn, J.D., Rakariyatham, N. 2007. Antimicrobial gallic acid from Caesalpinia mimosoides Lamk., Food Chemistry. 100: 1044-1048.

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CRONQUIST, Arthur. 1981. An integrated system of classification of flowering plants. The New York Botanical Garden, Columbia University Press. N. Y, USA.

MOLINA Kuntze. VALORACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTITUMORAL DE EXTRACTOS Y FRACCIONES OBTENIDAS DE Caesalpinia spinosa SOBRE DIFERENTES LÍNEAS CELULARES TUMORALES

POMBO Ospina Luis Miguel,trabajo de grado presentado como requisito para obtener el título de MAGISTER EN CIENCIAS BIOLÓGICAS

27

Pontificia Universidad Javeriana Facultad de Ciencias Básicas Programa de Postgrado Bogota D.C Junio De 2008

2.8. TANINOS VS. CÁNCER Según (Harborne, 1995) los taninos son compuestos fenólicos ampliamente distribuidos en plantas vasculares, su presencia en angiospermas esta asociada con materiales leñosos23. Por definición, estos compuestos tienen la capacidad de reaccionar con proteínas, formando copolímeros insolubles en agua. Debido a esa propiedad, se utiliza en los procesos de curtiembre para obtener cueros a partir de pieles frescas. Por otra parte, según (Bruneton, 1991), la combinación entre los taninos y las macromoléculas se establece, probablemente, por intermedio de enlaces por puente de hidrógeno entre los grupos fenólicos de los taninos y determinados lugares de las proteínas y otros polímeros24. Químicamente, existen dos tipos principales de taninos: taninos condensados y taninos hidrolizables. Ambos tipos de taninos son distribuidos desigualmente en el reino vegetal. Los taninos condensados están presentes universalmente en helechos y gimnospermas y distribuidos entre las angiospermas, especialmente en árboles y arbustos. En contraste, la presencia de los taninos hidrolizables se limita a las plantas dicotiledóneas (Harborne, 1995). Este tipo de taninos están determinados de acuerdo con las siguientes características: diversidad estructural, los taninos hidrolizables se basan en la unidad estructural fundamental del ácido gálico y se encuentran en forma de esteres con la D-glucosa (galotaninos). Derivados del ácido hidroxidifénico se conocen como elagitaninos; distribución taxonómica, restringida a plantas leñosas y herbáceas dicotiledóneas; acumulación y almacenamiento, su presencia es caracterizada regularmente por acumulaciones substanciales de metabólicos particulares en ciertos tejidos: por ejemplo se concentran en las hojas frescas de Rhus typhina y en las hojas jóvenes de Camellia sinensis. Por otra parte, la estructura de los taninos condensados se basa en la unidad fundamental del flavan-3-ol (catequina) y existen como oligomeros (solubles en agua), conteniendo de dos a diez unidades de catequinas o como polímeros insolubles en agua (Haslam, 2007). En una revisión realizada por Chung y col en 1998, sobre taninos con actividad antitumoral, se encontró que los individuos japoneses que consumen té verde con alguna frecuencia, tienden a tener menor riesgo de sufrir cáncer gástrico. El efecto inhibidor del té verde, rico en compuestos polifenólicos, ha sido bien estudiado. Se

23

HARBORNE, J.B. 1995. An overview of antinutritional factors in higher plants. Edited by J.C. Caygill and

I. Mueller-Harvey. Nottingham University Press, U.K. pp. 7-16. 24

BRUNETON, J. 1991. Elementos de Fitoquímica y de Farmacognosia. Acribia. Zaragoza, España. 594 p.

28

ha encontrado, in vivo, que extractos ricos en esos compuestos presentan actividad frente a diferentes tipos de tumores como esofágico, de colón, de páncreas, de hígado y duodenal, entre otros. Así mismo, se ha demostrado que el ácido tánico (galotanino), es inhibidor de la formación de tumores, ya que disminuyó el número de tumores por ratón y el porcentaje de ratones con tumores, empleando un modelo con DMBA (dimetilbenzantraceno) como promotor tumoral. Además, ha reportado que la aplicación tópica de ácido tánico inhibió de manera dosis dependiente, la actividad ornitina descarboxilasa, actividad relacionada con la formación de tumores en la epidermis de ratones donde los tumores fueron inducidos por TPA (12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato). De igual forma, se demostró que la aplicación tópica del ácido tánico inhibió la carcinogénesis inducida por luz ultravioleta, en ratones BALB/cAnNTacfBR. En la tabla 3 se resume la actividad anticarcinogénica de algunos taninos y fuentes de taninos. Tabla 3. Actividad anticarcinogénica de algunos taninos

Figura 8 Estructuras típicas de taninos hidrolizables y condensados

Fuente: Chung et. al. (1998)

29

Yang y col en el 2000, encontraron que dos taninos hidrolizables (1-O-galoil castalagina y casuarinina) aislados del extracto de acetona al 70% de la planta Eugenia jambos, presentaron citotoxicidad frente a las líneas celulares tumorales HL-60 (leucemia humana) y SK-HEP-1 (adenocarcinoma humano). Mediante citometría de flujo demostraron la presencia de células apoptóticas y una disminución de la población celular en la fase G2/M, principalmente en la línea HL-60. En el 2005, Pellegrina y col reportaron que una fracción fenólica obtenida de semillas de Oenothera biennis compuesta en un 55% de ácido gálico, presentaba actividad antitumoral en diferentes líneas celulares tumorales como las K562 (eritroleucemia humana) y Molt3 (leucemia de células T). En estas células la fracción inducía apoptosis activando principalmente las caspasas 1 y 8 (Pellegrina et al, 2005), tal como se ha sido reportado previamente por otros autores. Adicionalmente, se ha demostrado que el ácido gálico induce muerte celular o detención del ciclo celular en una amplia variedad de células tumorales por diferentes mecanismos dependiendo del tipo celular (Serrano et al, 1998). Trabajos recientes desarrollados por Larrosa y col en el 2006, donde compararon la actividad de 2 compuestos, un elagitanino llamado PUNI (promegranato punicalagino) y el ácido elágico libre (AE), demostraron que el PUNI puede ser considerado un precursor apoptótico tras la liberación del AE, producto de la hidrólisis de este. El AE entra a las células y es metabolizado para producir diferentes derivados dimetil-ácido elágico. El ácido elágico provoca diferentes efectos sobre células Caco2 (cáncer de colon humano), entre las que se incluyen una disminución en la expresión de la ciclina A y B1 y una sobre-expresión de ciclina E con detención del ciclo celular en la fase S e inducción de apoptosis vía intrínseca a través de la disminución de Bcl-xL con liberación de citocromo c al citosol y activación de caspasa 9 y 3. Adicionalmente no se evidenció alteración alguna en células de colon normal CCD-112CoN. (Larrosa et al, 2006). Como se mencionó anteriormente, la metástasis es una de las principales características del cáncer y es un proceso de múltiples pasos. Moléculas claves en la regulación e invasión de la metástasis son las metaloproteínasas (MMP). En los últimos años las MMPs han sido de gran interés para los investigadores debido a su función en el desarrollo, reproducción e inflamación de varias enfermedades. Es por esto que el grupo de Ho L y col, se ha interesado en estudiar el efecto de un polifenol llamado penta-O- galloyl-h-D-glucose (5GG). Este 5GG inhibió la invasión de células de melanoma in vitro, suprimiendo la activación de factores de transcripción como el AP-1 en el núcleo lo que conduce a una disminución en la transcripción de MMP-9 y en la traducción de la misma. De igual forma el 5GG disminuye la adhesión de la fibronectina y laminina, colagenasa tipo IV y vitronectina. Estos resultados sugieren que el 5GG puede tener un importante papel en el tratamiento de la metástasis del cáncer (Li-Lun Ho et al, 2002).

30

2.8.1 Capacidad protectora de cybopogon citratus (dc) stapf ante el daño genético inducido por estrés oxidativo. Se estudió el efecto protector de una decocción de las hojas de la planta Cymbopogon citratus (DC.) Stapf. (caña santa o caña de limón) frente al daño genético inducido por los agentes oxidantes H2O2 y etilnitrosourea (ENU). Se utilizó para ello un modelo experimental in vitro y otro in vivo: cultivo de células de ovario de Hamster chino (CHO) y el insecto Drosophila melanogaster, respectivamente. La capacidad de formar colonias de la línea celular CHO, fue el indicador de toxicidad utilizado para evaluar 5 concentraciones (0,1; 1; 5; 10; 15 %) de la decocción de caña santa, en tanto que el porcentaje de sobrevivencia de adultos se usó para evaluar el efecto tóxico de 4 concentraciones de esta (5; 25; 50; 100 %) sobre las larvas mwh + / + flr3 de Drosophila melanogaster; en ambos casos los resulta- dos evidenciaron efectos tóxicos dependientes de las concentraciones utilizadas. Los estu- dios citofluorimétricos con diclorofluoresceína-diacetato en células CHO permitieron demostrar la capacidad antioxidante de la decocción de caña santa. Dosis no tóxicas de 0,1; 1 y 5 % produjeron reducciones significativas del estrés oxidativo causado por el H2O2. La genotoxicidad y antigenotoxicidad de diferentes concentraciones de la decocción fueron evaluadas mediante los ensayos de aberraciones cromosómicas en células CHO y el SMART de alas de Drosophila melanogaster. Los resultados de actividad mutagénica obtenidos fueron negativos, en tanto que los correspondientes a la acción protectora de las concentra- ciones probadas reafirmaron la capacidad antioxidante mostrada por el extracto vegetal25. Descriptores DeCS: ESTRÉS OXIDATIVO; DAÑO DEL ADN; ANTIOXIDANTES/ uso terapéutico; PLANTAS MEDICINALES/uso terapéutico; MEDICINA HERBARIA; CRICETULUS/genética; DROSOPHILA MELANOGASTER/genética; MODELOS BIO- LÓGICOS26. Paralelo a la evaluación del riesgo genético al que el hombre está expuesto, las investigaciones actuales están dirigidas a la búsqueda de agentes quimiopreventivos naturales,1 inocuos, baratos, y de preferencia, que provengan de fuentes dietéticas accesibles al hombre. Muchos mutágenos y carcinógenos conocidos actúan a través de mecanismos oxidativos que dañan al ADN; consecuentemente, existen reportes de antioxidantes naturales capaces de minimizar los efectos de los compuestos genotóxicos: vitaminas, minerales, fenoles y aceites esenciales, han demostrado efectos inhibitorios sobre la genotoxicidad, tanto en ensayos in vivo como in vitro27.

25

SÁNCHEZ-LAMAR Ángel, FONSECA Gladys, BALUJA Ligia y BORGES Ernesto. Capacidad protectora

de Cymbopogon citratus (DC.) Stapf. ante el daño genético inducido por estrés oxidativo. 2001 - 11 p. 26

GREENBERG ER. A clinical trial of Beta carotene to prevent basal-cell and squamous-cell cancers of the

skin. N Engl J Med 1990;323:789-95. 27

HARTMAN PE, Shankel DM. Antimutagens and anticarcinogens. Environ Mol Mutagen 1990;15:145-82.

31

Una de las plantas medicinales más utilizadas en Cuba, por sus múltiples usos terapéuticos y por su sabor agradable como bebida, es la caña santa o caña de limón (Cymbopogon citratus [DC.] Stapf.)28. La decocción de sus hojas no ha mostrado efectos tóxicos, genotóxicos ni teratogénicos en diferentes modelos biológicos, en tanto que sí ha evidenciado efecto protector frente al agente alquilante de nitrógenos metilmetanosulfonato (MMS)29. Por lo tanto, el presente trabajo tuvo como objetivo evaluar la capacidad antioxidante de la decocción de caña santa y su efecto protector del ADN frente al daño inducido por el agente oxidante H2O2 y el agente alquilante de oxígenos, etilnitrosourea (ENU). La capacidad inhibitoria de la caña santa sobre la inducción de los eventos genéticos medidos por el ensayo mosaico del ala de Drosophila melanogaster, específicamente de los eventos mutacionales, quedó demostrada con la reducción de los porcentajes de las frecuencias de manchas totales en los cotratamientos aplicados respecto al control positivo utilizado. ENU es un potente alquilante de átomos de oxígeno causante de lesiones mutagénicas, lo que concuerda en este experimento con frecuencias incrementadas de manchas simples en relación con los controles negativos; por lo tanto, los porcentajes de reducción de manchas simples y totales, obtenidos con los tratamientos respecto a ENU a las 2 concentraciones probadas, sugieren que la protección de la caña santa al ADN podría realizarse haciendo que las posiciones de oxígenos sean menos accesibles a la alquilación por ENU, reacción que por demás, debe involucrar una oxidación- reducción para la formación de los aductos causantes de los eventos mutacionales30. Estos resultados ratifican y amplían las propiedades antigenotóxicas de esta especie vegetal, que han sido reportadas por otros autores y permiten inferir que uno de los posibles mecanismos antigenotóxicos de la caña santa esté en relación con su acción antioxidante

2.9. ACTIVIDAD CAPTADORA DE RADICALES LIBRES Y CITOTOXICIDAD DE PLANTAS COLOMBIANAS DE LA FAMILIA ANNONACEAE La actividad captadora de radicales libres de 53 extractos de diferente polaridad pertenecientes a especies de la familia Annonaceae fue evaluada por el método del DPPH (2,2-difenil-1-picryl hidra- zil). Se calculó el porcentaje de decoloración del radical DPPH midiendo el cambio en la absorbancia a 517 nm; determinándose para cada extracto la EC50 (concentración de extracto necesaria

28

MIRANDA M. Programa nacional de plantas medicinales. Rev Cubana Farm 1995;30:95. 29

TJIO JH, PUCK T. genética de mamíferos II células. Constitución cromosómica de las células en cultivo de

tejidos. J Exp Med 1958; 108:259-68. 30

SÁNCHEZ-LAMAR Ángel. Op. Cit., Capacidad protectora de Cymbopogon citratus., p. 10 - 11

32

para decolorar el ra- dical DPPH en un 50%)31. En general fueron más activos los extractos metanólicos, indicando que los metabolitos con mayor actividad captadora de radicales libres presentan alta polaridad. Adicionalmente fue evaluada la citotoxicidad de los extractos sobre líneas celulares U-937 (promonocitos humanos) y se obtuvieron los respectivos valores de CL50 (Concentración Letal 50). Algunos extractos con alto poder para es- tabilizar radicales libres mostraron menos citotoxicidad que los controles utilizados, hidroxitolueno butila- do (BHT) y silimarina32. El estudio logró comprobar que en las especies analizadas de la familia Annonaceae, los metabolitos con mayor actividad captadora de radicales libres son de carácter polar y que por su parte los agentes responsables de la citotoxicidad son, generalmente, no polares33. Por lo tanto, la utilización de alguna de estas plantas para un estudio que pretenda aislar sus componentes activos con potencial actividad antioxidante, puede partir de la preparación de un extracto alcohólico de la parte aérea (tallos y hojas). De los 58 extractos evaluados 12 se consideran muy promisorios debido a su alta actividad captadora de radicales libres (EC50 menor de 50 ug/ml) comparados con los controles utilizados, de tal manera que se justifica su fraccionamiento con el fin de encontrar los metabolitos responsables del efecto o comprobar la existencia de un sinergismo entre ellos34. Los resultados obtenidos en el presente estudio hacen ver estos extractos como fuente de futuras investigaciones que amplíen la evidencia en cuanto a su actividad antioxidante y vislumbren posibles aplicaciones. Se demostró, una vez más, que la técnica del DPPH es rápida, y que puede ser utilizada para la evaluación de la actividad captadora de radicales libre en matrices complejas como los ex- tractos vegetales. La familia Anonáceae, según la literatura consultada, presenta importancia terapéutica da- da su actividad biológica relacionada principal- mente con acciones antiparasitarias y antitumorales 17-23. En el presente trabajo se evidencia adicionalmente en forma novedosa el potencial antioxidante de especies de esta familia, lo cual podría ser de gran importancia en la búsqueda de sustancias activas contra patologías causadas por radicales libres35.

31

JIMENEZ, Nora. LONDOÑO,Julián. ARANGO Gabriel J. Actividad Captadora de Radicales Libres y

Citotoxicidad de Plantas Colombianas de la Familia Annonaceae. Grupo de Investigación en Sustancias

Bioactivas, Facultad de Química Farmacéutica, Universidad de Antioquia, Medellín, Colombia. 2005. 337 p. 32

Ibid., p. 340 33

PRYOR, W.A. & B. Frei (2004) “Natural Antioxidants in Human Health and Disease”; Ed. Academic press:

Londres, págs 1-62. 34

AMES, B N., M.K. Shigenaga & T.M. Hagwn (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90: 7915-22. 35

JIMENEZ, Nora. Actividad Captadora de Radicales Libres y Citotoxicidad de Plantas Colombianas de la

Familia Annonaceae Op. Cit. P. 340.

33

3. METODOLOGÍA Desde el punto de vista metodológico a continuación se presenta el objetivo general y objetivos específicos de este estudio.

3.1 OBJETIVO GENERAL Valorar la actividad antioxidante de extractos vegetales y fracciones obtenidas de Dividivi. Caesalpinia spinosa

3.2 OBJETIVO ESPECÍFICOS Teniendo en cuenta el objetivo general a continuación se desglosan los objetivos específicos:

Analizar desde el punto de vista fitoquímico la fracción que tenga más actividad antioxidante.

Establecer mediante una revisión bibliográfica, los antecedentes relacionados con la actividad antioxidante de los polifenoles, en particular los del extracto de dividivi.

Obtener, en una segunda fase de este trabajo, de manera bio-dirigida, extractos y fracciones para valorar su actividad antioxidante.

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4. MATERIALES Y MÉTODOS

4.1 OBTENCIÓN DE LOS EXTRACTOS Y FRACCIONES Los frutos frescos de Caesalpinia spinosa serán recolectados en la población de Villa de Leyva, Boyacá, región que se encuentra a una altura aproximada de 2.143 msnm, con una temperatura promedio de 18.1 °C. El ejemplar botánico (Tallos, hojas, flores y frutos) será identificado por el Biólogo y Botánico de la Fundación Universitaria Juan N. Corpas, Antonio Mejía, y determinado en el Herbario Nacional de Colombia. Para realizar la extracción, aproximadamente 3 kilogramos de frutos frescos se someterán al proceso de secado en horno solar con convección natural a 35°C. Posteriormente, los frutos secos serán molidos en un molino de bolas obteniéndose así el material vegetal seco. Los frutos secos y molidos serán extraídos con etanol al 96 % en un percolador con recirculado (2 veces al día) durante 10 días. El extracto será llevado a sequedad en un evaporador rotatorio. El extracto seco se mezclará con silica gel con el fin de aumentar el área de contacto y facilitar la obtención de las fracciones con solventes de polaridad creciente. El exceso de humedad será retirado en horno a 25°C. Posteriormente, a la mezcla obtenida (extracto-Silica gel) se le hará un proceso de extracción sólido-líquido con solventes de polaridad creciente: petrol (éter de petróleo), cloroformo, acetato de etilo, etanol y agua, obteniéndose así las respectivas fracciones para efectuar los ensayos de actividad antioxidante y análisis fitoquímico.

Valoración de la actividad antioxidante. Una vez culminadas las fases anteriores, los extractos y fracciones obtenidos serán sometidos a evaluación de la actividad antioxidante por el método del DPPH, siguiendo el protocolo de Afef Abdelwahed et al (2007), para lo cual se utilizarán alícuotas de solución etanólica de ácido gálico y ácido ascórbico empleados como control positivo en concentraciones de 0.3 a 100 µg/mL usando un factor de dilución de 1/10 entre cada concentración36.

36

ABDELWAHED, A., Bouhlel, I., Skandrani, I., et al (2007). Study of antimutagenic and antioxidant

activities of Gallic acid and1,2,3,4,6-pentagalloylglucose from Pistacia lentiscus Confirmation by microarray

expression profiling. Chemico-Biological Interactions. Edición 165. pág. 1–13

35

Todas las reacciones se desarrollarán en microplacas de 96 pozos protegidas de la luz a temperatura ambiente manejando una relación de 1/6 de solución de DPPH en etanol a una concentración de 0.1mM y los extractos y fracciones a diferentes concentraciones hasta completar un volumen de 200 µL. Se realizarán las lecturas en un intervalo de tiempo de 0 a 30 minutos, en un espectrómetro Labsystems Multiskan MCC/340, a una longitud de onda de 492 nm. Se empleará como control negativo, etanol para asegurar que este no interacciona con el DPPH. Las lecturas se realizarán por triplicado y los resultados serán expresados en porcentaje de inhibición del DPPH, calculado por medio de la siguiente expresión:

Donde A Control es la absorbancia del DPPH, A Muestra es la absorbancia del extracto o fracción a cada concentración y tiempo. Con los datos obtenidos se calculará la concentración inhibitoria 50 (IC50), parámetro importante para clasificar la potencia antioxidante de las muestras sometidas a estudio. El análisis estadístico de los datos se hará empleando el software GraphPad Prism, con el fin de calcular el área bajo la curva, hacer una regresión lineal y aplicar la prueba de t student, y de ésta manera determinar el grado de correlación de los datos y evidenciar cuál de los extractos analizados presenta mayor actividad antioxidante.

Caracterización fitoquímica de los extractos y las fracciones Con el fin de determinar la presencia de algunos grupos importantes de metabolitos secundarios en las fracciones que presenten una mayor actividad, se desarrollará una marcha fitoquímica siguiendo las etapas descritas por Sanabria (1983)37.

Pruebas de detección Alcaloides Siguiendo los procedimientos descritos Por Sanabria, se realizarán las pruebas de precipitación de alcaloides empleando los siguientes reactivos: reactivo de Dragendorff, reactivo de Mayer, reactivo de Valser y el reactivo de Reineckato de amonio. Todas las pruebas se harán en medio ácido, y los resultados serán tabularon de acuerdo con la abundancia de los precipitados formados como (+++),

37

SANABRIA, A. 1983. Análisis fitoquímico preliminar: Metodología y su aplicación en la evaluación de 40

plantas de la familia compositae. Universidad Nacional. Bogotá, Colombia. 113 p.

36

(++), (+) o (-), teniendo en cuenta que cualquier turbidez apreciable es considerada prueba positiva. Triterpenoides A 1 Ml de los extractos y fracciones se le adicionarán algunas gotas del reactivo de Liebermann-Burchard y se evaluarán algunos cambios de coloración, inmediatamente y a 5, 15, 30 y 45 minutos. Flavonoides Prueba de Shinoda: A 1 Ml de los extractos y fracciones se adicionarán gotas de HCl concentrado y un trozo de cinta de Mg. Se evaluará la formación de coloración roja durante diez minutos. Naftoquinonas y/o Antraquinonas A 5 Ml de de los extractos y fracciones se agregarán 5 Ml de agua oxigenada de 20 volúmenes. La mezcla será calentada sobre un baño de agua hirviendo durante 15 minutos. Posteriormente, se procederá a extraer con 5 Ml de benceno en un embudo de decantación. Alrededor de 2 Ml de la capa bencénica serán agitados con 1ml de una solución de hidróxido de sodio al 5% que contiene 2% de hidróxido de amonio. Cuando las naftoquinonas y/o antraquinonas están presentes, la capa alcalina toma una coloración que va del rosado al rojo intenso. Taninos y saponinas Para evaluar la presencia de este tipo de compuestos se harán pruebas de precipitación con FeCl3, acetato de plomo y el reactivo de gelatina-sal. Para las saponinas se efectuarán las pruebas de hemólisis y de producción de espuma.

37

CONCLUSIONES PRELIMINARES

En esta investigación se ha llevado a cabo la primera fase del estudio propuesto, la cual sirve de fundamento para la segunda fase y el desarrollo de las dos fases, están encaminadas al análisis de la actividad antioxidante de extractos vegetales y fracciones obtenidas de Dividivi. Caesalpinia spinosa desde el punto de vista fitoquímico, con base en una revisión bibliográfica de los antecedentes relacionados con la actividad antioxidante de los polifenoles, en particular los del extracto de dividivi. Además, en la segunda fase del trabajo propuesto, se obtendrá de manera bio-dirigida, extractos y fracciones para valorar su actividad antioxidante.

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BIBLIOGRAFÍA ABDELWAHED, A., Bouhlel, I., Skandrani, I., et al (2007). Study of antimutagenic and antioxidant activities of Gallic acid and1,2,3,4,6-pentagalloylglucose from Pistacia lentiscus Confirmation by microarray expression profiling. Chemico-Biological Interactions. Edición 165. pág. 1–13 AGUDO Cabrera, L. Amiano, P. ARDANAZ, E. BARRICARTE, A. BERENGUER, T. CHIRLAQUE, M.D. DO RRONSORO, M. LARRAÑAGA, N. MARTÍNEZ, C. NAVARRO, C. QUIRÓS, J.R. SÁNCHEZ, M.J. TORMO, M.J. GONZÁLEZ, C.pean Prospective Investigation into Cancer and American Journal Clinical Nutrition. 2007 85 -6 ALDERSHVILE J, Ambrosio G, Bayés de Luna A, Badimon L, Bertrand ME, Cleand J, et al (1998) Estrés oxidativo (especies de oxígeno reactivo), patología cardiovascular (Parte I) Eur Cardiol J 1998;3(72): AMERICAN DIETETIC ASSOCIATION. Position of the American Dietetic Association: Functional Foods. J. Am. Diet. Assoc.1999: 1278-1285. AMES, B N., M.K. Shigenaga & T.M. Hagwn (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90: 7915-22. BORS W, Heller W, Christa M y cols. Flavonoids as antioxidants: determination of radical-scavenging efficiencies. Methods Enzymol, 1990, 186:343-355. BRUNETON, J. 1991. Elementos de Fitoquímica y de Farmacognosia. Acribia. Zaragoza, España. 594 p. CASTAÑEDA, Benjamín, IBÁÑEZ Vásquez, Lucy A. Evaluación de la capacidad antioxidante de plantas medicinales peruanas nativas e introducidas. Rev Acad Peru, Salud. 15(1), 2008 CÉSPEDES Cabrera Teresita, SÁNCHEZ Serrano Daniel. Algunos aspectos sobre el estrés oxidativo, el estado antioxidante y la terapia de suplementación. Rev Cubana Cardiol 2000;14(1):55-60 GREENBERG ER. A clinical trial of Beta carotene to prevent basal-cell and squamous-cell cancers of the skin. N Engl J Med 1990;323:789-95. HARBORNE, J.B. 1995. An overview of antinutritional factors in higher plants. Edited by J.C. Caygill and I. Mueller-Harvey. Nottingham University Press, U.K. pp. 7-16. HARMAN Denham, MD, Ph.D.: la investigación pionera de envejecimiento de cinco décadas‖. Salud. Universidad de Nebraska en Omaha. 2003., p. 23 HARTMAN PE, Shankel DM. Antimutagens and anticarcinogens. Environ Mol Mutagen 1990;15:145-82. JIMENEZ, Nora. LONDOÑO,Julián. ARANGO Gabriel J. Actividad Captadora de Radicales Libres y Citotoxicidad de Plantas Colombianas de la Familia Annonaceae. Grupo de Investigación en Sustancias Bioactivas, Facultad de

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