6 LAGARTOS

3 LAGARTOS

1 LAGARTO

CRISTALES DE PROTEÍNA

Tamaño. Forma

Frágiles. Sensibles

- Interacciones débiles- Alto contenido de solvente (20-80%)

* Difusión Derivados complejos* Estructura Nativa

No-centrosimétricos

- Sólo 65 G. Espaciales

Alto volumen celdilla elemental

- Gran número de reflexiones- Baja intensidad del espectro- Intensidad decrece drásticamente en el tiempo

CRISTALIZACIÓN

Principio:- Mínimo de solubilidad- Población única

* Difusión Derivados complejos* Estructura Nativa

Factores:

- {Proteína}: 5-30 mg/ml- {Precipitante}: sales, disolventes, PEG- pH: buffer- T: 4,20º- Aditivos:

- Iones M- Inhibidores- agentes reductores

DIFUSIÓN DE VAPOR

Precipitante

Proteína + Precipitante

1mm

N2

X-Ray

Detector

La debe ser proporcional al tamaño del objeto.

La distancia entre puntos es inversamenteproporcional a la distancia entre nudos de la red.

A medida que nos alejamos del centro ladifracción es más débil.

La geometría de los puntos de difracción estárelacionada con la geometría de la red.

PROBLEMA DE LA FASE

EspacioReal

EspacioRecíproco

Densidadelectrónica (x y z)

Factor deestructura

|F(h k l)| + (h k l)

TF

siempre

???

(x y z) = 1/V |F(h k l)| exp {-2i (hx+ky+lz)+ i (h k l)}

I(h k l) |F(h k l)|2

??

SOLUCIÓNRemplazamiento MolecularRemplazamiento IsomorfoMAD

FAMILIA ESTRUCTURAL GLOBINAS

Hemoglobin (ascaris suum) Hemoglobin (lucina pectinata) Hemoglobin (urechis caupo)

Myoglobin (sperm whale) Leghemoglobin (lupinus luteus) Hemoglobin (glycera dibranchiata)

1mbc 2gdm 2hgb

1flp 1ithb1ash

Percentage identity matrix

1flp 1001ithb 22.8 1002gdm 21.2 18.0 1001mbc 18.5 15.1 17.0 1002hbg 24.4 23.1 19.9 22.1 1001ash 13.3 10.1 15.8 15.9 14.6

REMPLAZAMIENTO MOLECULAR

Determinar las posiciones de las moléculas dentro de la celdilla cristalina.

Modelo Cuerpo Rígido Función de Rotación

Función de Translación

Parámetros:- Completitud y calidad de los datos.

- Homología entre el modelo molecular y las moléculas reales que constituyen el cristal ( > 30%).

- Tamaño del modelo molecular respecto al contenido de la celdilla.

REMPLAZAMIENTO ISOMORFO MULTIPLE - MIR

Incluir átomos pesados en el cristal nativo que queden en posiciones fijas de la molécula sin deformar ni la celdilla ni la conformación de la proteína.

LAS DIFERENCIAS EN INTENSIDADES DEBEN SEREXCLUSIVAMENTE DEBIDAS A LOS ATOMOS PESADOS

MÉTODO:

1. Preparación de, al menos, un derivado (Hg, Au, Pt, U, Sm...Xe,Kr).

2. Toma de datos de difracción para nativa y derivados.

3. Aplicación de función de Patterson y obtención coordenadas del metal.

4. Refinamiento parámetros átomo pesado y cálculo ángulos de fase.

5. Cálculo de mapas de densidad electrónica de la proteína.

MIR

Derivado de Sm de Hal2

INCONVENIENTES:

1. Errores en |FPH| y |FP|.

2. No isomorfismo (4% < dmin).

3. Desorden en sitios minoritarios.

4. Escalado.

MAD

VENTAJAS:

1. No hay problemas de isomorfismo.

2. Da mejores resultados a alta resolución.

DISPERSIÓN ANÓMALA:

Espectro de fluorescencia de un cristal de proteína con Se-Met.

Para determinadas E del haz de Rayos X se produce un fenómeno de absorción y resonancia de electrones

de capas internas.

Modificación de la contribución del átomo pesado a cada spot de difracción (efecto anómalo).

F(h k l) F (-h, -k, -l)

( |F|anom)2 (x, y , z) anom

MÉTODO:

1. Inclusión de dispersores anómalos en la estructura.

Categoría Dispersor Anómalo

Metaloproteínasmetales de transición Fe, Cu, Zn, Mnotros metales Ca, Mo

Remplazamiento de metalesCa2+, Mg2+ por Lantánidos Tb,Ho,YbZn por Mercurio Hg

Complejos con átomos pesadosderivados comunes Pt,Au,Hg,Pb,W,UCompuestos con “cluster” Ta,W

Proteínas modificadasSelenometionina o selenocisteína SeTelurometionina Tenucleótidos Bromados o Iodados Br, I

2. Medida del espectro de absorción.

3.Toma de datos de difracción de rayos X a diferentes longitudes de onda.

4. Medida de los pares de Friedel { (h k l ), (-h, -k -l)}

INCONVENIENTES:-Medidas cuidadosas.

-Uso de diferentes Radiación sincrotrón.

MAD

|FCAL| + CAL

SÍNTESIS DE FOURIER

{(x y z)}

(x y z) = 1/V |FOBS| exp {-2i (hx+ky+lz)+ iCAL}

F= fj exp{2i(hx+ ky+ lz)}

|FOBS| DATOS EXPERIMENTALES

Cristalógrafo

MR - MIR - MAD

MR - MIR - MAD

MODELO INICIAL ERRORES GRAVES

MEJORA DE LAS FASES

REFINAMIENTOMODELADO

MODELO FINAL

- Gráfico- Experiencia Cristalógrafo- Elimina errores más graves

- Analítico.-Datos estereoquímica

REFINAMIENTO

El modelo cambia para minimizar las diferencias entrelos datos experimentales y los obtenidos a partir delmodelo.

ET = Exray + Eempirical

Exray= {|FOBS | - k |FCAL|}2

Eempirical=bonds Kb(b-bo)2 + angles K(- o)2 + torsional K(1+ cos(n-))+ VDV +......

TIPOS:

- Mínimos cuadrados. - Gradiente conjugado. - Dinámica Molecular.

T

U(x)

x

CONTROL: - Estereoquímica. - Factor de desacuerdo, R.

R {|FOBS | - k |FCAL|}/ {|FOBS | }

MAPA DE DENSIDAD ·ELECTRÓNICA

El mapa de densidad electrónica depende de la resolución.

BAJA: 5Å

MEDIA: 3Å

ALTA: 1.7Å

TRAZADO DE LA CADENA POLIPEPTÍDICA

MODELO FINAL CON ESFERA DE SOLVATACIÓN

VALIDACIÓN DEL MODELO ESTRUCTURAL

Plot de Ramachandran

1. R y Rfree (R < 0.2, Rfree =R+(5-10)% )

2. Estereoquímica del modelo frente a la ideal.

3. Distribución de factores térmicos.

4. Ajuste en densidad.

VALIDACIÓN DEL MODELO ESTRUCTURAL

.......................................................................ATOM 1 CB ASP 9 -31.877 64.364 9.711 1.00 37.33 6ATOM 2 CG ASP 9 -31.408 65.701 9.162 1.00 41.83 6ATOM 3 OD1 ASP 9 -32.254 66.612 8.998 1.00 44.35 8ATOM 4 OD2 ASP 9 -30.189 65.848 8.918 1.00 43.38 8ATOM 5 C ASP 9 -32.205 62.836 7.764 1.00 28.21 6ATOM 6 O ASP 9 -31.876 63.319 6.683 1.00 30.25 8ATOM 9 N ASP 9 -33.860 62.883 9.631 1.00 33.61 7ATOM 11 CA ASP 9 -32.913 63.691 8.811 1.00 31.98 6.......................................................................

MODELO ESTRUCTURAL FINAL

FICHERO DE COORDENADAS “pdb”

Coordenadas:(x, y, z)

Factor de ocupación

Factor térmico (B)

INFORMACIÓN DEL MODELO ESTRUCTURAL

TIPOS:

- ESTÁTICA {x y z}:- Estruct. terciaria. Dominios Funcionales

- Estruct. Cuaternaria.

- DINÁMICA {B}:- Flexibilidad funcional en bucles.-Termoestabilidad.

INTERACCIONES PROTEINA-PROTEINA.

INTERACCIONES PROTEINA-LÍPIDOS.

INTERACCIONES PROTEINA-LIGANDO:

- Reconocimiento.

- Estabilización.

- Procesos Catalíticos.

SUPERFICIES MOLECULARES:

- Determinación de zonas accesibles.

- Importancia del Potencial Electrostático.

ESTRUCTURA CUATERNARIA

Concanavalina de Cannavalia Brasiliensis

La diferente agregación de los monómeros en la estructura cuaternaria provoca variaciones en su función biológica.

GCMBE

FEBS Letters 405, 114-118 (1997)

INTERACCIONES PROTEINA-PROTEINA

S-Adenosilmetionina Sintetasa

El centro activo se crea porel empaquetamiento de dos monómeros.

GCMBE (1999)

MONÓMERO

TETRÁMERO Sitio de unión a metionina

ESTRUCTURA CUATERNARIA

HAL3at

El empaquetamiento cristalino es función del estado de agregación biológico de la proteína.

GCMBE (1999)

Trímero (unidad fisiológica)

Empaquetamiento Cristalino.

FLEXIBILIDAD FUNCIONAL EN BUCLES

Lipasa Fungica Candida A

Lid

GCMBE (1999)

TERMOESTABILIDAD

GCMBE

Mutante Termoresistente TR1

B= BNAT -BMUT

Un puente salino provoca la estabilización del plegamiento.

PROTEINS 33: 567-576 (1998)

INTERACCIONES PROTEINA-LIPIDOS

GCMBE

Complejo Ternario Lipasa-Colipasa-Micela

La unión del complejoLipasa-Colipasa a una micela de sal biliar esnecesaria para su activación in vivo.

EMBO Journal Vol. 16, 18, 5531-5536 (1997)

El anclaje del complejo proteico a la micela se produce mediante residuospolares en la superficie micelar y mediante residuos hidrofóbicos y aromáticos en el interior de la micela.

INTERACCIONES PROTEINA-LIGANDO

Complejo ternario Hal2p-Metal-sustrato

Hal2p hidroliza PAP a AMP. Es imprescindible la presencia de metales divalentes.

EMBO Journal (1999). En prensaGCMBE

Hal2p es inhibida por Li y Na.CLAVE para la tolerancia salina ya que es esencial parala vida celular.

SITIO DE UNIÓN A METALES

SITIO DE UNIÓN AL SUSTRATO

SUPERFICIES MOLECULARES

Aspartato Descarboxilasa (PanD)

El centro activo es inaccesible. Se propone movimiento relativo de protómerospara permitir la entrada del sustrato.

Nature Struct. Biol. (1998).STRUCTURE (1999)

GCMBE

PanD descarboxila L-Asp para producir Ala.

La superficie molecular sugiere interacción con otros componentes celulares.

Barril beta doble

INTERACCIONES PROTEINA-LIGANDO: RECONOCIMIENTO

GCMBE

-Glucosidasa de Bacillus polymyxa

El Glu 405 puede acomodar Glucosa y Galactosaal estabilizar el OH(4) ecuatorial o axial.

J. MOL. BIOL. 275, 491-502 (1998)

Glu405

INTERACCIONES PROTEINA-LIGANDO: PROCESOS CATALÍTICOS

Lipasa pancreática

La apertura del flap en el dominio catalítico permite la entrada del sustrato.

J. BIOL. CHEM. Vol.271, 18007-18016 (1996)

La estabilización del sustrato se realiza mediante residuos hidrofóbicosy la hidrólisis mediante la tríada catalítica (Ser, His, Asp).

SUPERFICIES MOLECULARESZONAS ACCESIBLES

Mutante FNR-E301A

PROTEINS. (1999).GCMBE

La mutación provoca la creación de una cavidad que modifica el procesode reoxidación de la enzima.

Od

La nueva cavidad permite el acceso del O molecular y la formación intermedio de la reacción flavin-hidroperóxido.

SUPERFICIES MOLECULARESPOTENCIAL ELECTROSTÁTICO

Mutante FNR-R264E

BIOCHEMISTRY. (1998).GCMBE

El potencial electrostático creado por los residuos cargados puede determinarla interacción entre proteína-proteína o proteína-ligando.

Líneas de campo en la FNR.

Sección del potencial en la FNR.

SUPERFICIES MOLECULARESPOTENCIAL ELECTROSTÁTICO

Octámero BglA

GCMBE

El Glu306 en la superficie del octámero podría servir como “atractor” de azucares en BglA.

J. MOL. BIOL. 275, 491-502 (1998)