6. fundamentos de la microscopía confocal espectral · 1. autofluorescente 2. tinciones...

6. Fundamentos de la microscopía confocal espectral

Microscopio confocal

6. Microscopía confocal espectral


Microscopio confocal

La distinción fundamental entre la microscopía

óptica convencional y la microscopía óptica confocal

es la manera en la cual se produce la imagen.


Microscopía óptica convencional● Interacción de la radiación con la muestra en una

región extensa.

● Imágenes degradadas por toda la información óptica

que se origina en esa extensa iluminación, así como

por la información óptica contenida en planos que no

son el plano enfocado.


● Se producen punto a punto en el plano imagen a

partir de los correspondientes puntos de iluminación

del plano de la muestra.

● La fuente de iluminación puntual ilumina una región

del objeto y el detector puntual recibe la radiación de

esta área objeto. La imagen se construye por el

barrido sincronizado de la fuente y el detector.


Microscopía óptica confocal

El principio de confocalidad:


Detector

Objetivo

Divisordel haz

Luz láser Diafragma(PINHOLE)

Muestra


● La calidad de las imágenes resultantes se debe a la

omisión de toda la información óptica fuera de foco

que degrada la imagen en la microscopía

convencional.



El principio de confocalidad:

● El pinhole está conjugado con el punto focal de las

lentes por eso es un pinhole confocal.




Detector

Objetivo

Divisordel haz

Luz láser Diafragma(PINHOLE)

Muestra


● La microscopía confocal permite obtener secciones

ópticas en profundidad que generan imágenes

tridimensionales de la morfología de una muestra.


Microscopía confocal Microscopía convencional


Instrumentación

Secciones ópticas:


Objetivo

Luz láser

Muestra

● Una imagen confocal es una sección óptica de una

muestra. Tomando distintas imágenes confocales se

obtiene una imagen tridimensional en foco.

● Esta capacidad es útil para medir perfiles de

superficie y cuando se acopla con la fluorescencia

da una representación tridimensional de la

morfología interna de la muestra.




Microscopía óptica confocalCélulas

Reconstrucción


Células


Series


Drosofila


Proyección máxima


Drosofila


Reconstrucción


Drosofila


Reconstrucción


Convalaria


¿Cómo funciona un microscopio confocal?6. Microscopía confocal espectral

muestra

microscopio

espejosde barrido

espejodicroico

pinhole detector

láser

¿Cómo funciona un microscopio confocal?

La imagen se forma punto a punto

y sección a sección.



Filtro de excitación

Filtro barrera

Espejo dicroico

Muestra

Microscopio confocal ESPECTRAL



Fluoresceína



Fluoresceína Rodamina



Fluoresceína Rodamina

498

537

552

665

La luz emitida por la muestra se separa en bandas

espectrales de modo que se pueda recoger el rango o

rangos de longitud de onda que interese.





Detectores

Rendijas



Prisma

Rendija

Detector

6. Microscopía confocal espectralMicroscopio confocal ESPECTRAL

● El sistema de detección espectral ofrece la posibilidad de seleccionar libremente las bandas de detección y aumenta la captación de luz en un 20 – 40 % frente a sistemas de detección basados en filtros ópticos.

● Esto supone una mayor relación señal/ruido, una mejor calidad de imagen, menor blanqueado y mayor viabilidad de muestras vivas ya que se requiere menor potencia de láser, y mayor poder de penetración en muestras con mucha dispersión de luz.

6. Microscopía confocal espectralMicroscopio confocal ESPECTRAL

● El resultado es un sistema de detección multibanda que permite ajustar individualmente las bandas de emisión aumentando la calidad y reduciendo el cruzamiento.

● Es un espectrómetro que permite hacer barridos a diferentes longitudes de onda.

● La longitud de onda puede ser adaptada a las características reales de emisión de la muestra.

● Fácilmente adaptable a nuevos fluorocromos.

Preparación de la muestra● La mayoría de los protocolos de microscopía

confocal se basan en los desarrollados para la

preparación de muestras en microscopía óptica

convencional.

● Un buen punto de comienzo para el desarrollo de un

nuevo protocolo es preparar la muestra para la

microscopía óptica convencional e ir modificándolo

para el confocal según sea necesario.


Preparación de la muestra● El sistema confocal recoge menos fluorescencia de

una muestra gruesa comparado con el microscopio

convencional por lo que las muestras requerirán

tiempos de tinción mayores o bien mayores

concentraciones, y en el microscopio convencional

pueden aparecer sobreteñidas.


Preparación de la muestra● Muchos protocolos incluyen un antiblanqueante que

protege el fluoroforo de los efectos de blanqueo del

láser.

● Es aconsejable utilizar la menor potencia de láser

que sea práctica y así se protege el fluorocromo.


Preparación de la muestra● Se deben tomar medidas para preservar la

estructura tridimensional de las muestras utilizando

algún tipo de espaciador entre el porta y el cubre.

● Cuando las muestras vivas están sujetas a estudio,

generalmente es necesario montarlas en una

cámara que provea todo lo necesario para la vida.


Preparación de la muestra● Las propiedades de la muestra tales como opacidad

o turbidez pueden influir en la profundidad que es

capaz de alcanzar el láser dentro de la muestra.

Muchos protocolos incorporan algún agente

aclarante que aumenta la transparencia de la

muestra.


Preparación de la muestraFijación:● Buena preservación de la muestra y del anfígeno● Sin añadir fluorescencia

Fijadores:● Metanol● Aldehídos: Paraformaldehído 4%

Formaldehído 3,9% = Formalina 10% Glutaraldehído

● Especiales: PLP(paraformaldehído, lisina, periodato)


Preparación de la muestraMarcaje:● Específico e intenso● Sin cruzamiento● Mínimo photobleaching


Preparación de la muestraMarcaje:1. Autofluorescente2. Tinciones fluorescentes● Tinciones generales: naranja de acridina, eosina● Tinciones específicas: (Molecular Probes)

● nucleo: DAPI, Hoechst, Ioduro propidio, Sytox● mitocondrias: mitotracker● lípidos: nile red● filamentos de actina: faloidina


Preparación de la muestraMontaje:● Medio:

● Índice de refracción: glicerol● Antifading● Inhibidor de la contaminación: Azida sódica

● Cubreobjetos:● 0,17 mm● plano, regular

● Montaje sin apretar pero sin espacio entre muestra y cubre.


6. fundamentos de la microscopía confocal espectral · 1. autofluorescente 2. tinciones...

Documents