59830701 analisis quimica de los alimentos

UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN ANTONIO ABAD DEL CUSCOFACULTAD DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL CURSO: ANALISIS DE LOS ALIMENTOS

ANALISIS DE HUMEDADTodos los alimentos, cualquiera que sea el método de industrialización o que hayan sido sometidos, contienen agua en mayor o menor proporción. En los tejidos animales o vegetales, puede decirse que existen en dos formas generales: agua libre y agua ligada. El agua libre o absorbida, que es la forma predominante, se libera con gran facilidad y es estimada en la mayor parte de los métodos usados para el cálculo del contenido de agua. El agua ligada se halla combinada o absorbida. Se encuentra en los alimentos como agua de cristalización (en los hidratos) o ligada a las proteínas o a las moléculas de sacáridos y absorbida sobre la superficie de las partículas coloidales. Estas formas requieren para su eliminación en forma de vapor un calentamiento de distinta intensidad. Parte de la misma permanece ligada al alimento incluso a temperaturas que la carbonizan. Para la determinación del contenido de agua en alimento, existen algunos métodos que se nombran a continuación: 1. Método por desecación en estufa hasta peso constante: Implica la deshidratación de la muestra hasta peso constante a temperaturas y presiones adecuadas al tipo de muestra, por cuanto existen patrones en las que se fijan: tiempo, temperatura a condiciones particulares. 2. Método por desecación en estufa al vacío: en este método la determinación de humedad se vería afectada por el hecho de que el alimento, en su composición, tendría sustancias que puedan desdoblarse por efecto del calor o por productos volátiles, esto a consecuencias de las elevadas temperaturas. Por ello se utilizan presiones entre 25-100 mg Hg y temperaturas menores de 75°C, con un tiempo de secado entre 3 y 6 horas. 3. Método de destilación con solvente inmiscible: es el método de destilación más frecuentemente utilizado (método de Bidwell-Sterling), en la cual se mide el volumen de agua liberada por la muestra durante su destilación continua, junto con un solvente inmiscible (tolueno), esto proporciona directamente la cantidad de agua en la muestra. 4. Método de desecación con la balanza de humedad: basado en la determinación de porcentaje de humedad mediante el uso de una balanza que tiene acoplada una fuente de ayos infrarrojos, que proporciona el calor necesario para desecar la muestra. Requiere de la realización de curva de calibración, para cada producto en particular que permiten el análisis rápido, de ello se obtiene el tiempo y temperatura más adecuada para la muestra. Existen un gran número de procedimientos y aparatos de secado. La deshidratación puede efectuarse a presión atmosférica o bajo vacío y que la transferencia de calor se haga por convección, conducción o radiación. Los más empleados son los que utilizan aire caliente y concretamente el secado por atomización.

Otros criterios permiten diferenciar los diversos procedimientos y aparatos:1) La forma y el estado de dispersión del producto sólido, película liquida más o menos viscosa (secador o tambor), aerosol (secador o atomización); un producto finamente disperso se seca más rápido. 2) El movimiento del producto (secador rotatorio) o el de fluido caliente o ambos; este movimiento presenta un secado más rápido y más uniforme. 3) La operación discontinua o continua de secado. 4) El reciclado parcial del aire que mejora la eficacia calorífica, asegura un secado más uniforme y facilita el mantenimiento de las condiciones constantes de secado. 5) El modo de calentamiento del aire: directo; por mezcla de gases de combustión (con peligro de contaminación por combustible) o indirecto.

PRINCIPALES TIPOS DE PROCEDIMIENTOS Y APARATOS DE SECADO. I. Horno de aire caliente: un aporte rápido de aire y una agitación de la capa de producto,

aseguran un secado uniforme en los diversos niveles de espesor. II. Secadores de plato: el alimento se coloca en capa delgada sobre los platos. Se caliente por

estantes calientes o más frecuentemente por aire caliente circulando entre los platos. El aire se recicla sobre todo al final del secado. Se obtiene un secado más uniforme si se logra invertir, de vez en cuando, el sentido de circulación del aire.

III. Túneles de secado: el producto se coloca sobre platos o bandejas, estos platos están dispuestos sobre carros que recorren un túnel donde circula aire caliente. La operación de secado es continua y puede hacerse totalmente automática. Por lo general, un túnel de secado

Elaborado por: Ing. David J. Ramos Huallpartupa


comprende dos secciones; una donde circula el aire en el mismo sentido que el producto y otra segunda donde circula en contracorriente.

IV. Secador rotativo: en estos aparatos, el producto avanza mientras se esta agitando en el interior de un cilindro rotativo, ligeramente inclinado. El aporte de calor queda asegurado por una circulación de aire caliente (con velocidad baja para no arrastrar partículas de productos) o por conducción a partir de las paredes del aparato. El secado es rápido y uniforme.

V. Secador por atomización: estos aparatos están muy generalizados para la deshidratación de diversos productos líquidos: leches concentradas, huevos, extractos de levaduras, zumos de frutas, té, sangre y concentrados proteicos, etc. Para ello se atomizan (se transforma en aerosol o nieblas) una solución o una suspensión más o menos viscosas de productos, las pequeñas gotitas líquidas así formadas se arrastran y deshidratan en una corriente de aire dando un polvo seco antes de caer sobre las paredes inferiores del aparato.

VI. Secadores a tambor: se coloca una ligera capa de alimento líquido en la superficie exterior de un tambor metálico hueco, calentando el interior por vapor. El tambor gira más o menos rápido y la capa líquida se seca, después de ½ ó ¾ de rotación. La transferencia de calor se hacen por conducción a través de la superficie metálica del tambor. La operación es continua y el secado es rápido (menos de minuto y medio).

La elección de un procedimiento de secado depende de las características físicas (sólido de tamaño más o menos grande, líquido más o menos viscosos) y químicas (sensibilidad al calor o a la oxidación por el aire) del producto; también depende de la mejora de la calidad que puede aportar un procedimiento más costoso (tal como secado bajo vacío); así mismo hay que considerar la diversidad y cantidad de producto a secar.

METODOLOGÍA CALENTAMIENTO DIRECTO

• Se secó en estufa cápsulas vacías. • Se colocaron en desecador y se pasaron a temperatura ambiente. • Se pesó dos a tres gramos de muestra, perfectamente homogenizada. • Se colocó la muestra en horno. • Se sacaron y se colocaron en desecador hasta que alcanzaron temperaturas ambiente. • Se procedió a pesar la muestra cada 1 horas según contenido de humedad. • Se llevó a peso constante colocando nuevamente en estufa durante 1 hora. • Luego se llevo al desecador donde se dejó enfriar y se pesó. • Se repitió esta operación hasta que dos pesadas consecutivas varíen solo en la cuarta cifra

decimal. POR DESTILACIÓN CON SOLVENTES MISCIBLES

• Se lavó el refrigerante y el tubo receptor perfectamente con mezcla sulfocronica, se enjuagó muy bien con agua destilada.

• Se lavó con alcohol y se secó en la estufa para evitar que quede algún residuo de agua adherida a la superficie interna del aparato.

• Se procedió a pesar suficientemente muestra para obtener de 2-5 ml de agua. • Se colocó en el erlenmeyer. • Se cubrió con tolueno (aproximadamente 75 cc). • Se conectó el aparato. • Se llenó el tubo receptor con tolueno agregando a través del condensador. • Se destiló lentamente (aproximadamente 2 gotas/seg.), Hasta que o pase más agua. • Luego se lavó el condensador, agregándole tolueno por la parte de arriba y se continuaba la

destilación hasta asegurarse que no salga agua. • Se repitió el lavado del condensador. • Permanecieron algunas gotas de agua adheridas a una varilla de cobre, donde se lavó al

mismo tiempo el condensador con tolueno. El proceso duró aproximadamente una hora. • Tubo receptor a temperatura ambiente.



• Quedaron algunas gotas adheridas y se bajaron con tolueno. • Se procedió a leer el volumen de agua.

BibliografíaF.L. HART y H.D. FISHER, Análisis Moderno de los Alimentos. De la edición en lengua española, Editorial Acribia. Zaragoza (España). 1991. HAROLD, EGAN y Otros, Análisis Químico de Alimentos de Pearson. Primera Edición. Compañía Editorial Continental, S.A de CV. México. 1987. H.G. MULLER y GITOBIN, Nutrición y Ciencia de los Alimentos, Editorial Acribia, Zaragoza (España)

ANÁLISIS DE AGUALas condiciones hidrológicas relacionadas con la lluvia, con las corrientes de agua y con la infiltración, son factores de mucha importancia en la formación de depósitos de aguas de abastecimiento y en la purificación de estas aguas. Las variaciones de estos factores afectan no solo la cantidad de agua aprovechable, sino también su calidad. Para la comodidad, las fuentes aprovechables de agua en el ciclo hidrológico pueden clasificarse como sigue:

1. Lluvia y nieve 2. Agua de superficie 3. Corrientes de agua 4. Lagunas y lagos naturales 5. Embalses 6. Aguas subterráneas 7. Manantiales 8. Pozos poco profundos y galerías de infiltración 9. Pozos profundos

Lluvia y nieve. El vapor de agua condensado en nubes o precipitado en forma de lluvia o nieve es prácticamente puro en altitudes muy grandes. A medida que caen, la lluvia y la nieve absorben oxígeno, dioxido de carbono y otros gases del aire, así como polvo, humos y vapores. La lluvia o la nieve recogen también las bacterias y las esporas vegetales que se encuentran en el aire. En general, la cantidad de estas impurezas es pequeña; mayor al principio de la precipitación y menor al final. la lluvia y la nieve que caen en el campo son más limpias que las que caen en las ciudades; y después de una sequía o en una región árida contiene más partículas de polvo que durante la temporada de lluvias o en un lugar sujeto a muchas precipitaciones. Generalmente estas impurezas tienen poco significado sanitario. El agua de lluvia es suave, saturada de oxígeno, pero insípida y un poco corrosiva. Con excepción de muy pocos lugares, como las Bermudas, y algunas casas aisladas en otras áreas, el agua de lluvia no se emplea para el consumo doméstico. En los sitios donde se usa, su calidad esencial depende de la limpieza de la zona de recolección y de los sistemas de almacenamiento y distribución. Debido a su suavidad y corrosividad no debe entrar en Contacto con tuberías o recipientes de plomo. Agua de superficie. Cuando la lluvia cae sobre la tierra, una parte corre al océano, a las corrientes de agua, lagunas o lagos. La nieve se evapora hasta cierto punto, pero en climas templados permanece casi en su totalidad para fundirse y correr en la primavera, contribuyendo con eso a las inundaciones en esta época del año. En las regiones montañosas, la nieve, en las partes más elevadas, se funde lentamente con el tiempo caluroso y de esa manera mantiene las corrientes de agua y afecta en el verano la calidad y cantidad. La calidad del agua tomada de una fuente de superficie depende del carácter y área de la cuenca, de su geología y topografía, de la extensión y naturaleza del desarrollo realizado por el hombre, de la época del año y de las condiciones del tiempo. La calidad del agua de las corrientes es generalmente más variable y menos satisfactoria que la de las lagunas y lagos. El agua de regiones calcáreas es más dura pero menos corrosiva, que el agua de regiones graníticas. Las fuentes de superficie en zonas muy pobladas están afectadas por las aguas de alcantarilla y desperdicios industriales. Corrientes de agua. La formación de las corrientes de agua se debe a los escurrimientos producidos por precipitaciones directas, que han corrido sobre la superficie de la tierra, al rebosamiento de lagos y



pantanos y a la filtración del agua a través de la tierra de las regiones montañosas hacia los valles. La proporción del flujo de estas fuentes varía de una temporada a otra y según la geología y el desarrollo de la cuenca. Durante los periodos de grandes precipitaciones, de nieve fundida y de inundaciones, el caudal de las corrientes consta principalmente de agua de superficie. En esas temporadas el agua puede ser lodosa, relativamente suave y con un alto contenido de bacterias. Durante grandes inundaciones, la dilución puede ser tal que el agua es menos lodosa y su contenido de bacterias menor que en aguas de inundaciones de magnitud moderada. En tiempos de sequía, el agua de las corrientes contiene una proporción relativamente grande de agua de subsuelo, por lo cual es mas dura que en otras temporadas. Las corrientes sujetas a polución por el hombre o sus actividades pueden volverse sumamente defectuosas debido a la sobrecarga con materia orgánica putrescible. Finalmente, entre el caudal máximo y el mínimo puede haber importantes variaciones en calidad. La calidad y clase de los aluviones de superficie llevados en las corrientes dependen del carácter del material de la superficie, de la inclinación de los declives del valle, del área y tipo de los bosques, pantanos y de la cantidad y clase de cultivo. Los suelos arcillosos producen corrientes lodosas y las tierras pantanosas dan notable color al agua. Las pendientes con fuerte declive provocan corrientes rápidas cuyo resultado es la erosión y un cambio en la calidad del agua por el arrastre de limo. Por otra parte, los bosques retardan el escurrimiento y tienden a igualar el caudal de la corriente. Las otras condiciones siendo iguales, los escurrimientos que provienen de arcas con árboles de hojas caedizas son más subidos de color que los que provienen de áreas con árboles siempre verdes. Los escurrimientos que atraviesan tierras de cultivo llevan limo y partículas de fertilizantes, mientras que los escurrimientos de pastizales llevan estiércol y otros desechos orgánicos. En el otoño, mucha vegetación muerta es llevada por el viento o los escurrimientos en las corrientes de agua. Por lo tanto, es evidente que aun las corrientes de cuencas relativamente poco pobladas llevan considerable polución natural.Los minerales solubles de las corrientes proceden no sólo de los escurrimientos que absorben estas substancias en la superficie suelo suelo, sino también de la disolución en el agua subterránea de estos minerales durante la percolación a través de la tierra. Estos minerales solubles aumentan la alcalinidad y la dureza del agua según las proporciones relativas del agua subterránea y del agua de superficie y el carácter de la formación geológica.Desde el punto de vista sanitario, la polución por el hombre o como resultado de sus actividades es la más significativa. En regiones poco pobladas, la polución humana es relativamente indirecta, incidental o accidental. En regiones pobladas, la polución por las aguas de cloaca y los desechos industriales es directa. Esta polución puede traer gérmenes de enfermedades contenidos en las excreciones humanas o substancias tóxicas de los desechos de las fábricas. El grado de deterioro de una corriente es aproximadamente proporcional a la densidad de la población en la zona de la corriente de agua. Como resultado final, la polución “natural” y la provocada por el hombre producen el color, turbiedad, sabores y olores, dureza, bacterias y otros microorganismos en el agua. Corregir estos defectos es la función del tratamiento de agua antes de que las aguas de superficie se empleen para usos domésticos o industriales Hay causas naturales que también tienden a purificar las corrientes contaminadas. Estas causas son físicas, químicas y fisiológicas. La sedimentacion quita el limo y otras materias en suspensión; la oxi-dación modifica los componentes orgánicos; la luz del sol aclara el color y las fuerzas biológicas destruyen los organismos patógenos. El grado de autopurificación obtenida depende de numerosos factores, entre ellos el tiempo, la temperatura y el carácter de la policion y aireación. Una capa de hielo retarda esos procesos naturales, puesto que aumentan con la aireacion superficial, y está probado que los gérmenes patógenos, como los de la fiebre tifoidea, viven más tiempo en agua fría que en agua caliente. La descomposición de los depósitos de materias orgánicas en el fondo de las corrientes tiene también un efecto adverso sobre el color, el sabor y el contenido de hierro y dióxido de carbono. Las condiciones climatológicas, geográficas e hidrográficas se encuentran entre los factores que afectan los caracteres físicos, químicos y biológicos de las corrientes de agua. Las temperaturas varían según la estación del año y la situación geográfica. En las grandes corrientes, las temperaturas



fluctúan menos rápidamente que en las corrientes chicas. El agua de las corrientes en regiones calcáreas es dura; en las regiones silíceas es suave. Las diferentes partes de un país tienen corrientes de distintos caracteres principales. Las corrientes de Nueva Inglaterra, por ejemplo, son de aguas suaves claras y coloradas; las aguas del Medio Oeste Son duras, turbias y bajas de color. La flora y fauna microscópicas están fomentadas o retardadas por las variaciones de las condiciones físicas y químicas. Las inundaciones, que aumentan temporalmente la turbiedad y las materias en suspensión, lavan los depósitos del lecho de las corrientes y se llevan las materias orgánicas que, al descomponerse, alterarían la calidad del agua. Las corrientes rápidas, poco profundas, pueden pasar por la autopurificación más rápidamente que las corrientes lentas y profundas, aunque en las últimas la sedimentación puede reducir con mas efectividad las materias en suspensión y con ellas las bacterias.

Lagunas y lagos naturales. El agua que llega a las lagunas y a los lagos es la de las corrientes tributarias. En estos sitios de agua relativamente quieta, los notables cambios en la calidad se deben a las fuerzas de autopurificación. El grado y el carácter de estos cambios dependen del volumen del cuerpo de agua en relación con su área de drenaje, tiene su forma y de las corrientes de aire. Un largo almacenamiento permite la sedimentacion de las materias en suspensión, la aclaracion del color y la remoción de bacterias. Por lo tanto, las agitas almacenadas son generalmente de calidad mucho más uniforme que las aguas tomadas directamente de las corrientes.La acción de las olas produce aguas turbias en la orilla, y en algunos casos el crecimiento de organismos microscopicos puede ser considerable en estas aguas. En los Grandes Lagos, la mayor parte de la polución ocurre a lo largo de las orillas en la proximidad de los grandes centros de población. Las corrientes inducidas por los vientos, las avenidas de las corrientes tributarias y los témpanos de hielo pueden llevar la contaminación a muchas millas en estos lagos. Generalmente, en los lagos grandes, la dilucion y la autopurificación aseguran la buena calidad del agua tiene se encuentra lejos de las orillas, a menos que se produzca una contaminación localizada y pasajera debida al movimiento de los barcos.En lagos más chicos, la autopurificación es generalmente menos completa que en los grandes. Además, la acción de corto circuito, que implica un flujo continuo de agua con menos del abasto normal, es un factor mayor. En pequeñas lagunas se produce, en particular el crecimiento de algas. Y en los estados norteños, las lagunas y los pequeños lagos sufren unos “trastornos” de primavera y de otoño que revuelven temporalmente los sedimentos del fondo. Embalses. Los embalses, formados con diques a traves de los valles cortados por corrientes, están sujetos a las mismas condiciones que las lagunas y los lagos naturales. Cuando se construyeron los primeros depósitos. Se arrancaba toda la vegetación del fondo y se quitaba la capa superficial de la tierra para evitar los efectos de la descomposición de las materias orgánicas. En los métodos más re-cientes se omite la remocion de la tierra y se confía en la elección del punto de admisión y en el tratamiento para asegurar la calidad satisfactoria del agua.Normalmente, la mejor calidad de agua se encontrará a una profundidad mediana. El agua de la parte superior es propensa a desarrollar algas. El agua del fondo puede tener un alto contenido de dióxido de carbono, hierro, manganeso y. a veces. sulfuro de hidrogeno. En lagos y embalses profundos, el agua del fondo permanece fría durante todo el año porque se produce una zona permanente de relativa estancación a profundidades abajo de seis metros aproximadamente. Agua subterránea. Parte de la lluvia que cae sobre la superficie de la tierra se filtra en el suelo y se torna en agua subterranea. Durante su paso a través del suelo, el agua entra en contacto con muchas sustancias, tanto orgánicas como inorgánicas. Algunas de estas substancias son fácilmente solubles en agua. Otras, como las que causan la alcalinidad y la dureza, son solubles en agua que contiene dióxido de carbono absorbido del aire o de las materias orgánicas en descomposición de la tierra. La descomposición de materias orgánicas quita también el oxígeno disuelto del agua que se filtra a través de ellas. Esta agua, exenta de oxígeno y con un alto contenido de dióxido de carbono, disuelve el hierro y el manganeso del suelo. Las aguas que contienen hierro y manganeso favorecen el desarrollo de bacterias del género Crenothrix y otros organismos similares en los depósitos de agua subterránea



almacenada. A veces, en las aguas subterráneas se produce sulfuro de hidrogeno cuando hay ausencia de oxigeno, descomposición de materias orgánicas o reducción de sulfatos. Aunque las bacterias y otros organismos vivientes en la superficie de la tierra pueden ser recogidos primero por la lluvia que cae sobre ellos, la filtración en el subsuelo da por resultado la separación de estos organismos. Hay una excepción cuando cerca de la superficie las rocas están agrietadas, como ocurre con la piedra caliza. En este caso, la contaminación de superficie debe ser llevada a grandes distancias sin variación importante. Las condiciones sanitarias en la proximidad de las fuentes de agua subterránea son importantes, en particular cuando la polución en el subsuelo proviene de letrinas pozos absorbentes y albañales con fugas. Especialmente seria es la polucion que se presenta al nivel o debajo del manto freático. Las fuentes de polución situadas en la superficie de la tierra, aunque no deben ser ignoradas, son menos importantes que las fuentes subterránea. Manantiales. El agua subterránea que corre en la parte superior de un estrato impermeable puede salir a la superficie en forma de manantial. Esto sucede generalmente cuando el estrato impermeable aflora debajo de una extensión elevada de material permeable. A veces, los manantiales brotan entre las grietas de las rocas. “Las aguas de manantiales provenientes de estratos someros se verán más probablemente afectadas por la polución superficial que las aguas profundas. En general, sus caracteres de calidad reflejan la formación geológica del lugar con que surgen. Normalmente, la can-tidad de agua que se obtiene en manantiales es limitada y, por lo tanto, este modo de abastecimiento se aprovecha solamente para pe pequeñas poblaciones.. Pozos someros y galerías de filtración. Los pozos someros son los que se forman en depósitos superficiales de material permeable encima de un estrato impermeable. De un modo arbitrario, los po-zos someros con más de 15 m de profundidad se califican de “profundos”. Hay pozos someros de gran diámetro abiertos por excavación y los hay de pequeño diámetro abiertos por perforaciones y utilizados mediante tubería. Generalmente se extrae el agua por aspiración. El limitado descenso de nivel aprovechable reduce el tamaño del área de donde proviene el agua subterránea. Por lo tanto, la calidad del agua proveniente de un suelo de profundidad se determinara principalmente por el carácter de la zona vecina de captacion. Pozos profundos. Los pozos profundos se excavan o se perforan, según los estratos de la región. Frecuentemente atraviesan capas impermeables antes de alcanzar el estrato acuífero deseado. Al igual que en los pozos someros, las aguas provenientes de pozos profundos tienen los caracteres determinados por la naturaleza de la superficie tributaria de captacion y las formaciones geológicas atravesadas por el agua. Generalmente, el terreno de captación para pozos profundos es bastante extenso. Esto significa que el agua subterránea recorrerá largas distancias y tendrá amplio contacto con las formaciones rocosas y con la tierra. Las aguas de pozos profundos a ser, por lo tanto, más intensamente mineralizadas que las aguas provenientes de pozos de poca profundidad. METODOLOGÍA MAS COMÚN Determinación de pH.

• Se encendió el pH metro, y se dejó calentar durante 30 min. • Se calibró con solución buffer. • Luego se lavo el electrodo con agua destilada. • Se midió 100 ml de la muestra (agua de pozo) y se coloco en un beacker de 250 ml • Se introdujo el electrodo dentro del beacker y se verificó el pH.

Determinación de dureza.

• Se midió 50 ml de muestra y colocadas en una fiola de 125 ml (por duplicado). • Se añadió 3 gotas de anaranjado de metilo. • Se adiciono HCl 1N, hasta que la muestra tomó un color rosado pálido. • Se neutralizó con NaOH 0.1N hasta color anaranjado.



• Se agregó 1 ml de solución tampón NH4Cl / NH4OH (pH7) (Buffer pH10). • Se tituló con solución 0.02 M de EDTA.

Determinación de alcalinidad parcial y total.

Parcial: • Se midió 50 ml de muestra y se transfirió a una fiola de 125 ml • Se añadieron 3 gotas de fenolflateína (la solución se mantuvo incolora, esto indica ausencia

de OH - y CO3=). Total:

• A la muestra anterior se le agrego 2 gotas de anaranjado de metilo. • Se tituló la solución con HCl (0.1N) hasta una coloración amarillo – anaranjado.

Determinación de cloruros. (Método de Mohr).

• Se midió 100 ml de muestra y se agregaron en una fiola de 125 ml • Se añadieron posteriormente 3 gotas de cromato de potasio. • Desde una bureta con solución de AgNO3 0.1 N, se dejó caer gota a gota, hasta una

coloración marrón. Determinación de Residuos fijos.

• Se pasaron los crisoles vacíos. • Se agregó 25 ml de muestra en los crisoles. • Se llevó a calentamiento hasta evaporación. • Luego se llevó a la estufa a 105oC durante 10 minutos. • Se retiraron de la estufa y se colocaron en el desecador para enfriar a temperatura ambiente. • Se pesaron en la balanza analítica.

BibliografíaF.L. HART y H.D. FISHER, Análisis Moderno de los Alimentos. De la edición en lengua española, Editorial Acribia. Zaragoza (España). 1991. HAROLD, EGAN y Otros, Análisis Químico de Alimentos de Pearson. Primera Edición. Compañía Editorial Continental, S.A de CV. México. 1987. H.G. MULLER y GITOBIN, Nutrición y Ciencia de los Alimentos, Editorial Acribia, Zaragoza (España).

ANÁLISIS DE GRASASNo hay una distinción clara entre los términos ‘grasa’ y “aceite”. La primera, generalmente, significa el estado sólido mientras que, corrientemente, “aceite”, se aplica a la forma líquida. La vaguedad de esta terminología es evidente por el hecho de que una grasa en una zona de temperatura climática, puede ser un aceite a temperaturas tropicales. Los términos están empleados indistintamente sin una referencia específica al estado físico. Las grasas naturales se caracterizan por:

a) ser insolubles en agua y solubles en la mayor parte de los disolventes orgánicos. b) poseer un carácter oleaginoso c) tener pesos específicos menores que el del agua, y d) ser fácilmente saponificables con álcalis.

Además de los triglicéridos, las grasas naturales contienen ciertos constituyentes no glicéridos que, mayormente, son insaponificables. Esta porción insaponificable consta de esteroles, hidrocarburos, tocoferoles y otras materias que no se determinan o identifican. El contenido de insaponificables de la mayor parte de las grasas naturales oscila normalmente entre el 0,5 y el 2,6 %, aunque hay unas pocas excepciones particularmente en el caso de los aceites de animales marinos. La mayoría de las grasas naturales que provienen de fuentes animales o vegetales son triglicéridos respectivamente. Los triglicéridos que constituyen la fracción mayor de todas las grasas y aceites naturales se clasifican en simples y mixtos, dependiendo de su composición. Un triglicérido simple es aquel que tiene idénticos los tres radicales de ácido graso. Los triglicéridos que no tienen iguales los radiales de ácido graso se denominan triglicéridos mixtos. Las grasas naturales han sido definidas como mezclas de



triglicéridos mixtos, puesto que, en la Naturaleza la mayor parte de los triglicéridos se presentan como del tipo mixtoClasificación de los Lípidos A.- Lípidos simples. Esteres de ácidos grasos y alcoholes.

1. Grasas y aceites. Esteres de glicerol con ácidos monocarboxílicos. 2. Ceras. Esteres de alcoholes monohidroxilados y ácidos grasos.

B.- Lípidos compuestos. Lípidos simples conjugados con moléculas no lípidas. 1. Fosfolípidos. Esteres que contienen ácido fosfórico en lugar de un ácido graso, combinado

con una base de nitrógeno. 2. Glucolípidos. Compuesto de carbohidratos, ácidos grasos y esfingosinol, llamados también

cerebrósidos. 3. Lipoproteínas. Compuestos de lípidos y proteínas.

C.- Compuestos asociados. 1.- Ácidos grasos. 2.- Alcoholes 3.- Hidrocarburos. 4.- Vitaminas liposolubles. También se pueden clasificar como saponificables o insaponificables (esteroles, hidrocarburos y prostaglandinas). La más importante aplicación de las grasas es en la alimentación. Una cantidad considerable de grasa comestible se consume en su forma original, como en carnes, nueces, cereales, productos lácteos y de aves de corral aunque también se consume mucho en forma de mantequilla, margarina, grasas de freír, aceites comestibles y de cocina. Las grasas no comestibles abarcan también una amplia industria, siendo empleadas en la fabricación de jabones, aceites secantes para la industria de pinturas y barnices, aceites industriales para la industria textil, aceites de corte y recientes avances en los que las grasas se emplean como materia prima para la síntesis de una amplia variedad de nuevos productos. Las grasas usualmente ocupan alrededor del 99% de la fracción de lípidos de un alimento y la comodidad relativa de determinar el contenido total de lípidos más que el verdadero contenido de grasa ha resultado en que el término grasa y lípido se hacen virtualmente indistinguible. Los alimentos pueden contener cualquiera o todos los compuestos lipídicos, pero los de mayor importancia son los triacilglicéridos y los Fosfolípidos. Los triacilglicéridos líquidos a temperatura ambiente son referidos como aceites, tales como: aceite do soya, de oliva y son generalmente de origen vegetal. Los triacilglicéridos sólidos a temperatura ambiente son tratados como grasas. El término grasa es aplicable a todos los triacilglicéridos así sean normalmente sólidos o líquidos a temperatura ambiente. Acidos Grasos Saturados: Este tipo de ácidos grasos, no presenta dobles enlaces en sus moléculas. Varían de C4 a C20, siendo los más comunes el ácido palmítico (C16) y el ácido esteárico(C18). El punto de fusión de un ácido saturado es directamente proporcional al tamaño de su cadena carbonada, por lo que los de C4 a C8 son líquidos a 20-25°C, mientras que los de C10 en adelante son sólidos a la misma temperatura. Su solubilidad disminuye a medida que aumenta la longitud de la cadena y el peso molecular de la molécula, como ocurre con el ácido butírico (C4) que es completamente miscible en agua, mientras que de C12 en adelante son inmiscibles. Acidos Grasos lnsaturados: Tienen una mayor reactividad química que los saturados debido a la presencia de dobles enlaces en su molécula. Predominan sobre los saturados, especialmente en los aceites vegetales y en las grasas de animales marinos que viven a bajas temperaturas. Su punto de fusión disminuye a medida que aumenta el grado de insaturación y su sensibilidad a las reacciones do oxidación es mayor cuanto más insaturado sea el ácido. Debido a la presencia de dobles enlaces, los ácidos grasos insaturados presentan dos tipos de isomerismo: a.- Geométrico: cis y trans. b.- Posicional: causado por la diferencia en la localización de los dobles enlaces en la cadena carbonada. Esteres: Son compuestos que derivan de la sustitución del hidrógeno perteneciente a la función alcohólica de un alcohol primario o secundario al reaccionar con un grupo ácido.



Esteroles: Esta clase de sustancias contiene un grupo químico común llamado perhidrociclopentanofenantreno, además de una cadena hidrocarbonada y un grupo alcohol, y se localizan en lípidos de origen vegetal y animal. Glucósidos: Están formados por dos fracciones muy diferentes: un azúcar reductor y un no-carbohidrato que se conoce con el nombre de aqlucón, cuya unión se efectúa a través del carbono anomérico del azúcar. Los glucósidos se denominan O-glucósidos, cuando existe un enlace entre el azúcar reductor y el hidroxilo de un alcohol o del fenol del aglucón. Los N-glucósidos, se forman por la unión del azúcar con un grupo amino. Los S-glucósidos se denominan también tioglucósidos por la presencia de azufre en su molécula. Colesterol: Es un esterol cuya cadena carbonada, en los esteroles, donde se encuentra el grupo(R) está sustituida por un átomo de hidrógeno(H). Es el principal esterol en grasas animales y aceites de origen marino y puede encontrarse (pero en muy bajas proporciones), en algunos aceites y grasas vegetales. Aunque es estructuralmente muy diferente de ácidos grasos y triglicéridos, aparece en alimentos como en yema de huevos, ostras, hígados y riñones, los cuales son muy ricos en este compuesto. Es también sintetizado por el cuerpo humano en cantidades que varían con la ingerida en la dieta, con la finalidad de suplir la cantidad necesaria para la formación de ácidos biliares, los cuales son requeridos para la digestión y absorción de grasas del intestino. El colesterol es también un compuesto esencial de la membrana celular y es encontrado en grandes cantidades en el cerebro y tejidos nerviosos. Además de ello, el cuerpo puede sintetizar también vitamina D a partir del colesterol y es necesario para formar las hormonas esteroidales, incluyendo la hormona del sexo. Con relación al problema del colesterol en la dieta, está basado en el hecho de que altas concentraciones de éste en la sangre puede ser causa de enfermedades como ateroesclerosis, la cual es una forma de enfermedad cardiovascular en el que los depósitos de grasa o desarrollo de placas se llevan a cabo sobre las paredes de las arterias (Schneeman B., 1986). Aunque el consumo de colesterol en la dieta no puede estar relacionado directamente al nivel de colesterol en la sangre, puede ser uno de los factores que contribuyen a su elevación. Fitoesteroles: Son esteroles de origen vegetal, cuya cadena carbonada donde se encuentra el grupo H en el colesterol, está sustituida por un grupo etilo. El tipo y cantidad de Fitoesteroles que contienen los aceites varían con a fuente vegetal de que se trate

Métodos Analíticos para extraer aceites o grasa.Las sustancias que contienen grasa juegan un papel importante en el comercio mundial, puesto que la grasa es un constituyente esencial de la dieta de los hombres y de los animales y porque tiene muchas otras aplicaciones industriales y domésticas. El contenido de grasa de muchos artículos de primera necesidad es la base del comercio de estos artículos. Así, el precio del aceite de las semillas de algodón, depende en parte del contenido de aceite de las mismas. El comercio de aceite de soja, durante la Segunda Guerra Mundial, se llevaba de la misma forma. El valor comercial de la leche y de la nata es determinado por su contenido de grasas naturales. Muchos alimentos, tanto humanos como animales, se fabrican para satisfacer algún contenido especificado de grasa. De estos pocos ejemplos, se deduce que la determinación de la grasa en productos de origen animal y vegetal es una función de cierta importancia. No hay un solo método aplicable a la determinación de grasa en todos los distintos tipos de productos existentes, aunque los métodos llamados de extracción están más cerca de un método general que la mayor parte de los restantes. A semejanza de otros muchos procedimientos analíticos, los métodos de determinación de grasa son empíricos en cierto grado, dependiendo del método empleado así como de la procedencia del material. Las variaciones en los métodos de análisis producen resultados variables. Esta diversidad de resultados puede atribuirse a distintos factores, pero probablemente, los dos más importantes son: a) el método empleado en la preparación de la muestra y b) la extensión o el grado en que la grasa, a grasa oxidada y ciertos componentes no grasos, sean solubles en cl disolvente elegido. La exactitud de esos métodos depende grandemente de la solubilidad de los lípidos en el solvente usado. La determinación de la grasa implica tres operaciones distintas, independientemente del origen del material o del método. Estos pasos, son:

1. Tratamiento preliminar de la muestra, incluyendo el secado previo, la molienda, la digestión o cualquier combinación de éstos.



2. Separación de la grasa por extracción con un disolvente apropiado o por separación con centrífuga.

3. Valoración de la grasa por un método u otro. Presecado: La finalidad del secado previo es reducir el contenido de humedad de la muestra. Se realiza por diversas razones:

1. Las muestras presecadas pueden ser molidas o, de otra manera, subdivididas con mayor facilidad que cuando están en su estado original. Este estado de subdivisión es importante en relación con su extracción perfecta.

2. El agua, al menos en cantidades excesivas, impide una extracción completa y eficiente si se emplea éter etílico o éter de petróleo como agente extractor.

3. El presecado ayuda a separar la grasa de las células de los tejidos de la carne y de sus productos.

4. Las emulsiones pueden romperse, por lo menos parcialmente, de forma que la grasa es más accesible y más fácil de extraer.

Una precaución importante que debe observarse en el secado previo, es evitar la oxidación de la grasa, puesto que reduce la solubilidad en el éter de petróleo. La oxidación puede evitarse, o cuando menos minimizarse, secando la muestra a temperaturas por debajo de los 100°C y a presiones menores de 760 mm de mercurio. Si no es posible realizar el secado con ayuda del vacío, es aconsejable emplear un tipo de estufa de tiro forzado para eliminar el agua lo más rápidamente posible para, de esta forma, exponer la muestra a la menor cantidad posible de calor. Cuando se trata de sustancias especialmente sensibles al calor, pueden secarse sobre un eficaz agente desecante. No obstante, este procedimiento es demasiado lento para ser práctico en usos rutinarios. En tales casos, es preferible seleccionar un método que no requiera secado previo. Pulverización o molienda: La finalidad de la molienda es reducir el tamaño de partícula de la muestra de forma que el disolvente pueda penetrar en la misma fácil y completamente. Hay una amplia variedad de molinos de laboratorio apropiados, pero ningún tipo de molino solo es satisfactorio para triturar todos los tipos de muestras. Las determinaciones de lípidos en % a nivel de laboratorio pueden hacerse mediante la extracción con solventes y extracción húmeda sin solventes. Estas extracciones se diferencian de las anteriores en que no se hacen a gran escala porque no son con fines comerciales sino simplemente para determinar el % de grasa en un alimento. Entre los métodos utilizados se tienen: extracción con solventes, extracción húmeda sin solventes e instrumentales.

Métodos de extracción con solventesLa validez de los análisis de grasas de un alimento depende del propio muestreo y de la preservación de la muestra antes del análisis. Un buen muestreo, una buena preservación y buen procedimiento de análisis son los factores críticos en un análisis de alimentos. La preparación de la muestra para un análisis de lípidos depende del tipo de alimento y tipo y naturaleza de los lípidos en el alimento. El método de extracción para lípidos de un alimento líquido es diferente al de uno sólido. Para analizar adecuadamente los lípidos en alimentos, es necesario un conocimiento previo de la estructura, la química y la incidencia de las principales clases de lípidos y sus constituyentes. Por lo tanto no hay un método estándar simple para la extracción de todas las clases de lípidos en diferentes alimentos. Para mejores resultados, la preparación de las muestras podría hacerse bajo una atmósfera inerte de nitrógeno a baja temperatura para minimizar las reacciones químicas tales como la oxidación de los lípidos. Los lípidos no pueden ser extraídos efectivamente con éter etílico de alimentos húmedos porque el solvente no podría penetrar fácilmente los tejidos alimenticios húmedos. El éter, el cual es higroscópico se saturaría con el agua y se haría ineficiente para la extracción de lípidos. La muestra seca a temperaturas elevadas es indeseable porque algunos lípidos formarían enlaces con proteínas y carbohidratos y los lípidos enlazados no son fácilmente extraibles con solventes orgánicos. El horno a vacío a baja temperatura o la liofilización incrementa el área de superficie de la muestra pava una mejor extracción de los lípidos. Este procedimiento hace la muestra más fácil de triturar para una mejor extracción, rompe las emulsiones agua-grasa y hace que la grasa se disuelva fácilmente en el solvente orgánico y ayuda a liberarla de los tejidos de los alimentos.



La eficiencia en la extracción de lípidos de alimentos secos depende del tamaño de las partículas; por lo tanto, es muy importante una buena trituración. El método clásico de determinar grasa en semillas aceitosas envuelve la extracción de a semilla triturada con un solvente seleccionado después de repetir la pulverización a baja temperatura para minimizar la oxidación de lípidos. Para una mejor extracción, la muestra y el solvente son mezclados en un triturador a alta velocidad. Aquellos alimentos tales como: pan, harina y productos animales que tienen una porción de lípidos enlazada a proteínas y carbohidratos son extraídos ineficientemente con solventes no polares. Tales alimentos deben ser preparados por una hidrólisis ácida para la extracción de lípidos. Esta hidrólisis rompe tanto los enlaces iónicos como covalentes de los lípidos con proteínas y carbohidratos y así pueden ser extraídos fácilmente. La muestra es predigerida con reflujo por una hora con HCL 3N, luego se añade etanol y hexametafosfato sólido para facilitar la separación de lípido de otros componentes antes de que los alimentos sean extraídos con el solvente. Un solvente ideal para la extracción de grasa debe reunir las siguientes características:

a) podría tener un alto poder disolvente para lípidos y uno bajo para proteínas, aminoácidos y carbohidratos.

b) deben ser evaporables fácilmente y no dejar residuos. c) tener un bajo punto de ebullición. d) no ser inflamables y tóxicos tanto líquidos como en estado de vapor. e) debe penetrar fácilmente las partículas alimenticias. f) no debe ser caro e higroscópico.

Es difícil un solvente que reúna todas estas características. el éter etílico y el de petróleo son los solventes más comúnmente usados. El primero tiene un punto de ebullición de 34,6°C y es mejor solvente para grasas que el segundo, es generalmente comparado con otros solventes, tiene un alto grado de peligro explosivo, es higroscópico y forma peróxidos. El éter de Petróleo es la fracción del petróleo de más bajo punto de ebullición y está compuesto principalmente de pentano y hexano tiene un punto de ebullición de 35-36°C y es más hidrofóbico que el éter etílico. Es selectivo para lípidos más hidrofóbicos, es menos higroscópico y menos inflamable que el éter etílico. Frecuentemente se usa una combinación de dos o tres solventes. Los solventes deberían ser purificados y libres de peróxidos. Los métodos de extracción de solventes pueden ser continuos, semicontinuos y discontinuos. Método de extracción continua: Para una extracción continua con solvente, la muestra triturada y seca es colocada en un dedal poroso de cerámica, la cual es tapada con fibra de vidrio y colocada en un portadedal de vidrio que es luego insertado en el aparato de extracción Goldfish. Después de ello, se coloca el vaso de precipitado especial con el solvente.(Éter etílico) y se enrosca, teniendo cuidado de subir con precaución la plancha de calentamiento para que haga contacto con el vaso de precipitado que ha sido previamente tarado. Se hace circular el agua por el refrigerante el cual no se observa a simple vista y se enciende el aparato. Se observa el solvente se evapora y al condensarse baja a través del dedal poroso extrayendo la grasa de la muestra. Este proceso tiene una duración aproximadamente de 4 horas. Al terminar, se sustituye el dedal con el portadedal por un recipiente donde se recogerá el solvente evaporado al calentar nuevamente el vaso de precipitado que contiene el solvente con la grasa. Después de esto, el vaso de precipitado se coloca en una estufa aproximadamente a 70°C para evaporar el resto del solvente, luego se enfría y se pesa nuevamente para determinar la grasa. El vaso de precipitado no debe tocarse directamente con las manos. Método de extracción semicontinua (soxhlet): Para una extracción semicontinua, el solvente se coloca en el balón de calentamiento y la muestra seca y triturada (2g) en su portadedal, se ubica en la parte superior del balón, en el sitio indicado para la extracción. Si la muestra contiene más de 10% de humedad, se debe secar hasta peso constante a 95 - 100°C bajo presión ≤ 100 mm de Hg alrededor de 5 horas(AOAC, método 934.01). Se adopta el condensador de serpentín (reflujo), y se hace circular el agua y el balón previamente tarado, se calienta con una plancha de calentamiento. Cuando el solvente se evapora, se condensa y se cae en el sitio donde está la muestra haciendo contacto con ella por un periodo que oscila entre 5 y 10 minutos. Cuando el sitio donde se encuentra la muestra se llena de solvente, ocurre el sifón y todo el solvente con el extracto baja al balón y así se repite varias veces este procedimiento hasta que la muestra se le haya extraído toda la grasa. Este método requiere más tiempo que el de extracción continua. El solvente condensado debe caer a una velocidad



de 5 o 6 gotas por segundo (aproximadamente 4 horas) o por 16 horas a una velocidad de 2 ó 3 gotas/segundo. Para obtener el peso de la grasa se debe proceder como en el caso anterior. Método de extracción discontinua con solvente (Mojonnier): Este método no requiere una remoción previa de la humedad de la muestra. El principio está basado en que la muestra es extraída por tres veces consecutivas con una mezcla de éter etílico y éter de petróleo y la grasa extraída es secada hasta peso constante y expresada como % do grasa por peso de muestra. Este método es ampliamente aplicado en la industria láctea, para la que se diseñó originalmente. No es aplicado directamente a los productos animales y vegetales. Lo más singular del aparato Mojonnier es el recipiente de extracción que puede servir para una gran variedad de productos. Proporciona un medio relativamente sencillo y rápido de separar la grasa de una sustancia determinada. El recipiente está constituido de forma que la disolución formada por la grasa y el disolvente se puedo extraer de la muestra que se esta analizando. Este método es especialmente conveniente cuando no se requiere un contacto prolongado entre el disolvente y la muestra. Es muy útil para las extracciones líquido-líquido y ha sido empleado con éxito con diversos materiales grasos, diferentes a los productos lácteos corrientes.

Métodos de extracción húmeda sin solventes.Método de Babcock: Se desarrolló para determinar el contenido de manteca de La leche y de la nata, pero el procedimiento primitivo ya se ha modificado y actualmente puede aplicarse a la mayor parte de los restantes productos lácteos, incluyendo helados, quesos, mantequilla y suero. Este método y sus modificaciones emplean un matraz o frasco especial, con un cuello estrecho graduado, el cual está calibrado de tal forma que puede leerse directamente el porcentaje de grasa, con tal que se empleen las cantidades de muestras especificadas. Los matraces y las divisiones graduadas deben calibrarse antes de su empleo, siguiendo los métodos comúnmente empleados para la calibración volumétrica del material de vidrio. El procedimiento Babcock comprende el calentamiento de la muestra, generalmente en el mismo matraz, con un reactivo para digerir la materia no grasa y dejar ésta en libertad. La separación de la grasa se completa por centrifugación, después de que aquella se le hace sobrenadar en una disolución de mayor densidad que la grasa. Se mide después la grasa volumétricamente en la parte graduada del frasco. Los cuellos de los matraces de Babcock tienen que ser necesariamente estrechos para permitir mediciones precisas de la grasa, lo que conduce a dificultades en la introducción en el frasco de muestras que no sean líquidas o que fluyan libremente. Tales productos, que incluyen quesos y carnes, se digieren, por lo tanto, en un vaso y después se pasan al matraz para la separación y medición de la grasa. No determina Fosfolípidos en productos lácteos y no es aplicable a productos que contienen chocolate o azúcar añadida.

Método Gerber(para grasa de leche): El principio de este método es similar al Babcock pero usa ácido sulfúrico y alcohol amílico. El ácido sulfúrico digiere proteínas y carbohidratos, libera la grasa y la mantiene en estado líquido por generación de calor. Este método es más simple y rápido que el Babcock y tiene aplicaciones más amplias para una variedad de productos lácteos. El alcohol isoamílico generalmente previene la carbonización del azúcar encontrado con el método regular de Babcock. Esta prueba es más popular en Europa que en América.

Método Detergente: El principio de este método es que el detergente reacciona con la proteína para formar un complejo proteína - detergente, rompiendo la emulsión y liberando la grasa. El método fue originalmente desarrollado para determinar grasa en leche, debido a las propiedades corrosivas del H2S04 en el método Babcock. Este método fue modificado más tarde para usarlo con otros productos. La leche es pipeteada en un recipiente Babcock. Un detergente aniónico (fosfato dioetil de sodio) es añadido para dispersar la capa de proteína que estabiliza la grasa para liberarla. Entonces se añade un detergente no iónico hidrofílico, polioxietileno, monolaurato sorbitan para separar la grasa de otros componentes alimenticios. El porcentaje de grasa se mide volumétricamente y se expresa como % de grasa.

Método del índice de refracción: El índice de refracción es característico para cada tipo de grasa y los valores varían con el grado y tipo de insaturación, oxidación, tratamiento al calor, temperatura de



análisis y el contenido de grasa. La grasa es extraída con un solvente (bromonaftaleno) y el índice de refracción del solvente es comparado con el de la solución grasosa y la grasa. El índice de refracción disminuye cuando aumenta la temperatura y cuando aumenta la longitud de onda del rayo luminoso. El índice de refracción del disolvente debe diferir considerablemente del aceite con el que vaya a emplearse. Es preferible que tenga un alto punto de ebullición para evitar evaporación.

Comparación de Métodos.La extracción por el método de Soxhlet es el más comúnmente usado para la determinación de grasa cruda en alimentos. Sin embargo, este método requiere una muestra seca para la extracción con éter etílico anhidro. Si las muestras son húmedas o alimentos líquidos, el método de Mojonnier es el más conveniente para determinar el contenido de grasa. Los métodos instrumentales corno: IR y RMN son muy simples, reproducibles y rápidos, pero son solamente disponibles para la determinación de grasa de alimentos específicos. La aplicación de los métodos instrumentales en estos casos generalmente requiere una curva estándar entre la señal del análisis del instrumento y el contenido de grasa obtenido por un método de extracción con solvente de un estándar. Un método instrumental rápido puede ser usado como un control de calidad para la determinación de grasa de un alimento especifico.

Características o Constantes Físicas. Indice de refracción: El índice de refracción de un aceite es definido como la relación de la velocidad de la luz en el aire (técnicamente, un vacío) a la velocidad de la luz en al aceite. Las muestras se miden con un refractómetro a 200C o 250C para aceites y 40°C para grasas, ya que la mayoría de las grasas son líquidas a esa temperatura. El índice de refracción es usado para controlar la hidrogenación; la cual decrece linealmente como decrecen los valores de yodo. Es usado también como una medida de pureza y medio de identificación, ya que cada sustancia tiene un índice de refracción característico. Punto de Fusión: Puede ser definido de varias formas, correspondiendo cada una a diferentes cantidades residuales de grasa sólida. Método del tubo capilar (punto claro). Es la temperatura a lo cual una sustancia pasa del estado sólido al estado líquido por acción del calor a una velocidad dada haciéndose completamente claro. Punto de fusión deslizado. Es determinado similarmente al del tubo capilar y mide la temperatura a la cual una columna de grasa se mueve en un capilar abierto cuando se calienta. Punto de fusión Wiley. Mide la temperatura a la cual un disco de grasa de 1/8 x 3/8 de pulgada suspendido en una mezcla de alcohol-agua de densidad similar cambia dentro de una esfera. Este método es más usado en los Estados Unidos y el punto de fusión por deslizamiento es preferido en Europa; sin embargo, el método del tubo capilar es menos usado para aceites y grasas (en comparación con compuestos puros) ya que ellos carecen de un punto de fusión definido debido a su contenido de varios componentes. Una desventaja del punto de fusión Wiley es la determinación subjetiva así como cuando el disco es esférico. Una desventaja del punto de fusión deslizante es el tiempo de estabilización de 16 horas. Punto de nube. Es la temperatura a la cual una nube es formada en una grasa líquida debido al comienzo de la cristalización. Punto de solidificación. Es la temperatura a la cual una sustancia grasa pasa del estado líquido al estado sólido por enfriamiento. Gravedad específica (Densidad relativa a 25/25°C). Es la relación entre la masa de una sustancia y la masa de igual volumen de agua, a cierta temperatura. Se puede determinar por medio de la balanza de Westphal o por el Picnómetro. Evaluación del color: El color de los aceites y grasas está relacionado en particular con el aspecto del producto final, y su evaluación es de cierta importancia industrial. Las muestras se deben homogeneizar a temperatura ambiente y las grasas en estado fundido. El color se puede determinar visual o espectroscópicamente. a) El color se compara con los cristales de un colorímetro Lovibond utilizando una celda adecuada. También se pueden determinar en una cubeta de porcelana poniendo el colorímetro en posición vertical. b) Se mide la longitud de onda de máxima absorbancia frente al tetracloruro de carbono en un espectrofotómetro utilizando una celda de 0,5 - 5 cm.



Deterioro de los LípidosLas grasas y los aceites son susceptibles a diferentes reacciones de deterioro que reducen el valor nutritivo del alimento y, además, producen compuestos volátiles que imparten olores y sabores desagradables. Esto se debe a que el enlace éster es susceptible a la hidrólisis química o enzimática y a que los ácidos grasos insaturados son sensibles a reacciones de oxidación. Rancidez: En general, el término rancidez, se ha usado para describir los diferentes mecanismos a través de los cuales se alteran los lípidos. El grado de deterioro depende del tipo de grasa o aceite; los más susceptibles a estos cambios son los de origen marino, seguidos por los aceites vegetales y finalmente por las grasas animales. El deterioro de los lípidos se ha dividido ondas grupos de reacciones: rancidez hidrolítica y rancidez oxidativa. El primero se debe básicamente a la acción de las lipasas que liberan ácidos grasos de los triacilglicéridos, mientras que el segundo se refiere a la acción del oxígeno y las lipoxigenasas sobre las insaturaciones de los ácidos grasos. Existe una tercera forma de deterioro de las grasas a través del fenómeno llamado reversión, cuyo mecanismo es poco conocido y que si bien se presenta en muchos lípidos que se almacenan en ciertas condiciones, tiene menos importancia que los de oxidación de grasas. Para medir el estado de oxidación de un aceite o grasa es recomendable realizar varias pruebas importantes, entre ellas tenemos: Indice o valor de peróxido, prueba de ácido tiobarbitúrico (TBA) y dienos conjugados. Sin embargo, hay otras pruebas que pueden ayudar al estudio sobre la oxidación de lípidos tales como: el valor anisidina, valor de yoduro, valor ácido, prueba de Kreis, prueba oxirano, medida de compuestos fluorescentes, compuestos carbonilos totales y volátiles, compuestos polares y gases hidrocarbonados. La mayoría de las pruebas requieren de la extracción de lípidos previo al análisis. Sin embargo, variaciones de algunos métodos comienzan con la muestra original como es el caso de TBA. La oxidación inicial de un aceite, por lo general es lenta y relativamente a una velocidad uniforme. Esto se conoce como período de inducción. Al final de este período, cuando la cantidad de peróxidos alcanza un nivel determinado, la velocidad de oxidación se acelera muy rápidamente. En este punto o poco después, las grasas o aceites comienzan a tener olor y sabor rancios. Como la rancidez es un fenómeno complejo, resulta aconsejable realizar tantas pruebas como sea posible, sobre todo en muestras dudosas. En el trabajo rutinario, además de los ácidos grasos libres, los análisis pueden incluir la determinación del Indice de Peróxido y la aplicación de la Reacción de Kreiss.

Indice de Peróxido. El valor de peróxido mide el grado de oxidación de lípidos en grasas y aceites pero no su estabilidad. Este valor es definido como los miliequivalentes de peróxido por Kg de grasa. Es una medida de la formación de grupos peróxidos o hidroperóxidos que son los productos iniciales de la oxidación de lípidos. Parece haber relación entre el índice de peróxido y la rancidez de las sustancias grasas, pero es necesario hacer notar, que las características del aceite juegan un papel muy importante. Así, aceites con alto índice de yodo, tendrán un índice de peróxido alto al comienzo de la rancidez y aceites con bajo índice de yodo, tendrán índice de peróxido bajo al inicio do la rancidez. Debe también establecerse correlación entre el índice de peróxido alto y las características organolépticas de rancidez antes de llegar a conclusiones definitiva.

METODOLOGÍA• Se pesó un papel de filtro y se taró con la muestra. • Se dobló el papel para no perder la muestra.

• Se colocó en un beacker pequeño y se introdujo en el desecador, posteriormente se llevó a estufa a 105°C durante la noche.

• Se pesó por diferencia 1 g de muestra en un papel el cual fue doblado e introducido en un dedal de vidrio.

• Se colocó ésta dentro de un recipiente para muestra y se fijó bajo el condensador del aparato de extracción Goldfisch.

• Se agregó en un beacker para solvente previamente limpio y seco con 40 ml de éter anhidro y se colocó sobre el condensador asegurandolo con el anillo o rosca, el cual se apretó con la



mano; pero sin tocar el beacker ya que la grasa de esta puede alterar el % de grasa de la muestra. Se accionó la llave del agua que actúa como refrigerante del condensador.

• Se subió la plancha de calentamiento, antes de que tenga contacto con los beacker se prendió el condensador.

• El éter empesó a hervir, luego se dejó hasta que transcurriera unas horas. • Se añadió más éter debido a que el contenido en el beacker se evaporaba a medida que se

extraía la grasa de la muestra. • Luego que transcurrió varias horas (5 aprox.) se apagó el aparato de Goldfisch, se bajaron las

planchas y se retirarón los beacker de solvente y se dejó a temperatura ambiente hasta que se evaporó el éter y la grasa que este contenía se colocó en el desecador.

• Se retiró el dedal con la muestra y se procedió a recuperar el éter localizado en el condensador del aparato del Goldfisch en un vaso recolector. Agregándolo luego en el envase original.

• Se colocó el beacker que contenía la grasa de la muestra localizada en la estufa a 105° por media hora.

• Luego se procedió a pesar y por diferencia se calculó la cantidad de grasa que contenía la muestra.

BibliografíaF.L. HART y H.D. FISHER, Análisis Moderno de los Alimentos. De la edición en lengua española, Editorial Acribia. Zaragoza (España). 1991. HAROLD, EGAN y Otros, Análisis Químico de Alimentos de Pearson. Primera Edición. Compañía Editorial Continental, S.A de CV. México. 1987. H.G. MULLER y GITOBIN, Nutrición y Ciencia de los Alimentos, Editorial Acribia, Zaragoza (España).

ANÁLISIS DE CENIZASImportancia de las Cenizas en Alimentos La cantidad de cenizas representa el contenido total de minerales en los alimentos. La determinación del contenido de cenizas puede ser importante por varias razones: Son una parte del análisis próximo para la evaluación nutricional. Las cenizas son el primer paso en la preparación de una muestra de alimentos para análisis elemental específico. La determinación del contenido de cenizas sirve para obtener la pureza de algunos ingredientes que se usan en la elaboración de alimentos tales como: azúcar, pectinas, almidones y gelatina. El contenido de cenizas se usa como índice de calidad en algunos alimentos como mermeladas y jaleas. En estos productos el contenido de cenizas es indicativo del contenido de frutas en los mismos: por lo tanto, se le considera como un índice de adulteración, contaminación o fraude. Es importante en productos de cereales porque revela el tipo de refinamiento y molienda. Ejemplo una harina de trigo integral (todo el grano) contiene aproximadamente 2% de cenizas; mientras que la harina proveniente del endospermo tiene un contenido de cenizas de 0,3%. Quiere decir que la mayoría de las cenizas están en las cáscaras. Se puede esperar un contenido de cenizas constante en productos animales, pero de otra fuente como las plantas, este puede ser variable. Se usa como índice de calidad en el vinagre. Hay normas al respecto. En algunos productos no sólo porque se establece el contenido de cenizas total sino además, el % de esa ceniza soluble en agua, en ácido y también la alcalinidad que presenta. Las cenizas contienen los elementos inorgánicos, mucho de los cuales son de interés nutricional como es el caso del calcio, fósforo, etc. Cuando en algún producto alimenticio hay un alto contenido de cenizas se sugiere la presencia de algún adulterante inorgánico. El método más común para determinar cenizas es la calcinación en mufla a temperaturas entre 500 y 600oC. Para determinar cenizas en azúcar se han recomendado métodos basados en la conductividad eléctrica (vía húmeda). El contenido de cenizas en carnes oscila entre 0,8 - 2% en base húmeda. En frutas y hortalizas está comprendido entre 2 - 12%. Los elementos minerales en los alimentos se encuentran en combinaciones orgánicas e inorgánicas. Las sales inorgánicas, tales como: fosfato, carbonato, cloruro, sulfato, nitrito de sodio, potasio, calcio, son comunes. También pueden encontrarse presentes sales de ácidos orgánicos: málico, oxálico,



acéticos, péptico, etc., Por otra parte ciertos elementos minerales pueden encontrarse formando complejos de moléculas orgánicas. A veces en la determinación de cenizas es conveniente mezclar el producto con arena como por ejemplo leche. Métodos Usados en la Determinación de Cenizas Existen tres métodos para la determinación de cenizas que son:

• Calcinación (vía seca) • Oxidación húmeda(digestión). • Cenizas a baja temperatura(cenizas plasma)

Calcinación Se refiere a la determinación de las cenizas en una mufla a temperaturas que oscilan entre 500 y 600oC. El agua y sustancias volátiles son evaporadas, mientras que las sustancias orgánicas son incineradas en presencia del oxigeno del aire para producir CO2 y óxido de nitrógeno. La mayoría de los minerales son convertidos a óxidos, sulfato, fosfato, cloruro y silicato. Los elementos tales como: Fe, Se, Pb y As, pueden volatilizarse parcialmente con este procedimiento, es por ello que otros métodos se deben usar como paso preliminar para análisis elemental específico. Las ventajas de este método son: Es un método seguro y no requiere adición de reactivos y sustancias del blanco. Se requiere de una pequeña atención sólo para evitar la formación de llamas y ello se logra subiendo la temperatura lentamente hasta aproximadamente 200oC. Después que se ha quemado la materia orgánica, se continua subiendo la temperatura hasta aproximadamente 500oC. Usualmente se pueden manipular varios crisoles a la vez y las cenizas resultantes se pueden utilizar para muchos análisis como: determinación, de elementos químicos, cenizas insolubles en ácido y solubles e insolubles en agua. Entre sus desventajas tenemos: El largo tiempo que se requiere para la incineración (12-18 horas o toda la noche). La pérdida de elementos volátiles y las interacciones entre los componentes minerales y los crisoles. Entre los elementos que se pueden perder por volatilización tenemos: As, B, Cd, Cr, Fe, Pb, Hg, Ni, P, V, y Zn. Oxidación húmeda(Digestión húmeda) Es un procedimiento en el cual se oxidan las sustancias orgánicas usando ácidos y agentes oxidantes o sus combinaciones. Los minerales son solubilizados sin volatilización. Las cenizas húmedas son preferibles a menudo a las cenizas secas como una preparación para un análisis elemental especifico La necesidad de vigilancia constante y la posibilidad de altos valores del blanco, hacen al método menos adecuado para el trabajo de rutina. El procedimiento consiste en oxidar la muestra en presencia de ácido nítrico, sulfúrico, perclórico y peróxido de hidrógeno, proporcionando calor hasta lograr la destrucción de toda la materia orgánica y que aparezcan humos blancos. Los ácidos se pueden usar en diferentes combinaciones, teniendo cuidado con el perclórico que es explosivo. Este método es muy aplicado a muestras con alto contenido en grasas(carnes y derivados). La oxidación húmeda posee ventajas frente a la calcinación en seco, ya que se utilizan temperaturas más bajas (menos de 350oC) y hay poca probabilidad de pérdida de los elementos por volatilización. El tiempo de la oxidación es corto. Entre sus desventajas se tienen: Se toma virtualmente todo el tiempo del operador. Se usan reactivos corrosivos y solamente se puede manipular un pequeño número de muestras. Cenizas a baja temperatura (cenizas plasma) Se refiere a un tipo especifico de método de cenizas secas en la cual los alimentos son oxidados en un vacío parcial por oxígeno naciente, formado por un campo electromagnético. Las cenizas así son obtenidas a una temperatura mucho más baja que con la mufla, previniendo la volatilización de muchos elementos. Las estructuras cristalinas usualmente permanecen intactas. La mayor desventaja es la pequeña capacidad para las muestras y lo caro del equipo.



Debido a que ciertos alimentos poseen alto contenido de minerales, el contenido de cenizas se hace importante. Se puede esperar un contenido constante de cenizas de productos de animales, pero de otras fuentes como las plantas, este puede ser variable. Contenido de Cenizas en los Alimentos El contenido de cenizas de la mayoría de los alimentos frescos raramente es mayor de 5%. Aceites puros y grasas generalmente contienen poca cantidad o nada de cenizas. Los productos tales como tocino puede contener 6% de cenizas y la carne seca de res puede poseer un contenido tan alto como 11,6% (base húmeda. Grasas, aceites y mantequillas varían de 0,00 a 4,09%; mientras que productos secos varían de 0,5 a 5.1%. Frutas, jugo de frutas y melones contienen de 0,2, a 0,6% de cenizas; mientras que las frutas secas contienen de 2,4 a 3,5%. Harinas y comidas varían de 0,3 a 1 .4%. El almidón puro contiene 0,3% y el germen de trigo 4,3%. Se podría esperar que el grano y sus derivados con salvado tendrían un contenido superior. Nueces y derivados contienen de 0,8 a 3,4% de cenizas; mientras que a carne, aves y alimentos marinos contienen entre 0,7 y 1,3% de cenizas.

Análisis de cenizasPreparación de las muestras: Entre 2 y 10 g de muestra son generalmente usados para determinar cenizas. Para este propósito, la molienda o trituración probablemente no alterarán mucho el contenido de cenizas; sin embargo si estas cenizas son un paso previo para la determinación de minerales se debe tener cuidado ya que puede haber contaminación por micronutrientes ya que los molinos son hechos de metal, el uso repetido de materiales de vidrio pueden ser fuente de contaminación; el agua también puede ser fuente de contaminación, por ello es conveniente usar agua destilada desionizada. Los materiales de las plantas son generalmente secados antes de la molienda por los métodos de rutina. La temperatura de secado es de pequeñas consecuencias para las cenizas. Sin embargo la muestra puede ser usada para determinaciones múltiples (proteína, fibra, etc.). Los materiales de las plantas con 15% o menos de humedad pueden ser incinerados sin secado previo. Los productos de animales, Syrups y especias requieren tratamiento previo a la incineración porque su alto contenido en grasas, humedad o azúcar pueden producir pérdidas de muestra. Las carnes, syrups y azúcares necesitan ser evaporados por secado en baño de vapor o con una lámpara infrarroja. Una o dos gotas de aceite de oliva se puede añadir para permitir escapar al vapor cuando se forma como una costra sobre el producto. La llama y el humo pueden aparecer en la incineración de muchos productos (quesos, alimentos marinos, especias, etc.). No se debe subir bruscamente la temperatura de la mufla para evitar la formación de llamas que provocan pérdidas de las muestras. La temperatura se debe subir lentamente hasta 200oC y dejarla allí hasta quemar toda la materia orgánica (desprendimiento de humo sin llama), después se sube lentamente hasta 500oC aproximadamente cuando se trate del método de incineración. En este método a veces la selección de los crisoles se hace crítica porque ello depende de su uso especifico. Existen crisoles de cuarzo, vycor, porcelana, platino, silica etc. Los crisoles de cuarzo son resistentes a los ácidos y halógenos pero no a los álcalis a temperaturas altas. Los vycor son estables hasta 900oC; pero los Gooch Pyrec están limitados hasta 500oC. Los de porcelana se asemejan al cuarzo en sus propiedades físicas pero se quiebran con los cambios bruscos de temperaturas, son económicos. Los de acero son resistentes a los ácidos y álcalis, son baratos pero están constituidos por cromo y níquel los cuales son fuentes posibles de contaminación. Los crisoles de platino son muy inertes y probablemente los mejores pero son muy caros para uso rutinario. Los de sílica son atacados por alimentos ácidos. Todos los crisoles deben ser marcados con creyón de grafito para su identificación ya que otros tipos de marcadores generalmente se borran con las altas temperaturas. En muchos alimentos, además de determinar las cenizas totales, es conveniente determinar también las cenizas solubles e insolubles en agua. Su alcalinidad y la proporción de cenizas solubles en ácido.

Métodos Usados en la Determinación de Minerales en CenizasAnálisis gravimétrico.

Las formas insolubles de los minerales son precipitados, lavados, secados y pesados para estimar el contenido de minerales utilizando procedimientos gravimétricos. El análisis gravimétrico está basado



en el hecho de que los elementos constituyentes en cualquier compuesto puro están siempre en las mismas proporciones por peso, por ejemplo, en el NaCI siempre hay un 39,3% de Na(100 x 23 / 58,5). En análisis gravimétrico, el constituyente deseado es separado de las sustancias contaminantes por precipitación selectiva y entonces lavado para minimizar cualquier adherencia o elementos atrapados. El precipitado es entonces secado y pesado. El peso del elemento mineral está en la misma proporción del peso del compuesto, igual que como está en el complejo precipitado. El cloruro por ejemplo es a menudo precipitado por cloruro de plata, el cual es lavado, secado y pesado. El peso del cloruro puede entonces ser calculado del peso del cloruro de plata, porque el cloruro es el 24,74% del peso molecular del AgCl. El calcio puede ser determinado por precipitación como oxalato, y convertido a CaO por ignición y reportado como peso de calcio/peso de muestra(Ver Suzanne, 1995. método modificado). Los procedimientos gravimétricos son adaptados mejores a tamaños grandes de muestras y son generalmente limitados a alimentos que contienen a grandes cantidades de los elementos a ser determinados. Los procedimientos que usan AgNO2 han sido usados para cuantificar cloruros. La mayoría de los elementos traza están en baja cantidad en los alimentos cuyo procedimiento gravimétrico son demasiado largos para tener un valor analítico. Una desventaja de los procedimientos gravimétricos es el tiempo extra en la segunda ignición donde el CaC204 es convertido en CaO. Lavados repetidos tienden a solubilizar algo del CaC2O4. Sin embargo la co-precipitación de otros minerales necesitan los pasos del lavado.

METODOLOGÍADeterminación de cenizas en queso crema (kraft).

• Se pesó aproximadamente entre 5 y 8 gr de muestra de queso crema en un crisol de porcelana.

• Se llevó a estufa para deshidratarlas a 105oC por 16 horas. • Pasado este tiempo, se sacó de la estufa y se colocaron en el desecador para enfriar a

temperatura del laboratorio. • Luego fueron puestas en el horno de mufla a 500-600oC durante un día para incinerar hasta

obtener cenizas blancas o grises. • Se sacó los crisoles del horno de mufla y se colocaron en desecador para enfriarlos a

temperatura del laboratorio. • Se pesó y luego se procedió a los cálculos requeridos.

Preparación de reactivos Solución de 250 ml de Hcl 1:1

• Se tomó una alicuota de 125 ml de Hcl y se transfirió a un balón aforado de 250 ml y se diluyó con un volumen de agua destilada igual a 125 ml, para así obtener la solución de Hcl 1:1.

Solución de 500 ml (NH4)2C2O4 4% P/V. • Se pesaron exactamente 4 gr de oxalato de amonio, se llevaron a un balón de 500 ml y se

aforó con agua destilada. Solución KMnO4 0,05 N.

• Se pesaron 1,5962 gr KmnO4 puro y se llevó a un beaker de 1000 ml. se calentó la muestra con agitación frecuente hasta que el sólido se disolvió a una temperatura inferior a la de ebullición durante 30 min.

• Se dejó en reposo durante 24 horas. • Se filtro a través de fibra de vidrio. • Se paró la disolución a un frasco de vidrio oscuro con tapón de vidrio.

Estandarización de solución de KmnO4 con oxalato de amonio. • Se midió un volumen de 52,08 ml H2SO4 puros, el cual se transfirió a un balón de 500 ml

aforando con agua destilada, para obtener la solución H2SO4 al 10% P/V.

• De esta solución se tomó una alícuota de 100 ml que fueron mezclados con 0,15 g exactos de oxalato de sodio previamente pesados.

• La solución preparada se calentó lentamente hasta ebullición.



• Se enrasó la bureta con solución de KmnO4 procediendo a titular en caliente. • El punto final se alcanzó con la aparición del color rosado. • Con el volumen gastado de KmnO4 se procedió a calcular su normalidad. • Solución alcohólica 50 ml rojo metilo al 0,02%. • Se pesaron 0,01 g de rojo metilo y se llevó a un balón de 50 ml y se aforó con alcohol.

Solución 250 ml H2SO4 8% P/V. • Se midieron 10,87 ml puros de H2SO4 y se llevaron a un balón de 250 ml y se aforó con

agua destilada. Solución de 50 ml NH4OH 0,5%.

• Se tomó un volumen de 1 ml de hidróxido de amonio y se llevaron a un balón de 50 ml aforando con agua destilada.

Preparación de muestra para determinación de Calcio (Ca).• Se tomó la muestra incinerada y se le agregó 5 ml de Hcl 1:1. • El crisol se colocó en una plancha de calentamiento hasta la sequedad con el fin de

deshidratar los silicatos y hacerlos insolubles, todo esto a la temperatura más baja. • Alcanzada la sequedad, se bajaron de la plancha y se volvió a agregar 5 ml de Hcl 1:1. • Fue puesto el crisol en la plancha y calentar por 30 minutos a temperatura baja a fin de

hidrolizar los, pirofosfatos a ortofosfatos. • Se filtró a través de un papel de filtro la solución sin cenizas (pero el papel que se utilizó no

indicaba esto) en un matraz aforado de 100 ml. • El papel de filtro con el residuo se colocó en un crisol y se llevó al horno de mufla para ser

incinerada. • Al residuo que se obtuvo se le agregó 5 ml de Hcl 1:1 y se calentó a baja temperatura por 5

minutos. • Pasado este tiempo se procede a filtrar nuevamente la solución en un papel de filtro. • Se recoge el filtrado en el mismo matraz aforado de 100 ml. • Se aforó a 100 ml con agua destilada (solución A).

Determinación de calcio (Ca). (Permanganometría). • Se transfirió una alicuota de 50 ml de la solución (A) a un beaker de 250 ml. • Se agregó 100 ml de agua destilada. • Esta solución se calentó hasta ebullición. • Se le agregó lentamente 10 ml de oxalato de amonio y tres gotas de indicador rojo de metilo

hasta la formación del precipitado. • Se agregó gota a gota solución de hidróxido de amonio 0,5 N hasta que se obtuvo el viraje del

indicador (incoloro, pH=5). • Luego se dejó hervir durante 5 minutos la solución. • Pasado este tiempo, se dejó enfriar y luego se dejó reposar durante 4 horas. • Después de las cuatro horas, se filtró la solución a través de un papel filtro con 20 ml de agua

destilada. • Se colocó el papel en el mismo envase y se lavó el papel con 10 ml de ácido sulfúrico al 8%

para disolver el oxalato de calcio. • Se agregó 50 ml de agua hirviendo. • Se tituló e caliente con solución de permanganato de potasio 0,05 N hasta una coloración

rosada persistente. BibliografíaF.L. HART y H.D. FISHER, Análisis Moderno de los Alimentos. De la edición en lengua española, Editorial Acribia. Zaragoza (España). 1991. HAROLD, EGAN y Otros, Análisis Químico de Alimentos de Pearson. Primera Edición. Compañía Editorial Continental, S.A de CV. México. 1987. H.G. MULLER y GITOBIN, Nutrición y Ciencia de los Alimentos, Editorial Acribia, Zaragoza (España).



ANÁLISIS DE FIBRASLa fibra bruta constituye un índice de las sustancias presentes en los alimentos de orígen vegetal cuyo valor alimenticio es igual al del heno. Está constituida fundamentalmente por celulosa, lignina y pentosanas, que constituyen junto con pequeñas cantidades de sustancias nitrogenadas de las estructuras celulares de los vegetales. Un comité de enlace combinado de la AOCS y la AOAC definió así el término: << La fibra bruta se pierde en la incineración del residuo seco obtenido tras la digestión ácido-alcalina bajo condiciones específicas>>. Van Socst y Wine, del Agricultural Research Service del USDA, han introducido un nuevo concepto del significado de fibra bruta. Definen la fibra sobre bases nutritivas como las sustancias vegetales insolubles no digeridas por las enzimas diastáticos o proteolíticas, nutritivamente inútiles excepto por fermentación microbiana en el tracto digestivo de los animales. Subrayan que la clásica digestión ácida-alcalina utilizada para obtener la porción fibrosa de los vegetales que la que se denomina fibra bruta da una cifra que guarda una elación variable e incierta con el valor nutritivo de la fibra obtenida. El método ideal debe aislar lignina, la celulosa y la hemicelulosa con un mínimo de sustancias nitrogenadas. El resíduo obtenido por digestión ácido-alcalina contiene cantidades considerables de proteína vegetal perdiéndose, en cambio, parte de lignina, que se gelatiniza o se disuelve. El valor de la fibra bruta en las nuevas tablas de composiión de los alimentos se está sustituyendo por un valor de carbohidrato no utilizable denominado fibra dietética. El papel de la fibra indigerible o alimento o forraje indigesto en la dieta en el mantenimiento de la salud (Burkih, 1973) es ahora considerado tan importante nutricionalmente como los niveles de nutrimientos absorbibles en los alimentos. La fibra dietética puede ser definida como constituida por todos los componentes de los alimentos que no son todos rotos por las enzimas del conducto alimentario humano para formar compuestos de masa molecular menor, capaces de ser absorbidos al torrente sanguíneo. Se han desarrollado diferentes métodos para la estimación de la fibra dietética. Dado que no es posible determinar los muchos componentes complejos individualmente de la fibra dietética, los métodos de uso práctico representan un compromiso en la separación completa y su determinación y la aproximación empírica de fibra cruda. Existen un procedimiento más selectivo (Van Soestywine, 1967) usa sulfato de sodio y laurilo al 3% sin ácido. La Asociación Americana de Químicos de cereales ha adoptado como oficial este método en combinación con una digestión enzimática para el ánalisis de fibra dietética (Schaller, 1977). En general, las cubiertas protectoras de muchos alimentos contienen considerablemente mayor cantidad de fibra que los tejidos interiores, más suaves y más fáciles de comer. Por consiguiente, el valor de la fibra se puede utilizar para establecer la proporción de cáscara presente en algunos alimentos como el cacao y la pimienta. En forma similar el valor de la fibra sirve para calcular la cantidad de cáscara en las nueces, los huesos de las frutas o el aserrín que pueden existir en algunos alimentos; todos estos adulterantes tienen un alto contenido enfibra. Como el contenido en fibra aumenta con la edad de las plantas, su nivel puede servir para calcular la madurez de las verduras. En vista de la cantidad mayor en los tejidos externos del grano detrigo, la harina morena produce valores más altos que la harina blanca. En consecuencia se ha establecido un mínimo de 0,6% de fibra sobre base seca para la harina y el pan moreno. El grano de trigo es una cariópside. El endospermo esta formado por 70% de almidones, 12% de proteínas y 1.7% de grasas. El trigo comercial es fundamentalmente la almendra, es decir, el grano sin glumas. Lo más común en proteínas es de 8-15%. Los trigos mejorados, bajobuenas condiciones de cultivo, tienen entre 10 y 11%. No obstante el porcentaje de proteinas los trigos blancos y blandos están destinados a galletería y los duros a panaderia. La composición del grano es la siguiente: Almidón ----- 63-71% Humedad ---- 8-10% Azúcares ----- 2-3% Grasas -------- 1.2 –2% Minerales ----1.5-2% Las proteínas contenidas en el endospermo se denomina glutén, compuesta por gliadina y glutenina. En trigo el glutén tiene la propiedad de retener el CO2 producido por la levadura, siendo este principio básico de la panificación (expansión del CO2).



El azúcar principal es la sacarosa. El trigo contiene el complejo B de vitaminas, no posee vitaminas C y D, tiene alto contenido de vitamina E. En los trigos redondillos tiernos blandos o almidoneros domina el almidón, dando en la molienda mucho salvado (parte exterior del grano que constituye la mogolla de trigo), usándose con preferencia en la fabricación de galletas y pasteles. La fibra esta dividida entre fracciones mayores: Polisacáridos estructurales (de las paredes celulares) Celulosa: Es prácticamente un polímero lineal de unidades de glucosa unidas entre si por enlaces β 14. Es el principal componente estructural de las paredes celulares de las plantas. Se considera relativamente insoluble en agua. Algunos polímeros pueden contener 10.000 unidades de glucosa. Los enlaces hidrógeno entre polímeros paralelos forman microfibrillas fuertes. Estas microfibrillas de celulosa proveen la fuerza y rigidez requerida en paredes celulares de plantas primarias y secundarías. Hemicelulosas: Son un heterogéneo grupo de sustancias que contienen un número de azúcares en su columna vertebral y en los lados de la cadena Xilosa. mannosa y galactosa frecuentemente forman la estructura vertebral, mientras la arabinosa galactosa y ácidos urónicos están presentes en los lados de la cadena. La hemicelulosas por definición son solubles en álcalis diluidos, pero no en agua. El tamaño molecular y el grado de ramificación son también altamente variables Una molécula típica de hemicelulosa contiene entre 50 y 200 unidades de azúcar. Las hemicelulosas son polisacáridos matrices que se enlazan junto a las microfibrillas de celulosa y forman enlaces covalentes con la lignina. Pectinas: Son ricas en ácidos urónicos Son solubles en agua caliente y forman geles. La estructura esqueletal consiste de cadenas no ramificadas de enlaces 1 ,4 de ácido galacturónico. Los lados de la cadena pueden contener ramnosa arabinosa, xilosa y fucosa La solubilidad es reducida por metilación de los grupos carboxilos libres y por formación de complejos de calcio y magnesio. Las pectinas similares a la hemicelulosa son polisacáridos matrices en las paredes celulares. β -Glucanos: Son polímeros de glucosa que contienen ambos enlaces (β 1→3 y β 1→4) en varias proporciones, dependiendo de la fuente, la cual hace a la molécula menos lineal que la celulosa y más soluble en agua. Polisacáridos no estructurales(no celulósicos) Son probablemente los que están en mayor proporción en la mayoría de los alimentos que la celulosa o lignina. Frutas y verduras tienden a tener niveles más altos de celulosa que los cereales. Algunas frutas, en el cual la semilla es comestible tienen una proporción muy alta de lignina. La composición fibrosa de las plantas varía con la especie, la parte(esto es: raíz, tallo, hoja) y madurez. El contenido de celulosa y lignina por ejemplo, se incrementan significativamente con la madurez de la planta. De acuerdo a como varían las funciones dentro de la planta varía la composición química de cada fracción. Los polisacáridos no estructurales incluyen hidrocoloides tales como mucilago, gomas(asociadas con el endospermo y el espacio intercelular) y polisacáridos de algas. Los hidrocoloides son polisacáridos hidrofílicos que forman soluciones viscosas o dispersiones en agua fría o caliente. Las avenas y cebadas contienen mucílagos. Las gomas exudadas de plantas incluyen gomas arábigas, caraya, y tragacanto; mientras que los polisacáridos de algas incluyen agar, alginatos, y carragenina. Los polisacáridos de las paredes no celulares contienen una gran cantidad de azúcares neutros y ácidos uránicos. No polisacáridos estructurales(Lignina) La lignina es un polímero tridimensional, no-carbohidrato que consiste aproximadamente de 40 unidades de fenol con enlaces intramoleculares fuertes: La lignina es a menudo enlazada covalentemente a hemicelulosa. Contiene unidades de fenil propano derivadas de sipanil, coniferil y alcoholes p-coumarílicos. Son considerados muy inertes, insolubles y resistentes a la digestión. La fibra dietética puede ser determinada comúnmente por dos aproximaciones básicas: gravimétricamente o químicamente, aunque también se utiliza un procedimiento enzimático rápido(Olds, B 1986). En la primera aproximación los carbohidratos digeribles, lípidos y proteínas, son solubilizados selectivamente por químicos y/o enzimas. Los materiales indigeribles son recolectados por filtración y el residuo de fibra es cuantificado gravimétricamente. En la segunda aproximación, los carbohidratos digeribles son removidos por digestión enzimática, los componentes fibrosos son hidrolizados por ácido y los monosacáridos son medidos. La suma de los monosacáridos en el



hidrolizado ácido representa la fibra. El componente alimenticio que es más problemático en el análisis de fibra es el almidón. En ambas aproximaciones es necesario que todo el almidón sea removido para un estimado exacto de la fibra. Con la aproximación gravimétrica, la remoción incompleta de almidón incrementa el peso del residuo y abulta el estimado de la fibra. En la segunda aproximación, la glucosa en el hidrolizado ácido es considerada fibra. Por lo tanto, la glucosa que no es removida en los primeros pasos analíticos causa una sobre estimación de la fibra dietética. Existen enzimas específicas para hidrolizar cada uno de los enlaces del almidón (amilasa amiloglucosidasa y pululanasa) la cual hidrolizan los enlaces internos α -1,6 de las unidades de glucosa. Todos los métodos de fibra incluye un paso de calentamiento entre 80 y 130 oC por un tiempo aproximado que oscila entre 10 min. y 3 horas para hinchar y desintegrar los gránulos de almidón. Igual con la gelatinización algo de almidón escapa a la digestión (solubilización) e infla los valores de la fibra. Por ello es controvercial el hecho de que se considere el almidón resistente corno fibra. En la aproximación gravimétrica es esencial que todo el material digerible sea removido de la muestra, tal que solamente los polisacáridos indigeribles permanezcan o que el residuo indigerible sea corregido como contaminante digerible remanente. Los lípidos son fácilmente removidos de la muestra con solventes orgánicos y generalmente no poseen problemas analíticos para el análisis de fibra. Las proteínas y minerales que no son removidos de la muestra durante los pasos de solubilización podrían ser corregidos por el análisis de nitrógeno por Kjeldahl y por porciones incineradas del residuo fibroso. Métodos gravimétricos. Pueden ser usados para aislar varias fracciones las cuales son entonces cuantificadas por peso o diferencia en peso. Fibra cruda: Este método fue desarrollado en los años 1950 para determinar carbohidratos indiqeribles en alimentos para animales y la fibra en alimentos para humanos fue determinada como fibra cruda a partir de 1970. La fibra cruda es determinada por una digestión secuencial de la muestra con H2SO4 al 1,25% y después con NaOH al 1,25%. El residuo insoluble se obtiene por filtración, luego es secado y pesado. Allí se obtiene el peso de la fibra junto con el de los minerales. Para obtener el contenido de fibra es necesario incinerar esta muestra, donde se elimina la fibra por incineración, quedando solamente el residuo de las cenizas constituido por los minerales. Por diferencia entre el peso anterior (antes de la incineración) y el de las cenizas se obtiene el de la fibra cruda; la cual es_una medida del contenido de celulosa y lignina en la muestra, pero los hidrocoloides, hemicelulosas y pectinas son solubilizadas y no pueden ser detectadas. Métodos Detergente: Los métodos de fibra detergente ácida y fibra detergente neutral fueron adecuados y bien aceptados para hacer más exactos la estimación del contenido de lignina, celulosa y hemicelulosa en alimentos para animales; pero no se justifica su uso para determinar pectinas e hidrocoloides ya que estos constituyentes se encuentran en proporciones menores y aunque son importantes para la salud humana resultarían un método muy largo para analizar este tipo de alimentos.Fibra Total, Soluble e Insoluble: Con el conocimiento de que la fibra soluble e insoluble producen respuestas fisiológicas diferentes y que ambas son importantes para la salud humana, se propusieron una serie de métodos con pequeñas diferencias entre si. De todos hubo uno que fue el mas común y ampliamente aceptada por la Asociación de Químicos Analíticos Internacionales (AOAC 1990) el cual representa una combinación de las metodologías anteriores fibra cruda, fibra detergente y metodologías de Southgate (Suzanne. 1994). Todos los métodos corrientes usan una combinación de α amilasa estable al calor y amiloglucosidasa para digerir y remover el almidón de la muestra. Los procedimientos gravimétricos entonces digieren y remueven proteínas con una proteasa. El material remanente indigerible (fibra) es recolectada por filtración y luego pesada. El residuo fibroso es corregido por proteína residual y contaminación por las cenizas. Métodos químicos Método de Southgate: Southgate (1969 y 1976) fue el primero que cuantificó sistemáticamente la fibra dietética en un amplio rango de alimentos. La química de los carbohidratos usados por Southgate ha sido mejorada y modernizada pero su aproximación forma la fundación para que muchos sigan los métodos gravimétricos y químicos usados en la determinación de fibra.



El método fracciona la fibra en soluble e insoluble polisacáridos no celulósicos, celulosa y lignina. Esta última es determinada gravimétricamente y el contenido de polisacáridos es determinado de los constituyentes monosacáridos que son medidos colorimétricamente. Procedimiento Englyst-Cummings. Este es una versión modernizada del Southgate y una alternativa para el método AOAC. El almidón es gelatinizado y digerido enzimáticamente. Los polisacáridos remanentes diferentes al almidón son hidrolizados por ácido sulfúrico para liberar los monosacáridos. Los azúcares neutros son determinados por CG y los ácidos urónicos son determinados colorimétricamente. Un procedimiento alterno y rápido mide todos los monosacáridos por métodos colorimétricos. Los valores para la fibra total, soluble e insoluble pueden ser determinados por ambas aproximaciones. Con la CG la fibra puede ser dividida en celulosa y polisacáridos no celulósicos con valores para azúcares constituyentes. Aproximación de Theander-Marlett: Debido a que los procedimientos de Theander-Marlett son tan similares se decidió unirlos y por eso se conocen con ese nombre(Marlett, 1989; Marlett, 1990 y Theander and Westerland, 1986) El único aspecto de la aproximación usada por esos dos grupos de investigadores son: Extracción de azúcares libres de la muestra en los pasos analíticos iniciales y cuantificación directa de lignina. Ambos aspectos fueron parte del método de Southgate pero no son incluidos en otras metodologías corrientes de fibra. Los azúcares libres y lípidos son extraídos con etanol y hexano. El almidón es removido por digestión enzimática y la fibra insoluble es separada de la soluble. Las fracciones de fibra son hidrolizadas con ácido sulfúrico y el contenido de azúcar del hidrolizado ácido es determinado. La lignina es determinada gravimétricamente.

Fibra = monosacáridos – lignina Comparación de Métodos El método modificado de la AOAC el Englyst-Cummings y el Theander-Marlett son los más ampliamente usados para determinar fibra dietética. Esos tres métodos y otros muy similares dan resultados comparables del contenido de fibra para una amplia variedad de alimentos. En general el Englyst-Cummings da los valores de fibra más bajos porque la lignina y el almidón resistente no son incluidos como parte de la fibra en este método. Obviamente, los alimentos con una cantidad significante de almidón resistente tales como hojuelas de maíz y alimentos con una cantidad significante de lignina, tales como cereales, afrecho, los cuales mostrarán una desviación mayor. El método de la AOAC sobrestima la fibra si el alimento es rico en azúcares simples glucosa, fructosa y sucrosa), tales como en frutas secas y comidas compuestas. Es una hipótesis el hecho de que algunos azúcares simples son atrapados y precipitado con etanol si ellos no son extraídos a priori para análisis de fibra. Esto no parece ser un problema con el procedimiento Englyst-Cummings, posiblemente debido al pequeño tamaño relativo de la muestra y la gran cantidad de etanol usado para precipitar la fibra soluble. Con el tamaño de muestra pequeña ≤ 200 mg de materia seca en este procedimiento es imperativo que el alimento esté completamente homogéneo, tal que las submuestras puedan ser tomadas para análisis de fibra.Los procedimientos de la AOAC y del anterior incorporan una enzima proteolítica para digerir la proteína. La proteólisis permite que algo de la fibra sea solubilizada lo cual en efecto mueve algo de la fracción de fibra insoluble en la fracción soluble. Además, la proteólisis tiene el efecto general de reducir la cantidad de material medida como lignina. Los procedimientos de la AOAC incluyen almidón resistente como un componente de la fibra dietética. Productos cocidos, hojuelas y extruidos tendrán un valor en fibra significativamente alto si es determinado por el procedimiento de la AOAC que si son determinados por el Englyst-Cummings. El procedimiento rápido de este método requiere, al menos, una cantidad de tiempo, técnica y equipo especializado comparado a los otros comúnmente usados Overall, Englyst-Cummings y Theander-Marlett son más reproducibles que los del AOAC. ¿ Cuál método se puede utilizar para determinar fibra en un determinado momento?. Ello depende de:a.- La técnica disponible b.- El tiempo obligado para ello e.- Disponibilidad de CG o HPLC



d.- Importancia del conocimiento sobre el contenido de los constituyentes integrados por azúcar, celulosa, no celulósicos pectina o lignina.

Metodología• Se tomaron las muestras que se utilizaron en la práctica de determinación de estracto etéreo• Se colocaron en los beacker y se le agregó 200 ml de solución de H2SO4 que contenía 1,25 g

de H2SO4 disueltos en 100 ml de agua. • Los beacker se colocaron en las hornillas de calentamiento para proceder a la digestión. • Se sometió a la ebullición bajo reflujo. • Se tomó el tiempo cuando empezó a ebullir y se esperó 30 min exactamente. • Pasado este tiempo, se bajaron los beacker de las hornillas y se procedió a filtrar al vacío en

los erlenmeyer. • Los crisoles estaban recubiertos con fibra de vidrio, para recoger la muestra. • Se procedió a lavar con agua destilada para eliminar cualquier rastro de ácido. • Se tomó con una pinza la fibra de vidrio y la muestra contenida en los crisoles. • Se colocaron en unos beacker y se lavaron los crisoles con solución de NaOH, luego se

completaron 200 ml de solución. • Se colocaron en las hornillas y se dejó ebullir por 30 minutos. • Se procedió a filtrar al vacío con agua destilada hasta eliminar completamente el NaOH. • Los crisoles se colocaron en la estufa a 105oC por 16 horas. • Luego se pasó al desecador para llevarlo a temperatura ambiente y se peso. • Se reportaron resultados. • Posteriormente se incineró en la mufla durante 3 horas a 600oC, se enfrió y se peso.

• Se reportaron resultados. BibliografíaF.L. HART y H.D. FISHER, Análisis Moderno de los Alimentos. De la edición en lengua española, Editorial Acribia. Zaragoza (España). 1991. HAROLD, EGAN y Otros, Análisis Químico de Alimentos de Pearson. Primera Edición. Compañía Editorial Continental, S.A de CV. México. 1987. H.G. MULLER y GITOBIN, Nutrición y Ciencia de los Alimentos, Editorial Acribia, Zaragoza (España).

ANALISIS DE VITAMINAS Y MINERALESLas enfermedades carenciales nutritivas fueron reconocidas hace más de 200 años, sin embargo, no fue hasta principios de siglo cuando se aislaron las primeras vitaminas. En 1912 Casimir FunK aisló una fracción del arroz que curaba el beriberi y debido a que este factor tenía propiedades de amina lo llamó Vitamina que significa "amina vital". Aunque desde el siglo 17 ya se conocía el escorbuto, no fue hasta 1930 que se aisló por primera vez la vitamina C. Desde entonces, ciertas características de las vitaminas han complicado su determinación, entre ellas: i) las vitaminas no pertenecen a un grupo específico de compuestos, ii) generalmente son de estructura muy compleja, iii) son muy diferentes entre sí , iv)sustancias químicas diferentes pueden tener similar actividad vitamínica, v) se encuentran en los alimentos en cantidades muy pequeñas. A pesar de estas dificultades, son mucho los avances que se han hecho en este siglo en cuanto a la determinación de vitaminas se refiere. Hasta ahora, se han desarrollado al menos un método para la determinación de cada vitamina conocida. Estos métodos pueden clasificarse según sus fundamentos en : A) Métodos químicos: están basados en reacciones específicas de coloración o precipitación. Presentan el problema de que generalmente no son lo suficientemente específicos, pudiendo resultar también positivas para sustancias de estructura química similar pero sin actividad vitamínica. Sin embargo, algunos de estos métodos permiten la obtención de buenos resultados, tal es el caso de la técnica recomendada por la A.O.A.C. para la determinación de la vitamina C en frutas cítricas. Por lo general estos métodos son rápidos y económicos.B) Métodos Físicos: Basados en la medición directa de una propiedad óptica de lasolución problema sin previa adición de reactivos químicos. Pertenece a este grupo el método espectofotométrico de determinación de Vitamina A, basado en la



medición directa de la absorvancia que se presentan sus soluciones (carentes de otras sustancias interferentes) a la luz ultravioleta de 328 milimicras.C) Métodos Fisico-Químicos: se fundamentan en la medición de una propiedad física de la solución problema que se desarrolla previo tratamiento con reactivos químicos específicos. Dentro de este grupo se destaca el método fluorométrico de Jansen para la determinación de tiamina, y los métodos fotocolorimétricos de dosaje de las vitaminas A, B6 y C. Generalmente implican métodos de extracción laboriosos y consumidores de tiempo. También pertenecen a este grupo los métodos de determinación por cromatografía.D) Métodos Biológicos: se hacen midiendo la acción fisiológica de la vitamina en animales de experimentación reactivos, en los cuales, o bien se provoca una carencia vitamínica experimental, o bien se estudian detenidamente los efectos curativos del material que se valora, en animales que presentan el cuadro clínico de avitaminosis. Poseen la gran ventaja que permiten medir únicamente las moléculas de estricta acción fisiológica o farmacológica. Algunos ejemplos son las dosificaciones de Vitaminas A y D.E) Métodos Microbiológicos: Se basan en el siguiente fundamento: si un microorganismo no puede sintetizar una vitamina que le es esencial, presenta una necesidad absoluta de dicho factor para su crecimiento, el cual será proporcional, dentro de ciertos límites, ala cantidad de la vitamina que se introduzca en su medio de cultivo. El crecimiento se determina mediante la medición de la turbidez del cultivo (Nefelometría) y la valoración química de la cantidad de ácido producida por el microorganismo que es proporcional al desarrollo bacteriano. Estos métodos son laboriosos, consumidores de tiempo y lo que es más importantes, los resultados dependen muy significativamente de la experiencia y habilidad del analista. Entre los avances mas novedosos se encuentran los métodos fisicoquímicos de determinación de vitaminas por cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC).Estos métodos desarrollados en su mayoría a partir de la década de los setenta, cuando se basaban principalmente en la lectura de la fluorescencia producida por el tiocromo derivado de la tiamina, o de la riboflavina como tal, previa extracción de las mismas a partir de muestras molidas digeridas con ácidos y enzimas. Esta enzimas podían ser takadiastasa ( la cual defosforilaba las vitaminas para convertirlas en sus formas libres) y pepsina, para desnaturalizar las matrices proteicas y liberar así las vitaminas. Posteriormente fueron desarrollados métodos que permitían determinar mas de una vitamina hidrosoluble con un sólo método de extracción y en un solo cromatograma, como el desarrollado por Agostini y Godoy en 1997. En cuanto a las vitaminas liposolubles, su solubilidad en los lípidos requiere de métodos de extracción con solventes no polares como éter de petróleo previa saponificación de las grasas con KOH. La materia no saponificable puede ser concentrada o usada directamente para inyección en el equipo de HPLC dotado con detectores UV. Los recientes avances han permitido desarrollar métodos para determinar con un solo tratamiento las vitaminas A, D y E simultáneamente y en un período breve de tiempo. Se hace importante entonces reconocer la utilidad y pertinencia de estos métodos según vayan destinados a la investigación, control de calidad, caracterización bromatológica u otras utilidades.BibliografíaF.L. HART y H.D. FISHER, Análisis Moderno de los Alimentos. De la edición en lengua española, Editorial Acribia. Zaragoza (España). 1991. HAROLD, EGAN y Otros, Análisis Químico de Alimentos de Pearson. Primera Edición. Compañía Editorial Continental, S.A de CV. México. 1987. H.G. MULLER y GITOBIN, Nutrición y Ciencia de los Alimentos, Editorial Acribia, Zaragoza (España).

Análisis del contenido aminoacídico de los alimentos con fines nutricionales

1. Introducción.Los aminoácidos, péptidos y proteínas son componentes importantes de los alimentos. Por un lado proporcionan los elementos necesarios para la síntesis proteica. Por otro lado, los aminoácidos y péptidos contribuyen directamente al sabor de los alimentos y son precursores de los componentes aromáticos y las sustancias coloreadas que se forman mediante las reacciones térmicas y/o enzimáticas que ocurren durante la obtención, preparación y almacenamiento de los mismos.



Aminoácido. Los aminoácidos son ácidos carboxílicos que contienen un grupo amino. Existen unos cien en la naturaleza. En el hidrolizado total de las proteínas existen veinte aminoácidos que tienen, con algunas excepciones, la fórmula general siguiente:R-CH-COOHNH2

En el caso más sencillo, el radical R es un átomo de Hidrógeno (ácidoaminoacético o glicina), en los demás aminoácidos R es un resto alifático, aromático o heterocíclico, que puede ser portador de otros grupos funcionales.Existen diez aminoácidos, denominados aminoácidos esenciales, que el organismo es incapaz de sintetizar y que deben ser aportados por la alimentación. El organismo no los puede sintetizar porque carece del mecanismo necesario para elaborar los cetoácidos correspondientes; se ha comprobado que si se le suministran éstos y sales de amonio es capaz de elaborarlos.Los aminoácidos constituyentes de las proteínas son, aproximadamente, veinte: alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutámico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina y valina.iminoácidos, Todos ellos son aminoácidos excepto dos, que son la prolina y la hidroxiprolina, que también pueden considerarse como aminoácidos por su similitud estructural. Se les llama aminoácidos porque el grupo amino está unido al carbono de la cadena que es, por convenio, el átomo de carbono adyacente al grupo carboxilo.Los aminoácidos contienen tantos grupos ácidos como básicos, por lo que tienen propiedades ácidas y básicas débiles y se les llama anfolitos. Se comportan como anfipróticos porque pueden aceptar o donar electrones. Las moléculas de aminoácidos transportan una carga negativa y otra positiva, lo que da como resultado una carga total nula, esta forma se conoce como "zwitterion" del aminoácido. La carga total transportada por un aminoácido depende del pH de la solución y de los valores de la constante de acidez de los grupos ionizables presentes. Si el pH es mucho mayor que el valor de la constante de un grupo, se libera un protón y la molécula tendrá una carga negativa, pero si el pH es menor, tendrá carga positiva. El hecho de que a diferentes valores de pH el aminoácido tenga distintas formas y lleve distintas cargas netas se utiliza en muchos métodos analíticos, como en la electroforesis y en la cromatografía de intercambio iónico. El punto iso-iónico de una molécula es el pH en el que el número de cargas negativas debidas a los protones perdidos es igual al número de cargas positivas debidas a los protones ganados, entonces predomina la forma zwitteriónica. El punto isoeléctrico es el pH en el que las moléculas no presentan migración en un campo eléctrico y puede determinarse experimentalmente por electroforesis; en los aminoácidos es igual que el puntoiso-iónico.Un aspecto importante en el análisis de los aminoácidos es el hecho de que no se pueden detectar en el visible-UV. Existen varios reactivos que reaccionan con los aminoácidos dando compuestos coloreados o fluorescentes y que, por tanto, pueden utilizarse para análisis cualitativos o cuantitativos. Esto es lo que se denomina derivatización de los aminoácidos. Los métodos fluorimétricos tienen muchas ventajas respecto a la espectrofotometría para el análisis de aminoácidos.Necesidades proteicas. Se requiere un criterio para fijar las necesidades o exigencias en proteínas para el ser humano. Por ello se establece una "proteína de referencia" o "patrón".Conocida la composición en aminoácidos de las proteínas de los distintos alimentos que se consumen y cuales han demostrado poseer mayor valor biológico, a saber: la de la leche, la del huevo y las de la carne; y teniendo en cuenta la composición cuali-cuantitativa en aminoácidos, se ha adoptado dicha "proteína de referencia" o "patrón".En la calidad de las proteínas influye el contenido en aminoácidos esenciales, y es importante la presencia de "limitantes". En efecto,se llama así al aminoácido esencial que en una proteína dada se encuentra en cantidad relativa más baja con respecto a la proteína patrón porque limita el aprovechamiento de esa proteína a los fines biológicos.Es importante determinar el contenido en aminoácidos, en conjunto, para estimar el grado de proteólisis enzimática que ha sufrido el producto, así como la proporción de cada uno de ellos, como componentes de la proteína, cuando se desea establecer su valor biológico.La determinación de aminoácidos en alimentos permite extraer algunas conclusiones acerca de su composición; por ejemplo, la gelatina usada como espesante se diferencia rápida y sencillamente, de otros hidrocoloides (grasas vegetales, almidón, etc.), en función de su composición aminoacídica.



Objetivos.En primer lugar recogemos los distintos métodos oficiales y estándares para el análisis de aminoácidos en alimentos, encontrados en Métodos Oficiales de Análisis editados por el Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación (1986) y en Methods of Analysis of AOAC (1995), así como algunos métodos recomendados.Posteriormente, en la discusión, tratamos sobre las distintas técnicas de separación (cromatográficas y electroforesis), del analizador automático de aminoácidos, de los distintos reactivos derivatizantes y el tipo de detección apropiada para cada uno, y las ventajas y desventajas de la derivatización, tanto antes (precolumna) como después (postcolumna) de la separación.

2. Métodos de análisis de aminoácidos en alimentos.Métodos oficiales.Determinación de prolina en miel.Reacción de la prolina con ninhidrina en medio ácido y posterior determinacióna 517 nm de la absorbancia del compuesto formado.Preparación de la muestra: Suponiendo que la miel ya ha sido separada del panelpor escurrimiento a través de un filtro de luz de malla, optaremos por realizarel siguiente paso, la homogeneización. Reblandecer la muestra calentando entre25-30ºC agitándola al mismo tiempo. Una vez homogeneizada se calienta a 50ºCal baño María hasta que se consiga la fusión y se deja enfriar rápidamente.Determinación de hidroxiprolina en carnes.Previa hidrólisis en medio ácido de las proteínas y oxidación de lahidroxiprolina. El derivado formado con el p-dimetilaminobenzaldehido se valoracolorimétricamente a 560 nm..Preparación de la muestra: Primero, se quitan las diferentes capas protectorasdel producto para poder tomar una muestra representativa. Se parten trozos de0,5 - 1 cm y se cortan dichos trozos en pequeños cubos. Después se pasan poruna trituradora varias veces hasta conseguir una mezcla homogénea. Se guarda enfrascos limpios y secos para prevenir la pérdida de humedad. Se conserva enrefrigeración de forma que evite su deterioro y cualquier cambio en sucomposición.Métodos estándares.Determinación de prolina en miel.Determinación de hidroxiprolina en carnes.Determinación de aminoácidos en preparados vitamínicos.Determinación de lisina en suplementos nutricionales.Los grupos amino de las proteínas reaccionan con DNFB dando lugar a losderivados lisina-DNFB. Posteriormente se produce una hidrólisis ácida y ladeterminación en un analizador de aminoácidos de la lisina.Determinación de triptófano en alimentos.La muestra es hidrolizada en medio básico, seguidamente se realiza un ajuste depH. El triptófano es separado por cromatografía líquida de intercambio iónicoy determinado por un detector UV a 280 nm.Determinación de aminoácidos sulfurados en alimentos (metionina y cisteína).En primer lugar las proteínas son oxidadas con ácido perfórmico paraconseguir ácido cisteico y metionina sulfonada, luego se realiza una hidrólisisácida con HCl. Realizamos una cromatografía de intercambio iónico aplicándoleun detector que sea capaz de medir a 570 nm.Métodos recomendados.Análisis de aminoácidos por HPLC seguido del método del fenilisotiocianato.(Lab. Enzymology and Physical Chemistry of Proteins).A continuación, incluimos un protocolo típico del análisis de aminoácidos enharinas:

- Dejar a reflujo la muestra con HCl 6N durante 24 horas. Evaporar a sequedad en evaporador rotatorio.- Añadir agua y evaporar a sequedad.- Realizar el examen cromatográfico de una solución problema al 10% de lamuestra tratada en solución acuosa de isopropanol a 10%.- El sistema solvente: n-butanol/Hac/H2O en proporción 12:3:5.- Soporte papel Whatman nº1.



- Longitud del papel 50 cm.- Método cromatográfico descendente.- Duración: 12 horas.- Solución reveladora: solución acetónica de ninhidrina al 0.25%.- Condiciones de revelado: 20 min a 105ºC.- Comparación frente a muestras puras de clorhidratos de aminoácidos.

3. Técnicas de separación de aminoácidos.A menudo es necesario identificar y cuantificar los aminoácidos individualesde una mezcla, tanto en estudios metabólicos como en las investigaciones de laestructura de las proteínas.El uso de la cromatografía en capa fina o de la electroforesis son adecuadospara averiguar el número y la cantidad relativa de los diferentes aminoácidospresentes en una muestra (análisis cualitativo), aunque para los análisiscuantitativos es necesaria la cromatografía de gases o un analizador de aminoácidos.

Cromatografía en capa fina.Una importante aplicación de la cromatografía en capa fina es la de servir como guía para el desarrollo de las condiciones óptimas para realizar separaciones por cromatografía de líquidos en columna. Proporciona una idea rápidade los aminoácido mayoritarios existentes en la muestra. Las ventajas de este procedimiento son la rapidez y el bajo coste de los ensayos experimentales.De hecho, algunos cromatografistas son de la opinión de que los ensayos en capa fina deberían preceder siempre al uso de la columnaEn la cromatografía de papel se pueden aplicar grandes volúmenes de muestra, lo que permite la elución posterior de un aminoácido en particular para su posterior purificación y análisis, factor que tiene gran importancia en la identificación de un constituyente desconocido de la muestra.Antes de la realizar la cromatografía, es necesario eliminar las sustancias que interfieren, tales como proteínas, carbohidratos y sales, lo que puede hacerse con una resina de intercambio iónico. Los aminoácidos retenidos pueden eluirse a continuación añadiendo a la columna un pequeño volumen de amoniaco y lavando después con agua destilada.La separación de los aminoácidos se basa en que éstos se reparten de modo diferencial entre la fase móvil y la fase estacionaria. Generalmente se realizan por el procedimiento ascendente:introduciendo el borde inferior de la placa cromatográfica en el eluyente que será succionado por acción de las fuerzas capilares del recubrimiento de la superficie del la placa.La identificación de un aminoácido se realiza comparando los valores de Rf(factor de retraso: cociente entre la distancia recorrida por el compuesto desde el origen y la distancia recorrida por el solvente desde el origen), con otros tomados como referencia, debiéndose utilizar al menos tres sistemas de disolventes distintos para establecer su identidad con un cierto grado de seguridad.La naturaleza de los aminoácidos es un factor importante a la hora de elegir un disolvente, ya que los diferentes solventes pueden permitir una mejor resolución de los componentes ácidos, básicos o neutros. En general, aumentando la proporción de agua en el disolvente se incrementan todos los valores de Rf e introduciendo pequeñas cantidades de amoniaco aumentan los valores del factor de retraso de los aminoácidos básicos. Algunos disolventes contienen compuestos nocivos, por ejemplo el fenol, lo que restringesu uso rutinario. La composición química del disolvente puede también limitarel rango de reactivos de localización que pueden aplicarse satisfactoriamente. Por ejemplo, el ácido sulfanílico no puede utilizarse con disolventes fenólicos.El poder de resolución de la cromatografía de capa fina puede aumentarse empleando técnicas bidimensionales, o sea, utilizando dos disolventes distintos. Se aplica una cantidad de muestra mayor que la utilizada generalmente para la separación cromatográfica de una dimensión (aproximadamente el triple) en una esquina del papel o placa y se hace correr en una dimensión. Entonces el cromatograma se seca completamente al aire, se gira un ángulo de 90º y se desarrolla con el segundo solvente. Tras un nuevo secado, se sumerge en el reactivo de localización elegido. En la cromatografía de dos dimensiones, la composición de los dos disolventes es la que determina el orden en que debe utilizarse.Las separaciones bidimensionales permiten la resolución de un gran número de aminoácidos presentes en una muestra, ya que los que tienen una movilidad similar en la primera dimensión se



separan en la segunda. Ésto es muy útil en la detección de los componentes que están en muy baja concentración y pueden quedar enmascarados por otros compuestos que tengan una concentración alta cuando se utiliza la cromatografía en una dimensión.

Electroforesis.La electroforesis es un proceso en el cual las especies cargadas (iones o partículas coloidales) se separan en función de su distinta velocidad de migración en un campo eléctrico. Desde los años cincuenta, las separaciones electroforéticas fueron la piedra angular de gran parte de la investigación de químicos y biólogos moleculares relacionada con la separación y análisis de proteínas, polinucleótidos y otros biopolímeros. Estas separaciones han sido (y continúan siendo) muy eficientes y de una extensa aplicación, pero por desgracia, son unas técnicas muy lentas y laboriosas que tienen tendencia a ser poco reproducibles.A mediados de los ochenta, esta situación cambió espectacularmente con la aparición de aparatos comerciales para realizar electroforesis analíticas a microescala en columnas capilares (electroforesis capilar).El hecho de que los distintos aminoácidos transporten diferentes cargas netas aun pH particular, permite separarlos de una mezcla mediante la electroforesis de alto o bajo voltaje. Los medios utilizados más frecuentes como soporte son elpapel o las placas de capa fina (celulosa o gel de sílice), pudiéndose utilizar para visualizar las manchas, los reactivos de localización que describiremos más adelante. Las separaciones se pueden realizar más fácilmente con alto que con bajo voltaje, siendo una de las principales ventajas de la primera, el que las sales y otras sustancias presentes en la muestra afectan en menor extensión la calidad del electroforetograma.A pesar de que se pueden conseguir separaciones electroforéticas con tampones a distintos pH, en la práctica los valores de pH escogidos están entre 2 y5’3. A pH 2 todos los aminoácidos tienen carga positiva y los de tipo básico que tienen la mayor carga positiva migran más rápidamente hacia el cátodo, mientras, que a pH 5 los aminoácidos se dirigen hacia ambos electrodos, dependiendo de la carga transportada. Las separaciones a pH 5’3 se utilizan para determinar la naturaleza ácida o básica de un aminoácido desconocido.Cromatografía de gases.Se han hecho muchos ensayos para aprovechar la velocidad y sensibilidad que ofrece la cromatografía de gases, pero aunque se han realizado considerables progresos en el desarrollo de tales métodos, aún no se utiliza de forma rutinaria para el análisis de aminoácidos en muestras biológicas. La razón de ésto radica en el hecho de que los aminoácidos, aunque similares, son compuestos químicamente heterogéneos y además no son suficientemente volátiles a menos que se conviertan en algún derivado apropiado. Aparecen dificultades no sólo a la hora de elegir el método de obtención de tales derivados, sino también en la selección de una fase estacionaria que sea capaz de resolver los derivados de todos los elementos de un grupo tan diverso de compuestos. A la hora de elegir el detector aparecen también problemas similares.Analizador automático de aminoácidos - HPLC.Existen dos técnicas para la determinación de aminoácidos a través de cromatografía líquida: cromatografía de reparto en fase reversa y cromatografía de intercambio iónico.La cromatografía de líquidos de alta resolución es la técnica de separación más ampliamente utilizada. Las razones más importantes son su sensibilidad, su fácil adaptación a las determinaciones cuantitativas exactas, su idoneidad para la separación de especies no volátiles o termolábiles y, sobre todo, surja aplicabilidad a sustancias que son de primordial interés en la industria, en muchos campos de la ciencia y para la sociedad en general. Algunos ejemplos de estos materiales incluyen los aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos y otros.Cromatografía de reparto en fase reversa.La cromatografía en fase reversa consiste en un disolvente fundamentalmente polar como fase móvil y una cadena hidrocarbonada ligada como fase estacionaria. Algunas de las ventajas más sustanciales de esta alternativa son su gran reproducibilidad, tiempos de retención cortos, velocidad de muestreo alta, sistema cromatográfico simple y amplio campo de aplicación. Por todoello, las aplicaciones son cada vez más numerosas.La selectividad se basa en las interacciones específicas entre el soluto y la fase móvil, ya sea de tipo polar, de formación de puentes de hidrógeno o mediante equilibrios secundarios provocados al variar



la composición de la fase móvil (ácido-base, formación de complejos o pares iónicos, adición de complejos metal-ligando o reactivos quirales para separar los isómeros ópticos, etc.).Cromatografía de intercambio iónico.La cromatografía iónica está relacionada con los métodos modernos y eficaces para la determinación de iones que se basan en el uso de resinas de intercambio iónico.Existen métodos automatizados para la separación y detección de aminoácidos y otras especies iónicas en mezclas complejas. El desarrollo de la HPLC moderna empezó a finales de los años sesenta, pero su aplicación a la separación por intercambio iónico se retraso debido a la inexistencia de un método general y sensible para la detección de especies como los cationes alcalinos y alcalinotérreos,y aniones como los haluros, acetato y nitrato. Esta situación se remedió en1975 al desarrollarse por técnicos de Dow Chemical Company la técnica de supresión del efluente, la cual hace posible la detección conductimétrica de los iones eluídos. El analizador de aminoácidos, con el que se lleva a cabo la cuantización de los aminoácidos se basa en esta técnica.Analizador automático de aminoácidos. La separación de aminoácidos fue el primer proceso cromatográfico automatizado con derivatización post-columna. La separación fue llevada a cabo por Moore, Spackman y Stein (1958), mediante un intercambio iónico, seguido de su cuantización de cada componente eluido de la columna por reacción con ninhidrina y posterior detección en el visible. Este método se ha realizado durante más de treinta años, en cualquier laboratorio de proteínas.El equipo usado actualmente se basa en el original pero introduciendo algunas modificaciones para conseguir un mejor grado de eficacia. Consiste en bombear tampones de pH o de fuerza iónica variables, a través de una columna termostatizada. Entre las novedades está la fabricación de resinas de alta calidad, desarrollo del HPLC, sistemas de automatización sofisticados y un aumento en la sensibilidad de los métodos de detección.La separación tiene lugar en una columna de resina de poliestireno sulfonado. Inicialmente el pH de la fase móvil es bajo, por lo que los aminoácidos cargados positivamente se verán atraidos por los grupos sulfurosos ( SO3

-). Conforme se va aumentando el pH del támpon los aminoácidos se eluyen diferencialmente al disminuir su carga positiva y ser menos atraidos por el anión. A pH 3.5 los aminoácidos con un grupo ácido extra, de su cadena tendrán muy poca afinidad por la resina y serán los primeros en salir de la columna, mientras que los que tengan un grupo extra ionizable capaz de transportar una carga positiva (e.g. lisina, histidina) serán retenidos fuertemente por la resina y se eluirán sólo cuando el pH haya aumentado sustancialmente y se haya reducido su carga neta positiva.Además del pH también hay que considerar la concentración del tampón eluyente, pues influye en la elución de tal modo que cuando la concentración de ion aumenta en mismo, los aminoácidos se eluyen más rápidamente.Las interacciones no iónicas entre los aminoácidos y la resina también influyen en la secuencia de elución, permitiendo que algunos aminoácidos que tienen un comportamiento similar se eluyan de forma separada.La resolución cuantitativa de mezclas de aminoácidos se consigue variando la composición del támpon, bien incrementando del pH y manteniendo constante la concentración, o viceversa, o incluso variando ambos. Hay otros factores menos significativos en la calidad de la separación como son la temperatura, la velocidad de flujo del tampón o el tipo de catión utilizado.Aspectos prácticos del analizador:

Columna: en los analizadores tipo se usan dos columnas, una para separar los aminoácidos ácidos y neutros y otra para los básicos. Las de vidrio o acero inoxidable dan picos estrechos y altos, mejorando la separación de aminoácido similares.Solución tampón: suele ser citrato sódico o de litio, al que se le añade un detergente, un antioxidante y un conservante. Actualmente se utilizan dos disoluciones tampón, una ácida y otra básica. Se mezclan en proporciones variables para conseguir un aumento de pH. De esta forma se mejora la separación disminuyendo el tiempo de análisis y se eliminan las fluctuaciones bruscas dela linea base debidas a cambios repentinos en el tampón, como sucedia con anteriores técnicas.Temperatura: puede ser constante para evitar cambios en el pH y en la ionización de los aminoácidos, o bien puede utilizarse un programa de temperaturas que implica un cambio de ésta en diversos momentos del proceso.



Flujo de la columna: se requiere un flujo de tampón constante para permitir la reproducibilidad. Se consigue por uso de bombas de presión o de desplazamiento constante.Detección: es necesaria una segunda bomba para el reactivo derivatizante (generalmente ninhidrina) que se ha de mezclar con el eluyente de la columna. Cuando la reacción ha tenido lugar, la corriente se controla en una célula de flujo de un colorímetro o un fluorímetro. Se mide la absorbancia continuamente a 570 y 440 nm. para detectar los amino e iminoácidos respectivamente.El análisis aminoacídico es un buen ejemplo del hecho de que raramente hay un único sistema de separación para problemas analíticos, sino que de la elección del sistema apropiado depende el problema analítico. Por ejemplo, de la matriz en la cual los aminoácidos van a ser determinados, de la sensibilidad deseada yen la velocidad requerida para el análisis.Los actuales métodos de detección para aminoácidos dependen de la reacción del grupo amino primario del aminoácido para formar un derivado coloreado o fluorescente, esta derivatización tiene lugar tanto antes como después de que la separación de los aminoácidos haya sido efectuada. La menor variedad de tipos de aminoácidos en comparación con las estructuras de los péptidos hace que los modos de HPLC disponibles para el investigador sean la cromatografía de intercambio catiónico (CEC), y la cromatografía de fase reversa (RPC). La cromatografía en fase reversa es más apropiada para la separación de derivados aminoacídicos que para aminoácidos libres.La elección de HPLC está limitada por la elección del agente de derivatización y/o la decisión de usar tanto pre- como post-columna de derivatización, de hecho, algunos de los más interesantes descubrimientos llevados a cabo en la separación de aminoácidos por HPLC reside en el desarrollo y optimización de nuevos agentes de derivatización. Reacciones muy rápidas como la derivatización con fluorescamina y ortoftaldehido (OPA) están siendo empleadas en aumento con el clásico método de la ninhidrina.4. Reactivos de derivatización.El problema de la derivatización de aminoácidos está concentrado en la detección selectiva y sensible de los mismos. Las cantidades de muestra disponibles son muy pequeñas, ya sean proteínas cuya estructura vaya a ser determinada o muestras de investigaciones en el campo de la ciencia alimenticia, de modo que la reacción de derivatización debería permitir la detección en el rango del pmol.La derivatización puede ser llevada a cabo antes de la separación. Debería ocurrir cuantitativamente para producir productos sencillos para cada aminoácido, el reactivo no debería interferir. Es probable que la derivatización genere productos que son más parecidos el uno al otro, de cualquier modo, la altaselectividad de separación de los sistemas cromatográficos implica que raramente haya problemas. La derivatización precolumna puede ser llevada a cabo automáticamente inmediatamente antes de la separación.La derivatización tras la separación requiere, en general, una complejidad instrumental mayor. Los instrumentos comerciales a menudo necesitan ser optimizados para alcanzar sensibilidad de detección más alta.Ninhidrina.La ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) reacciona con los aminoácidos en medio ácido (pH entre 3 y 4) y en caliente produciendo amoniaco, dióxido decarbono y un complejo de color púrpura azulado. Todos los aminoácidosprimarios forman el mismo complejo tras su reacción con ninhidrina, haciendo este agente inapropiado para la precolumna de derivatización. La mayoría de columnas de HPLC de intercambio catiónico utilizadas para el análisis de aminoácidos con postcolumna basada en la ninhidrina todavía emplean resinas de sulfonato de poliestireno / divinilbenceno.Los primeros sistemas automáticos para el análisis de aminoácidos descritos en 1958 basados en la separación de aminoácidos por cromatografía de intercambio catiónico y posterior reacción con ninhidrina, permanecen hoy día como la metodología más fiable para el análisis de aminoácidos en péptidos y proteínas. Analizadores comerciales basados en esa metodología están disponibles en compañías como Beckman y Pharmacia. A altas temperaturas (>=100ºC), todos los aminoácidos primarios reaccionan con dos moléculas de ninhidrina para formar un cromóforo (púrpura de Ruthermann) con máxima absorción a 570 nm.En la cuantificación de los aminoácidos individuales puede utilizarse el coeficiente de absorción molar del compuesto coloreado, aunque su valor varía de un aminoácido a otro y debe determinarse para las



condiciones particulares del análisis. Sin embargo, se debe escoger un valor de referencia para utilizarlo en la cuantificación de los aminoácidos totales de una mezcla.La reacción coloreada de la ninhidrina se utiliza en trabajos analíticos, así como en la visualización de las bandas de los aminoácidos después de su separación por electroforesis o por cromatografía. El reactivo que se utiliza en estas circunstancias se prepara generalmente disuelto en etanol; cuando se añade2,4-6colidina, las diferencias de color entre cada mancha ayudan a la identificación de los distintos aminoácidos.OFtaldehido (OPA).El OPA fue originalmente introducido como un reactivo alternativo a la ninhidrina en la post columna de derivatización y suministró un significante incremento en la sensibilidad. Los aminoácidos reaccionan con el OPA en presencia de un reductor fuerte, en condiciones alcalinas (pH 9-11), dando un compuesto fluorescente. La separación en fase reversa seguida de detección fluorescente constituye un método de detección rápido, sensible y selectivo para todos los aminoácidos con grupos amino primario. Los péptidos son menos reactivos que los -aminoácidos y las aminas secundarias no reaccionan.Aunque el OPA fue originalmente aplicado solamente para post columnas de derivatización ahora está ampliamente usado como un agente para pre columnas. Mientras que la separación de aminoácidos siguiente a una pre columna de derivatización está llevada a cabo por cromatografía de fase reversa, ambas, cromatografía de fase reversa y cromatografía de intercambio catiónico pueden ser utilizadas cuando el OPA es el agente de derivatización en la postcolumna.Una desventaja del OPA reside en la relativa inestabilidad de sus derivados, quizás añadida a los problemas de cuantización, aunque ésto no es de gran dificultad en la técnica de derivatización en postcolumna. Sin embargo, en precolumna y desde el punto más bajo de pH 7’2 hasta un pH típico de reacciónde 9’5, los productos deben ser inmediatamente aplicados a un sistema cromatográfico. Bajando estos dos pH se amortigua la reacción y sirve para estabilizar ligeramente los productos de reacción. La mayor desventaja del OPA es que no reacciona con aminas secundarias (prolina e hidroxiprolina) aunque esto puede ser solventado con su oxidación por cloramina-T o hipoclorito. Una estratégica combinación del uso de OPA con FMOC (9-fluorenilmetil cloroformato) ha sido recientemente introducida para solucionar esta deficiencia.El método con OPA se utiliza específicamente con precolumna de derivatización para el análisis de aminoácidos porque es más sensible y tarda menos tiempo que otros métodos HPLC.Fluorescamina.La fluorescamina fue también introducida como una posible alternativa a la ninhidrina en postcolumnas de derivatización. Todas las aminas primarias reaccionan con la fluorescamina en medio básico (pH 9-11) dando un producto fluorescente con un incremento en sensibilidad de detección mayor que la ninhidrina, aunque la fluorescamina por si misma no tiene fluorescencia. El producto fluorescente es inestable en disolución acuosa y el reactivo debe prepararse en acetona. Las aminas secundarias no reaccionan, a menos que se conviertan previamente en aminas primarias, lo que puede hacerse con N-clorosuccinimida, hipoclorito o cloramina-T. Aunque el reactivo tiene interés por su rápida velocidad de reacción con los aminoácidos a temperatura ambiente, la reacción no es tan sensible como la de la ninhidrina.Isotiocianato de fenilo (PITC).El PITC, también conocido como reactivo de Edman, ha sido largamente usado para la secuenciación de polipéptidos y proteínas y fue introducido para el análisis de aminoácidos al principio de los años ochenta. Es actualmente, el agente más usado para pre columnas de derivatización, seguido de cromatografía en fase reversa, en análisis de aminoácidos, siendo empleado para mezclas de aminoácidos de una gran variedad de fuentes.En lugar de ser analizados como derivados de PTH (feniltiohidantoin), como ocurre durante la secuenciación de péptido o proteínas, los aminoácidos son analizados como derivados de PTC (feniltiocarbamol). Así, a pH alcalino, los aminoácidos primarios y secundarios producen derivados de PTC, que pueden ser registrados por absorbancia UV (240-255 nm) con un límite de detección en el rango de 5 a 50 pmol. Todos los aminoácidos forman derivados mono-PTC, exceptolisina y cisteína, que producen dobles formas PTC. Los productos son relativamente estables, aunque alguna conversión al derivado PTH puede ocurrir si el pH no se controla adecuadamente.Aunque la metodología PITC puede ser considerada superior al resto de las técnicas en un gran



número de aspectos, tiene una mayor desventaja en que algunos derivados PTC de aminoácidos son fuertemente afectados por la presencia de algunas sales, cationes divalentes, metales e iones tampon. Así, mientras el acetato amónico, el cloruro sódico y el borato sódico se ha encontrado que no tienen efecto en aminoácidos PTC, otras sales, como el fosfato de sodio y el bicarbonato de sodio si que lo tienen. Además la contaminación por trazas de iones metálicos se ha encontrado que reduce la formación de aminoácidos PTC. Incluso añadiendo EDTA se han conseguido mejores rendimientos para la derivatización.Cloruro de dansilo y cloruro de dabsilo.El cloruro de dansilo (cloruro de 1-dimetil amino naftaleno-5-sulfonilo) fue inicialmente introducido para el análisis del nitrógeno terminal de los aminoácidos en péptidos y proteínas, un propósito para el cual todavía es empleado. Reacciona con aminas primarias y secundarias para producir derivados fluorescentes. Su aplicación adolece de la presencia de numerosos productos laterales y de la formación de múltiples derivados de ciertos aminoácidos. Además de ésto está el requerimiento de un largo tiempo de reacción. Así, aunque el cloruro de dansilo es frecuentemente empleado por lo investigadores para la derivatización en precolumna seguida de cromatografía en fase reversa, este método nunca ha sido ampliamente aceptado para el análisis automático de aminoácidos.El cloruro de dabsilo (cloruro de dimetil amino azobenceno sulfonilo) es un agente muy relacionado con el cloruro de dansilo. Fue introducido y desarrolla por Chang y sus colaboradores, para la detección de aminoácidos en el rango del visible y en el nivel del pmol. Reacciona con aminoácidos primarios y secundarios para producir derivados que tienen una gran absorbancia en el rango del visible. La reacción se realiza a unos 70ºC y un pH de 8 a 8’5,produciendo derivados altamente estables en 10 o 12 minutos. Se forman mono y bis-derivados de lisina, tirosina e histidina.A pesar de las ventajas sobre el cloruro de dansilo como agente de derivatización, la técnica del cloruro de dabsilo tiene una tolerancia limitada a la presencia de sales, y aun no está clara cómo se vería afectada la detección a altos niveles de sensibilidad (rango del 10 al 20 pmol) por la presencia de metales, sales y otros contaminantes.Aunque no se usa ampliamente en análisis automáticos de aminoácidos como la ninhidrina, el OPA y el PITC, una adaptación comercial del método del clorurode dabsilo está disponible en Beckman Instruments.Cloruro de 9-Fluoroenilmetil cloroformato (FMOC-Cl).El FMOC-Cl reacciona con grupos amino para formar derivados carbamados altamente fluorescentes y estables. Este agente altamente reactivo, originalmente y todavía usado como grupo amino protector en síntesis de péptidos, fue primeramente aplicado como un agente derivatizante en precolumna para análisis de aminoácidos. El FMOC-Cl reacciona con todos los aminoácidos a pH alcalino y temperatura ambiente para producir derivados aminoacídicos altamente estables que tienen una fluorescencia comparable a los derivados de OPA. Se pueden formar mono- y bis-derivados con histidina, tirosina y lisina. Las proporciones relativas de estos derivados varían en función del pH y de la proporción de reactivo y aminoácido.Durante la reacción con FMOC-Cl, los productos de hidrólisis del reactivo que se forman tienen fluorescencia parecida a la de los derivados aminoacídicos. Estos productos interfieren en la separación por cromatografía de fase reversa a menos que sean eliminados por el disolvente orgánico de extracción, antes de aplicar la muestra a la columna de cromatografía de fase reversa. Una versión automatizada de este procedimiento de derivatización ha sido desarrollada y comercializada.Betnér y Foldi solucionaron el problema de las interferencias por la elusión de grandes picos de FMOC-Cl y sus productos de hidrólisis, FMOC-OH, que son eluídosen la misma región cromatográfica que muchos de los aminoácidos FMOC, por derivatización del volumen de exceso FMOC-Cl con una amina hidrofóbica. El derivado resultante es eluído más tarde en el cromatograma después de todos los aminoácidos FMOC.Una combinación entre OPA/FMOC ha sido descrita, la cual usa un analizador comercialmente disponible (Hewlett-Packard Amino Quant). La reacción de aminoácidos primarios es llevada a cabo inicialmente por OPA, seguida por la reacción de prolina e hidroxiprolina con FMOC. La determinación de la fluorescencia para los derivados de aminoácidos primarios OPA y FMOC-prolina es llevada a cabo entonces a longitudes de onda apropiadas.7-cloro y 7-fluro-4-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazole (NBD-Cl y NBD-F).



Reactivos de derivatización basados en la estructura del nitrobenzofurazan, NBD-Cl y NBD-F, tienen probada utilidad para aplicaciones específicas en el análisis de todos los aminoácidos.El NBD-Cl fue introducido por Ghosh y por Whitehouse como un agente fluorigénico para aminas, incluyendo aminoácidos y posteriormente Rot como una útilherramienta para el análisis de aminoácidos, particularmente por su realzadareactividad con aminas secundarias. Desde entonces, este reactivo ha tenido empleo ocasionalmente para la detección de aminoácidos, con particular énfasis en la detección de prolina e hidroxiprolina. NBD-Cl ha sido aplicado a la derivatización en pre- y post-columna, con un límite de detección en éstas últimas de 1 nmol para prolina e hidroxiprolina y un límite de detección en las primeras algo menor. Aunque NBD-Cl es estable y permite una detección sensible de aminoácidos, reacciona algo más despacio con aminas y no ha tenido un uso extendido como agente analítico general para aminoácidos.NBD-F es más reactivo que su análogo de cloro, permitiendo una derivatización más rápida, acompañada de una gran fluorescencia para prolina ehidroxiprolina. De forma similar al NBD-Cl, el NBD-F ha sido aplicado tanto aderivatizaciones precolumna como postcolumna. Los límites de detección para la precolumna están definidos en el rango de 5-15 fmol para la mayoría de los aminoácidos. El NBD-F tampoco ha sido utilizado ampliamente como método analítico para aminoácidos, aunque algunos investigadores emplean este reactivo habitualmente.Otros reactivos derivados del isotiocianato.El 4’-N,N-dimetilamino-4-azobencenoisotiocianato (DABITC) ha sido usado satisfactoriamente en la secuenciación manual y análisis de nitrógeno terminal de péptidos y proteínas. La degradación tipo Edman de péptidos yproteínas efectuada por este agente produce derivados tiohidantoin coloreados(DABTH), que pueden ser separados por cromatografía de fase reversa. El método de degradación generalmente comprende un doble acoplamiento, primero con DABITC y luego con PITC. La 4-N,N-dimetilnaftilazobenzeno homologa del DABITC(DANABITC) ha sido también aplicada con éxito, aunque en menor grado que elDABITC.Difenil indenonilisotiocianato (DIITC) ha sido estudiada para ser utilizada cuando la espectrometría de masas por ionización química es acoplada con identificaciones previas por cromatografía de fase reversa. La detección de derivados de tiohidantoin (DITH) se lleva a cabo por determinación UV (en el rango por debajo del pmol). La detección electroquímica es un utensilio alternativo.Otros reactivos isotiocianatos de derivatización precolumna son4-(t-butiloxicarbonilaminometil) fenil isotiocianato (BAMPITC, detecciónfluorescente), trimetilsisil isotiocianato para análisis de secuencia decarbono terminal (detección UV) y p-N,N-dimetilaminofenil isotiocianato (DMAPI)como una instrumento electroquímico para el análisis de aminoácidos.Reactivos mixtos.Otros reactivos están siendo continuamente desarrollados y utilizados para detecciones de aminoácidos. Algunos tienen aplicaciones muy específicas y limitadas, mientras otros son tratados como posibles competidores para amplios usos en sistemas automáticos. Tales reactivos incluyen el ácido2,4,6-trinitrobencensulfónico (TNBS) y su análogo 2,4-dinitrobenceno (DNBS),N,N-dietil-2,4-dinitro-5-fluoroanilina, fluoro-2,4-dinitrobenceno, ácido1,1-difenilbórico y 1-fluoro-2,4-dinitrofenil-5-L-alanina amida (reactivo deMarfey). La detección fluorescente es posible cuando se emplean reactivos tales como pentano-2,4-diona/formaldehido, 9-antrildiazometano, cloruro laril,2,3-naftaleno-dicarboxialdehido, succinimida -naftilcarbamato,3-benzoil-2quinolina-carboxaldehido, 9-hidroximetilantraceno e isotiocianatofluorescente y 1-naftil isocianato. Un reactivo quimioluminiscente,4-isocianatoftalhidrazida, también ha sido investigado. Con excepción delpentano-2,4-diona/formaldehido, donde el reactivo fue usado en derivatización postcolumna seguida de intercambio iónico HPLC de aminoácidos, todos los demás fueron utilizados para la derivatización previa de cromatografía de fase reversa.En la siguiente tabla se pueden comparar las diferentes características de los reactivos de derivatización más importantes para la determinación de aminoácidos:

REACTIVOS DE DERIVATIZACIÓN

Complejos con:

Método de separación

Post- o pre-columna

Detección

1os CIC o electroforésis Post- VIS 570 nm



OPA 1os CFR (en post-columna,CIC)

Pre- y post- Fluorescencia

Fluorescamina 1os CIC o electroforésis Post- Fluorescencia

PITC 1os y 2os CFR Pre- UV 240-255 nm

Cloruro de dansilo 1os y 2os CFR Pre- Fluorescencia

Cloruro de dabsilo 1os y 2os CFR Pre- VIS

FMOC-Cl 1os y 2os CFR Pre- Fluorescencia

NBD-Cl 1os y 2os CFR Pre- y post- Fluorescencia

NBD-F 1os y 2os CFR Pre- y post- Fluorescencia Preparación de las muestras. La reacción con los derivatizantes forma el mismo cromóforo con las aminas primarias que con las secundarias, por tanto las muestras deben estar libres de sales y lípidos antes de que tengan lugar la hidrólisis y los pasos de derivatización. La mayor causa de los bajos rendimientos en las reacciones de derivatización es la presencia de contaminantes en la muestra, como son las sales no-volátiles, detergentes y lípidos. Las sales y los támpones interfieren tanto en la hidrólisis como en la posterior derivatización, distorsionan la cromatografía y añaden picos extra al cromatograma.Las sales pueden ser eliminadas de las proteínas y de los péptidos usando tampónes volátiles y HPLC de fase reversa, precipitación, diálisis o columnas de filtración de gel.

5. Derivatización pre-columna frente a post-columnaLas opiniones de investigadores sobre los ventajas relativas de la derivatización antes o después del HPLC, de aminoácidos serán determinadas por los requerimientos de la aplicación específica. Factores como la sensibilidad requerida en la detección, cantidad de muestra disponible, tipo demuestra, fuente de muestra, velocidad de análisis y reproducibilidad e incluso consideraciones económicas influirán en la elección entre la derivatización pre- o post-columna de aminoácidos.Derivatización post-columna. La derivatización siguiendo a una cromatografía de intercambio catiónico de aminoácidos libres tiene distintas ventajas, con tal de que la instrumentación produzca velocidades y temperaturas de reacción reproducibles. Además, para la derivatización no es necesario proceder al completo, y los problemas de estabilidad del derivado son insignificantes. Otras ventajas son que la automatización es fácil y que el tiempo consumido y la pérdida a causa de la preparación de la muestra son innecesarias. También pueden ser usados detectores en serie. Una gran cantidad de experiencias han sido adquiridas del tradicional método de intercambio catiónico y tinción con ninhidrina, el cual ha resultado ser fiable, preciso y capaz de una separación excelente de mezclas complejas de aminoácidos y sus metabolitos.Una desventaja con un sistema HPLC convencional es que son necesarios instrumentos más complejos que para el método de pre-columna. La derivatización post-columna requiere la adición de una o más bombas para los disolventes y reactivos derivatizantes. También se requiere la adición de un reactor post-columna, el cual llevará a un ensanchamiento de banda adicional, y por esto, un decrecimiento en la sensibilidad de detección. La columna de eluciónes continuamente diluida por el reactivo derivatizante, provocando un descenso en la sensibilidad de detección. Así, la máxima sensibilidad alcanzable por derivatización post-columna será menor que en el caso de la precolumna.Derivatización pre-columna. Ésta, acoplada con cromatografía de fase reversa en lugar de con cromatografía de intercambio catiónico, fue originalmente introducida como respuesta al incremento en la demanda de mayor sensibilidad y mayor velocidad de análisis. Las ventajas de la metodología dela derivatización pre-columna incluyen simplicidad, velocidad y alta sensibilidad. Por ello, si se requiere máxima sensibilidad de detección, un reactivo fluorescente combinado con la derivatización pre-columna es el método más indicado.Como desventaja está la necesidad de garantizarse la completa reacción del reactivo derivatizante y la posibilidad de interferencia con la separación por exceso de reactivo, el medio de reacción o la producción de diferentes derivados de un componente. Además, la estabilidad del derivado puede ser



un importante factor durante la derivatización pre-columna, la demora entre la derivatización y la inyección llega a ser fundamental para los resultados obtenidos.

6. Bibliografía.David J. Holme y Hazel Peck, Bioquímica Analítica, Longman Group Limited,1983.Hans-Dieter Belitz y Werner Grosch, Química de los Alimentos, Springer-VerlagGmbH & Co., 4ª edición.Adolfo Leandro Montes, Bromatología, Editorial Universitaria de Buenos Aires, 2ªedición, 1981.Valcarcel-A. Gómez, Técnicas Analíticas de Separación, Ed. Reverté S.A.,1994.Skoog y J.J.Leary, Análisis Instrumental, Ed. McGraw Hill Interamericana, 1994.Métodos Oficiales de Análisis, Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación,Dirección General de Política Alimentaria. 1986.Methods of Analysis of AOAC, Association of Official Analytical Chemist, 1995.


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