5. aislamiento de principios activos de drogas vegetales 2013-2014
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Drogas vegetales , extracción, principios activos,TRANSCRIPT
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Universidad Central de VenezuelaFacultad de Farmacia
Farmacognosia y Medicamentos Herbarios
Prof Nery Margarita Prez Ibez2013-2014
Tema N 5. Aislamiento de Principios Activos de Drogas Vegetales
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Drogas vegetales
Elaboracin de medicamentos
herbarios
Aislamiento de principios
activos
Elaboracin de medicamentos
alopticos
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Artemisinina
Dihidroartemisinina
Artemisia annua L.
Semisintesis
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DROGA VEGETAL
EXTRACTO
Extracto activo
FRACCIONES
Fracciones activas
COMPUESTOS
Compuestos activos
Compuestos inactivos
Bioensayo
Separacin, Purificacin
Fracciones inactivas
Bioensayo
Fraccionamiento
Extracto inactivo
Bioensayo
Extraccin
ESTUDIO BIOGUIADO
Elucidacin estructural
COMPUESTOS ACTIVOS ELUCIDADOS
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Aislamiento de principios activos de drogas vegetales
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PLANIFICACIN PREVIA 1. Seleccin del material vegetal
Seleccin etnomdica Seleccin quimiotaxonmica Seleccin ecolgica Seleccin al azar
2. Recoleccin, limpieza, secado y almacenamiento del material vegetal
3. Identificacin botnica 4. Revisin bibliogrfica
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REVISIN BIBLIOGRFICA
Literatura secundaria Libros Revistas de ndices y resmenes, etc.
Index Medicus (Medline) Chemical Abstracts International Pharmaceutical Abstracts Medicinal and Aromatic Plant Abstracts Biological Abstracts Current Contents
Literatura primaria Revistas cientficas de investigacin
Planta Medica (Alemania) Journal of Ethnopharmacology (Irlanda) Phytotherapy Research (Inglaterra) Fitoterapia (Italia) Phytomedicine (Alemania) Journal of Natural Products (USA) Phytochemistry (Inglaterra) Internacional Journal of Pharmacognosy (Holanda) Journal of Herbs, Spices and Medicinal Plants (USA)
Aislamiento de principios activos de drogas vegetales
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Aislamiento de principios activos de drogas vegetales
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MTODOS o TCNICAS
Extraccin
Fraccionamiento
Separacin y purificacin
Elucidacin estructural
ENSAYOS BIOLGICOS
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Mtodos de extraccin de drogas vegetales
Aislamiento de sustancia
activas:
TCNICAS:
Extraccin
Fraccionamiento
Separacin y
purificacin
Elucidacin
estructural
ENSAYOS BIOLGICOS
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Procesos de extraccin
Discontinuo
Continuo
Mtodos de extraccin
Decoccin
Maceracin
Reflujo
Percolacin
Soxhlet
Destilacin
Fluidos supercrticos
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Extraccin de drogas vegetales por decoccin
Races, semillas, corteza8
Ventajas ?Desventajas?
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Extraccin de drogas vegetales por maceracin
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Ventajas ?Desventajas?
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http://lavraieverte.blogspot.com/2010/06/maceration-day-2.html
Artemisia sp.
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Extraccin de drogas vegetales por reflujo o digestin
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Ventajas ?Desventajas?
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Extraccin de drogas vegetales por percolacin
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EXTRACTO
SOLVENTE
PERCOLADOR
Ventajas ?Desventajas?
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Extraccin de drogas vegetales por Soxhlet
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El aparato de Soxhlet consta de tres partes: En A se dispone de un matraz
del disolvente, en contacto con una manta calentadora.
En B se dispone de un cartucho de papel de filtro o de tela que contiene un peso dado de la droga vegetal.
C es el refrigerante y en l condensa el disolvente que, por efecto de la gravedad, cae en el cartucho embebiendo el material vegetal.
Cuando el cuerpo intermedio (B) est lleno de lquido extractivo, mediante un sistema de sifn, cae de nuevo en A, inicindose de nuevo el proceso.
A
B
C
Ventajas ?Desventajas?
Soxhlet
Cartuchos (B)
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Extraccin de drogas vegetales por destilacin(arrastre con vapor)
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Obtencin de sustancias voltiles como aceites esenciales (esencias)
Agua
Vapor de agua
FloresAceite
esencial
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Extraccin de drogas vegetales por fluidos supercrticos (FSC)
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Propiedad Gas FSC LquidoDensidad (kg/m3) 1 100-800 1000Viscosidad (cP) 0.01 0.05-0.1 0.5-1.0
Difusividad(mm2/s)
1-10 0.01-0.1 0.001
Aum
ento
de
la p
resi
n y
tem
pera
tura
FSC
LquidoGas
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Extraccin de drogas vegetales por fluidos supercrticos
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El solvente a utilizar se deposita en (1). Luego el fluido pasa por el intercambiador de calor (2), en el cual se enfra para que entre sin problemas a la bomba (3), en la cual se eleva la presin sobre la presin crtica. Posteriormente en el intercambiador (4) se logra el estado supercrtico al subir la temperatura sobre la crtica. As se hace pasar el fluido supercrtico a travs de la droga vegetal en el extractor (5), disolviendo y arrastrando los compuestos de inters, dada las propiedades del fluido. En (6) y (7) se baja la presin y temperatura respectivamente, por lo que el fluido ya no es supercrtico y los compuestos no son solubles, lo que permite que en (8) el gas se extraiga por la parte superior y el extracto por la parte inferior. El gas se condensa en (9), lo que permite que sea totalmente reutilizable.
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Ventajas del dixido de carbono (CO2) como fluido supercrtico
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No genera contaminacin en el proceso.
Presenta baja toxicidad y es poco reactivo.
No es inflamable. Existe en abundancia. Es barato en grados de pureza
elevada. No son necesarios procesos de
limpieza subsecuentes. Es prcticamente inerte desde el
punto de vista qumico. Se separa fcilmente del producto
que se quiere extraer Posee condiciones crticas
fcilmente accesibles Puede ser reciclado de una parte
del proceso y ser utilizado nuevamente
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Ventajas y desventajas de la Extraccin con FSC
Costo
Personal calificado
Equipos automatizados P y T
moderada
Selectividad
Extracciones eficaces
Extractos de calidad
Disolvente CO2
EFS
No txico No inflamable Inerte Costo moderable
Baja viscosidad y alta difusividad del FS
Poder disolvente ajustable por cambios de P y/o T
Separacin del FSC por despresurizacin
Ideal para compuestos termolbiles
Aplicados a sistemas de diferentes escalas: analtica, preparativa, piloto e industrial
Acoplamiento a cromatgrafos
Mantenimiento Operacin
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Formas de extraccin de drogas vegetales
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Extraccin total Se utiliza etanolSe obtiene un extracto etanlico
Extraccin fraccionadaSe utilizan solventes de polaridad crecienteSe obtienen extractos de polaridad diferente
EXTRACCIN SLIDO-LQUIDO
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Extraccin total
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DROGA VEGETAL
EXTRACTO ETANLICO(Compuestos polares, medianamente
polares y apolares)RESIDUO VEGETAL
ETANOL
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Extraccin fraccionada
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DROGA VEGETAL
EXTRACTO HEXANLICO(Compuestos apolares)
Residuo vegetal
EXTRACTO CLOROFRMICO(Compuestos medianamente polares)
Residuo vegetal
EXTRACTO ETANLICO (Compuestos polares)
Residuo vegetal
ETANOL
CLOROFORMO
HEXANO
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Fraccionamiento de extractosAislamiento de
sustancia activas:
Tcnicas:
Extraccin
Fraccionamiento
Separacin y
purificacin
Elucidacin
estructural
Ensayos biolgicos
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Lquido-lquido
cido-base
Cromatografa columna abierta
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Fraccionamiento lquido-lquido
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EXTRACTO ETANLICO
FRACCIN HEXANLICA(Compuestos apolares)
FRACCIN METANOL-AGUA (9:1)
FRACCIN CLOROFRMICA(Compuestos medianamente polares)
FRACCIN METANOL-AGUA (1:1)(Compuestos polares)
Ajustar con agua hasta proporcin 1:1 Particin con cloroformo
Concentracin a sequedad Disolucin en metanol-agua (9:1)
Particin con hexano
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EXTRACTO VEGETAL
FASE ACUOSA(Glicsidos, aminas cuaternarias)
FASE ORGNICA
FASE ACUOSA (Aminas primarias, secundarias y terciarias)
FASE ORGNICA
FASE ACUOSA(cido carboxlico)
FASE ORGNICA
continua
NaHCO3 (5-10%)
HCl (5-10%)
S.O. /Agua
Fraccionamiento cido-base
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S.O. = solvente orgnico inmiscible con agua
-
Fraccionamiento cido-base
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FASE ORGNICA
FASE ACUOSA (cidos carboxlicos, fenoles
FASE ORGNICA
FASE ACUOSA (Aldehdos y cetonas)
FASE ORGNICA (Compuestos
neutros)
NaHSO3 (5-10%)
NaOH (5-10%)
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Fraccionamiento de extractos vegetales
Aislamiento de sustancia
activas:
Tcnicas:
Extraccin
Fraccionamiento
Separacin y
purificacin
Elucidacin
estructural
Ensayos biolgicos
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Evaluacin de las fracciones obtenidas por CCF
Fracciones
Cromatografa de columna abierta
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Separacin y purificacin de las sustancias activas
Aislamiento de sustancia
activas:
Tcnicas:
Extraccin
Fraccionamiento
Separacin y
purificacin
Elucidacin
estructural
Ensayos biolgicos
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CRISTALIZACIN
CROMATOGRAFA
Columna abierta
Lquida de alta resolucin
(CLAR o HPLC) preparativa
Capa fina preparativa
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Cristalizacin Proceso por el cual a partir de una
disolucin los iones, tomos o molculas establecen enlaces hasta formar una red cristalina.
Mtodos: Evaporacin del disolvente Enfriamiento de una disolucin
concentrada Cambio de disolvente
Se repite el proceso de cristalizacin en una disolucin que ya se haba hecho dicho proceso. Las aguas que quedan an contienen soluto disuelto que puede cristalizarse.
Para un proceso de cristalizacin ms rpido, aplicar un ncleo de cristalizacin.
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HPLC preparativo
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Columnas para HPLC
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Cromatografa de capa fina preparativa
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Elucidacin estructural de sustancias activas
Aislamiento de sustancia
activas:
Tcnicas:
Extraccin
Fraccionamiento
Separacin y
purificacin
Elucidacin
estructural
Ensayos biolgicos
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Tcnicas espectroscpicas (existe irradiacin electromagntica de la sustancia y se produce absorcin y emisin de dicha radiacin por grupos cromforos presentes en la molcula): Espectroscopia de Absorcin UV/VIS e IR
Espectroscopia de Resonancia Magntica Nuclear de 1D y 2D
Dicrosmo Circular
Cristalografa por Rayos X
Espectrometra de Masas
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Espectroscopia UV-VIS
Determina la existencia de grupos cromforos conjugados (instauraciones mltiples: dieno, enona, aromtico).
Se fundamenta en la absorcin de energa UV VIS (380-780 nm) para las transiciones electrnicas desde un estado fundamental a un estado excitado.
Las seales del espectro son muy anchas debido a los cambios vibracionales y rotacionales que acompaan a las transiciones electrnicas.
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ESPECTROSCOPIA IRDetermina grupos funcionales presentes en la molcula (OH, NH, CO, etc.), as como el carcter aliftico o aromtico del compuesto.
Se fundamenta en la absorcin de energa de la regin infrarroja (4000 200 cm-1) para las transiciones electrnicas causando los cambios vibracionales y rotacionales de los enlaces presentes en la molcula.
1350 y 900 cm-1 = la huella dactilar de la molcula porque las bandas de esa regin corresponde a las vibraciones y rotaciones del esqueleto carbonado.
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Resonancia magntica nuclear (RMN)
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Determina grupos funcionales, subestructuras, conectividades, estereoqumica, etc., a partir de datos de desplazamiento qumico, reas de los picos y constantes de acoplamiento observadas en los espectros.
La muestra es colocada en un campo magntico y bombardeada por ondas de radio (3 Hz -300 GHz), los ncleos pasan a un estado de mayor energa, se produce el fenmeno de resonancia. Al cesar el estmulo, los ncleos emiten la energa absorbida en forma de fotones que luego son detectados por equipos especiales.
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RMN 1D: RMN-1H
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IBUPROFENO
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RMN 1D: RMN-13C
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IBUPROFENO
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RMN 2D: HMQC
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El experimento HMQC (Heteronuclear Multiple Quantum Correlation) es usado para correlacionar protones resonantes a los carbonos directamente unidos a esos protones. Los espectros de protones y carbonos en 1D son mostrados en los ejes horizontal y vertical.
En el experimento 2D del ibuprofeno se observa que en el espectro de carbono el pico del carbono a 45 ppm se compone de las resonancias CH y CH2 en posiciones 2 y 9 con desplazamientos qumicos idnticos, pero en el espectro de protn presentan desplazamientos qumicos diferentes.
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RMN 2D: HMBC
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El experimento HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Correlation) es usado para obtener las correlaciones proton-carbon a larga distancia, a dos hasta tres enlaces. Los espectros de protones y carbonos en 1D son mostrados en los ejes horizontal y vertical, respectivamente. Los picos en el espectro 2D indican cuales protones estn conectados a cuales carbonos va acoplamiento a larga distancia. Por ejemplo, en el espectro del ibuprofeno se observa acoplamientos claros de los protones en posicin 2 y 13 al carbn cuaternario en posicin 1.
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Dicroismo circular Determina la
estereoqumica de las molculas con centros quirales que tienen un cromforo.
La muestra se irradia con luz polarizada (UV-VIS) y se registra la rotacin ptica.
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Cristalografa por Rayos X Determina la estructura total de la
molcula incluida la estereoqumica de la misma a partir de las posiciones relativas de los tomos.
Los rayos X (10-0,01 nm) son difractados por los electrones que rodean los tomos por ser su longitud onda del mismo orden de magnitud que el radio atmico. El rayos X difractado contiene informacin sobre la posicin y tipo de tomos encontrados en su camino. Detectores especiales observan y miden la intensidad y posicin de los rayos X difractados, y su anlisis posterior por medios matemticos permite obtener una representacin a escala atmica de los tomos y molculas del material estudiado.
Se requiere cristales perfectos de sustancias puras
TIROSINA
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Espectrometra de masas (MS)Permite determinar la masa molecular.
Consistente en el bombardeo de lamuestra (previamente vaporizadamediante el uso de alto vaco y una fuentede calor) con una corriente de electrones aalta velocidad. Ello produce que lasustancia pierda a su vez algunoselectrones y se fragmente dandodiferentes iones, radicales y molculasneutras. Los iones (molculas ofragmentos cargados), son conducidosmediante un acelerador de iones a un tuboanalizador curvado sobre el que existe unfuerte campo magntico y conducidos a uncolector/analizador sobre el que serecogen los impactos de dichos iones enfuncin de la relacin carga/masa de losmismos. Posteriormente dichos impactosson transformados en un espectro demasas.
No es una tcnica espectroscpica puesno existe irradiacin electromagntica dela sustancia y no se produce absorcin dedicha radiacin.
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Ensayos biolgicos (Bioensayos)Aislamiento de
sustancia activas:
Tcnicas:
Extraccin
Fraccionamiento
Separacin y
purificacin
Elucidacin
estructural
Ensayos biolgicos
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Son experimentos in vitro o in vivo que se
usan para detectar la actividad biolgica de
extractos o sustancias puras obtenidas de
drogas vegetales.
Sirven para monitorear el fraccionamiento de
una droga vegetal hasta el aislamiento de las
sustancias puras bioactivas, esto se conoce
como estudio bioguiado (aislamiento
biodirigido).
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Ensayos biolgicos (Bioensayos)Aislamiento de
sustancia activas:
Tcnicas:
Extraccin
Fraccionamiento
Separacin y
purificacin
Elucidacin
estructural
Ensayos biolgicos
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Los ensayos biolgicos, empleados en un
fraccionamiento bioguiado, deben ser sencillos,
rpidos, baratos, de alta capacidad y fcilmente
disponibles (que se pueda realizar utilizando
instalaciones simples, en un laboratorio de
fitoqumica)
CLASIFICACIN:
BIOENSAYOS GENERALES
BIOENSAYOS ESPECIALIZADOS
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Bioensayos generales Se evalan muchos
efectos diferentes
Ejemplos: Mtodo Hipocrtico Motilidad del leon
aislado de cobayo Mortalidad de la
Artemia salina
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Bioensayos especializados Dirigido a encontrar algn efecto contra
una enfermedad especfica Son ms sofisticados Requieren la habilidad de un equipo
multidisciplinario (bioqumicos o farmaclogos)
Se emplean: Organismos inferiores
(microorganismos, insectos, moluscos, protozoarios, helmintos).
Sistemas sub-celulares aislados (enzimas, receptores, orgnulos).
Clulas intactas aisladas de origen animal o humano
rganos aislados de animales Animal completo
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Referencias bibliogrficas
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Abreu G., Cullar A., 2008. Estrategias en la seleccin de las plantas medicinales ainvestigar. Rev Cubana Plant Med; 13(3). [citado 02-08-2014]. Disponible en:.
Castro M., M. Valcrcel, Valcrcel Cases, M., 1993. Extraccin con fluidos supercrticos enel proceso analtico. Publisher Reverte.
Colegate S. and Molyneux R., 2007. Bioactive natural products: detection, isolation andstructural determination. Second Edition. CRC Press Taylor & Francis Group. Boca Raton.Florida.
Duddeck H., Dietrich W., Tth G., 2000 Elucidacin estructural mediante RMN: ejercicios yproblemas. Publisher Springer Science & Business Media.
Nrnberg E. und Surmann P., 1991. Hagers Handbuch der Pharmazeutischen Praxis,Methode. Volume 2. Editor Franz von Bruchhausen. Publisher Springer-Verlag. Berlin-Heidelberg-New York.
Skoog D. Crouch S. and Holler F., 2008. Principios de anlisis instrumental / Principles ofInstrumental Analysis. Edition 6. Publisher Cengage Learning Latin America.
Tringalli C., 2001. Bioactive compounds from natural sources: isolation, characterization andbiological properties. Taylor& Francis Group. New Fetter Lane. London.
Tema N 5. Aislamiento de Principios Activos de Drogas VegetalesNmero de diapositiva 2Nmero de diapositiva 3Aislamiento de principios activos de drogas vegetalesAislamiento de principios activos de drogas vegetalesAislamiento de principios activos de drogas vegetalesMtodos de extraccin de drogas vegetalesExtraccin de drogas vegetales por decoccinExtraccin de drogas vegetales por maceracinNmero de diapositiva 10Extraccin de drogas vegetales por reflujo o digestinExtraccin de drogas vegetales por percolacin Extraccin de drogas vegetales por SoxhletExtraccin de drogas vegetales por destilacin (arrastre con vapor)Extraccin de drogas vegetales por fluidos supercrticos (FSC)Extraccin de drogas vegetales por fluidos supercrticosVentajas del dixido de carbono (CO2) como fluido supercrticoVentajas y desventajas de la Extraccin con FSCFormas de extraccin de drogas vegetalesExtraccin totalExtraccin fraccionadaFraccionamiento de extractosFraccionamiento lquido-lquidoFraccionamiento cido-baseFraccionamiento cido-baseFraccionamiento de extractos vegetalesNmero de diapositiva 27Separacin y purificacin de las sustancias activasCristalizacinHPLC preparativoCromatografa de capa fina preparativaElucidacin estructural de sustancias activasEspectroscopia UV-VISNmero de diapositiva 34Resonancia magntica nuclear (RMN)RMN 1D: RMN-1H RMN 1D: RMN-13CRMN 2D: HMQCRMN 2D: HMBCDicroismo circularCristalografa por Rayos XEspectrometra de masas (MS)Ensayos biolgicos (Bioensayos)Ensayos biolgicos (Bioensayos)Bioensayos generalesBioensayos especializadosReferencias bibliogrficas