4 conferencia ig y tecnologia adriana vivas unrc 27102015.compressed
TRANSCRIPT
Dra. Adriana B. Vivas
Departamento de Anatomía Animal Facultad de Agronomía y VeterinariaUniversidad Nacional de Río Cuarto
ARGENTINA.
����54-358-4676210. ���� [email protected]
Institut für Pharmakologieund Toxikologie
IgY – Tecnología
Dra. Adriana Vivas
IgY – Tecnología
IgY-Tecnología
�Bases Biológicas
IgY-Technology
�Historia
�Mantenimiento de gallinas
�Inmunización
�Título de Anticuerpo
�Comparación de IgG e IgY
�Distancias filogenéticas
�Experimentos en UNRC
IgY-Technology
Experimento de Klemperer (1893)
Inmunizacines repetidas con Tetanus bouillon en cultivo
DespuésDespués de 4 de 4 semanassemanas preparaciónpreparación de un de un extractoextracto de de yemayema de de huevohuevo
1 ml1 ml 0,5 ml0,5 ml 0,25 ml0,25 ml 0,0 ml0,0 ml
Administración al día siguiente de dosis letal de Tetanus bouillon en cultivo
vivosvivos muertosmuertos
IgY-Technology
Experimento de LeClaire et al. (2002)
Staphylococcal Enterotoxin B
IgY 10 mg/kg,
toxin 5 LD50 as
aerosol
InmunizacinesInmunizacines
repetidasrepetidas concon
Después de 8 semanas preparación de extracto de yema de huevo
IgY 20 min antes desafío con toxina
(5 LD50)
IgY 4 h después desafío de toxina
(5 LD50)
buffer 4 hs
después toxina
buffer 20 min antes
desafio toxina
vivos vivos muertos muertos
aerosol
IgY-Technology
Batería comercial
Comparación de áreas disponibles para las gallinas
Equipo de mantenimiento
W. Russell and R. Burch
“The Principles of Humane Experimental Techniqueˮ (1959)
ReemplazarReemplazarReemplazarReemplazar Reducir Reducir Reducir Reducir RefinarRefinarRefinarRefinar
IgY-Technology [email protected]
Mamíferos
Circulación sanguínea
Leche materna
Inmunización
pasiva
IgY-Technology
Transferencia de anticuerpos
Aves
Circulación sanguíneaInmunización
pasiva
Solo IgYSolo IgY
IgY-Technology [email protected]
Transferencia de IgY desde
sangre a yema
VC1
C2
C3
Conclusión – un Fc intacto y la región HEAL son
requeridas para el transporte de la Ig hacia la yema
Morrison et al. (2001) Mol. Immunol. 38:619-625
429-436
HEAL – His-Glu-Ala-Leu
HEAL es importante para
transporte hacia la yema
Amarillla zona expuesta Amarillla zona expuesta
sobre la superficie de Csobre la superficie de CHH2 2 ––
importante como importante como
reconocimiento del receptor reconocimiento del receptor
Fc-part
C3
C4
IgY-Technology
Transferencia de anticuerpos desde
sangre a yema
¿Por qué esperar 10 días
después de la 2da inmunización?
IgY-Technology [email protected]
Tecnología Aviar
Viragen has signed a collaborative agreement with the Roslin Institute,
the renowned Scottish birthplace of the world’s most famous sheep,
Dolly. Viragen has obtained a worldwide exclusive license by the
Roslin Institute to their
Avian (bird) technology
to enable Viragen,...., to produce drugs, including monoclonal
antibodies to fight cancer and other life-threatening diseases, inside
the eggs of specially created transgenic chickens.
The development of avian technology promises a much faster, cost-
effective and virtually unlimited production process marked by the
chicken’s prolific egg laying capabilities.
IgY-Technology
Recomendaciones para
la immunización de Gallinas
Antigen 0,10 – 1,00 mg sometimes 10 µg sufficient
Adjuvant FIA 0,10 – 0,25 ml usually i.m. or s.c.
Specol 0,5 ml s.c.
PCLS 250 µg preferably s.c.
FCA 0,10 – 0,25 ml only with weak immunogens
Injections
-volume 0,5 ml (-1 ml)
-intervals 4 – 8 weeks
-number 2 (or more if necessary)
-route i.m. or s.c.
IgY-Technology
Cantidad de antígeno y la producción de
anticuerpo
Development of Ab-titre of chickens after immunisation with
human albumin
200
250
3005 mg
2.5 mg
1 mg
0.5 mgi.v.
An
tib
od
y t
itre
0 10 20 30 40 50 60 70 80 900
50
100
150
i.m.
i.m.
Time after immunisation (days)
An
tib
od
y t
itre
IgY-Technology
Vista Microscópica
Vista
Macroscópica
Daño tisular por el uso de adyuvante de
Freund‘s completo
Vista Microscópica
Después del tratamiento con y sin FCA
IgY-Technology [email protected]
IgY-Technology
The use of gene-specific IgY antibodies for
drug target discovery
Gene gun
immunisation
W.-W. Zhang (2003) Drug Discovery Today 8,
364-371
Conventional keeping (Mouse
IgG1)
0.1
1
10
100
1000
An
tib
od
y-T
itre
(x
1,0
00
)
SPF-keeping (Mouse IgG1)
0.1
1
10
100
1000
An
tib
od
y-T
itre
(x
1,0
00
)
Desarrollo de título de anticuerpo y de concentración proteica de Desarrollo de título de anticuerpo y de concentración proteica de
yema de huevo bajo condiciones convencionales y SPFyema de huevo bajo condiciones convencionales y SPF
Chicken 1, Chicken 2
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 1100.1
Time (d)
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 1100.1
Time (d)
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 1100
2
4
6
8
10
12
14
Time (d)
mg
Pro
tein
/ml
Yolk
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 1100
2
4
6
8
10
12
14
Time (d)
mg
Pro
tein
/ml
Yolk
IgY-Titre Development
2.0
2.5
3.0Ch80
Ch81
Ex
tin
ctio
n
Ritmo septadiano
IgY-Technology [email protected]
0 10 20 30 40 50 60 70 800.0
0.5
1.0
1.5
Days after first immunisation
Ex
tin
ctio
n
IgY-Technology [email protected]
IgY-Technology
Muestreo invasivo no-invasivo
Cantidad de Ac 200 mg/40 ml
sangre
50-100 mg/huevo
5-7 huevos/semana
Características del IgG versus IgY
IgG Mamífera IgY Aviar
Cantidad de Ac
/mes
200 mg appr. 1.000 – 2.800
mg
Interferencia con
IgG (Factores
reumatoideos
sí no
Interferencia con
Complemento
sí no
Protein A/G sí no
Hetero-Aglutininas sí no
IgY-Technology [email protected]
IgY-Technology [email protected]
IgY-Technology
Ensayo para proteína C reactiva (CRP)
Ensayo
Oveja
Ensayo Ave Factor reumatoideo
Ensayo
Oveja
Falso
positivo
Ensayo Ave
No falso positivo
Ensayo Oveja: Combinación de
dos Ac mamíferos
Ensayo ave: Combinación de un
nAc mamífero con uno de ave
Sh
eep
Ass
ay
con
cen
tra
tio
nFalse positive response
IgY-Technology
Ensayo de detección para Proteina C reactiva (CRP)
Chicken Assay
CRP-concentration
Sh
eep
Ass
ay
CR
P-c
on
cen
tra
tio
n
IgY-Technology
Phylogenetic Tree of Vertebrates
Placodermi
Chondrichthyes Osteichthyes
Amphibia Reptilia
Phylogenetic
difference
Amphibia Reptilia
Aves Mammalia
Chicken Human Rabbit
IgY-Technology
Diferencia FilogenéticaSecuencia de la proteína Prion (AA 151-190)
RENMHRYPNQ VYYRPVDQYS NQNNFVHDCV NITVKEHTVT
Bovina
Ovina
RENMYRYPNQ VYYRPVDQYS NQNNFVHDCV NITVKQHTVT
RENMHRYPNQ VYYRPVDQYS NQNNFVHDCV NITIKEHTVT
Mus
SENSARYPNR VYYRDYSSPV PQDVFVADCF NITVTEYSIG
Aves
Doctorado en Ciencias Biológicas
“TECNOLOGÍA DE IGY ANTI-ESCHERICHIA COLIAPLICADA MEDIANTE COMPUESTOS HIDROGEL-
NANOTUBOS SOBRE CULTIVOS DE ENTEROCITOS PORCINOS”
Doctoranda: Lic. Romina Bellingeri
Directora: Dra. Adriana Vivas
Co-Directora: Dra. Nora Gorla
Las inmunoglobulinas de yema de huevo (IgY) anti-Escherichia coli administradas
mediante nanocompuestos hidrogel-nanotubos afectan la actividad patógena de la
Escherichia coli en cultivos primarios de enterocitos porcinos.
Evaluar la capacidad protectora de la IgY anti-Escherichia coli administrada
mediante nanocompuestos en cultivo primario de enterocitos porcinos desafiados
con E. coli.
MATERIALES Y MÉTODOS
Muestra de IgY Proteínas (mg/g) IgY total (mg/g) IgY específica (título)
IgY anti-ETEC 686,2 ± 58,6 195,3 ± 1,7 * 1:100000 *
IgY control 556,1 ± 42,4 114,2 ± 3,4 1:1000Media ± desvío estándar (n=3). * indica diferencias significativas (p < 0,05).
Concentración y título de la IgY por ELISA
RESULTADOS
Bellingeri et al. (2012)
MATERIALES Y MÉTODOSrelación de los monómeros (AAm:AAc)
molaridadacrilamida(AAm)
molaridadac. acrílico
(AAc)
molaridadbisacrilamida
(BAAm)
porcentajebisacrilamida
(%)
A (0,5:1 ) 0,7 1,4 0,008 0,38
B (1:1) 1,4 1,4 0,016 0,57
C (2:1) 2,8 1,4 0,032 0,76
Síntesis
Caracterización de los hidrogeles pH-sensibles
CaracterizaciónEspectroscopia infrarroja
transformada de Fourier
Porcentaje de hinchamiento a pH 2Porcentaje de hinchamiento a pH 2Liberación de la IgY desde los hidrogeles
Liberación de la IgY desde los hidrogeles
FGS: 1,13 % (0,03 mg IgY/ml.h)
FIS: 7,27 % (0,19 mg IgY/ml.h)
Incorporación de la IgY en los hidrogeles
Composición (AAm:AAc)
mg IgY/pastilla de gel
A (0,5:1) 9,0 ± 0,1
B (1:1) 8,4 ± 1,1
C (2:1) 8,2 ± 0,3
Los datos son presentados como media ±desvío estándar (n=3).Test de Kruskal-Wallis,Infostat, 2009.
Interacción IgY-hidrogeles
MATERIALES Y MÉTODOS
Funcionalización de nanotubos con quitosano
Producto MWNT
Pureza >90%
Residuos <5%
Diámetro 10-30nm
SíntesisDeposición química en fase
vapor
Caracterización de nanocompuestos
Síntesisvapor
Sun Nanotech Co Ltd
Espectroscopia infrarroja transformada de Fourier (FT-IR)
MATERIALES Y MÉTODOS
Porcentaje de hinchamiento (%)
Contenido de agua(%)
Hidrogel 96,69 ± 0,32a 2944,09 ± 299,81a
Hidrogel-NTC1% 96,76 ± 0,51ab 3035,70 ± 456,08ab
Hidrogel-NTC5% 97,21 ± 0,10b 3484,12 ± 135,24b
Los datos son presentados como media ± desvío estándar (n=3). Letras diferentes indican diferenciassignificativas (p < 0,05). Hidrogeles incubados por 8 h. Test de Kruskal-Wallis, Infostat, 2009.
RESULTADOS
Estabilidad de la IgY encapsulada en nanocompuestos en fluidos gástricos simulados
Estabilidad en FGS y FIS
Estabilidad en FGS y FIS
MATERIALES Y MÉTODOS
Efecto de la IgY administrada mediante nanocompuestosen la adhesión de ETEC
MATERIALES Y MÉTODOS
0 h 2 h 4 h 6 h
E. coli 7,56 ± 0,02 a 8,17 ± 0,05 a 8,89 ± 0,05 c 9,41 ± 0,04 c
E. coli + IgY 7,56 ± 0,04 a 8,13 ± 0,08 a 8,56 ± 0,04 a 8,65 ± 0,03 a
E. coli + IgY-hidrogel FGS 7,53 ± 0,02 a 8,12 ± 0,03 a 8,71 ± 0,04 ab 8,90 ± 0,03 ab
E. coli + IgYFGS 7,57 ± 0,06 a 8,18 ± 0,03 a 8,86 ± 0,03 c 9,28 ± 0,09 cLos datos son presentados como media Log UFC/ml ± desvío estándar (n = 3). Letras diferentes indican diferencias significativas(p < 0,05). Test de Kruskal-Wallis, Infostat, 2009.
Doctorado en Ciencia Animal
“Tecnología de anticuerpos aviarios administrados en nanoestructuras aplicados a la sanidad porcina”
Mic. Fabrisio E. AlustizaLaboratorio de Radioisótopos y de Biotecnología Animal
Facultad de Agronomía y Veterinaria U.N.R.C.
Datos ensayo in vivo en lechones en confinamiento.
GRUPOS DIARREA GANANCIA PESO (g)
T° RECTAL (°C)
SI/NO Score Desh. Inicial Final
CONTROL – NO 0A 0A 222,5 a±115,6 37,8 a 38 b
CONTROL VEHICULO NO 0 A 0 A 244,8 a±87,5 37,7 a 38 b
UFC/m
l)
CONTROL +
Solo desafío
SI 3 B 2 B -262,5 b±75,3 37,9 a 39a
RESULTADOSIN
OC
ULA
DA
S
5 ml (1010UFC/m
l) Solo desafío
TRATAMIENTO 1
IgY sin encapsular
6c
NO 0 A 0 A 250 a±167 37,8 a 38,3 b
SI 3B 2B -70c±60,5 37,9a 38,5b
TRATAMIENTO 2
IgY encapsulada
NO 0 A 0 A 387,5 a±111,5 37,7 a 38,4 b
Letras distintas en la misma columna indican diferencias significativas (p<0.05) A, B Kruscal Wallis.
a, b , c ANOVA
Li,et al. 2009. Vet. Immunol. Immunopathol. 129:132-136.
Doctorado en Ciencias Biológicas
Tesis Doctoral
“TECNOLOGÍA DE ANTICUERPOS AVIARIOS Y NANOTECNOLOGÍA APLICADA A LA SANIDAD BOVINA”
Doctoranda: Mic. Natalia Picco
Grupos (n=4)Diarrea Grado de
deshidrataciónGanancia/pérdida de peso
(gramos)(SI/NO) Duración Consistencia Deposic/día
Inocula
dos
IgY a
nti-
EC
ET
Encapsul 1
No - - 1 Ninguno+600
675,00 ± 35,36 b,c2 +700
3Si 2 días Líq/Semi-líq 2 Ninguno
-300-525,00 ± 318,20 a,b
4 -1100
IgY c
ontr
ol
Encapsula
d 1
No - - 1 Ninguno
+700
162,50 ± 573,55 a,b,c2 +650
3 -200
4 -750
IgY a
nti-
EC
ET
Lib
re 1
No - - 1 Ninguno
+300
50,00 ± 479,58 a,b,c2 +600
3 -300
4 -400EC
ET
4 -400
sin
IgY
1
Si 3 días Líq/Semi-líq 3-5 Leve
-300
-612,50 ± 317,21 a2 -500
3 -600
4 -1700
Contr
ol
1
No - - 1 Ninguno
+2000 1016,67 ± 275,38 c2 - 200
3 +1000
4 Si 2 días Líq/Semi-líq 2 Ninguno -1600 -1600,00 ± 0,00 a
• Vega et al., 2011.
• Ozpinar et al., 1996.
•Li et al., 2009.
Los datos se expresan como la media ± el desvío estándar. Letras diferentes indican diferencias significativas (p= 0,0185).
� En conjunto, los resultados de esta tesis indican que laadministración de IgY anti-ECET, mediante hidrogeles pH-sensibles,administración de IgY anti-ECET, mediante hidrogeles pH-sensibles,resulta eficaz para controlar la diarrea por ECET y por K88.
� La tecnología de IgY representa una solución alternativaespecialmente en aquellos establecimientos donde la diarreaneonatal de los terneros causa importantes problemas económicosy para lechones destetados.
Tecnología de IgY: sistema inmune asociado a mucosas
(MALT) y a intestino (GALT) en gallinas inmunizadas contra
Escherichia coli K8”.
Doctorando: Magister Lic. María Fernanda PERALTA
Directora: Dra. Adriana Beatriz VIVAS.
Codirectora: Dra María Das Gracia MIRANDA DANELLI.
CoDirector: Dr. Raúl D. MIAZZO.
POBLACIONES DE LI B
Sangre periférica BazoControl
Muchas Gracias Muchas Gracias Muchas Gracias Muchas Gracias
por su atenciónpor su atenciónpor su atenciónpor su atención