39530813 caro a mecanismos moleculares de la muerte celular inducida por privacion de glucosa 2010

5/21/2018 39530813 Caro a Mecanismos Moleculares de La Muerte Celular Inducida Por Privacion de Glucosa 2010

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TesisDoctoral

MECANISMOSMOLEC

ULARESDELAMUERTECELULARINDUC

IDAPORPRIVACINDEGLUCOSA

AlfredoCaroMaldonado


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Doctorado en Inmunologa Molecular y

Celular

Tesis Doctoral:

MECANISMOS MOLECULARESDE LA MUERTE CELULAR

INDUCIDA POR PRIVACIN DE

GLUCOSA

Doctorando: Alfredo Caro Maldonado

Directora de Tesis: Cristina Muoz Pinedo


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A los que luchan, a los utpicos, a mis padres.

Ella est en el horizonte. Me acerco dos pasos, ella se aleja dos pasos.

Camino diez pasos y el horizonte se corre diez pasos ms all. Por mucho que

yo camine, nunca la alcanzar. Para qu sirve la utopa?

Para eso sirve: para caminar.

Eduardo Galeano. La Utopa


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CITALos filsofos (cientficos) no han hecho ms que interpretarde diversos modos el mundo, pero de lo que se trata es de

transformarlo.Carlos Marx, (Modificacin) de la Tesis 11 sobre Feuerbach.

AGRADECIMIENTOS

Echo en falta en el reglamento de la tesis la posibilidad deplasmar sobre el papel lo que ha significado para m hacerla tesis, por eso lo ir escribiendo aqu mismo, en losagradecimientos. Y por qu entre comillas? Porque es

necesaria un poco de irona en esto de la ciencia, sinhumor e irona difcilmente se puede llegar cuerdo al finaldel camino.Agradezco a la tesis la posibilidad que me ha dado deaprender, de superarme, de transformar lo imposible enrealizable, conocer mundo y gente, de hacer lo que me

gusta.Agradezco a la tesis el mileurismo, la precariedad, laincertidumbre, las frustraciones, la burrocracia y demsobstculos de la seleccin artificial que supone una tesisdoctoral en nuestro pas.Agradezco a la administracin todos sus obstculos, suempeo en que no me licenciara y despus que no hicieraesta tesis porque no era vlido. An as parece que lo heconseguido.En todas las tesis aparece en los agradecimientos el jefe.Pero en muchas, y me consta, la sinceridad no es mucha y

el merecimiento an menos. sta no es el caso. Confianza,respeto, sinceridad, honestidad, aprendizaje, interaccin,apoyo, complicidad frente a la mediocridad esto es lo queha representado mi relacin con Cris. Apenas unos aosmayor que yo, pero a aos luz en ciencia. Ha sido unverdadero placer ser su primer predoc, que no becario.Agradezco a la FJI-Precarios, a Drecerca (muyespecialmente a Elena, Brbara y Noe) y a todos losrepresentantes de predocs del IDIBELL por demostrarmeque luchar s que sirve, que otra ciencia, y por ende, otro


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mundo es posible. La FJI demuestra que la dignidad, lalucha, el tesn y la excelencia cientfica pueden ir de lamano. Es ms, sin crtica no puede haber ciencia, sin

nimo de progreso tampoco.La FJI durante ms de cuatro aos me ha enseado lacapacidad de innovacin, el corazn, la capacidad desacrificio, los ideales, las ganas de aprender, etc. de gentesno posicionadas polticamente, sin manuales ni doctrinas.Ellos demuestran que todo es posible.

Agradezco muchsimo a mi maestra, la que compens mirama anarquista con unas dosis de sovietismo cientfico,

orden, limpieza y disciplina. Mara, nunca olvidar lo queme enseaste, otra cosa es que sea capaz de seguir con esas

prcticas y Bakunin no campe a sus anchas por losbenchs de mi vida. Eso s, buena parte de esta tesis ladebo a ella, sin duda.

Hace aos me preguntaron por qu haca biologa y nociencias polticas. Bueno, me lo han preguntado muchasveces. Yo dije que haca biologa para hacer la revolucin.Y por qu he hecho la tesis, por lo mismo, para aportar mi

granito de arena a esa transformacin urgentementenecesaria. Por eso tengo que agradecer a todos esos

personajes que me acercaron a la ciencia marxista, con losque madur, espero no dejarme ninguno: Ale, Jose Juan,Valentn, Carlos Enrquez, Luis Domingo, Varico, David,Manolo Valle, Amanda, etc. Y agradecer a todos aquellosque me hicieron alejarme de la rama burro-institucional y

ms amarilla, y por tanto del positivismo y mecanicismocientfico: Manuel, Jorge, Puentedura, Josevi y undesgraciado y largusimo etc.Hay gente sin la que me hubiera sido mucho ms difcilterminar esto, tirar palante, mis amigos Javi, Matas,Adolfo y Jess. Javi, Matas y Moha me inspiraron en losltimos das de la carrera, vivir con ellos hizo quesintetizara Biologa, ciencia y poltica en uno.


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A mi familia, padres y hermano. Sin ellos no habrallegado hasta aqu. Me han dado valor y valores. A vecesdemasiados...Espritu de sacrificio, honestidad y seriedad

tan necesarios para terminar una carrera en lascondiciones en las que lo hice, y ser capaz de mudarme deciudad sin pensrmelo dos veces. Por apoyarme en todo loque he hecho, en todas las decisiones, y lo seguirnhaciendo.

Realmente alguien que me hizo muchsimo ms fcilvolver a empezar fue Mnica. Otro elemento clave en estatesis y en mi vida.

Agradezco a todos aquellas estudiantes (estos s) deprcticas que han pasado por el laboratorio, especialmentea Marcela. Me han enseado un poco a ensear. Tambina que se puede ser "jefecillo" y no explotar, ridiculizar,acosar ni maltratar como tanto se estila en esta profesin.

Pero si alguien ha influido enormemente en esta tesis hasido Silvia. Me ha enseado tantas cosas! La ms

importante de todas es que no slo de ciencia vive el"hombre". Buena parte del trabajo es tambin suyo,durante meses hemos trabajado y algo ms, codo con codo.Silvia es un presente continuo, un gerundio. Me hadescubierto el mundo de las emociones, y de lo necesariasque son para la revolucin y la ciencia. Ella me ha hechover que mi camino es el correcto, me ha hecho mirar hacia

adentro sin tener demasiado miedo al vaco, nadie comoella ha sabido infundirme nimos y autoestima, aunquetambin algn cabreo. Su sinceridad y su crtica mordazson tan necesarias en este mundo de hipocresas, dedemostrar ms de lo que se es. Silvia no necesitademostrarle a nadie lo que sabe, o lo que no. qu cunda elejemplo! Gracias, te quiero.


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Tambin quiero agradecer a Mara que me ayude aentender quin soy, de dnde vengo y a disfrutar un pocoms de la vida.

Agradezco a todos los que me acompaaron en mis dosestancias. A Lluis y a Xavi por ensearme a surfear y nomorir en el intento (aunque por poco), a Cintia por sudulzura y compaa en tierras australes. A Guillermo,Amanda, Vctor, Miguel y Mar por todo su cario yayuda. Desde luego que sin ellos mi estancia en Memphishubiera sido una pesadilla, con ellos fue un sueo.

Agradezco especialmente a Stephen Tait, Doug, John, Nufiy dems "nativos" que fueron hospitalarios, pacientes,maestros y hasta "chferes". Ellos no leern esto.

Adems de agradecer quiero animar. A todas esaspersonas que hay a mi alrededor tan especiales y quetienen tantas dificultades. Mireia, Eder, Violeta, Diana,Laia, Olga, Joana y un desgraciado etc. Sufren el mundo de

la irracionalidad dentro del "racionalismo cientfico".Sufren la mediocridad dentro de la "excelencia". Aos deexperiencia por fin me han hecho entender que el ejemplono cambia conciencias, pero si terminar una tesis enmenos de 4 aos, gracias a Cristina, puede servir para almenos despertar un pequesimo remordimiento en laalmohada, bienvenido sea. difundida sea la buena nueva!

Con la excelencia no s, pero nuestr tesis (no es slo ma),demuestra que la calidad no est reida con el bienestar.Creo sinceramente que hemos hecho un buen trabajo, queCristina tendr un futuro duro, pero algn da estesistema cientfico de m..... le permitir situarse donde letoca.


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Espero no dejarme a nadie, pero son tantas personas lasque han hecho esto posible!.


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Todos somos muy ignorantes. Lo que ocurre es que no todos ignoramos las

mismas cosas. Einstein.

NDICE:I. ABREVIATURAS......................................................................................... 5

II. RESUMEN.................................................................................................. 7

III. INTRODUCCIN...................................................................................... 11

1 METABOLISMO Y CNCER ....................................................................... 11

1. METABOLISMO ENERGTICO ............................................................. 11

Glucosa:............................................................................................ 11

Glutamina (Gln):............................................................................... 14

Adaptaciones a la escasez de nutrientes.................................... 15

2. AUTOFAGIA ............................................................................................. 19

2.1. REGULACIN Y MECANISMOS ........................................................... 21

2.2. DETECCIN DE LA AUTOFAGIA .......................................................... 23

3. MUERTE CELULAR ................................................................................... 25

3.1. INTRODUCCIN .................................................................................. 25

3.2. APOPTOSIS ......................................................................................... 27

3.3. CASPASAS ........................................................................................... 29

CASPASAS INICIADORAS:................................................................ 31

CASPASAS EFECTORAS:.................................................................. 33

3.4. MECANISMOS DE INDUCCIN DE APOPTOSIS ................................... 33

3.4.1. RUTA EXTRNSECA - REGULACIN............................ 34

a) RECEPTORES DE MUERTE.................................................... 34b) CASPASA-8................................................................................. 38

c) DIFERENCIAS ENTRE APOPTOSIS TIPO I Y II.................. 41

d) SENSIBILIZACIN A LA VA EXTRNSECA.......................... 42

3.4.2. VA INTRNSECA - REGULACIN.................................. 46

3.4.3. PERFORINA GRANZIMA............................................... 49

3.5. APOPTOSIS INDUCIDA POR ESCASEZ DE NUTRIENTES ....................... 49


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3.6. APOPTOSIS Y AUTOFAGIA .................................................................. 53

3.7. NECROSIS ............................................................................................ 55

3.7.1. NECROPTOSIS................................................................... 56

4. MUERTE CELULAR Y CNCER .................................................................. 57

IV. OBJETIVOS............................................................................................... 59

V. MATERIALES Y MTODOS....................................................................... 61

1 MATERIALES ............................................................................................ 61

1.1. LNEAS CELULARES ............................................................................. 61

1.2. REACTIVOS.......................................................................................... 61

2. METODOLOGA ........................................................................................ 69

2.1. CULTIVO CELULAR Y TRATAMIENTOS ................................................ 69

2.2. TRANSFECCIONES TRANSITORIAS ...................................................... 69

Disminucin de los niveles de protena mediante ARN deinterferencia.......................................................................................... 69

Expresin de ADN exgeno.............................................................. 70

2.3. TRANSFECCIONES ESTABLES. ............................................................. 70

Retrovirus:............................................................................................ 70

Expresin de protenas............................................................... 70

Disminucin de los niveles de protena mediante ARN deinterferencia.......................................................................................... 71

Transfecciones estables por seleccin............................................ 71

2.4. MEDICIN DE LA MUERTE CELULAR: ................................................. 71

2.4.1. MEDICIN DE LA VIABILIDAD POR CRISTAL VIOLETA............ 72

2.4.2. DETECCIN DE APOPTOSIS POR CITOMETRA DE FLUJO: ...... 72

2.4.3. ACTIVIDAD CASPASA-3................................................... 74

2.5. WESTERN BLOT: ................................................................................. 75

2.6. RT-PCR: ............................................................................................... 76

2.7. MICROSCOPA. ................................................................................... 76


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VI. RESULTADOS........................................................................................... 79

1. LAS CLULAS DEFICIENTES EN BAX Y BAK SON SENSIBLES A DIFERENTES

TRATAMIENTOS ............................................................................................... 79

ANTECEDENTES .......................................................................................... 79

2. LA PRIVACIN DE GLUCOSA PUEDE INDUCIR APOPTOSIS O NECROSIS

DEPENDIENDO DE LA LNEA CELULAR. ............................................................ 81

3. LA PRIVACIN DE GLUCOSA INDUCE ACTIVIDAD CASPASA EN

FIBROBLASTOS MURINOS INMORTALIZADOS ................................................. 85

4. LA APOPTOSIS INDUCIDA POR LA PRIVACIN DE GLUCOSA EN CLULAS

DKO TIENE UN FENOTIPO ATPICO. ................................................................. 88

5. LA APOPTOSIS INDUCIDA POR PRIVACIN DE GLUCOSA ES

INDEPENDIENTE DE LA VA INTRNSECA ......................................................... 91

5.1. La apoptosis inducida por privacin de glucosa en fibroblastos

murinos deficientes en Bax y Bak no es dependiente de la ruta

mitocondrial. .............................................................................................. 91

5.2. Fibroblastos murinos sobre-expresando establemente Bcl-2 mueren

por apoptosis tras privarlos de glucosa. .................................................... 93

5.3. Lneas celulares que sobre-expresan Bcl-xL mueren en ausencia deglucosa. ....................................................................................................... 94

6. LA CASPASA INICIADORA DE LA APOPTOSIS INDUCIDA POR PRIVACIN

DE GLUCOSA ES LA CASPASA-8 ....................................................................... 97

6.1. La protena viral CrmA protege de la retirada de glucosa. ................ 97

6.2. La reduccin de los niveles de caspasa-8 protege de la privacin de

glucosa. ....................................................................................................... 98

7. LA APOPTOSIS INDUCIDA POR PRIVACIN DE GLUCOSA ESINDEPENDIENTE DE LA INTERACCIN DE LOS LIGANDOS DE MUERTE CON

SUS RECEPTORES. .......................................................................................... 101

7.1. La muerte inducida por privacin de glucosa en DKO no est mediada

por TNF. .................................................................................................... 101

7.2. La muerte inducida por privacin de glucosa en clulas DKO no es

mediada por FasL. .................................................................................... 104


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7.3. TRAIL tampoco est implicado en la muerte por privacin de glucosa

en clulas DKO. ......................................................................................... 105

8. LOS COMPONENTES DEL DISC NO SON NECESARIOS PARA LA MUERTE

POR PRIVACIN DE GLUCOSA ....................................................................... 107

8.1. La sobreexpresin de c-FLIPL no protege de la privacin de glucosa en

clulas deficientes en Bax y Bak. .............................................................. 107

8.2. Estudio de la implicacin de FADD en la muerte por privacin de

glucosa. ..................................................................................................... 109

8.3. No hay sinergismo entre la falta de cIAP1 y la muerte inducida por

privacin de glucosa. ................................................................................ 111

8.4. RIPK1 no est implicado en la apoptosis inducida por privacin deglucosa. ..................................................................................................... 113

9. METABOLISMO Y MUERTE .................................................................... 116

9.1. La privacin de glucosa induce agregacin de GFP-LC3. .................. 116

9.2. La 3-metiladenina reduce significativamente el porcentaje de clulas

hipodiploides. ........................................................................................... 118

9.3. Fibroblastos murinos deficientes en ATG7 son ms resistentes a la

privacin de glucosa que clulas que la expresan. .................................. 119

9.4. La cloroquina no altera el porcentaje de apoptosis inducida por

privacin de glucosa en clulas deficientes en Bax y Bak. ....................... 121

9.5. No se observan membranas de autofagosomas por microscopa

electrnica tras la privacin de glucosa. .................................................. 122

9.6. A pesar de acumularse, la protena p62 no est implicada en la

muerte inducida por privacin de glucosa. .............................................. 124

VII. DISCUSIN GENERAL.................................................................... 1271. LA PRIVACIN DE GLUCOSA INDUCE APOPTOSIS O NECROSIS

DEPENDIENDO DE LA LNEA CELULAR ........................................................... 127

2. LA CASPASA INICIADORA ES LA CASPASA-8 PERO

INDEPENDIENTEMENTE DE LA VA CLSICA DE RECEPTORES DE MUERTE .. 132

3. METABOLISMO Y MUERTE CELULAR ..................................................... 137

VIII. CONCLUSIONES ..................................................................................... 141

IX. REFERENCIAS.................................................................................. 143


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I. ABREVIATURAS

3-MA: 3-MetiladeninaADN: cido Desoxirribonucleico.AICAR: 5-amino-imidazol-4-carboxamida ribonuclesido.AMP: Adenosina monofosfato.ARN: cido Ribonucleico.ARNm: cido Ribonucleico mensajero.Atg: Genes relacionados con autofagia (del ingls, Autophagy-related genes)

ATP: Adenosn trifosfato.BH: Dominio de homologa a Bcl-2 (del ingls, Bcl-2 homologydomain)BIR: (del ingls, Baculoviral IAP repeat)CARD: Dominios de reclutamiento y activacin de caspasas (delingls, Caspase activation and recruitment domain)CHX: Cicloheximida.DAPI: Diaminofenilindol.DD: Dominio de muerte (del ingls, Death domain)

DED: Dominio efector de muerte (del ingls, Death effectordomain)DISC: Complejo inductor de muerte (del ingls, Death-inducingsignaling complex)DKO: Doble Knock out. Hace referencia a las clulas deficientesen Bax y Bak.DMEM: (del ingls, Dubelcos modified Eagles medium)DMSO: Dimetilsulfxido.DNA: ADN (del ingls, Deoxyribonucleic acid)

ECL: Reactivo quimioluminiscente (del ingls, Enhancedchemiluminiscence)EDTA: Etinildiaminotetraacetato.EM: Microscopa electrnica (del ingls, Electron microscopy)FACS: Citometra de flujo (del ingls, Fluorescence activated cellsorting)FBS: Suero bovino fetal (del ingls, Foetal bovine serum)GFP: Protena fluorescente verde (del ingls, Green fluorescentprotein)

HRP: Peroxidasa de rbano (del ingls, Horseradish peroxidase)


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IFN: InterfernLDH: Lactato deshidrogenasa.MEFs: Fibroblastos embrionarios de ratn (del ingls, Murineembryonic fibroblasts)MOMP: Permeabilizacin de la membrana mitocondrial externa(del ingls, mitochondrial outer membrane permeabilization).MPT: Transicin de la permeabilidad de la membrana mitocondrial(del ingls, Mitochondrial membrane permeability transition)NK: (del ingls, Natural killer)PBS: Solucin salina fosfato (del ingls, Phosphate-bufferedsaline)PE: Fosfatidiletanolamina (del ingls, Phosphatidilethanolamine)

PI: Yoduro de propidio (del ingls, Propidium iodide)PMM: Potencial de membrana mitocondrial.PS: Fosfatidilserina (del ingls, Phosphatidilserine)PTP: Poro transitorio de permeabilidad.PVDF: (del ingls, Polyvinylidene difluoride)RE: Retculo endoplsmico o endoplasmticoRING: (del ingls, Really interesting new gene)RNA: ARN (del ingls, Ribonucleic acid)Rnase: Ribonucleasa.

ROS: Especies reactivas de oxgeno (del ingls, Reactive OxygenSpecies)RT-PCR: Transcripcin reversa de ARN y amplificacin de ADNpor Reaccin en Cadena de la Polimerasa (del ingls, Reversetranscriptasepolymerase chain reaction)SDS: Sodium dodecyl sulfate.shRNA: (del ingls, Short hairpin RNA).siRNA: ARN de interferencia (del ingls, Small interfering RNA).SV40: (del ingls, Simian vacuolating virus 40).

TAE: Tris acetato EDTA.TBS: Solucin salina de Tris (del ingls, Tris-buffered saline)TCR: Receptor de clulas T (del ingls, T-cell receptor)TE: Tris EDTA.TEMED: Tetrametiletileno diamina (del ingls, N-N-N-N-Tetramethylethylene diamine)TRIS: (del ingls, Trishydroxymethylaminomethane)WT: Fenotipo silvestre (del ingls Wild Type).z-VAD-fmk: (del ingls, Z-Val-Ala-Ala-Asp(OMe)-fluoromethyl

ketone)


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II. RESUMEN

La apoptosis es una forma de muerte controlada por unas proteasas

llamadas caspasas. La activacin de las caspasas lleva a ladesintegracin controlada de la clula y a su fagocitacin por parte demacrfagos. De esta manera, se evita la salida de materialcitoplasmtico al medio extracelular, lo que evita la inflamacin. Sinembargo, la necrosis es una forma de muerte que no depende decaspasas, pero que s que puede tener un control y ser homeosttico.La necrosis s que genera una extravasacin del material intracelularal exterior.Buena parte de los tumores presentan la caracterstica de tener un

metabolismo glicoltico superior al de la mayora de los tejidos.Adems, esta gran dependencia en la glucosa hace a las clulasbastante sensibles tanto a su ausencia como a la inhibicin delmetabolismo glicoltico. Esta caracterstica es usada tanto endiagnstico como en tratamientos en pruebas: la 2-deoxiglucosa seest utilizando en ensayos clnicos. Sin embargo se sabe poco decmo la inhibicin del metabolismo de la glucosa mata a las clulas.Otra caracterstica de las clulas tumorales es la de ser resistentes amuchos inductores de muerte, tanto de apoptosis como de necrosis.

Estas clulas han tenido que escapar de los mecanismos fisiolgicosde control anti-neoplsico del organismo: tanto los controlesintracelulares (induccin de apoptosis), como sistmicos (sistemainmunolgico). Adems, muchos tumores slidos pueden sufrirambientes con escasez de nutrientes. Se da la coincidencia de quemuchos oncogenes estn a su vez relacionados con el metabolismo.En clulas sanas, en general, los ambientes con escasez denutrientes llevan a la induccin de protenas BH3 y a la bajada de losniveles de protenas antiapoptticas de la familia Bcl-2 quedesencadenan apoptosis por la va mitocondrial o intrnseca. Sinembargo, muchos tumores tienen bloqueada esta va de activacin deapoptosis, lo que, como deca ms arriba, les hace ser resistentes adiversos ambientes estresantes.Todos estos datos hacen interesante el estudio del efecto de laprivacin de glucosa sobre varios tipos celulares. Por un lado,caracterizar los efectos de la privacin de glucosa en clulas quetienen bloqueada la va mitocondrial de la apoptosis al ser deficientes

en las protenas Bax y Bak (DKO). Por otro, estudiar los efectos de laprivacin de glucosa en clulas tumorales humanas.


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Dentro de esta caracterizacin, es importante averiguar si se muerenpor apoptosis o necrosis. Qu elementos reguladores estnimplicados, protectores o sensibilizadores. Si es apoptosis, y la muertedepende de caspasas, averiguar qu caspasas son las iniciadoras ycmo se estn activando. Y cul es el papel del metabolismo engeneral y de la autofagia en particular en esta muerte.En esta tesis se muestra cmo la privacin de glucosa induceactividad caspasa en clulas deficientes en Bax y Bak. Y que estaactividad caspasa es dependiente de la caspasa iniciadora 8. Lacaspasa-8 es la caspasa responsable de la activacin de la rutaextrnseca de la apoptosis.Aqu enseamos que la apoptosis inducida por la privacin de glucosa

en clulas DKO induce actividad caspasa, degradacin del ADN,condensacin atpica de la cromatina, externalizacin de lafosfatidilserina y dems rasgos tpicos de apoptosis como el corte desustratos especficos de caspasas. Todo esto, excepto lacondensacin de la cromatina es inhibido por inhibidores de caspasas.Nosotros hemos demostrado que la privacin de glucosa no induceapoptosis al sensibilizar a la clula a los ligandos de muerte, sino quees independiente de la interaccin de ligandos y receptores de muerte.Asimismo, hemos demostrado que la activacin de caspasa-8 no se

inhibe por FLIP, y probablemente FADD no es la molcula adaptadorao reclutadora de caspasa-8. Aunque esto ltimo necesita deconfirmacin.Hemos intentado ver si otros mecanismos de activacin de lacaspasa-8 que han sido publicados en los ltimos aos podran ser lacausa. Ni p62, ni FLIP estn implicados en la muerte inducida porprivacin de glucosa. Un posible reclutamiento de la caspasa-8 alcomplejo formado por RIPK1 no es el responsable, ni tampoco laactividad kinasa de RIPK1 ya que la necrostatina no protege de la

muerte.El estudio del papel de la autofagia da resultados contradictorios. Porun lado, la autofagia sera un proceso que sensibilizara a las clulas ala privacin de glucosa, ya que la 3-metil-adenina protege, y lasclulas deficientes en Atg7 estn tambin protegidas. Pero por otrolado, la autofagia no tendra un papel importante, porque la presenciade cloroquina no afecta a la privacin de glucosa. Aunque no hemospodido clarificar ni siquiera si se est induciendo autofagia, o si esta almenos se resuelve completamente. A pesar de que vemos acmulos

de GFP-LC3 por microscopa confocal, no vemos vesculas con doble


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membrana al microscopio electrnico ni desaparicin de p62. Msbien al contrario, la privacin de glucosa induce una acumulacin dep62, que como se deca ms arriba no parece ser la causa de laactivacin de la caspasa-8..Por ltimo indicar que la caspasa-8 tambin est implicada en lamuerte por privacin de glucosa en las clulas HeLa, que mueren deforma dependiente de caspasas. Pero que otras lneas celulares, porejemplo las clulas de rabdomiosarcoma (RH30) o las de tumor demama (MCF7) sufren necrosis tras la privacin de glucosa.


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III. INTRODUCCIN1 METABOLISMO Y CNCER

1. METABOLISMO ENERGTICO

Todos los organismos vivos son sistemas abiertos que necesitan unconstante flujo de elementos del exterior, incluidos nutrientes, ynecesitan librarse de los deshechos de su metabolismo.Para evitar la necesidad de disponer continuamente de nutrientes, losorganismos desarrollan mecanismos de almacenamiento tisular ycelular.Pero cules son los principales nutrientes con los que las clulas

obtienen el ATP? A nuestra mente viene en seguida la glucosa comoprincipal fuente de energa de la mayor parte de los seres vivos. Perosi se mira con detenimiento, en muchos tipos celulares yespecialmente en tumores, la glutamina puede ser la principal fuentede energa y nitrgeno de las clulas (DeBerardinis and Cheng 2009).En cualquier caso, la glucosa es uno de los nutrientes esenciales de lamayora de los seres vivos, tanto para la produccin de ATP, comopara su transformacin en otros nutrientes esenciales como cidosgrasos.

Glucosa:

La glicolisis es la ruta metablica que convierte la glucosa en piruvato.Es comn a la mayora de los seres vivos con ligeras variaciones. Y elque una clula utilice la glicolisis es independientemente de su estadooxidativo. La primera parte es comn a la ruta anaerbica y aerbica.La glucosa es convertida en piruvato, con la produccin de 2 ATPs. Encondiciones anaerbicas, el piruvato ser transformado en cidolctico o etanol (glicolisis anaerbica); mientras que en condicionesaerbicas el piruvato es convertido en acetil-coA (acetil coenzima A)por la piruvato deshidrogenasa. Este acetil-coA entra en el ciclo de laspentosas fosfato (ciclo de Krebs), donde se producen 34 molculas deATP por acetil-coA. La conversin anaerbica del piruvato en etanol olactato es mucho menos eficiente en la produccin de ATPs.En condiciones normales, en organismos aerbicos, conviven ambossistemas, con un peso importante de la ruta oxidativa de la

mitocondria. En situaciones de baja presin de oxgeno, por ejemplo


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en los msculos de los velocistas, las clulas musculares tienen lacapacidad de virar rpidamente su produccin de ATP hacia laglicolisis anaerbica, con la consecuente produccin de lactato.

Efecto Warburg: realidad o fantasa. Hace ms de 80 aos queWarburg describi que las clulas tumorales tienden a utilizar muchams glucosa que los tejidos sanos (Warburg, Wind et al. 1927). Seconoce como efecto Warburg el que los tumores utilicenpreferencialmente la ruta anaerbica de la glicolisis en vez de la rutaoxidativa. Esto ocurre incluso en ambientes con alta presin deoxgeno como en tumores sanguneos.Hoy da el efecto Warburg se utiliza como un marcador del cncer,

llegndose a utilizar para diagnstico clnico. El PET (tomografa deemisin de positrones), utiliza la 2-[18F] fluoro-2-desoxi-D-glucosa,que preferencialmente va a clulas con un alto requerimiento deglucosa, de manera que los tumores son as fcilmente detectables.

Pero como decamos, la glicolisis anaerbica es energticamenteineficiente. Entonces por qu los tumores la utilizan produciendogran cantidad de lactato? Utilizan la glicolisis nicamente para laproduccin de ATP?

Realmente, las clulas tumorales todava mantienen un grado defosforilacin oxidativa que es variable entre tumores. Y la contribucinde la glicolisis al ATP celular puede ir de un 50% como describiWarburg a menos de un 5% en otras lneas tumorales (DeBerardinisand Cheng 2009).Adems, no todos los tumores son PET- positivos, ni todas lastransformaciones neoplsicas estn asociadas con un incremento dela glicolisis anaerbica. De hecho, hay tumores con una funcinmitocondrial aumentada.

Para algunos investigadores como Craig Thompson, latransformacin neoplsica lleva asociada necesariamente el cambiometablico a glicolisis anaerbica. Segn otros, es un epifenmenode la transformacin ms que una causa (Garber 2004).Lo que parece estar claro es que no es la adaptacin a ambienteshipxicos lo que hace que una clula sea glicoltica, ya que tumoressanguneos o pulmonares siguen siendo glicolticos y crecen enambientes muy oxigenados.


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Difcilmente se puede explicar la causa del efecto Warburg por unacuestin de demanda energtica o porque los tumores sufran hipoxia.Probablemente es el hecho de que en la glicolisis, en la primera parte,no slo se produce ATP y NADH, sino piruvato, que es unintermediario necesario para la produccin de esqueletos carbonados:cidos grasos, nucletidos y glcidos. Imprescindibles para una clulaen rpido crecimiento como las tumorales, ms que el ATP. Pero losintermediarios de esos elementos se producen en el ciclo de loscarbonos, en la mitocondria (Figura 1). Por tanto, aunque la clula seaglicoltica, es imprescindible que el ciclo de los carbonos sigafuncionando (DeBerardinis and Cheng 2009).Segn el Dr. C. Thompson (Jones and Thompson 2009), una serie demutaciones desregulan la ingesta de nutrientes por parte de la clula,que la hace ms autnoma al medio, y facilita su transformacinneoplsica.

Muchos oncogenes estn relacionados con el metabolismo. Porejemplo, c-Myc acta como un oncogn. Ya en 1997 se vio que la

Figura 1: Rutas de metabolizacin de la glucosa y la glutamina.

(DeBerardinis and Cheng 2009)


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lactato deshidrogenasa (LDH) era regulada por c-Myc (Dang andLewis 1997). La enzima LDH est implicada en la glicolisisanaerbica.De todas maneras el que las clulas tumorales tengan incrementadahasta 200 veces la glicolisis anaerbica sea una causa oconsecuencia de la transformacin no resta importancia al hecho deque este efecto Warburg hace a estas clulas ms sensibles a lainhibicin del metabolismo glicoltico.Y es que esta caracterstica no se usa slo para el diagnstico, sinoque en la actualidad se est utilizando con xito el inhibidor 2-deoxiglucosa que est en fase clnica (Raez, Langmuir et al. 2007). La2-deoxiglucosa es fosforilada por la hexoquinasa a la que queda

unida, bloquendola. De esta forma la 2-deoxiglucosa reduce el ATPintracelular (Zhong, Xiong et al. 2009) e inhibe la proliferacin celular(Kang and Hwang 2006).Pero la glucosa no slo es utilizada como fuente energtica o demateria prima, sino que es necesaria para la modificacin post-traduccional de protenas, la glicosilacin. Por lo que la 2-deoxiglucosainduce estrs del retculo endoplsmico por acumulacin de clulas noglicosiladas debido a la falta de glucosa-6P(Kang and Hwang 2006).

Pero faltan piezas en el puzle. No se puede entender el metabolismoenergtico y biosinttico de las clulas en crecimiento sin tener encuenta que mientras que el reemplazamiento de acetil-coA viene dela glicolisis, la mayor parte del reemplazamiento (anapleurosis) deloxalacetato es producto de la glutaminolisis.No est claro entonces por qu esa gran dependencia de las clulastumorales por la glucosa, y lo que es ms interesante, por qu sonespecialmente sensibles a su falta. Es el efecto Warburg causa oconsecuencia? Realmente la mayora de los tumores tienen

bloqueada la ruta de los carbonos mitocondrial?Otros elementos han resurgido tambin como importantes tanto en elmetabolismo energtico como anablico, la Glutamina.

Glutamina (Gln):

Aunque la Gln contribuye slo al 4% de la masa muscular, supone el20% de los aminocidos de la sangre.La Gln es utilizada para sntesis de nucletidos o para reacciones de

glicosilacin por un lado, o para la produccin de glutamato. El


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glutamato es un elemento escaso en la sangre y muy necesario paraclulas proliferantes, por ello los tumores tienen mucha actividadglutaminasa, que convierte la Gln en glutamato. Este es utilizado parala produccin de glutathione, antioxidante imprescindible, que permitea las clulas tumorales resistir al estrs oxidativo derivado del intensometabolismo. El glutamato es tambin utilizado como un sustrato de larespiracin. La oxidacin del esqueleto carbonado del glutamato, quepasa a convertirse en -cetoglutarato, es uno de las principalesfuentes de energa para clulas proliferando, incluidas no slo clulastumorales, sino linfocitos, enterocitos, fibroblastos, etc. (DeBerardinisand Cheng 2009) .

Sin embargo, parece que en clulas tumorales en proliferacin, el usode la glutamina, al igual que el de la glucosa parece ser tambinineficiente. Buena parte del nitrgeno y el esqueleto carbonado esliberado sin metabolizar completamente, lo que podra ser otra marcade los tumores, al igual que el efecto Warburg (DeBerardinis andCheng 2009).

Pero la glutamina tambin se utiliza como un mecanismo desealizacin celular, por ejemplo en glioma. Las clulas gliales

secretan glutamato, y el grado de secrecin es proporcional a sucapacidad de crecimiento (DeBerardinis and Cheng 2009).Receptores del glutamato (mGLUR) expresados en las clulas delglioma activan PI3K induciendo proliferacin y supervivencia.

Adaptaciones a la escasez de nutrientes

Los organismos vivos estn continuamente sujetos a periodos deescasez en la naturaleza. La disponibilidad de nutrientes determina la

expansin de especies y la colonizacin de nuevos nichos. Losnutrientes tambin dictan el momento de la reproduccin, de laesporulacin, hibernacin o diferenciacin, desde organismosfotosintticos unicelulares a mamferos. Nuestra especie sufreperiodos de escasez nutricional que pueden ser temporales en elrecin nacido o durante el sueo, o persistentes debido a la escasezde comida disponible en el entorno. Nuestro desarrollo como especieviene marcado en buena medida por la escasez de nutrientes. Tanto anivel cultural como metablico. Incluso el ayuno forma parte de

numerosas terapias.


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Tambin las clulas y los tejidos sufren privacin de nutrientes, porejemplo en situaciones patolgicas como la isquemia, donde hayescasez de nutrientes y oxgeno. Las clulas tumorales tambinsuelen sufrir escasez debido a que los tumores suelen crecer msrpido que los vasos sanguneos. Esto lleva a menudo a la formacinde centros necrticos, que son reas del tumor con gran cantidad declulas muertas debido a la falta de irrigacin sangunea.

Mientras que los organismos unicelulares han desarrollado formas deresistencia para sobrevivir a los periodos de escasez, los animalesutilizan hormonas para movilizar las reservas energticas. A nivelcelular, la escasez de nutrientes provoca diferentes respuestas

dependiendo del tejido. Estas respuestas generalmente llevan a lamovilizacin de nutrientes almacenados y a la adaptacin a esareduccin en la cantidad de nutrientes. Cuando esa escasez es agudao crnica lleva a la muerte de la clula. Pero en un primer momento laclula responde parando todo su metabolismo anablico: disminucinde la sntesis de protenas, y ribosomas o parada del ciclo celular. Yun aumento en la expresin de genes relacionados con la absorcin ycon el catabolismo: transportadores de membrana, induccin deautofagia, etc.

Las respuestas son ms complejas debido a que los aminocidos, laglucosa y los cidos grasos son, adems de nutrientes energticos,fuentes de esqueletos carbonados para la sntesis de estructurascelulares.

La principal manera en la que la clula detecta escasez es a travs delATP y los aminocidos. De esa manera se est detectando escasezenergtica o nutricional. La clula, ante la escasez, lo primero quehace es adaptarse a ella, reduciendo el gasto e intentando aumentar

la absorcin y la degradacin del esqueleto de la clula que ha servidocomo estructura pero que puede convertirse en energa.La falta de energa (ATP) es detectada por la clula a travs de laactivacin de la AMPK (proten quinasa activada por AMP) (Hardie2007). Es una protena que forma un complejo trimrico, con actividadquinasa, que es activado alostricamente por el ratio AMP/ATP. Laactivacin de la AMPK permite a la clula reaccionar a la falta de ATPregulando procesos como el transporte de glucosa (incrementando laexpresin del transportador de glucosa GLUT4). La AMPK tambin

regula la transcripcin, por ejemplo inhibiendo los genes implicados en


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biosntesis. Bajos niveles de ATP y la activacin de AMPK tambininhiben la proliferacin celular a travs de la activacin de p53 y laestabilizacin de p27 (Jones and Thompson 2009), (Liang, Shao et al.2007).

El AMP se une a la subunidad gamma de la AMPK, que es donde estla actividad quinasa. Hay algunas protenas que parecen actuar porencima de AMPK. Una de ellas, LKB1, es una quinasa considerada unsupresor de tumores que est mutado en el sndrome de Peutz-

Jeghers. LKB1 actuara como activadora de AMPK aunque siemprejunto a la seal de AMP (Hardie 2007).Otro elemento clave para el mantenimiento de la homeostasisnutricional de la clula es TORC1. En mamferos es un complejomultiprotico que contiene mTOR, acrnimo en ingls de diana de larapamicina en mamferos. Es activado por hormonas y factores decrecimiento, y tambin se activa con la presencia de aminocidos.Aunque no se sabe si los aminocidos activan mTOR directa oindirectamente. Algunas protenas que parecen tener un rol en la

FLIPp27

Glucose deprivation / antiglycolytics

AMPK

Torp53Catabolism:Fatty acidoxidation and

autophagy

Cell cycle arrest

ER stress

BH3-only proteins

Bim Puma Bad Noxa

NADPH lossROS production

Death receptorsignaling

Mcl-1

DEATH

CHOP

Impaired

glycosylation

ATP

Figura 2: La inhibicin del metabolismo de la glucosa induce diferentes

respuestas en las clulas.


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activacin de mTOR son MAP4K3 y Rag A y B (Wang and Proud2009).No se conocen a fondo los mecanismos de activacin de mTOR porfalta de aminocidos, pero en definitiva su activacin por elaminocido leucina induce proliferacin celular y sntesis proteica. Laglutamina tambin es un aminocido esencial para la activacin demTOR. Esto es especialmente importante en tumores, ya que el altoflujo de Gln activa mTOR que induce proliferacin.

Por tanto, estos son los dos elementos claves que la clula utiliza parasentir su estado nutricional y energtico. Cuando los nutrientes sonabundantes, la clula se activa e induce proliferacin o anabolismo

segn el tipo celular. Cuando, al contrario, los nutrientes escasean,mTOR se inactiva, y AMPK se activa induciendo en un principiomecanismos de adaptacin como parada del ciclo celular, induccinde catabolismo y autofagia, esperando tiempos mejores.Si esta escasez se hace crnica, la clula terminar muriendo. Estosigue siendo un mecanismo adaptativo, que en determinados tejidospuede ser una medida desesperada como en msculo cardiaco, oadaptativa y beneficiosa para el resto del organismo, como la atrofiamuscular.


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2. AUTOFAGIA

La autofagia es un proceso homeosttico fundamental para las clulaseucariotas. Permite a las clulas degradar orgnulos y componentesdaados, y transformarlos, reciclndolos, en elementos esenciales. Esun proceso catablico por el que la clula consigue principalmenteaminocidos y renovacin de estructuras. Por autofagia entendemoscualquier proceso celular por el que contenido citoplasmtico es deuna u otra forma digerido en el interior de lisosomas.

Las clulas eucariotas tienen dos mecanismos principales dedegradacin de protenas: el proteosoma y los lisosomas. Elproteosoma es un complejo de proteasas multicataltico que degradala mayora de las protenas endgenas mal plegadas, daadas oinservibles, para mantener una funcin celular normal. Estemecanismo de degradacin juega un papel importante en mltiplesprocesos como progresin del ciclo celular, proliferacin, apoptosis o

angiognesis.

Figura 3: Los autofagosomas poseen dobles membranas. Fotografa de

microscopio electrnico. De Mizushima et al. (Mizushima, Yoshimori et al.

2010)


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El segundo mecanismo de degradacin, mediado por lisosomas,degrada protenas extracelulares internalizadas por endocitosis,fagocitosis o pinocitosis. Pero tambin degradan componentescitoplasmticos intracelulares que provienen de autofagia.La autofagia realmente engloba muchos procesos: autofagia mediadapor chaperonas, microautofagia o macroautofagia.La diferencia entre micro y macroautofagia radica en que en lamicroautofagia el lisosoma engloba directamente el contenidocitoplsmico a degradar (Kunz, Schwarz et al. 2004). Sin embargo, lamacroautofagia implica la formacin de vesculas de doble membranacitoslicas, que secuestran contenido del citoplasma y lo degradantras fusionarse con lisosomas (Levine and Kroemer 2008). A

diferencia de otras vesculas, los autofagosomas tienen doblemembrana con un tamao de entre 300 y 900 nm. y son sintetizadasde novo en el citoplasma.Mientras que el proteosoma principalmente degrada de maneraespecfica protenas de vida media corta, la autofagia es elmecanismo catablico por el que las clulas degradan protenas devida media larga, otras macromolculas e incluso orgnulos(Mortimore and Poso 1987).

Al principio se pensaba que la autofagia era un proceso dedegradacin citoplasmtica aleatorio, sin especificidad. Sin embargo,es un proceso muy controlado y bastante especfico. Por ejemplo, ladegradacin de protenas ubiquitiniladas a travs de SQSTM1/p62(Kirkin, McEwan et al. 2009). El proteosoma tiene el problema de queno es eficiente degradando grandes complejos proteicos. Sinembargo, la autofagia, a travs de este complejo SQSTM1/p62, puededegradar desde complejos proteicos marcados hasta orgnulos oincluso microorganismos (Kirkin, McEwan et al. 2009). En clulas y

tejidos deficientes en autofagia se ha visto que se induce la formacinde inclusiones de protenas ubiquitiniladas. El silenciamiento de p62lleva a la desaparicin de esas inclusiones. Adems, p62 se haidentificado como un substrato especfico que es degradado a travsde la ruta autofgica (Komatsu and Ichimura). Esto sucede debido aque interacciona con LC3 en la membrana del autofagosoma. Cuandola autofagia est inhibida, p62 se acumula. De hecho su acumulacinparece ser la responsable de algunas de las patologas derivadas dela inhibicin de la autofagia. A su vez p62 funciona como un


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transportador de protenas ubiquitiniladas a los autofagosomas(Komatsu and Ichimura).La autofagia sirve como una respuesta comn al estrs extracelular(hipoxia, altas temperaturas, falta de nutrientes) e intracelular (dao deorgnulos), permitiendo a los organismos eucariotas sobrevivir bajoestas condiciones mediante el reciclado.

Es evidente que un proceso catablico como este debe estar limitado,no puede ser crnico. Si la seal que lo induce no revierte, ladegradacin masiva de orgnulos, especialmente mitocondrias(mitofagia) llevara a que la autofagia en vez de ser protectora seaperjudicial. La clula se encontrara con materias primas pero sin

fbricas para transformarlas en energa. De hecho su desregulacines causa de varias enfermedades como cncer, cardiomiopatas,enfermedades musculares y enfermedades neurodegenerativas(Levine and Kroemer 2008).

2.1. REGULACIN Y MECANISMOS

Como deca, la autofagia es un proceso homeosttico, por lo queocurre constantemente en la clula. Existe una autofagia basal. Sin

embargo, este proceso se regula rpidamente cuando las clulas

Figura 4: Esquematizacin de la ruta molecular de la autofagia.

receptor de insulinaaminocidos

rapamicina


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necesitan nutrientes, en periodos de escasez, por ejemplo enambientes con una baja concentracin de aminocidos (Sato,Tsuchihara et al. 2007). Tambin cuando hay disminucin de factoresde crecimiento (Lum, Bauer et al. 2005) y cuando se produce unaacumulacin de componentes citoplasmticos daados en la clula(orgnulos daadas o formacin de agregados de protenas que seacumulan en la clula). En estos casos, el proceso se conoce comoautofagia inducida. Adems, tras una infeccin (Kirkegaard, Taylor etal. 2004) o durante otros tipos de estrs las clulas tambin aumentanlos niveles de autofagia.La autofagia es fuertemente inhibida por la quinasa mTOR, parece serque hiper-fosforilando a Atg13 se impide la formacin del complejo

Atg1, necesario para la formacin del autofagosoma. Tambin lopuede hacer inhibiendo eEF2 (Kamada, Funakoshi et al. 2000).Aunque se ha sugerido que se puede inducir autofagiaindependientemente de mTOR (Mordier, Deval et al. 2000), (Kochl, Huet al. 2006).Y las seales de PI3K/AKT, que responden a receptores tirosnquinasas, activan a TOR. Por tanto, la insulina, los aminocidos yfactores de crecimiento activan a TOR, inhibiendo la autofagia yactivando la sntesis de protenas a travs de la activacin de la

protena quinasa p70S6K, entre otras funciones.Por otro lado existen varios elementos que la inactivan: AMPK, eIF2aque responde a privacin de nutrientes, ARN de doble cadena, estrsdel retculo endoplsmico, p53 y un largo etctera (Levine andKroemer 2008).Hasta ahora se han descrito unas 30 protenas relacionadas con laautofagia, la mayora nombradas Atg. Estas protenas tienen diversasfunciones, desde implicadas en el sistema de conjugacin deubiquitinas, sistema de lipidacin, proten quinasas o complejos PI3K

especficos de autofagia (Hamasaki and Yoshimori).Todo empieza con un centro reclutador, son estructuras pre-autofagosoma o fagforos. Lo que no est claro es cmo se sintetizala doble membrana, sobre todo en un momento de parada en lasntesis de nuevas estructuras y es difcil estudiar si esas membranasprovienen de otras estructuras como Golgi o retculo endoplsmico.Existen estudios que indican ambas estructuras como lasresponsables. Una de las protenas esenciales en este fagforo esAtg14L, que recluta a Atg16L o LC3 a la incipiente membrana.


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Un paso fundamental es la unin covalente de fosfatidiletanolamina aLC3, formndose LC3-II. Esta unin es catalizada por una cascada dereacciones implicando a varias protenas Atg: 7, 3 y 12-5. Este LC3-II,localizado en las membranas del autofagosoma y esencial en subiognesis, es al final degradado.Mucho queda por dilucidar del proceso de formacin delautofagosoma. Por ejemplo, se sabe que Beclina-1, un homlogo enmamferos de Atg6, esencial para la autofagia, forma un complejo conactividad quinasa. En mamferos, Beclina-1 cuando se une a unasprotenas activa autofagia y cuando se une a Bcl-2 la inhibe. Pero elmecanismo es desconocido.Cuando la membrana del fagosoma se ha cerrado uno o varios

lisosomas se fusionarn, generando un fagolisosoma. En l todo elcontenido que ha quedado englobado junto con la membrana internaser degradado por las hidrolasas lisosomales. De l saldrnaminocidos y cidos grasos que podrn ser utilizados por la clula.

2.2. DETECCIN DE LA AUTOFAGIA

El hecho de que la autofagia sea un proceso tan complejo y con variasetapas claves, hace que su deteccin y medicin sea objeto decontroversia.El mtodo utilizado durante ms tiempo es la microscopa electrnica,y aunque se han desarrollado mtodos moleculares de deteccin,sigue siendo el ms fiable. Con la microscopa electrnica se detectanla formacin de estructuras intracelulares rodeadas de doblemembrana.Otro mtodo muy utilizado es la agregacin de LC3, que unido a GFP,puede ser detectado por microscopa. Efectivamente, cuando segenera el autofagosoma, el LC3 est en la membrana y esto puede

ser visualizado. Pero esto no necesariamente indica que la autofagiaest discurriendo con normalidad. Puede ocurrir que la degradacinde los autofagosomas est impedida, por ejemplo es lo que hace lacloroquina. Por ello se percibe una acumulacin de autofagosomasque puede inducir a creer que la autofagia est aumentada cuando enrealidad est inhibida.El LC3 sufre una lipidacin, y sta, por el cambio de tamao puede serdetectada por western blot, aunque aqu hay una paradoja. El LC3lipidado resuelve ms rpidamente en el gel que el LC3-I. Sin

embargo, la proporcin LC3-II/LC3 no siempre ser indicativa del


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grado de autofagia debido a que no se conoce bien la cintica deformacin, lipidacin, delipidacin. Adems de que, como se decaantes, influye tambin la cintica de fusin del lisosoma y degradacindel autofagolisosoma. De hecho, la acumulacin de LC3-II nonecesariamente indica un incremento de la autofagia, puede ser,como en el caso de p62, que realmente se est inhibiendo en un pasofinal. Por ejemplo, la bafilomicina es un potente inhibidor de la bombade protones de los lisosomas, lo que impide su fusin efectiva con losautofagosomas. Este inhibidor genera una acumulacin de LC3-II enuna situacin en la que la autofagia no es funcional.La implicacin de varias protenas en el proceso puede hacer muy tillas tcnicas de silenciamiento gnico como el siRNA, para detectar si

la autofagia est o no implicada en las consecuencias del tratamiento.Es por tanto frecuente utilizar fibroblastos deficientes en los genesAtg5 o Atg7, o silenciarlos mediante siRNA. Debido a que lo queentendemos por autofagia, la degradacin de contenido citoplasmticodentro de vacuolas, probablemente sea consecuencia de variosprocesos independientes y regulados de manera diferente, es posibleque estos abordajes de silenciamiento sean insuficientes. De hecho,se ha descrito que existe una ruta de macroautofagia independientede Atg5 y Atg7 (Nishida, Arakawa et al. 2009).

No existe un mtodo perfecto para medir autofagia. Por ello a la horade detectar autofagia es necesario asegurarse de que todas lasetapas del proceso son funcionales, utilizando diferentes tcnicas queanalicen el estatus y las funciones de la autofagia en un tratamiento ycondicin determinada (Mizushima, Yoshimori et al.).


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3. MUERTE CELULAR

3.1. INTRODUCCIN

La definicin de vida y muerte ha sido histricamente un reto filosficoy cientfico. Es un virus un ser vivo o no? Est una espora de unhongo que lleva cientos de aos en el hielo viva o no?La cosa se complica cuando nos referimos a nuestra especie. Enqu momento del desarrollo de un feto ste es considerado un servivo? Y cundo morimos? En principio sera cuando nuestro corazndeja de latir, pero qu pasa entonces con el mantenimiento de lavida artificialmente?

Estas parecen reflexiones banales con respecto al tema de esta tesis,sin embargo no lo son. Cundo una clula muere? Si pretendemosestudiar muerte celular, especialmente en el tratamiento de tumores,ms resistentes que muchas clulas, tendremos que encontrar unadefinicin comn de muerte para saber de qu estamos hablando.Como se explicar ms adelante, se han descrito varios tipos demuerte, clasificacin que viene dada por el proceso y lasconsecuencias del mismo.Se suele medir muerte celular como la incapacidad de la clula demantener la integridad de la membrana, por eso se vuelve permeablea distintos colorantes. Pero una poblacin de clulas aparentementeviva, negativa para esos colorantes como el yoduro de propidio, puedehaber dejado de ser viable. Y aqu entra un nuevo concepto, laviabilidad. Podramos definirla como la capacidad de las clulas deseguir creciendo. Esto no lo definiramos como muerte, la clula sigueestando viva, ntegra, consume energa, respira y libera deshechos yfactores al medio. Sin embargo, para nosotros, el hecho de que una

clula no sea viable es tan importante o ms que el que est muerta.Una clula que no es capaz de multiplicarse no existe en unorganismo de miles de millones de clulas. Esto es muy importante enel caso del tratamiento antitumoral. Por supuesto la mayora de lasclulas de un organismo no tienen la capacidad de dividirse, funcinque recae sobre unos pocos tipos celulares. Sin embargo esas clulastienen una funcin determinada.

Como todo, la muerte celular es un proceso, y en ese discurrir existe

un punto de no retorno, en el que la clula todava no est muerta,


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pero tampoco puede dar marcha atrs. Esto tambin ha de ser tenidoen cuenta a la hora de estudiar este fenmeno.El comit de nomenclatura en muerte celular dice que una clula estmuerte cuando ha perdido la integridad de la membrana plasmtica,cuando el ncleo se ha fragmentado o cuando los cuerpos apoptticoshan sido fagocitados (Kroemer, Galluzzi et al. 2009). Ellos consideranque clulas senescentes han de ser consideradas como vivas, aunquehayan perdido la viabilidad, la capacidad clonognica.

Sea como fuere, la muerte celular en un sentido amplio es muyimportante para la homeostasis de los organismos multicelulares ypara las poblaciones de organismos unicelulares (Prindull 1995).

Es necesaria para eliminar clulas innecesarias, envejecidas,daadas, perjudiciales, etc.En el sistema inmunolgico, despus de la proliferacin clonal anteuna infeccin, es necesario volver al estado basal, para ello loslinfocitos que haban proliferado tienen que desaparecer.Durante el desarrollo embrionario, para la formacin tridimensional delos tejidos, es necesario que determinadas zonas desaparezcan. Unejemplo universalmente conocido es el de la metamorfosis delrenacuajo a la rana. Al renacuajo la cola no se le cae, sino que va

desapareciendo gradualmente, esas clulas sufren apoptosis (R.Kerr,Harmon et al. 1974).En nuestro nimo por clasificarlo todo, hemos separado la muertecelular en varios tipos dependiendo del estmulo, del proceso y de lasconsecuencias.Nosotros vamos a clasificar la muerte celular en apoptosis y necrosis.E incluiremos dentro de cada apartado otros procesos que por suscaractersticas podran ser clasificados aparte, pero esta clasificacinnos parece ms realista.


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3.2. APOPTOSIS

Al principio esta muerte fue definida por criterios morfolgicos (Kerr,Wyllie et al. 1972). Pero se ha ido viendo que estas caractersticasmorfolgicas no son universales, y que lo nico que se mantieneconstante en todas las condiciones es la actividad de unas proteasasllamadas caspasas. Pero s hay una serie de caractersticasbioqumicas y fenotpicas que la caracterizan: presencia de actividadcaspasa y protelisis de sus substratos, fragmentacin de ADN y

condensacin de la cromatina.Tambin se le ha venido llamando muerte celular programada, encontraposicin a lo que se crea como una muerte incontrolada,espontnea o pasiva que era la necrosis.Esta denominacin pierde su sentido cuando se empieza a ver queexisten circunstancias en la que se induce muerte con caractersticasnecrticas pero de manera controlada, en el sentido en el que existeuna ruta determinada implicada.

APOPTOSIS

LIGANDO

DED

Ca

spasa-8

DD

DED

FADD

Caspasa-9

DD

BH3

estrs

Escasez de nutrientes

Bid

Apoptosoma

DISC

Granzyme B

Muoz-Pinedo 2010, Ancient Origin of Self Recognition Systems in Nature, 1st ed.

TipoII

TipoI

Bcl-2 antiapoptticas

Figura 5: Esquema de las distintas rutas de induccin deapoptosis.


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Parece ser que la mayora de los procesos que suceden en una clulaque sufre apoptosis estn relacionados con la necesidad de que estaclula sea rpida y eficientemente fagocitada por un macrfago.El proceso que tiene lugar en una clula en apoptosis puede dividirseen 4 fases secuenciales:1) Estmulo.Son diversos, y deben superar un umbral determinado. Se dividen enestmulos de la va intrnseca o de la va extrnseca.2) Fase de Induccin.El estmulo induce la activacin de caspasas, si el estmulo y laactivacin superan un umbral. Existen dos puntos de controlprincipales donde se decidir si se entra en apoptosis o no. Por un

lado, si la unin del ligando de muerte genera suficiente actividadcaspasa, o por otro, si la liberacin de citocromo C induce suficienteagregacin de la caspasa-9.3) Fase de Ejecucin.En esta fase, el ADN es fragmentado por la accin de lasendonucleasas (cariorrexis), originando una serie de fragmentosoligonucleosomales mltiplos de la unidad bsica de 180-200pares de bases (Cohen, Sun et al. 1994). Tambin se produce elprocesamiento de sustratos intracelulares por protelisis (Martin

and Green 1995) y la externalizacin a la superficie de la cluladel fosfolpido fosfatidilserina, que es la seal para la accinde los macrfagos (Martin, Reutelingsperger et al. 1995).La accin de las caspasas lleva a la clula a sufrir un fenmenollamado burbujeo. ste consiste en la formacin de burbujas a partirde la membrana plasmtica. Finalmente, la clula se fragmenta,originando los cuerpos apoptticos.4) Fase de Reconocimiento y Fagocitosis.Este proceso est bastante bien conservado en los organismos

multicelulares. Esto es debido a que de esta manera la muerte es unproceso ordenado, eficiente y controlado. El resultado de esta fase esque la clula, ya fragmentada en trocitos (cuerpos apoptticos),rpidamente ser fagocitada por los macrfagos (Savill and Fadok2000), evitando su lisis y expulsin del contenido al medioextracelular.Cuando los investigadores en el laboratorio inducimos apoptosis enausencia de macrfagos, esas clulas apoptticas sufren necrosissecundaria. Algo parecido puede ocurrir in vivo si la apoptosis es


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masiva o la fagocitosis insuficiente. Las clulas apoptticas, si no soninmediatamente fagocitadas, se lisarn.

3.3. CASPASAS

Antes de empezar a explicar el proceso, hay que explicar qu son lascaspasas, que como se deca, son los elementos esenciales y quedefinen este tipo de muerte. Se denominan caspasas por el acrnimoen ingls (cysteine aspartyl-specific proteases) (Thornberry 1997).

Las caspasas estn en la clula en forma de cimgenos inactivos,procaspasas. Por lo tanto necesitan siempre una seal que las active.Estos cimgenos estn formados por tres dominios: un prodominio en

el extremo aminoterminal y los dominios p20 (subunidad larga) y p10(subunidad corta), que se encuentran en la enzima activa (Hengartner2000). En todos los casos conocidos, las caspasas activas estncompuestas por heterotetrmeros, que contienen dos heterodmerosp20/p10 y dos sitios activos de catlisis (Earnshaw, Martins et al.2003). Sin embargo, es posible que pueda haber caspasas en formade monmeros activos bajo determinadas condiciones. Una vezactivas, las caspasas son capaces de cortar gran variedad desustratos celulares. Existe una base de datos de libre acceso con los

sustratos de las caspasas (http://www.casbah.ie). Estos sustratostienen en comn un motivo tetrapptido.En este momento se han descrito 11 caspasas en humanos. No todastienen funciones apoptticas. Por ejemplo, la caspasa-1, 4 y 5 estnimplicadas en inmunidad y maduracin de citoquinas.Dentro de la familia de las caspasas, las que tienen una funcinapopttica se suelen dividir en caspasas iniciadoras y ejecutoras. Sinembargo, muchas de estas caspasas tienen ms funciones que lasapoptticas.

Tabla 1: Representacin esquemtica de la funcin y papel delas caspasas as como las consecuencias de su deficiencia.

Caspasa Fenotipo Knock-out

Papel enapoptosis

Funcin noapopttica

Caspasa-1 Los ratones sedesarrollan connormalidad

Papel enpiroptosis.

Inmunidad innata,secrecin deprotenas


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Caspasa-2 Los ratonestienen un excesode oocitos.Envejecimiento

prematuro.

Caspasainiciadora/ejecutora

Iniciador de

apoptosis tras eldao al ADN,durante catstrofemittica y shocktrmico.

No determinado

Caspasa-3 Mortalidadperinatal.Hiperplasiacerebral.

Caspasa ejecutora Inmunidadadaptativa,proliferacincelular ydiferenciacin de

trofoblastosplacentarios.Mantenimiento declulasprecursoras (Stemcells).

Caspasa-6 Los ratones sedesarrollan connormalidad.

Caspasa ejecutora Inmunidad innata.

Caspasa-7 Mortalidadperinatal.

Caspasa ejecutora No determinada

Caspasa-8 Letal en elembrin.Problemas en eldesarrollo delcorazn y bajosniveles deprecursoreshematopoyticos.

En humanos,mutacionesfamiliares llevanainmunodeficiencias.

Caspasa iniciadorade la rutaextrnseca.

Inmunidad innata yadaptativa.Proliferacin delinfocitos ydiferenciacin demacrfagos.

Caspasa-9 Mortalidadperinatal. Excesode tejido cerebral

Caspasa iniciadorade la rutaintrnseca.

No determinada


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Caspasa-10 En humanos, unamutacin familiarest ligada alsndrome

autoinmunelinfoproliferativode tipo II.

Posible caspasainiciadora de laruta extrnseca

No determinada

Caspasa-11 Los ratones sedesarrollannormalmente.Los linfocitostienen un defectoen la de-polimerizacin dela actina.

Implicada enmuerte celularneuronal inducidapor MPTP y otrosestmulospatolgicos.

Inmunidad innata,migracin demacrfagos.

Caspasa-12 Los ratones sedesarrollannormalmente

Caspasa iniciadoraen apoptosisinducida por estrsreticular.

No determinada

Caspasa-14 La piel de losratones presentabaja hidratacin yalta sensibilidad a

UVB.

Desconocida Diferenciacin dequeratinocitos.

CASPASAS INICIADORAS:

Las caspasas iniciadoras tienen un prodominio (DED) o card (figura 5)que les permite unirse a molculas adaptadoras y formar un complejoactivador.Son capaces de auto-activarse e iniciar el proceso proteoltico,

cortando y activando otras caspasas. La dimerizacin que induce laactivacin es necesaria, suficiente y reversible.Las caspasas iniciadoras 8 y 10 tienen dos dominios DED, (dominioefector de muerte en ingls), que les sirve para unirse a otrasprotenas que contienen los mismos motivos. La caspasas iniciadoras,caspasas 2 y 9, contiene un dominio de reclutamiento de caspasa(CARD). Estos motivos les sirven para unirse a otras protenas oplataformas de activacin, que al reclutar molculas de caspasas, lasacercan permitiendo su activacin.


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Las caspasas 8 y 9 las trataremos ms en profundidad ms adelante.Brevemente veremos el papel de caspasa-2.El papel fisiolgico de caspasa-2 es menos conocido que del resto decaspasas iniciadoras. Su funcin es controvertida, parece claro quetienen un papel apopttico y no inflamatorio, aunque tambin se le hanatribuido funciones en el ciclo celular y proliferacin. Revisado en(Kitevska, Spencer et al. 2009).Parece que su localizacin celular es nuclear, aunque tambin ha sidodetectada en Golgi, e incluso en algunos experimentos conmicroscopa confocal la sitan en la mitocondria (Kitevska, Spencer etal. 2009).Por su homologa con CED-3 (la principal caspasa efectora en C.

elegans), y porque al sobre-expresarla induce apoptosis, se crey queese era su papel.Los ratones deficientes en caspasa-2 no tienen un fenotipo dramtico.Las hembras tienen ms oocitos que los ratones silvestres. Otro rasgoparece ser que estos ratones muestran un envejecimiento prematuro,especulndose que la deficiencia en caspasa-2 impedira laeliminacin de clulas con un alto estrs oxidativo.Tambin se cree que caspasa-2 pueda tener un papel en el ciclocelular. Fibroblastos murinos deficientes en caspasa-2 crecen mucho

ms rpido que su contraparte. Caspasa-2 es inducida bajooncogenes como E1A. Sin embargo, este papel en proliferacin no hapodido ser probado in vivo.Hay bastantes pruebas de su implicacin en reparacin del ADN. Yaunque clulas deficientes en caspasa-2 fallen en la reparacin delADN tras radiacin, no se han encontrado sustratos de la enzima quepuedan ser responsables de esta funcin. (Kitevska, Spencer et al.2009)Su implicacin en otras rutas de apoptosis es tambin muy

controvertida. Por ejemplo, su implicacin en apoptosis inducida porshock trmico. Mientras existen estudios que muestran sudimerizacin y activacin tras shock trmico (Bouchier-Hayes, Oberstet al. 2009), otros ven que se induce apoptosis sin caspasa-2 (Milleronand Bratton 2006).


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CASPASAS EFECTORAS:(tabla 1)

A diferencia de las iniciadoras, no son capaces de auto-activarse,necesitan ser cortadas y activadas por aquellas. Las caspasasefectoras cortan una gran cantidad de sustratos. Se conocen lascaspasas 3, 6 y 7. No tienen un prodominio como las iniciadoras. Yestn en forma de dmero inactivas. Al contrario que las iniciadoras, elcorte de una subunidad de unin las activa, y este es un procesoimprescindible e irreversible.

En general, las caspasas, por su funcin y actividad, tienen que estar

muy bien controladas. Una activacin descontrolada lleva aenfermedades neurodegenerativas, mientras que una disminucin desu actividad puede llevar al desarrollo de tumores. Iremos explicandola regulacin de las mismas a lo largo del texto.

3.4. MECANISMOS DE INDUCCIN DE APOPTOSIS

La induccin de apoptosis es como generar una figura con fichas dedomin. Una vez que la primera ficha ha cado, no hay vuelta atrs. Laprimera ficha es la caspasa iniciadora, y el estmulo (empujar la ficha)debe ser lo suficientemente fuerte. A diferencia del efecto domin,cada ficha slo puede ser tumbada por la/s que le preceden.Aunque nosotros los representemos de manera lineal, nada ms lejosde la realidad. Las propias caractersticas de las caspasas hacen a lainduccin de apoptosis una intrincada red de activaciones einhibiciones. Y si bien existen dos rutas claramente definidas porfuncin, mecanismos y protagonistas, estas se comunicancontinuamente. Podemos dibujar un modelo de induccin de apoptosis

sobre el papel que difcilmente podremos ver en la realidad.Para desenredar esta madeja, dividiremos las rutas en 2, rutaextrnseca e intrnseca que son las mejor caracterizadas. Y despushablaremos de otras vas de activacin de caspasas. Entre ellas unade las ms importantes desde el punto de vista adaptativo, la inducidapor la granzima B por los linfocitos T citotxicos.


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3.4.1. RUTA EXTRNSECA - REGULACIN

Tambin llamada de ligandos de muerte. En esta ruta participan losreceptores de muerte y la caspasa iniciadora es la 8 (y la caspasa-10en humanos).

a) RECEPTORES DE MUERTE

Los receptores de muerte son miembros de la familia de losreceptores del Factor de Necrosis Tumoral (TNF). Son protenastransmembrana tipo-I (extremo aminoterminal expuesto en la caraexterna para su unin al ligando) y se caracterizan por contener entredos y cuatro dominios extracelulares ricos en cistenas (CRD), para la

unin de los ligandos, y un dominio intracelular de muerte de unos 80aminocidos (DD), que sirve para reclutar protenas adaptadorascomo TRADD o FADD (Ashkenazi and Dixit 1998).La homotrimerizacin de los receptores en la membrana se producepor la unin de ligandos especficos de la familia de TNF.

Figura 6: Esquema de los ligandos y los receptores de la familia del TNF

(Wehrli, Viard et al. 2000)


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Los receptores de la familia del TNF, pueden transmitir sealescontrapuestas Se llaman ligandos de muerte, pero adems deapoptosis pueden transmitir una seal prosupervivencia, proliferativa,inflamatoria a travs de la activacin de NF-B.Cuando la seal es de muerte, al interaccionar el ligando con sureceptor, se induce un rpido ensamblaje de un complejo inductor dela seal (DISC). El DISC contiene principalmente a la caspasa-8 (y 10en humanos), a la molcula adaptadora FADD que interacciona conFas a travs del dominio de muerte DD (revisado en (Strasser, Jost etal. 2009)). As como a una molcula inhibidora, anloga a caspasaspero sin el dominio activo, c-FLIP.

Adems, dependiendo del estado del receptor, de las molculas co-estimuladoras o inhibidoras puede darse una seal u otra. Receptoresque carecen del dominio de muerte, pueden funcionar comoinhibidores de la seal, como seuelo (decoy) (Marsters, Sheridan etal. 1997).Aunque hay ms (figura 6), aqu vamos a tratar los receptores yligandos de muerte ms importantes o mejor estudiados

FAS:

El receptor Fas juega un papel muy importante en el sistemainmunitario. Se identific en 1991 (Itoh, Yonehara et al. 1991). Formaparte de de la familia de TNF. Aunque puede encontrarse solubledebido a un splicing alternativo (Cheng, Zhou et al. 1994),normalmente es una protena transmembrana, con un dominiointracitoplasmtico de muerte (DD). Se expresa ampliamente, y es

regulado por citoquinas proinflamatorias como IFN- o TNF(Zimmermann, Bonzon et al. 2001). Sin embargo, la expresin delligando, FasL, est ms restringida a clulas inmunes, y a testculos,

hgado, pulmn, intestino y ojo.La unin de FasL a su receptor induce la activacin de caspasa-8. Ygeneralmente est asociado a apoptosis. Sin embargo, est clara lafuncin de Fas en proliferacin en linfocitos, activacin odiferenciacin (Strasser, Jost et al. 2009). No slo en clulas inmunessino incluso en otros tejidos como hgado estimula la proliferacin(Desbarats and Newell 2000)La funcin apopttica de Fas necesita de modificacionesposttraduccionales como palmitoilizacin (Feig, Tchikov et al. 2007).

Esto lleva al receptor activado a zonas llamadas lipid rafts que son


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resistentes a la disociacin por SDS. Es ah donde parece que esactivada la caspasa iniciadora.

TRAIL:Fue definida como una citoquina inductora de apoptosis de la familiadel TNF. Es importante en la respuesta inmune innata y del sistemainmune en general.Tiene varias funciones, y buena parte de las clulas sanas sonresistentes a este ligando, si bien la transformacin tumoral parecesensibilizar a las clulas. Se cree que la capacidad de TRAIL deinducir autofagia protectora en clulas no transformadas a travs deuna ruta que implica a TAK1 (TGF- activating kinase 1), AMPK y

mTORC1. Sin embargo, en clulas transformadas por activacin deoncogenes son incapaces de inducir esa autofagia protectora tras eltratamiento con TRAIL y mueren por apoptosis (Herrero-Martin, Hoyer-Hansen et al. 2009) y (Han, Hou et al. 2008).

TNF

El factor de necrosis tumoral es una citoquina pleiotrpica, confunciones pro apoptticas o proinflamatorias. Tiene dos receptores

para transmitir la seal. El receptor 1 (TNFR1) tiene un dominio demuerte en su porcin intracelular, mientras que el receptor 2 no. Anas, parece que el TNFR2 puede transmitir una seal de muerte, biena travs del estmulo del TNFR1, ya sea porque la seal de TNFR2induce la produccin de ms TNF que induce la produccin deTNFR1, o por un efecto de transmisin del TNF. TNFR2 tiene muchaafinidad por la citoquina, y actuara pasando el TNF al TNFR1. Perootros autores han visto que el TNF puede inducir muerteindependientemente de TNFR1 (Depuydt, Van Loo et al. 2005).

Existen indicios de que los receptores pueden inducir sealindependientemente del TNF (Rao, Hsu et al. 1995).Cuando el TNF se une al receptor, se forma un complejo trimrico,que recluta a diferentes protenas como TRADD, TRAF2, RIPK1,FADD Y CASPASA-8, o cIAP y FLIP.


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Cuando hay suficientes niveles de las protenas inhibidoras cIAP1 y 2y c-FLIPL, estas impiden el reclutamiento de RIPK1, y de caspasa-8 aFADD, permitiendo que la seal sea a travs de IKK que induce laactivacin de NF-B.Esta es una seal (figura 8) (Chen and Goeddel2002) prosupervivencia que induce proliferacin e inflamacin en elmbito del sistema inmunolgico.Cuando los niveles FLIP y/o cIAP1 bajan por alguna razn se induce

el reclutamiento de caspasa-8 y/o RIPK1 y se induce muerte, ya sea atravs de la activacin de caspasa-8 (apoptosis), o de la actividad

apoptosis

Receptor

RIP

cIAP1

FADD

FADD

CASPASA-3

q-VD/

z-VAD

kinaseGeldanamicina

Necrostatina

Ligando

RIPkinase

necroptosis

FLIP

Figura 7: Esquema de la ruta extrnseca de la apoptosis.


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kinasa de RIPK1, inducindose entonces necroptosis. Vamos a irviendo estos elementos uno a uno.

b) CASPASA-8

FUNCIN

Si bien su principal funcin es la de inducir la apoptosis como caspasainiciadora, tambin est envuelta en otras funciones no apoptticas,revisadas por Maelfait y Beyaert (Maelfait and Beyaert 2008).Lo primero que llama la atencin es que la deficiencia en caspasa-8es letal en ratones a nivel embrionario. Los embriones mueren porproblemas en el desarrollo: hiperemia, eritrocitosis y defectos en eldesarrollo del msculo cardiaco son algunos de los rasgos(Varfolomeev, Schuchmann et al. 1998). Experimentos hechos enratones deficientes en caspasa-8 especficamente en el msculocardiaco indica que esta proteasa tiene funciones no apoptticas en eldesarrollo embrionario. Adems de caspasa-8, parece que para estasfunciones son necesarias las molculas adaptadoras como FADD ocFLIPL. Estas anomalas en el desarrollo no se producen en humanoscon mutaciones en caspasa-8, probablemente debido al papelredundante de caspasa-10, proteasa no presente en ratones (Maelfaitand Beyaert 2008).Tambin es necesaria para la diferenciacin de los monocitos enmacrfagos. La diferenciacin a macrfagos necesita de reajustescitoplasmticos en los que parece ser necesaria la actividad decaspasa-8 sin la induccin de apoptosis. Esto debe estar regulado ams niveles, por ejemplo caspasa-3 tiene que estar fuertementeregulada. Pero tambin debe estar inhibida la seal proliferativa queimpedira la diferenciacin, mediante la degradacin de RIPK1 por

caspasa-8.Linfocitos T en proliferacin se ha visto que tienen aumentada laactividad de la caspasa-8, pero no sufren apoptosis.En relacin a esto, caspasa-8 est implicada en la activacin de NF-B en linfocitos T-CD8 que sobre-expresan cFLIPL.

ACTIVACIN

Caspasa-8, junto a la caspasa-10 en humanos, es la caspasa

iniciadora de la ruta extrnseca de la apoptosis (Medema, Scaffidi et al.


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1997). Forma parte del complejo proteico DISC y su activacin ocurreen dos pasos. Primero, el reclutamiento de FADD a la reginintracelular de FAS promueve la dimerizacin y cambio deconformacin de la caspasa-8 dentro del DISC lo que permite laactivacin total de la caspasa-8. A continuacin la caspasa-8 sufre unprocesamiento autoproteoltico que permite a la enzima liberarse delDISC. El dmero no proteolizado es activo pero muy inestable, una vezcortada, la caspasa-8 como monmero es inactiva, pero con muchaafinidad por otro monmero (Pop, Fitzgerald et al. 2007) o a protenasproapoptticas como Bid.Existen otros mecanismos de activacin de caspasa-8.Parece ser que caspasa-3 cortada puede a su vez cortar y activar

caspasa-8 en un mecanismo de retroalimentacin, aunque no se sabesi este proceso tiene un papel determinante en la apoptosis, ya que niel corte, ni la dimerizacin son por s solos suficientes para activarcaspasa-8 (Oberst, Pop et al.).Pero puede que el reclutamiento de caspasa-8 por el DISC no seasuficiente para inducir una actividad que desencadene apoptosis.Existen otros elementos y modificaciones de la misma caspasa queinfluyen en su actividad:Jin et al. (Jin, Li et al. 2009) describieron que tras la formacin del

DISC se induce poly-ubiquitinizacin de la caspasa-8 a travs de unainteraccin previamente desconocida entre el DISC y una E3 ligasallamada Culina-3. Esta ubiquitinizacin requera una protena llamadaRBX1, y era un equilibrio entre ubiquitinizacin y de-ubiquitinizacinpor la A20 deubiquitinasa. A continuacin entraba en juego otraprotena, p62/sequestosoma-1, una protena de unin a ubiquitina.P62 agregara a la caspasa-8 modificada por culina-3 endeterminados focos.Estos datos mostraran que la activacin de caspasa-8 est

fuertemente regulada por muchos factores, incluidos los metablicos.La unin del ligando induce la ubiquitinizacin de la caspasa-8, sealque suele indicar la degradacin de la protena, que en este caso esactivadora. Adems de la seal qumica, parece que existen tambincompartimentos donde se dan los procesos de activacin. En estecaso la caspasa-8 se encuentra en lipids rafts de la membranacitoplasmtica.

Se sabe que caspasa-8 puede ser activada por repeticiones de poli-

glutamina (Snchez, Xu et al. 1999). La acumulacin de pptidos que


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acumulan series de glutamina parece ser txica para neuronas. Estatoxicidad viene por la induccin de apoptosis por caspasa-8, suactivacin es inhibida por la protena viral antiapopttica CrmA, por undominante negativo de FADD y por Bcl-xL y Bcl-2. Esta activacinparece ser independiente de FasL y los autores observaron que FADDest en la fraccin no soluble cuando se induce la expresin de esospptidos de poli-glutamina. Adems de que en las fraccionesinsolubles de cerebros afectados por la enfermedad de Huntington,existe una acumulacin de caspasa-8. Estos resultados podranindicar que una agregacin de FADD y caspasa-8 independiente delos receptores de muerte es posible.Existen ms ejemplos de activacin de caspasa-8 independiente de

los receptores de muerte. Grbner et al. (Grbner, Adkins et al. 2007)describieron que la protena P de Yersinia induca la produccin de unDISC atpico en clulas dendrticas que activa caspasa-8 y reclutaRIPK1, induciendo una mezcla de apoptosis y necrosis. Ellosconjeturan que esta protena acetila a la MAP kinasa inhibindola.Esta MAP kinasa sera la responsable de la expresin de FLIP.Se han descrito incluso otras formas de activacin de caspasa-8independientemente de FADD. La protena viral HPV18 E2 induce laagregacin de caspasa-8 en unas estructuras filamentosas. A pesar

de que esta protena E2 no tiene ningn dominio de muerte. Adems,el anlogo viral de FLIP es capaz de inhibir la interaccin entrecaspasa-8 y E2, protegiendo a la clula de la protena viral (Thierryand Demeret 2008).Por ltimo indicar el estudio de Suzuki et al. (Suzuki, Kusakai et al.2003) del 2003. Ellos describen una forma de muerte por privacin deglucosa a la que llaman necrtica, pero dependiente de caspasa-8.Adems de observar corte de caspasa-8 y degradacin de Bid por laprivacin de glucosa, ven que no es dependiente de FADD y es

parcialmente inhibida por FLIP. Ellos concluyen que es necrosisporque no ven algunos rasgos como fragmentacin nuclear opresentacin de fosfatidilserina. Pero la muerte inducida por privacinde glucosa en sus clulas es inhibida por el inhibidor de caspasas z-VAD adems de por la sobre-expresin de ARK5, que es el objeto desu estudio. Ellos concluyen que ARK5 protegera de la privacin deglucosa al impedir la activacin de caspasa-8 porque impide ladegradacin de FLIP.


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c) DIFERENCIAS ENTRE APOPTOSIS TIPO I Y II

Como decamos, la caspasa iniciadora tiene diversos substratos, entreellos estn las caspasas efectoras y la protena slo BH3 Bid. Estaes cortada a tBid, y una acumulacin de tBid induce activacin de laruta intrnseca o mitocondrial como luego veremos.Entonces, una vez que la caspasa iniciadora est activa y se hasuperado el umbral de la seal, pueden pasar dos cosas: que lacaspasa iniciadora corte y active a caspasa-3, desencadenndoseapoptosis, o que sea necesario la acumulacin de tBid para lainduccin de apoptosis. Seran el tipo I y II respectivamente.Parece ser que lo que hace que una clula sea tipo I o II es la

actividad de XIAP (Jost, Grabow et al. 2009). Esta protena es uninhibidor de la caspasa-3, lo que impide que caspasa-8 la puedaactivar. Para ello es necesario la liberacin de la mitocondria deprotenas como SMAC, que interaccionan con XIAP, liberndola decaspasa-3. Por ello, en las clulas en las que la actividad de XIAP essuficientemente alta, ser necesaria la liberacin de SMAC parainducir apoptosis, estas son clulas tipo II.Aunque hay indicios de que existen otros elementos diferentes entreambas rutas. Por ejemplo se ha visto que FAS est presente

constitutivamente en las clulas tipo I en estructuras de membranaresistentes a detergentes (rafts) donde colocalizan con estructurassealizadoras de oligomerizacin de protenas (SPOTS en ingls),pero esto no ocurre en clulas tipo II (Feig, Tchikov et al. 2007).Tambin se ha visto que el patrn de corte de la caspasa-8 esdiferente en ambos tipos de muerte. Mientras que el fragmento p10 dela caspasa slo puede ser detectado en las clulas tipo I, el fragmentop18 poda ser detectado en los tipos I y II (Li, Qi et al. 2009).Esto indicara que existen ms elementos que regulan el que en una

clula pueda morir tras la unin de ligandos de muerte de maneraindependiente de mitocondria o no adems de la actividad de XIAP


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d) SENSIBILIZACIN A LA VA EXTRNSECA

Los ligandos de muerte, como decamos, tienen un papel dual. Yapue

39530813 caro a mecanismos moleculares de la muerte celular inducida por privacion de glucosa 2010

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