3288800 pruebas bioquimicas fundamentos microbiologia

7/16/2019 3288800 Pruebas Bioquimicas Fundamentos Microbiologia

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MEDIOS DE AISLAMIENTO Y ENRIQUECIMIENTO

Si se desea recuperar determinados m.o. de sus ecosistemas naturales (agua, tierra, alimentos,etc.) puede recrearse en el laboratorio un medio ambiente artificial que favorezca el crecimiento deellos frente a otros m.o. que los acompaen en ese ecosistema. Se puede emplear un medio decultivo y condiciones de incubacin (atmsfera, temperatura, pH) considerando las caractersticas

fisiolgicas del m.o. buscado, para otorgarle ventajas frente al resto de m.o. de ese ecosistema.Pretendemos inhibir la mayor cantidad posible de m.o. no deseados, de manera que estos nointerfieran durante el aislamiento de los que s interesan.

Un esquema general para el enriquecimiento, aislamiento e identificacin de m.o. es el siguiente:

Debemos realizar las siguientes consideraciones si deseamos detectar y aislar un determinado tipode m.o. y simultneamente minimizar la interferencia de otros:

MuestraElegir la muestra adecuadamente. El m.o. que se est buscando debe ser factible de estarpresente, ya sea si lo estamos buscando per se, o como contaminante.Debemos considerar si es til someter la muestra a un tratamiento previo. Cuanto mayor seleccinse realice en este paso inicial, menos selectivos debern ser los medios de cultivo a utilizar.Debemos comenzar con un enriquecimiento o aislar la muestra directamente? Si el m.o. quedeseamos aislar est en un bajo nmero, se siembra la muestra en un caldo de cultivo quefavorezca su multiplicacin (enriquecimiento). Cuando un enriquecimiento se realiza en un medioformulado para frenar el desarrollo de m.o. acompaantes no deseados, se denominaenriquecimiento selectivo. Cuando el m.o. deseado est en alto nmero, no se necesita realizar unenriquecimiento, y se puede sembrar la muestra en un medio slido adecuado directamente.

Medio de cultivoDebemos realizar una formulacin adecuada de los medios de cultivo empleados. En general enlas primeras etapas se utilizan medios de cultivo selectivos. Dicha selectividad se puede determinarya sea, a) agregando un inhibidor de la flora acompaante, o b) haciendo el medio restrictivo alincluir un nutriente que slo el m.o. deseado sea capaz de utilizar.Debemos utilizar las condiciones de incubacin adecuadas: temperatura, luz, atmsfera (aerobia oanaerobia, atmsfera con concentracin de CO2, etc.).Los componentes del medio de cultivo que se pueden manejar son:

Fuente de carbono. A modo de ejemplo, se podran quitar todos los compuestos orgnicospara permitir el crecimiento de m.o. auttrofos que son capaces de obtener su fuente decarbono del CO2 (que difunde de la atmsfera al medio o por agregado de bicarbonato). Oincluir exclusivamente una fuente de carbono particular, por ej, fenol si queremos aislardegradadores de ese compuesto.

Fuente de nitrgeno. Se puede omitir el agregado de fuente nitrogenada (orgnica uinorgnica) para permitir el crecimiento de fijadores libres de nitrgeno, que son capacesde obtener su fuente de nitrgeno del N2 atmosfrico.

Fuente de energa. Si no se agrega ningn compuesto capaz de ser utilizado como fuentede energa y se incuba a la luz, slo crecern los m.o. fotosintticos que usan la luz comofuente de energa.

Se pueden agregar o no compuestos que sean utilizados como factores de crecimiento(vitaminas, aminocidos, cidos nucleicos, cidos grasos, etc.) segn se necesiten o no.

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Fuente de inculo Caldo de enriquecimiento Aislamiento Identificacin


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PRUEBAS BIOQUMICAS

INDOL

Introduccin

El indol es uno de los productos de degradacin metablica del aminocido triptofano. Lasbacterias que poseen la triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptofano conproduccin de indol, cido pirvico y amonaco. La produccin de indol es una caractersticaimportante para la identificacin de muchas especies de m.o.

PrincipioLa prueba de indol est basada en la formacin de un complejo rojo cuando el indol reacciona conel grupo aldehdo del p-dimetilaminobenzaldehdo. Este es el principio activo del reactivo deKovacs descrito ms adelante. El medio de cultivo utilizado debe ser rico en triptofano.

Medios y reactivosCaldo triptofanoPeptona o digerido pancretico de casena 2 gCloruro de sodio 0,5 g

Agua destilada 100 ml

Reactivo de KovacsAlcohol amlico o isoamlico 150 mlp-dimetilaminobenzaldehdo 10 gHCl conc. 50 ml

ProcedimientoInocular el caldo triptofano con el m.o. en estudio e incubar a 35C durante 18 a 24 horas. Alfinalizar este perodo, aadir 5 gotas de reactivo por la pared interior del tubo.

InterpretacinEl desarrollo de un color rojo intenso en la interfase del reactivo y el caldo, segundos despus de

aadir el reactivo indica la presencia de indol y un resultado de la prueba positiva.

ControlesEscherichia coli: positivoKlebsiella pneumoniae: negativo (mayora de las cepas)

ROJO DE METILO - VOGES-PROSKAUER (RM VP)

PrincipioUna de las caractersticas taxonmicas que se utilizan para identificar los diferentes gneros deenterobacterias lo constituyen el tipo y la proporcin de productos de fermentacin que se originanpor la fermentacin de la glucosa. Se conocen dos tipos generales: la fermentacin cido-mixta y la

fermentacin del 2,3 butanodiol. En la fermentacin cido mixta se forman fundamentalmentelctico, actico y succnico, adems de etanol, H2 y CO2. En la va del butanodiol se formancantidades menores de cido (acetato y succinato) y los principales productos son el butanodiol,etanol, H2 y CO2.El rojo de metilo es un indicador de pH con un intervalo de viraje entre 6,0 (amarillo) y 4,4 (rojo),que se utiliza para visualizar la produccin de cidos por la va de fermentacin cido mixta.El acetil-metil-carbinol (o acetona) es un producto intermediario en la produccin de butanodiol. Enmedio alcalino y en presencia de oxgeno la acetona es oxidada a diacetilo. Este se revela enpresencia de alfa-naftol dando un color rojo-fucsia

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Medios y reactivosCaldo RM/VPPeptona 7 gGlucosa 5 gFosfato dipotsico 5 g

Agua destilada 1 L

pH = 6,9 0,1

Indicador de pH rojo de metiloRojo de metilo 0,1 g en 300 mL de etanol 95

Agua destilada 200 ml

Revelador VPalfa-naftol (solucin al 5% en etanol 95)Solucin de KOH al 40% en agua destilada

ProcedimientoInocular el caldo RMVP con un cultivo puro de no ms de 24 horas del m.o. en estudio. Incubar a

35C durante 48 horas. Luego de finalizado el tiempo de incubacin transferir 1 mL del caldo a untubo limpio para VP. En el caldo restante revelar RM agregando unas 4 - 8 gotas del indicador rojode metilo. Para revelar VP agregar 0,6 ml (10 gotas) de alfa-naftol al 5% y 1 gota de KOH al 40%.

Agitar cuidadosamente para exponer el medio al oxgeno atmosfrico y dejarlo reposar durante 10a 15 minutos.

InterpretacinLa prueba RM es positiva si se desarrolla un color rojo estable. Esto indica que la produccin decido es suficiente para producir el viraje del indicador y el m.o. ferment la glucosa por la va decido mixta. Un color anaranjado, intermedio entre el rojo y el amarillo no es considerado comopositivo.La prueba VP es positiva si se desarrolla un color rojo-fucsia luego de 15 minutos, que indica lapresencia de diacetilo, producto de oxidacin de la acetona.

ControlesRM positivo, VP negativo: Escherichia coliRM negativo, VP positivo: Enterobacter aerogenes

UTILIZACIN DE CITRATO

IntroduccinLa utilizacin de citrato como nica fuente de carbono es una prueba til en la identificacin deenterobacterias.

PrincipioLa utilizacin de citrato como nica fuente de carbono se detecta en un medio de cultivo con citrato

como nica fuente de carbono mediante el crecimiento y la alcalinizacin del medio. Este aumentode pH se visualiza con el indicador azul de bromotimol que vira al alcalino a pH 7,6.

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Medios y reactivosMedio de SimmonsFosfato dicido de amonio 1 gFosfato dipotsico 1 gCloruro de sodio 5 gCitrato de sodio 2 gSulfato de magnesio 0,2 g

Agar 15 gAzul de bromotimol 0,08 gAgua destilada c.s.p. 1 L

pH = 6,9

ProcedimientoSe inocula la superficie del agar inclinado con una sola estra en el pico. Utilizar un cultivo de 24horas en un medio slido y cuidando no arrastrar medio de cultivo, ya que se pueden producirfalsos positivos por crecimiento a partir del medio de cultivo del inculo. Incubar a 35C durante 4das.

Interpretacin

El ensayo es positivo cuando se observa crecimiento a lo largo de la estra, acompaado o no deun viraje del indicador al azul.

ControlesPositivo: Klebsiella spp.Negativo: E.coli

DESCARBOXILACIN DE LISINA Y ORNITINA

IntroduccinLa descarboxilacin de aminocidos es llevada a cabo por descarboxilasas y se forman aminas yCO2. Cada descarboxilasa es especfica para un aminocido y la reaccin es completa eirreversible. Los aminocidos ensayados habitualmente para la identificacin son lisina, ornitina yarginina.

PrincipioEl caldo descarboxilasa de Moeller es el medio base ms comnmente usado para ladeterminacin de las descarboxilasas en enterobacterias. Se prepara un tubo con el medioconteniendo el aminocido a ensayar y un tubo control con medio base sin aminocido. Se cubrencon una capa de aceite mineral (vaselina lquida) para hacer el medio anaerobio de manera queocurra la fermentacin de la glucosa que contiene. Durante las primeras etapas de la incubacin enambos tubos se observar viraje del indicador de pH del medio al cido, por la fermentacin de laglucosa. Luego, si el aminocido es descarboxilado, se forman aminas que provocan un retorno alcolor original del medio o un viraje al alcalino.

Medios y reactivos

Base de MoellerPeptona 5 gExtracto de carne 5 gGlucosa 0,5 gPiridoxal 0,005 gPrpura de Bromocresol 0,01 gRojo de cresol 0,005 g

Agua destilada c.s.p. 1 L

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pH final = 6,0

Caldo Lisina o Ornitina de Moeller: Preparar igual al medio base y agregar 10 g del aminocido (1%de concentracin final de la forma levo, utilizar el doble si se usa la forma dl del aminocido ya quesolo la levo es activa). Agregar aceite mineral para formar una capa de 1 cm de espesor.

ProcedimientoInocular con un cultivo puro de 24 horas un tubo de base de Moeller con el aminocido a estudiar(lisina u ornitina) y un tubo de la base (control sin aminocido). Incubar a 35C durante 18 a 24horas.

InterpretacinEl ensayo puede ser ledo si en el tubo control se observa crecimiento y viraje del indicador alamarillo indicando que se dio la fermentacin de la glucosa y un descenso de pH que permite laactivacin de las descarboxilasas. El retorno al color azul-violeta en el tubo que contiene elaminocido indica una reaccin positiva debida a la liberacin de aminas por descarboxilacin.

ControlesDescarboxilacin de lisina positiva: Enterobacter aerogenes

Descarboxilacin de lisina negativa: Enterobacter cloacaeDescarboxilacin de ornitina positiva: Serratia sppDescarboxilacin de ornitina negativa: Klebsiella spp.

FENILALANINA DESAMINASA

IntroduccinLa fenilalanina es un aminocido que por desaminacin oxidativa forma un cetocido, el cidofenilpirvico. Slo los gneros Proteus y Providencia poseen la fenilalanina desaminasa, lo quepermite diferenciarlas del resto de las Enterobacterias.

PrincipioLa prueba de la fenilalanina se basa en la deteccin del cido fenilpirvico luego del desarrollo delm.o. en un medio que contiene fenilalanina. Para eso se agrega cloruro frrico que forma uncomplejo de color verde con el cido fenilpirvico. El medio de cultivo no puede contener extractosde carne o peptonas por su contenido variable en fenilalanina.

Medios y reactivosAgar fenilalaninaDL fenilalanina 2 gExtracto de levadura 3 gCloruro de sodio 5gFosfato de sodio 1 g

Agar 12 gAgua destilada c.s.p. 1 L

pH = 7,3

Cloruro frricoCloruro frrico 10 gHCl concetrado 2,5 g

Agua destilada c.s.p. 100 ml

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ProcedimientoInocular el agar en pico de flauta con un cultivo puro de 24 horas e incubar a 35C durante 18-24horas. Luego de transcurrido el perodo de incubacin, agregar 4 o 5 gotas de reactivo de clorurofrrico, directamente sobre la superficie del agar.

InterpretacinLa aparicin inmediata de un color verde intenso indica la presencia de cido fenilpirvico y unaprueba positiva.

ControlesPositivo: ProteusNegativo: Escherichia coli

TSI (TRIPLE SUGAR IRON)

IntroduccinEl agar triple azcar hierro es un medio nutriente y diferencial que permite estudiar la capacidad deproduccin de cido y gas a partir de glucosa, sacarosa y lactosa en un nico medio. Tambin

permite la deteccin de la produccin de H2S. Es un medio til para la identificacin deenterobacterias.

PrincipioEl agar se prepara en forma de pico de flauta. Esto determina queexistan dos cmaras de reaccin dentro del mismo tubo. La porcininclinada (pico) expuesta en toda su superficie al oxgeno es aerobiay la porcin inferior (fondo) est protegida del aire y es relativamenteanaerobia.

Al crecer un m.o. en el TSI, el pico tiende a virar al pH alcalino (colorrojo por el rojo fenol) por la produccin de aminas, debido a lautilizacin aerobia de las peptonas. En el fondo del tubo -donde no hay oxgeno- la degradacin depeptonas es menor y no se generan aminas, de manera que se pueden detectar la produccin depequeas cantidades de cido (color amarillo por el rojo fenol). Si se inoculan m.o. nofermentadores no se formarn cidos, pero por la produccin de aminas en el pico, todo el medioquedar rojo.

La glucosa en el TSI est en una proporcin 10 veces menor que la lactosa y la sacarosa. Si el TSIes inoculado con una bacteria fermentadora de glucosa pero no de lactosa ni de sacarosa, lacantidad de cido producida por fermentacin ser baja (porque la cantidad de glucosa inicial esbaja). En las primeras horas (10 a 16 hs) de incubacin se producir viraje del indicador al amarilloen todo el tubo (pico y fondo), pero al continuar la incubacin, el pico del tubo retornar al rojo porla produccin de aminas debida a la degradacin aerobia de las peptonas antes descrita.Si el m.o. fermenta la lactosa y/o la sacarosa, como las concentraciones de estos azcares son 10veces mayores a la glucosa, se producir gran cantidad de cido (que no puede ser neutralizadopor la produccin de aminas en la superficie), por lo tanto todo el tubo (pico y fondo) virar al color

amarillo (cido).

La produccin de H2S a partir de tiosulfato se pone en evidencia por precipitacin del sulfuroferroso (negro). Como esta reaccin se da preferencialmente en medio cido, un ennegrecimientodel fondo del tubo (que puede cubrir todo el fondo del tubo y enmascarar el color amarillo) se leecomo fermentacin de algunos de los azcares del medio. Adems puede observarse laproduccin de gas (H2 y CO2), ya sea como burbujas en el fondo del tubo, por ruptura del agar odesplazamiento del mismo hacia la superficie.

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Medios y reactivosTSIExtracto de carne 3 gExtracto de levadura 3 gPeptona 15 gProteosa peptona 5 gLactosa 10 gSacarosa 10 gGlucosa 1 gCloruro de sodio 5 gSulfato ferroso 0,2 gTiosulfato de sodio 0,3 g

Agar 12 gRojo fenol 0,024 g

Agua destilada 1 L

pH = 7,4 0,2

ProcedimientoInocular los tubos de TSI con punta (alambre recto). Para eso introducir la punta hasta 3 a 5 mm

del fondo del tubo. Tras retirar la punta del fondo, estriar el pico con un movimiento hacia uno y otrolado. Incubar a 35 C durante 18-24 hs, pero no ms de 24 hs..

Interpretacin y ControlesPara el TSI siempre se informa el resultado en el siguiente orden: pico, fondo, produccin de gas yH2S.

Pico alcalino/fondo alcalino (Alc/Alc/gas-/H2S-)No hay fermentacin de azcares. Caracterstica de bacterias no fermentadoras como Ej.Pseudomonas sp

Pico alcalino/fondo cido (Alc/A/gas-/ H2S-)Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas. No hay produccin de gas ni de H2S.

Ej. Shigella spp.

Pico alcalino/fondo cido (Alc/A/gas-/ H2S+)Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas. No hay produccin de gas, si de H2S.Ej. Salmmonella typhi.

Pico alcalino/fondo negro (Alc/A/gas+/H2S+)Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas, produccin de gas y produccin de cidosulfhdrico. Ej. Salmonella spp. (la mayora de las especies de Salmonella).

Pico cido/fondo cido (A/A)Glucosa y lactosa y/o sacarosa fermentadas. Puede producirse H2S o no. E.coli (A/A/H2S -)

A estos resultados se les agrega el resultado de la produccin de gas. Ej. A/A/gas+/H2S-.

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LIA (LYSINE IRON AGAR)

IntroduccinEste ensayo permite diferenciar los m.o. que producen descarboxilacin o desaminacin de lalisina. Se puede detectar adems la produccin de H2S. Es muy utilizado en las tcnicas debsqueda de Salmonella, principalmente para descartar otras bacterias que dan colonias deaspecto similar en los medios diferenciales utilizados durante el aislamiento selectivo.

PrincipioDurante las primeras etapas de la incubacin el fondo virar el indicador de pH del medio al cido(amarillo) por la fermentacin de glucosa. Luego, si el aminocido es descarboxilado se formarnaminas que provocan un retorno al color original del medio o hacia un viraje al bsico (colorvioleta).En la desaminacin se produce un cido carboxlico y NH3 y se visualiza en la superficie laaparicin de un color rojo intenso. La produccin de H 2S a partir de tiosulfato se visualiza por laprecipitacin de sulfuro ferroso de color negro.

Medios y reactivosPeptona 5 gExtracto de levadura 3 g

Glucosa 1 gL-lisina HCl 10 gCitrato frrico amnico 0,5 gTiosulfato de sodio 0,04 gPrpura de bromocresol 0,02 g

Agar 15 gAgua destilida 1 L

pH = 6,7 0,2

Interpretacin y controlespico alcalino/fondo alcalino/H2S +, descarboxilacin de lisina positiva. Ej.: Salmonella choleraesuis.pico rojo/fondo cido/H2S-, desaminacin de lisina positiva, descarboxilacin de lisina negativa. Ej.:

Proteus mirabilis.pico alcalino/fondo cido/H2S- descarboxilacin de lisina negativa. Ej. E. colipico alcalino/fondo cido/H2S+ descarboxilacin de lisina negativa, produccin de H2S. Ej.Citrobacter freundii.

PRODUCCIN DE PIGMENTOS PARA PSEUDOMONAS SP.

IntroduccinLa capacidad para producir pigmentos como pioverdina (fluorescena) y piocianina es unacaracterstica importante para la identificacin de especies de Pseudomonas. Algunas de ellaselaboran slo fluorescena (ej. Ps. fluorescens) y otras ambos pigmentos (ej. Ps. aeruginosa). Lapiocianina solamente es producida porPs. aeruginosa aunque no todas las cepas de esta especie

la producen. Se han diseado medios de cultivo que potencian la elaboracin de uno de lospigmentos e inhiben la formacin del otro.

PrincipioEl medio King A (o Pseudomonas Agar P) potencia la elaboracin de piocianina mientras que elKing B (o Pseudomonas Agar F) potencia la elaboracin de fluorescena e inhibe parcialmente lade piocianina. Estos pigmentos son solubles en agua y difunden al medio. La piocianina es unpigmento azul-verde mientras que la fluorescena es amarillo-verdoso y fluoresce cuando esexpuesto a la luz UV (=254 nm). Existen pigmentos amarillo-verdosos producidos por algunasespecies de Pseudomonas que no fluorescen.

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Medios y reactivosKing A King BPeptona 20 g Proteosa Peptona 20 gGlicerol 10 g Glicerol 10 gK2SO4 10 g K2HPO4 1,5 g

MgCl2 1,4 g MgSO4.7H2O 1,5 g

Agar 15 g Agar 15 gAgua 1 L Agua 1 L

Los medios se reparten en tubos, se esterilizan a 121C durante 15 minutos y se dejan solidificarinclinados.

ProcedimientoInocular los tubos por estras. Incubar a 35C durante 24 hs.

InterpretacinObservar al UV, la produccin de pigmento azul-verdoso en el medio King A y la de pigmentoamarillo-verdoso, en el King B

ControlesPseudomonas aeruginosa: King A +P. fluorescens: King A -P. fluorescens: King B +P. stutzeri: King B -

DNASA - DESOXIRRIBONUCLEASA

IntroduccinLa actividad desoxirribonucleasa (DNAsa) se ha demostrado fundamentalmente en los gnerosStaphylococcus y Serratia y consiste en la propiedad de degradar el ADN a fracciones de menorpeso molecular. Esta caracterstica se ha utilizado para identificar las especies de Serratiamarcescens y Staphylococcus aureus. Weckman y Catlin demostraron la estrecha correlacin entrela produccin de DNAsa de los cultivos de Staphylococcus aureus con la produccin de coagulasa.

PrincipioLos m.o. DNAsa positivos degradan el DNA cuando son incubados en un medio que lo contiene.Esto puede ser visualizado de diferentes maneras: ya sea inundando las placas crecidas con HCl0,1 N y observando zonas transparentes alrededor de las estras o incorporando al medioindicadores como azul de toluidina o verde de metilo (viran a rosado cuando el test es positivo).

Medios y reactivosDNAsa agarTriptosa 20 g

ADN 2 gNaCl 5 g

Agar 15 gAzul de toluidina* 0,1 gAgua c.s.p. 1 L

* o verde de metilo

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ProcedimientoEstriar la superficie de la placa e incubar a 35C durante 18-24 horas. Observar el viraje delindicador a rosado alrededor de las estras.

InterpretacinUn resultado positivo est dado por el viraje del indicador en la zona de la estra a rosado.

ControlesPositivo: S.aureus y Serratia marcescensNegativo: S.epidermidis:

COAGULASA

IntroduccinLa coagulasa es una enzima proteica con actividad semejante a la protrombina, capaz detransformar el fibringeno en fibrina, provocando la formacin de un cogulo visible en un sistemaanaltico adecuado. Se cree que la coagulasa funciona in vivo, produciendo una barrera en el sitiode infeccin estafilocccica. En el laboratorio, la prueba de coagulasa se utiliza ms comnmente

para diferenciar al Staphylococcus aureus (coagulasa positivo) de otros Staphylococcus.

PrincipioLa coagulasa se halla presente en dos formas, libre y fija, cada una de las cuales poseediferentes propiedades que requieren el uso de tcnicas de determinacin diferentes:Coagulasa fija (prueba en portaobjetos): la coagulasa fija est unida a la pared celular bacteriana.Los hilos de fibrina formados entre las clulas suspendidas en plasma (que contiene fibringeno)provocan su aglutinacin, indicada por la presencia de agregados visibles en el portaobjetos.Coagulasa libre (prueba en tubo): la coagulasa libre es una enzima extracelular que se hallapresente en los filtrados de cultivos. Cuando una suspensin de bacterias productoras decoagulasa se mezcla en partes iguales con plasma en un tubo de ensayo, se forma un cogulovisible como consecuencia de la utilizacin de los factores de coagulacin del plasma de manerasimilar a cuando se aade trombina.

Medios y reactivos

Plasma coagulasa (Difco, o BBL)Cultivo de Staphylococcus de 24 horas en un agar nutriente o caldo nutriente.

ProcedimientoPrueba en portaobjetosColocar una gota de agua destilada sobre un portaobjetosEmulsionar suavemente el organismo en estudio en la gota de agua de manera de obtener unasuspensin cargada homognea. Agregar una gota de plasma reconstituido junto a la gota de lasuspensin del m.o. Mezclar bien con el ansa. Inclinar el portaobjetos hacia uno y otro lado,observando la formacin inmediata de un precipitado granular o de grumos blancos.

Prueba en tuboColocar aspticamente 0,5 ml de plasma reconstituido en el fondo de un tubo estril.

Aadir 0,5 ml de cultivo de 24 horas (o suspensin en suero fisiolgico de un cultivo en placa).Mezclar por rotacin el tubo, evitando remover o agitar el contenido.Colocar en bao de agua a 37C y observar cada hora hasta 4 horas y luego a las 24 horas, laformacin de un cogulo visible.

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InterpretacinPrueba en portaobjetos: una reaccin positiva se detecta usualmente en 15 a 20 segundos por laaparicin de un precipitado granular. La prueba se considera negativa si no se observa aglutinacinen 2 a 3 minutos. Esta prueba es solo presuntiva y todos los cultivos que den resultados negativoso positivos tardos deben verificarse mediante la prueba en tubos ya que algunas cepas deStaphylococcus aureus no producen coagulasa fija.Prueba en tubos:

1+: pequeos cogulos no organizados.2+: pequeos cogulos organizados.3+: gran cogulo organizado.

4+: todo el contenido aparece coagulado y se mantiene cuando se invierte el tubo.Se consideran positivos los grados 3+ y 4+

ControlesPositivo: S.aureusNegativo: S.epidermidis:

PRUEBA DE LA BILIS ESCULINA

IntroduccinLa prueba de la bilis-esculina est basada en la capacidad de ciertas bacterias, particularmente losestreptococos del grupo D, de hidrolizar la esculina en presencia de bilis al 1 o 4%. La esculina es,qumicamente, un derivado de la cumarina (6-b-glucsido-7-hidroxicumarina), que por su estructurapertenece a los glucsidos. Por definicin, stos estn constitudos por dos restos unidos por unpuente de oxgeno. En el caso de la esculina, uno de los restos es una glucosa y el otro la 7-hidroxicumarina (que no es un hidrato de carbono, y es denominado aglucona).

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PrincipioLas bacterias capaces de desarrollar en bilis y tambin hidrolizar esculina, producen glucosa yesculetina (7,7 dihidroxicumarina) y sta puede visualizarse en un medio con una sal de hierro, porformacin de un complejo marrn oscuro o negro.

Algunos medios bilis-esculina incluyen tambin azida sdica para inhibir el desarrollo deorganismos Gram negativos, transformndose en selectivos para estreptococos.

Medios y reactivosMedio bilis-esculinaPeptona 5 gExtracto de carne 3 gBilis de buey 40 gEsculina 1 gCitrato frrico 0,5 g

Agar 15 gAgua destilada 1 L

ProcedimientoSe estra el organismo en estudio en placas o tubos en pico de flauta del medio bilis-esculina. Se

incuba a 37C durante 24 horas.

InterpretacinLa esculetina difunde hacia el medio de agar por ser hidrosoluble. La reaccin es positiva si seobserva un ennegrecimiento difuso del tubo o un halo marrn oscuro o negro alrededor de lascolonias en placa.

ControlesPositivo: streptococo del grupo DNegativo: estreptococo no del grupo D

UREASAIntroduccinLa urea es una diamida del cido carbnico que puede ser hidrolizada con liberacin de amonacoy dixido de carbono.

PrincipioLa ureasa es una enzima que poseen muchas especies de m.o. que pueden hidrolizar urea deacuerdo a la siguiente reaccin qumica:

El amonaco reacciona en solucin para formar carbonato de amonio, producindose alcalinizaciny aumento de pH del medio.

Medios y reactivosEl caldo urea y agar urea de Christensen son los dos medios mas comnmente usados en loslaboratorios para la deteccin de la ureasa de m.o.

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Urea + 2H2O CO2 + H2O + 2NH3


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Caldo de StuartExtracto de levadura 0,1 gFosfato monopotsico 9,1 gFosfato disdico 9,5 gUrea 20 gRojo fenol 0,01 g

Agua 1 L

pH = 6,8

Agar urea de ChristensenPeptona 1 gGlucosa 1 gCloruro de sodio 5 gFosfato monopotsico 2 gUrea 20 gRojo fenol 0,012 g

Agar 15 gAgua 1 L

pH = 6,8

ProcedimientoInocular el caldo con una ansada cargada con el cultivo puro del m.o. o estriar la superficie delagar. Incubar a 35C durante 24 hs.

InterpretacinLos m.o. que hidrolizan urea rpidamente pueden producir reacciones positivas en 1 a 3 hs. Lasespecies mas lentas pueden requerir 3 o mas das.Caldo: una coloracin rojiza indica alcalinazacin e hidrlisis de urea

Agar: una coloracin rojiza en el medio indica hidrlisis de urea positiva. Los degradadores lentosproducen coloracin parcial (generalmente el pico), los rpidos producen coloracin en todo el

tubo. Si no hay hidrlisis el medio permanece con el colo original (amarillo) y se observacrecimiento.

ControlesPositivo: Proteus spNegativo: Escherichia coli

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PROBLEMAS TERICOS

GENERALIDADESLa identificacin de una cepa bacteriana requiere comparar las caractersticas de esa cepa con lascaractersticas de las especies conocidas descritas. Esta descripcin se encuentra en el BergeysManual of Determinative Bacteriology.

Las propiedades que usa para clasificar los procariotas en grandes grupos (secciones del Manualde Bergey) son las morfolgicas, el tipo de pared y la tolerancia al oxgeno. Esas son generalmentelas caractersticas por donde se comienza la identificacin de una bacteria. Puede ocurrir que estasea una nueva bacteria, en ese caso comparando con las ya descritas slo podremos decir que separece mucho a una especie ya descrita pero que no pertenece a la misma.En la mayora de los anlisis de rutina en un laboratorio de microbiologa el problema que sepresenta no es identificar una bacteria an no descrita, sino determinar si una cepa aisladapertenece o no a una especie de inters. El conocimiento de las propiedades de esa especie deinters se utiliza en el proceso de aislamiento para seleccionar especies con determinadascaractersticas. Por ej. si se quiere determinar si en una muestra de agua estn presentesestreptococos fecales (cocos Gram positivos anaerobios facultativos) utilizar medios ycondiciones de incubacin tales que excluyan a otros grandes grupos de bacterias como los cocosGram positivos anaerobios estrictos y durante su anlisis incubar aerbicamente.

La informacin de la ecologa del m.o. aislado, es decir la muestra de la cual proviene, as como elproceso de aislamiento del mismo reducen considerablemente el espectro de especies posibles.Por ello, en el proceso de identificacin es posible que no necesite analizar todas lascaractersticas que indica el Manual de Bergey.Otra razn por la cual el nmero de caractersticas a analizar puede reducirse es que en la mayorade los anlisis microbiolgicos se busca confirmar o descartar que la cepa aislada pertenece a unaespecie dada. Si la cepa no pertenece a la especie de inters, no es necesario identificarla. Por ej.si en una muestra dada para la cual se exige ausencia de Pseudomonas aeruginosa se aisla unabacteria que pertenece al gnero Pseudomonas pero no es de la especie P. aeruginosa, no esnecesario determinar a que especie del gnero pertenece.

Problema I (E.coli)

AntecedentesLas bacterias de la especie Escherichia colison bastones Gram negativos que no reducen sulfatocuyo hbitat natural es el intestino humano y de animales de sangre caliente. Las cepas de E. coligeneralmente no son patgenas, sino indicadores de contaminacin fecal. Su presencia en unamuestra implica que otros m.o. de origen fecal, incluyendo patgenos, pueden estar presentes enla misma. Slo algunas cepas de E.colison agentes etiolgicos de infecciones gastrointestinales.Estas cepas patgenas entricas se diferencian entre si y de las no patgenas por su biotipo,generalmente asociado a la presencia de plsmidos.En los procedimientos de rutina de anlisis de especialidades farmacuticas y de alimentos sedetermina la presencia o el nmero de bacterias de la especie E.colipero no se determina si esascepas son potenciales patgenos entricos. Cuando hay sospecha de presencia de E.colipatgena se realiza una serotipificacin de un numero determinado de cepas aisladas y/o seenvan a Centros de referencia.La contaminacin fecal puede originarse en las materias primas utilizadas en la elaboracin de un

producto o por contaminacin durante o posteriormente al proceso de elaboracin. El nmero debacterias generalmente depende del tipo de producto y proceso y determina el procedimiento quese realizar para aislar bacterias que pertenezcan a la especie E.coli. El otro factor que determinael procedimiento de aislamiento es la flora acompaante: la proporcin relativa de E.coli a lasdems bacterias presentes y las propiedades fisiolgicas de esas otras bacterias.En muestras que se preparan a partir de materias primas que no deben tener contaminacin fecal(como medicamentos preparados a partir de materias primas sintticas) o en muestras en lascuales despus de su preparacin se ha realizado un proceso para disminuir la carga bacteriana(alimentos pasteurizados) se podra esperar un nmero muy bajo de E.coli. En esas muestras se

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realiza un procedimiento de bsqueda, en el cual por siembra en medios de enriquecimiento seaumenta el nmero de bacterias para despus realizar su aislamiento e identificacin.En muestras de origen natural (generalmente materias primas de origen natural como leche nopasteurizada, aguas presumiblemente contaminadas) se podra esperar un nmero mas alto deestas bacterias. En ese caso no se realiza la etapa de enriquecimiento sino que directamente secuenta el nmero de estas bacterias empleando un mtodo de recuento de bacterias viables en unmedio selectivo para E.coli.En ambos casos la etapa siguiente es determinar si las colonias aisladas pertenecen o no a laespecie E.coli. Los procedimientos oficiales para su deteccin en alimentos y medicamentosgeneralmente llegan a esta etapa despus del aislamiento en medios selectivos y diferenciales.Los medios selectivos mas comunes utilizan inhibidores para las bacterias de origen fecal queacompaan a E.coli (como enterococos) o para bacterias que no son de origen fecal. Los mediosslidos generalmente contienen sales biliares y cristal violeta y los medios lquidos que se empleanpara el recuento por nmero ms probable de coliformes en alimentos y agua (Caldo Lauril Sulfato,Caldo Lactosa Bilis Verde Brillante y caldo Escherichia coli) contienen lauril sulfato de sodio o salesbiliares y verde brillante. Estos medios son generalmente diferenciales porque tienen ademslactosa - E.coli fermenta lactosa y glucosa- y un modo para detectar su fermentacin (indicadoresde cambio de pH) o la produccin de gas en medio lquido (campanas de Durham).Las colonias aisladas en medios selectivos no necesariamente son cultivos puros debido a que elinhibidor del medio puede detener el crecimiento de los otros m.o. contaminantes sin eliminarlos.

Se debe reaislar en un medio no selectivo para asegurarse de obtener un cultivo puro. En elreaislamiento se debe observar si hay colonias con una o varias morfologas y se debe proseguir elanlisis slo con las colonias con morfologa macro y microscpica caractersticas de la especieque se busca aislar.EN ESTA COMO EN CUALQUIER OTRA IDENTIFICACION ES IMPORTANTE QUE CONOZCALAS CARACTERISTICAS PRINCIPALES DE ACUERDO AL MANUAL DE BERGEY- DELMICROORGANISMO QUE INTENTA IDENTIFICAR.

ProblemaEn jarabes preparados a partir de extractos naturales de plantas la Farmacopea Europea exigeausencia de E.colien 1 mL de jarabe. Para realizar dicho anlisis se realiza un enriquecimiento encaldo lactosa, se aislan colonias de dos tipos en medio Mac Conkey incubado entre 43-450C: 1)colonias rojas con halo de precipitacin alrededor, 2) colonias incoloras sin halo de precipitacin.

Cules son las colonias que podran pertenecer a la especie E. coli?

Ud. recibir un reaislamiento de una colonia sospechosa en medio Agar Lactosa Rojo Fenol.Cmo crecera una cepa de E. coli en ese medio?Que ensayos adicionales a la observacin de la colonia y de sus caractersticas en el medio decultivo debe realizar en el momento para determinar si dicha colonia puede serE. coli?Que otras propiedades puede deducir a partir de este crecimiento? De acuerdo a ellas, la cepaque tiene en ese reaislamiento podra pertenecer a la seccin en la cual el Manual de Bergey ubicaa E.coli? En que Familia se ubica a E. coli? Que propiedades debera determinar para distinguiresa Familia de las otras de la misma seccin?

En que caso puede afirmar que tiene un cultivo puro?Puede continuar con las etapas de identificacin? Si no puede, que procedimiento realizara?

De acuerdo a la Farmacopea Europea, la cepa sospechosa que Ud. tiene hasta ahora (coloniastpicas en el medio selectivo) indica la presencia probable de E.coli. Para la confirmacin serecomienda el test para la produccin de indol y otras pruebas bioqumicas.En qu consiste la prueba de indol?Qu resultado espera para esta prueba si fuese E.coli? Utilice la tabla de pruebas bioqumicaspara Enterobacterias resumida del Manual de Bergey. (recuerde que el nmero que aparece en latabla es el % de cepas que dan un resultado positivo para ese test en el total de cepas analizadas)

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Podra perderse alguna cepa de E.colisi realizara slo esta prueba? Es decir una cepa que,siendo E.coli, no la puede identificar como tal porque la cepa da un resultado atpico en laproduccin de indol.

La recomendacin de la American Public Health Association (APHA) para el anlisis de alimentosincluye tres pruebas adems del indol: Rojo de Metilo, Voges Proskauer y Citrato. Las 4 pruebasse resumen en la sigla IMViC (Indol, Metilo, Voges, Citrato).Qu cree que se logra incluyendo mas pruebas bioqumicas?En qu consisten estas pruebas? Qu resultados espera para E.coli?Los manuales de mtodos del APHA dan por identificada una cepa como Ecolisi el resultado de laspruebas IMViC es ++-- (Indol y Rojo de Metilo positivos, VP y Citrato negativos) o si es -+--.Podra perderse una cepa de E.colien este caso?Podra darse el caso al revs, es decir que identifique como E.coliuna cepa que no es?

Problema II (Salmonella)

AntecedentesLas bacterias del gnero Salmonella son bastones Gram negativos que no reducen sulfato cuyohabitat es el intestino humano y de animales. Aunque no todas las especies de Salmonella son

igualmente patgenas, todas son importantes para la salud pblica, y por tanto el procedimiento deanlisis debe estar dirigido a recuperar cualquier especie que pertenezca a este gnero.

En especialidades farmacuticas y alimentos a diferencia de muestras clnicas- se esperaun nmero bajo de estas bacterias, que adems pueden estar fisiolgicamente daadas debido alprocesamiento y almacenamiento de la muestra. Debido a ello en el anlisis de estas muestras seincluyen siempre etapas de enriquecimiento. El aislamiento generalmente se realiza en mas de unmedio de cultivo (no todas las especies de Salmonella crecen en un solo tipo de medio slido). Losmedios selectivos ms comunes utilizan inhibidores como el colorante verde brillante o salesbiliares para bacterias que no son de origen fecal. Varios de estos medios son diferenciales porquetienen adems lactosa o xilosa y un modo para detectar su fermentacin (indicadores de cambio depH) o lisina y la deteccin de la decarboxilacin. La etapa siguiente es determinar si las coloniasaisladas pertenecen o no al gnero Salmonella. Las pruebas bioqumicas y la serologa se usan derutina para la identificacin presuntiva en laboratorios de anlisis microbiolgico. La identificacin

definitiva se realiza en centros de referencia por serologa.Recuerde que las colonias aisladas en medios selectivos no necesariamente son cultivos purosdebido a que el inhibidor del medio no elimina los otros m.o. contaminantes. Se debe reaislar en unmedio no selectivo para asegurarse de obtener un cultivo puro. En el reaislamiento se debeobservar si hay colonias con una o varias morfologas y se debe proseguir el anlisis slo con lascolonias con morfologa macro y microscpica caractersticas de la especie que se busca aislar.

ProblemaEn preparaciones farmacuticas que contienen plantas medicinales la Farmacopea Europea exigeausencia de Salmonella en 10 g de la preparacin. Para realizar dicho anlisis se realizan dosetapas de enriquecimiento: una en caldo lactosa y la siguiente en un caldo selectivo contetrationato, bilis y verde brillante. A partir de all se aislan colonias en mas de un tipo de medio decultivo selectivo: en uno de ellos, el Agar Verde Brillante (que tiene adems lactosa, sacarosa y rojo

fenol), crecen dos tipos de colonias: 1) colonias que viran el medio a amarillo, 2) colonias incolorasque no viran el medio a su alrededor.Cules colonias podran pertenecer al gnero Salmonella?

Ud. recibir un reaislamiento de una colonia sospechosa en medio Agar Lactosa Rojo Fenol.Cmo crecera una cepa de Salmonella en ese medio?Qu ensayos adicionales a la observacin de la colonia y de sus caractersticas en el medio decultivo debe realizar en el momento para determinar si dicha colonia puede ser una especie deSalmonella?

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Qu otras propiedades puede deducir a partir de este crecimiento? De acuerdo a ellas, la cepaque tiene en ese reaislamiento podra pertenecer al grupo de bacterias en el cual el Manual deBergey ubica a las especies de Salmonella?En qu Familia se ubica a las especies de Salmonella? Que propiedades debera determinarpara distinguir esa Familia de las otras de la misma seccin?

En qu caso puede afirmar que tiene un cultivo puro?Puede continuar con las etapas de identificacin? Si no puede, que procedimiento realizara?

De acuerdo a la Farmacopea Europea, la cepa sospechosa que Ud. tiene hasta ahora (coloniastpicas en los medios selectivos) indica la presencia probable de bacterias del gnero Salmonella.La identificacin presuntiva se realiza con la prueba bioqumica llamada Tripe Sugar Iron (TSI).En que consiste esta prueba?Que resultados espera para las distintas especies del gnero Salmonella? Utilice la tabla depruebas bioqumicas para Enterobacterias resumida.

Podra perderse alguna cepa de Salmonella? Es decir una cepa que, siendo Salmonella sp., nola puede identificar como tal porque la cepa da un resultado atpico en esta prueba.

La Farmacopea Europea recomienda la realizacin de otras pruebas bioqumicas y pruebas

serolgicas para la identificacin definitiva.La recomendacin de la American Public Health Association (APHA) para el anlisis de alimentossigue un procedimiento similar para enriquecimiento y aislamiento pero usa otras pruebasbioqumicas como la produccin de indol, y la descarboxilacin de lisina entre otras. Recuerdeadems que, durante el aislamiento, se eligieron para la identificacin las cepas no fermentadorasde lactosa. Que cree que se logra incluyendo mas pruebas bioqumicas?En que consisten estas pruebas? Que resultados espera para las especies de Salmonella?

Podra perderse alguna cepa de Salmonella en este caso?Podra darse el caso al revs, es decir que identifique como una especie del gnero Salmonella auna cepa que no lo es?

Problema III (P. aeruginosa)

AntecedentesEn el curso de una investigacin epidemiolgica de varios casos de infeccin por Pseudomonasaeruginosa en una sala de atencin de quemados, se realizaron cultivos de los posibles fuentes oreservorios de la bacteria en el ambiente.Ud. recibir una placa de Agar Cetrimide sembrada con uno de los antispticos analizados,cultivada durante 24 horas a 37C, en aerobiosis. Se solicita que determine si el antisptico pudoser el reservorio o fuente de la cepa de Pseudomonas aeruginosa que provoc los casos deinfeccin.

Qu tipo de medio de cultivo es el Agar Cetrimide? Las bacterias que crecen en l requierenfactores de crecimiento? Requiere altas concentraciones de NaCl?

A cul seccin del Manual Bergey corresponde la o las bacterias en estudio?

Podra tratarse de una bacteria aerobia estricta? Como hara para confirmar que se trata de unabacteria aerobia estricta?

Cul es el fundamento de los ensayos King A y King B? Si una cepa creciera en Agar Cetrimidecon produccin de un pigmento difusible de color azul, realizara ambos ensayos?

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Es el antisptico analizado un posible reservorio de la cepa que caus las infecciones en lospacientes?

El antisptico del cual se obtuvo este aislamiento fue una solucin de un compuesto de amoniocuaternario. Es posible suponer que fuera un reservorio para P. aeruginosa?

Problema IV (S. aureus)

AntecedentesLas bacterias pertenecientes a la especie Staphylococcus aureus son cocos Gram positivos, quepueden ser patgenos para el hombre. Las principales afecciones que producen son intoxicacinalimentaria, por produccin de una toxina termoresistente en alimentos, e infecciones de piel.Existen seres humanos que son portadores sanos de S. aureus, el cual se aloja en narinas y piel. Apartir de esas fuentes, puede llegar a los alimentos donde su proliferacin constituye un riesgopotencial para la salud pblica por la posible produccin de enterotoxinas.

Las siguientes situaciones llevan a analizar los alimentos para determinar la presencia o elnmero de clulas de S. aureus:

A) confirmar si es el agente causal de una enfermedad alimentaria.B) determinar si un alimento o ingrediente es una fuente potencial de estafilococos

enterotoxignicosC) demostrar contaminacin post-proceso, que generalmente se debe a contacto humano conalimentos procesados.

Los alimentos que se sospecha fueron vectores de una toxiinfeccin alimentaria debida a S.aureus frecuentemente presentan altos nmeros de clulas del m.o.. En cambio, si se sospechauna contaminacin post proceso, puede esperarse una poblacin menor. En general S. aureus noes el nico m.o. presente en el alimento, por lo cual debe emplearse medios selectivos para suaislamiento y recuento.Las especialidades farmacuticas tambin se analizan para detectar S. aureus, debido a laposibilidad de causar infecciones en piel y mucosas. En este tipo de muestras, por lo general seexige ausencia de S. aureus en 1 g de producto.

Los medios selectivos contienen inhibidores de otros m.o., de modo de impedir el desarrollo deotras especies. Los agentes selectivos ms comnmente usados en medios para S. aureus sonNaCl (S. aureus puede crecer en presencia de concentraciones entre 5.5% y 10%) y telurito depotasio (K2TeO3, S. aureus reduce el telurito de potasio, produciendo colonias negras), y otroscloruro de litio, polimixina, azida de sodio y neomicina.Debe considerarse que el uso de los agentes selectivos no garantiza la completa inhibicin deotros m.o., como por ejemplo miembros de los gneros Bacillus, Micrococcus, Streptococcus y anlevaduras. Por esta razn, la aparicin de colonias tpicas no es suficiente y debe confirmarse sidichas colonias tpicas desarrolladas en placas de medio selectivo verdaderamente pertenecen a laespecie S. aureus.

ProblemaUna familia presenta sntomas de toxiinfeccin alimentaria 2 a 4 horas despus de comer, con

nusea, vmitos, diarrea y dolor abdominal. Esta sintomatologa puede deberse al desarrollo deelevados nmeros de S. aureus y formacin de toxina en el alimento ingerido. Se decide analizaruna muestra remanente de queso artesanal que form parte de la comida, de modo de determinarsi el m.o. responsable fue S. aureus.

Qu mtodo puede usarse para aislarS. aureus de dicha muestra si el m.o. estuviera presente ennmeros altos?

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A Ud. se le entregar una placa de MSA proveniente de esta muestra. Considerando que lasbacterias del genero Staphylococcus son fermentadoras de glucosa y manitol. Es posible afirmarque en la muestra haba S. aureus? Por qu?

En caso de que haya que continuar el anlisis:Cmo determinara si las colonias tpicas corresponden a S aureus o no? Qu morfologa yreaccin al Gram presenta el gnero Staphylococcus?Cmo se clasifican las bacterias de este gnero segn sus relaciones con el oxgeno?Cmo puede diferenciarse el gnero Staphylococcus de otros relacionados? (Deber recurrir aTablas del Manual de Bergey que tendr para consulta en clase)

Cmo puede diferenciarse S. aureus de otras especies del gnero Staphylococcus?

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DETERMINACIONES CUANTITATIVAS DE LA BIOMASA - RECUENTOS

Se propone la siguiente clasificacin:

1. Recuentos (determinacin del nmero de microorganismos)

Recuento en placa ya sea en superficie o incorporado Mtodo de las diluciones mltiples o del Nmero Ms Probable (NMP) Filtracin por membrana e incubacin de sta sobre medio de cultivo slido Recuento microscpico directo de los m.o., ya sea en frotis o en cmaras Filtracin por membrana, coloracin del filtro, y conteo al microscopio . Conteo electrnico, usando contadores de partculas.

2. Determinacin de la masa celular

Medida de la masa Medida del volumen Determinacin del contenido de N Turbidimetra y nefelometra

3. Determinacin de la actividad celular

Determinacin de una actividad enzimtica Determinacin de un metabolito Medida del consumo de oxgeno Medida de ATP Calorimetra Medida de impedancia Radiometra (de CO2)

Al momento de elegir la tcnica de recuento a emplear, se debe tener en cuenta el tipo de muestrasobre la que se va a trabajar, porque es posible que algunos de los mtodos no sean aplicables.Cuando es necesario llevar a cabo diluciones, la toma y preparacin de la muestra se realiza de lamanera descrita anteriormente (toma de muestra). En las descripciones que siguen se denominarhomogeneizado a la muestra preparada para su anlisis microbiolgico.

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RECUENTOS

RECUENTO EN PLACA

Permite determinar indirectamente el nmero de m.o. presentes en una muestra en base a que sedesarrollen en medio de cultivo, en placa, formando colonias. Por lo tanto se determinan por estemtodo slo las clulas microbianas VIABLES en las condiciones de trabajo (nutrientes, atmsfera,temperatura). Como las colonias pueden originarse tanto de una clula como de un grupo declulas, se utiliza el trmino: UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS (u.f.c.) Adems, a losefectos de que todas las clulas que estn en una placa tengan una adecuada disponibilidad denutrientes, y que la incertidumbre del mtodo sea menor, se establece que las condiciones ptimasde recuento se dan cuando desarrollan entre 30 y 300 colonias por placa. Esta regla general seusa siempre que no haya una especificacin diferente. Para alimentos se utilizan el rango decolonias ptimas entre 25 a 250 ufc por placa. Si fuera posible y necesario se puede repetir elrecuento para obtener placas con un nmero de colonias ptimas.

ProcedimientoLa preparacin de la muestra se realiza como para cualquier mtodo utilizando diluyentesadecuados. Se preparan diluciones decimales sucesivas (relacin muestra/volumen de dilucin 1en 10), partiendo en general de 10 g o mL de muestra en 90 mL de diluyente para la primera

dilucin (1/10 o 10-1). Para la segunda dilucin (1/100 o 10-2) se toma 1 mL de la 10-1 y se descargaen 9 mL de diluyente y as sucesivamente. Se descarta la pipeta luego de cada descarga.

Cada vez que se prepara una dilucin en necesario homogeneizarla adecuadamente para lograruna distribucin de los m.o. en todo el volumen de dilucin. Esto se logra por agitacin (si es unfrasco con tapn hermtico se realiza con agitacin durante 25 veces, formando un arco de aprox.30 cm y si es un tubo con agitacin con Vortex). Tambin puede cargarse y descargarse undeterminado volumen de la dilucin con una nueva pipeta (al menos tres veces), y finalmente tomarel volumen deseado .

Segn la carga esperada, o permitida, se eligen las diluciones a sembrar.Cuando se esperan cargas altas, se siembran no menos de tres diluciones consecutivas Ej.: 1:10(10-1), 1:100 (10-2), 1:1000 (10-3).Una vez preparadas las diluciones, se siembra dentro de los 15 minutos siguientes .

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ANTES DE PROCEDER A LA SIEMBRA SE ROTULAN LAS PLACAS CON LOS SIGUIENTESDATOS:

Identificacin de la muestra: Nombre y/o cdigoDilucin, Volumen sembradoSuperficie o incorporadoFechaOperador

SIEMBRA INCORPORADASe deposita 1 mL de cada dilucin en placas estriles, vacas, por duplicado. Se puede emplear lamisma pipeta para todas las diluciones si se comienza por la ms diluida. Posteriormente, seagrega a cada placa 15 a 20 mL del medio de cultivo a emplear, previamente fundido ytermostatizado a 45C (en bao o estufa). Se agita moviendo la placa tapada sobre la superficie dela mesa con movimiento circular, horario y antihorario yy hacia delante y hacia atrs.En algunas situaciones puede sembrarse un volumen diferente, en general no ms de 3 mL porplaca.

SIEMBRA EN SUPERFICIESe deposita en la superficie de las placas que ya contienen el medio de cultivo, 0.1 mL de cada

dilucin. Se realiza duplicado para cada dilucin. Se puede emplear la misma pipeta para todas lasdiluciones si se comienza por la ms diluida. Luego de realizada la descarga de la muestra, seprocede a extenderla sobre toda la superficie de las placas para que se absorba, usando rastrilloestril.

Medio de cultivoSe elige segn el tipo de m.o. que se quiere contar pudiendo emplearse medios selectivos o noselectivos.

IncubacinUna vez enfriado el agar en el caso del recuento incorporado, y absorbida la muestra en el caso derecuento en superficie, las placas se invierten, y se ponen en la estufa que corresponde segn los

m.o. a contar, durante el tiempo propuesto en la tcnica correspondiente.

INTERPRETACINFinalizado el perodo de incubacin se observa con buena luz a efectos de visualizar todas lascolonias y diferenciarlas de cualquier partcula de muestra que pueda confundir. Contar todas lascolonias desarrolladas por placa, marcando cada una con un lpiz de tinta indeleble. Se cuentancomo colonias individuales todas aquellas que disten de las colonias prximas una distancia almenos igual al dimetro de la colonia ms pequea.

Cuando se utilizan medios NO SELECTIVOS se procede de la siguiente forma:

1) Se cuentan en primer lugar las placas que tengan entre 30 y 300 colonias (o 25 250). Se

hace el clculo multiplicando por la inversa de la dilucin y luego se promedian sicorresponde- los valores de las distintas placas y diluciones. Para el informe final se toma encuenta solo los valores de estas placas.

Si no hay placas que contengan entre 30 y 300 colonias proceder de la siguiente manera:2) Si slo hubieran placas con menos de 30 colonias, se hace el clculo multiplicando por lainversa de la dilucin y se informa igualmente el resultado, expresndolo por g o mL demuestra. En este caso se informa el resultado como ESTIMADO.Si no hubiera colonias en ninguna de las placas, se informa como: Menor que 1 o 10 (segnsea incorporado en superficie) por la inversa de la dilucin menor.

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3) Si en todas las placas hubiera ms de 300 colonias, se estima el resultado. Si no esposible distinguir colonias individuales (crecimiento confluente) se puede informar elresultado como mayor de 300 por la inversa de la dilucin mayor. Si es posible distinguircolonias individuales y estn homogneamente distribuidas, se cuentan las colonias en unasuperficie conocida de la placa y luego se extrapola a la superficie total de la placa: 65 cm2

para las de vidrio comunes, o 57 cm2 para las de plstico.Se siguen las siguientes reglas:

Si hay menos de 10 colonias por cm2, se cuentan 13 cuadrados de 1 cm de lado: 7consecutivos horizontales y 6 consecutivos verticales. El total de colonias contadasse multiplica por 5 o 4.4 segn el tipo de placa, para estimar el nmero de coloniasen toda la placa. En este caso se informa el resultado como ESTIMADO

Si hay ms de 10 colonias por cm2, se cuentan 4 cuadrados de 1 cm de lado, y elpromedio se multiplica por 65 o 57 segn el tipo de placa. En este caso se informael resultado como ESTIMADO

Si hay ms de 100 colonias en 1 cm 2, no se cuentan sino que se estima elresultado como mayor de 6500 o 5700 por placa.

Una vez estimado el nmero de colonias por placa, se aplica el factor de conversin para

expresar el resultado por gramo o mL de muestra, de acuerdo al mtodo (incorporado osuperficie), y a las diluciones sembradas.

Es frecuente que desarrollen colonias extendidas sobre la superficie o el fondo y bordes de laplaca, o que se den cadenas de colonias unidas. Este tipo de crecimiento se denomina "spreaders"y se cuentan como una. Cuando el spreader cubre ms del 50% de la placa, esta no debecontarse. Cuando el spreader cubre una superficie menor del 50%, se cuentan las colonias en elresto de la placa, SOLO si estn uniformemente distribuidas.Si en todas las placas hay spreaders se informa : Spreaders

Todas las situaciones en las que no se pueda informar el recuento por no caer en los casosanteriores, (ej.: contaminacin, mal funcionamiento del medio), se informa como: "Accidente delaboratorio"

Cuando se emplean medios SELECTIVOS, el nmero de colonias que se considera ptimo paracontar, suele ser menor de 300, es necesario referirse a la tcnica correspondiente (de referencia)a los efectos de la interpretacin de los resultados.

VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE AMBOS MTODOS:

Incorporado Superficie

Mayor cantidad de muestra. Menor cantidad de muestra

Mayor precisin Menor precisin

Mejor aprovechamiento de nutrientes Peor aprovechamiento de nutrientes

Dificultades al subcultivar colonias Facilidad para subcultivar colonias

Visualizacin de colonias dificultosa Fcil visualizacin

Temperatura del agar puede afectar laviabilidad de algunos m.o.

No se afectan los m.o. termosensibles

Se desarrollan m.o. microaerofilicosEn aerobiosis slo crecen aerobios y anaerobiosfacultativos

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Expresin de los resultados:

Se informan los resultados de recuento con slo DOS CIFRAS SIGNIFICATIVAS, redondeando losvalores cuando corresponda. Redondear la segunda cifra significativa a la inmediata superior si latercera cifra es 6 ,7, 8 o 9. Redondear la segunda cifra significativa a la inmediata inferior si latercera cifra es 1, 2, 3 y 4. Si la tercera cifra es 5 redondear hacia arriba si la segunda cifra esimpar y hacia abajo si es par

Ej.: 137 se informa 140 1,4 x 102

145000 se informa 1,4 x 105

En el informe de un recuento en placa se expresa,:

Recuento de ..............(tipo de microorganismo): X u.f.c. /g o mL

NUMERO MAS PROBABLE (NMP) O METODO DE LOS TUBOS MULTIPLES

Se basa en la determinacin de la presencia o ausencia de un determinado tipo de m.o. (en funcinde que crezcan o de que produzcan determinada reaccin en el medio), en cantidadesdecrecientes de muestra. Se analizan en forma paralela por triplicado o quintuplicado porciones dela muestra cada vez menores inoculadas en un medio lquido. Por ejemplo, se utilizan un total denueve tubos con medio de cultivo, en tres de los cuales se siembra 0,1 g. de muestra, en tres 0,01g y en los otros tres restantes 0,001 g. Luego de la incubacin, se observan y cuenta el nmero detubos positivos.Segn el tipo de m.o que se desea contar se utilizan medios de enriquecimiento selectivo o mediosnutrientes. En funcin de esto se puede considerar como positivos aquellos tubos en los que:

1) Hubo crecimiento que se detecta como aparicin de turbidez (siempre que la muestrasembrada no enturbie el medio).2) Deteccin de productos del metabolismo del m.o.

a) produccin de gas que se observa en una campanita invertida (Durham) en el tubo.c) viraje de indicador (de pH, de potencial redox, etc).d) produccin de pigmento.e) otros (reduccin de NO3-, produccin de indol, hidrlisis de una protena, etc)

Ocasionalmente, es necesario subcultivar cada uno de los tubos positivos, o presuntamentepositivos a placa, o a otro tubo (con el mismo u otro medio) a efectos de confirmarlo.

El nmero de tubos (positivos) que se busca en las tablas para el informe final es el que resulta deesta etapa de confirmacin, siendo el valor anterior slo un valor presuntivo. La interpretacin delos resultados, se hace en base a una distribucin de tipo Poisson, y en general se emplean tablaspreparadas de acuerdo a la cantidad de muestra que se siembra en cada serie de tubos.

Ejemplo 1:

N de tubos sembrados: 3 3 3Volumen por tubo (mL) 1 1 1Dilucin de la muestra: 10-2 10-3 10-4

Equivalente en g de muestra 0,01 0,001 0,0001Tubos positivos 3 1 0

El resultado 3-1-0 se busca en tabla III y se obtiene un valor de 43/g mL, cuando en la primerserie de tubos se siembra 0,1 g. Como en nuestro caso no estamos en condiciones hay querealizar la conversin. En este caso resulta claro que estamos sembrando diez veces menos en la

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primera serie de tubos (0,01 g), por lo tanto el factor a utilizar es multiplicando el resultado de tablapor diez. El resultado a informar es entonces: NMP de (tipo de m.o) = 43/g.

Una manera general de calcular el resultado es multiplicar el valor de tablas por el inverso de ladilucin sembrada en la serie del medio. Ej:

Ejemplo 2:N de tubos sembrados: 5 5 5

Volumen de muestra en c/u (mL): 10 1 0,1Nmero de tubos positivos: 2 0 0(dos tubos positivos para la primera dilucin, ninguno en las siguientes)

De la tabla IV surge el valor: 5/mL. Como la siembra no esta realizada en las condiciones de latabla debe aplicarse el factor de correccin.El resultado final se informa: NMP de .... (tipo de m.o):= 5 x 1/100= 0,05/mL 5/100 mL

100Si la muestra es agua es habitual informar el resultado por 100 mL.

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3 1 0 en Tabla III 43/g

NMP de tipo de m.o/mL = 43 x 1/dilucin de la serie del medio = 43 x 1/10-3 = 430/g 4,3 x 102/g100 100


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Es de fundamental importancia antes de leer la tabla, asegurarse que est construida paracondiciones similares a las de trabajo, que sea para igual nmero de tubos por serie, y paracantidades de muestra que sean mltiplo o submltiplo ya que hay variedad de tablas segn elnmero de tubos y diluciones a sembrar.La correccin se hace utilizando proporcionalidad inversa. En todos los casos el valor informado seconsidera un ndice de la carga microbiana, y se conocen los lmites de confianza para cada valor.

Dado que la distribucin de las clulas obedece una distribucin de Poisson puede calcularse elnmero de clulas promedio de la dilucin sembrada cuando no se trabaja en las condiciones mscomunes para las que existen tablas, usando la siguiente ecuacin:

NMP/g o mL = ___________N de tubos positivos____________________

(mL o g de muestra X mL o g de muestra)en tubos negativos en todos los tubos

VENTAJAS Y DESVENTAJAS DEL MTODO:

Puede emplearse para aquellos m.o. que no crezcan en medio slido y para aquellos m.o. decrecimiento lento (paras los cuales se evidencia el crecimiento por una reaccin y no por turbidez)

Este mtodo es especialmente til para determinar cargas microbianas bajas, menores de 10 porgramo para slidos o menores a 1 por 10 mL para lquidos, pero puede igualmente emplearse paracargas mayores utilizando las diluciones apropiadas.

Asimismo, es el nico mtodo a utilizar en el caso de muestras como por ejemplo polvosinsolubles, en los que no es aplicable el mtodo de filtracin ni es recomendable el recuento enplaca debido a la presencia de partculas.Se prefiere tambin este mtodo cuando los m.o. son de lento crecimiento, o cuando han sidosometidos a condiciones adversas (temperatura alta, desecacin, etc.)

Es posible enumerar tambin por este mtodo m.o. anaerobios utilizando en los tubos medioprerreducido, que se tapan con vaselina-parafina luego de inocular, e incuban en condicionesaerobias.

FILTRACION POR MEMBRANA

Este mtodo consiste en hacer pasar un volumen determinado de muestra lquida, o solucin enagua o en solvente apropiado estril a travs de un filtro de membrana estril (dimetro 50 mm,poro 0,45 m), colocado en un equipo de filtracin.Luego de enjuagar con soluciones estriles apropiadas se retira el filtro, y se lo coloca sobre la

superficie de una placa de Petri con el medio de cultivo a utilizar e incuba.

Los filtros pueden ser de distintos materiales; en microbiologa se emplean de nitrato o acetato decelulosa generalmente, y pueden tener bordes hidrofbicos, que minimizan la adsorcin deconservadores y antimicrobianos.

Luego de transcurrido el tiempo de incubacin, se cuentan las colonias desarrolladas en el filtro. Seconsidera que las condiciones ptimas del mtodo se dan cuando desarrollan entre 20 y 200colonias en el filtro. Se utilizan filtros reticulados, y existen reglas para el conteo:

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1) Si hay 1 o 2 colonias por cuadrado del retculo, o menos, se cuentan todas.2) Si hay entre 3 y 10 por cuadradito, se cuentan 10 cuadrados, y se promedia, multiplicandopor 100 para obtener el nmero de colonias en el filtro (se multiplica por 100 porque el readel cuadrado representa la centsima parte del rea total del filtro).3) Si hay entre 10 y 20 se cuentan 5 cuadrados y promedia, multiplicando luego por 100.4) Si hay ms de 20 se considera >2000 por filtroToda vez que se utilice el promedio por cuadrado, el recuento se informa como ESTIMADO.

Ventajas y desventajas:Sirve para determinar cargas muy bajas, pues se puede filtrar volmenes de 100 y hasta 1000 mL.Es adems el mtodo de eleccin para muestras lquidas o solubles que contienen agentesantimicrobianos, por cuanto no es necesario neutralizarlos.

Expresin de los resultados:Una vez conocido el nmero de colonias por filtro, se expresa el valor en u.f.c. al igual que elrecuento en placa expresndolo por gramo, o mililitro de muestra.

RECUENTO MICROSCOPICO DIRECTO

Este mtodo permite determinar el nmero de clulas microbianas, por observacin en elmicroscopio. La muestra puede utilizarse tal cual, (si es lquida como leche o cultivos puros enmedio lquido), o puede prepararse una dilucin tal como se realiza para otros mtodos derecuento.

Se basa en contar m.o. en una cantidad conocida de muestra utilizando frotis coloreados, cmarasdel tipo de las de contar glbulos, o las especialmente diseadas para contar hongos en alimentoscomo la cmara de Howard.

Se determina el nmero TOTAL de clulas presentes (VIABLES Y NO VIABLES) Ocasionalmentese pueden utilizar colorantes que indiquen diferentes estados metablicos de las clulas. Porejemplo en un recuento en cmara de un cultivo de levaduras con azul de metileno, se puedendistinguir las clulas VIABLES (no absorben el colorante, se vern transparentes) de las NOVIABLES (absorben el colorante y se vern azules).

Recuento sobre frotis coloreadoSe marca sobre un portaobjetos limpio y desengrasado, un cuadrado de 1 cm de lado. Sobre lasuperficie opuesta del portaobjetos, se deposita en el centro 0,01 mL de muestra ya sea con ansacalibrada o con micropipeta. Se extiende por todo el cuadrado con ansa. Se deja secar en posicinhorizontal. Se fija y colorea, ya sea por Gram o con azul de metileno 1 minuto (mtodo de Breedpara leche).

Se observa por inmersin, contando los m.o. en cada uno de varios campos. El nmero de camposa contar depende del nmero de m.o. por campo y del factor del microscopio. Se transcribe la tablaque se propone para el recuento directo en leche (Standard Methods for the Examination of DairyProducts APHA)

Nmero de campos a contar segn el factor del microscopio y el nmero de microorganismos:

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Microorganismos por campo

Factor del microscopio

300000 400000 500000 600000

Menos de 1 30 40 50 60

1 a 10 20 20 20 30

Ms de 10 10 10 10 20

Clculo del factor del microscopio

Con objetivo de 40 x, o 100 x, se mide el radio del campo utilizando un portaobjetos calibrado, o elretculo de una cmara cuenta glbulos. Si se utiliza el de 40 x, luego debe hacerse la correccinutilizando el factor 40/100 para llevarlo al aumento de trabajo.

Se calcula el rea del campo: r2El nmero de campos por cm2 es: 1 / r2

Si se extendi en 1 centmetro cuadrado 0,01 mL de muestra, el nmero de campos por mililitro,

llamado Factor del Microscopio (FM), se calcula de la siguiente forma:

FM = 100 / r2 donde r se expresa en cm, o FM = 10000/ r2 con r en mm.

Expresin de resultados

Una vez contado el nmero de m.o. en los campos que corresponde, se promedia, y multiplica porel Factor del microscopio; de esa forma se obtiene el resultado que se expresa en trminos de:

Recuento microscpico directo = N microorganismos por mL

Recuento en cmara de NeubauerEs una cmara que se utiliza para contar glbulos (En E se cuentan eritrocitos y en L losleucocitos) y est diseada de manera de contener una cantidad fija de lquido. Consta de uncuadrado central de 1 mm de lado dividido en 25 cuadraditos. Cada uno de ellos est, a su vez,dividido en 16 cuadrados.

Se coloca un cubreobjetos sobre la zona cuadriculada, apoyado sobre dos hombros laterales demanera que cuando hay un buen contacto entre ellos, queda una distancia de 0.1 mm entre elcubreobjetos y la cmara. Esto determina que el lquido quede contenido en un volumen de 0.1mm3.

Ventajas del mtodo:Es rpidoLos frotis se pueden guardarLas exigencias de equipo son mnimasSe pueden observar las diferentes morfologas de los m.o.

Se observan tanto los m.o. viables como los no viables

Desventajas del mtodo:La cantidad de muestra analizada es pocaProvoca cansancio del operadorSlo sirve para muestras con cargas superiores a 10.000 por mL.Es difcil distinguir los m.o. de las partculas de muestraUna inadecuada distribucin de la muestra sobre la superficie del portaobjetos puede ocasionarserios errores.

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DETERMINACIN DE LA MASA CELULAR

TURBIDIMETRA

Este mtodo da informacin sobre el contenido de macromolculas, y no sobre el nmero declulas.

En el laboratorio de microbiologa se usa un colormetro, o un espectrofotmetro y se mide laabsorbancia de la suspensin de m.o. en comparacin con un blanco que es el medio esterilizado,y sin sembrar. Cuanto mayor es el nmero de clulas en suspensin, tanto menor es el porcentajede luz que atraviesa el medio.

Se cumple una ley similar a la de Lambert-Beer yexpresando la relacin en trminos de masa microbiana yabsorbancia, la ecuacin es la siguiente:

A= k x W:

donde: Absorbanciak: constante

W: masa celularLa grfica correspondiente construida con valores realesmuestra una desviacin a medida que aumenta la masa microbiana.

Para utilizar la medida de la absorbancia como mtodo de recuento, es necesario hacer para cadam.o. una curva de calibracin, midiendo el nmero de m.o. por otro mtodo de recuento. El mtodose emplea fundamentalmente para preparar inculos, cuando se trabaja con cultivos puros.

ESCALA DE MAC FARLAND

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A

W


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Existe la posibilidad de estimar cargas altas de m.o., comparando a simple vista con una escalaformada por tubos numerados de 1 a 10 y elaborada con diferentes cantidades de sulfato de bario.Se conoce la cantidad aproximada de clulas bacterianas a que corresponde cada tubo, y de esaforma se puede estimar la cantidad de m.o. presentes. Este mtodo slo da una estimacin delnmero de m.o. (viables y no viables) y sirve slo para cargas altas. Tiene la ventaja de ser muyrpido y no es necesaio disponer de espectrofotmetro.

Tubo Millones de bacterias/ mL

1 3002 6003 9004 1.2005 1.5006 1.8007 2.1008 2.4009 2.700

10 3.000

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ALGUNAS APLICACIONES DE RECUENTOS

MICROORGANISMOS INDICADORES

Los mtodos usados para el aislamiento y el recuento de los m.o. patgenos en agua, alimentos,etc. pueden no ser eficaces debido a que dichos m.o. se encuentren en muy baja cantidad, sobretodo en presencia de nmeros altos de otros m.o. Tambin puede ocurrir que tengan unadistribucin irregular en la muestra. An cuando se cuenta con mtodos sensibles, en general sonlargos y costosos; adems, hay patgenos que no pueden determinarse en laboratorios noespecializados, como, por ejemplo, el virus de la hepatitis A. Estas dificultades han impulsado aque se utilicen grupos de m.o. de deteccin y enumeracin ms fciles y cuya presencia en ciertonmero se considera como una indicacin de que la muestra estuvo expuesta a condiciones quepudieron determinar la llegada a la misma de m.o. peligrosos y/o permitir la proliferacin deespecies patgenas. Estos grupos de m.o. se denominan indicadores.

Se usan como m.o. indicadores aquellos cuya relacin con los patgenos ha sidoestudiada.

Los indicadores utilizados ms frecuentes son:

- mesfilos aerobios totales o hetertrofos- Enterobacterias- Coliformes totales y fecales- Estreptococos fecales y Enterococos- Clostridios sulfito-reductores

AGUA

El anlisis microbiolgico de muestras de agua tiende a determinar la calidad sanitaria de sta y suaptitud para distintos usos. En general, los mtodos utilizados estn diseados de modo dedetectar el grado de contaminacin del agua con desechos de origen humano y/o animal.

Tradicionalmente se han usado ensayos para la determinacin de m.o. indicadores ms que parala determinacin de patgenos.

El grupo de bacterias coliformes ha sido siempre el principal indicador de calidad de los distintostipos de agua; el nmero de coliformes en una muestra se usa como criterio de contaminacin ypor lo tanto, de calidad sanitaria de la misma.

Los coliformes son bastones Gram (-), aerobios o anaerobios facultativos que fermentan la lactosacon formacin de gas cuando se incuban 48 horas a 35C. Incluye los gneros Escherichia,Enterobacter, Klebsiella y especies lactosa positivas de otros gneros. Tambin interesa ladeterminacin de coliformes fecales que representan la fraccin de coliformes que provienen deintestinos y materias fecales de hombre y animales de sangre caliente (coliformes termotolerantes).Esto provee informacin importante sobre la fuente y el tipo de contaminacin presente.

Un mtodo muy utilizado para el recuento de coliformes en agua ha sido siempre el NMP, pero hanido variando los medios de cultivo, las condiciones y las tcnicas de manera de obtener cada vezmayor sensibilidad y precisin hasta hacerlo aceptable como mtodo estndar. Los distintosmtodos de NMP para coliformes totales se basan, en primera instancia, en una seleccin de losm.o. que producen gas de lactosa a 35C. Por ello, el primer paso es siempre la siembra en tubosde algn caldo lactosado, con tubo de fermentacin para recoger el gas que pueda producirse. Aesto sigue una confirmacin en un medio lquido selectivo y/o una determinacin de los coliformesfecales cuya diferenciacin se realiza en base al hecho de que pueda producir gas de lactosa enun medio apropiado cuando se incuba a 44,5C mientras que los dems coliformes no.

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Tambin es muy utilizado el mtodo de filtracin por membrana para el recuento de bacteriascoliformes totales y fecales. Es un mtodo altamente reproducible, puede usarse para analizarvolmenes de muestra relativamente grandes y se obtienen resultados en menor tiempo que con elNMP. Sin embargo, no puede aplicarse a cualquier tipo de muestra y tiene sus limitaciones.Tambin se encuentra entre los mtodos estndar. A los efectos de la filtracin por membrana debereplantearse la definicin de coliformes: bastones Gram -, aerobios o anaerobios facultativos, quedan colonias oscuras con brillo metlico en medio Endo, luego de 24 hs. de incubacin a 35C. Ladeterminacin de coliformes fecales por filtracin puede hacerse a partir de las coloniasdesarrolladas en Endo o directamente incubando la membrana en medio m-FC e incubando a44,5C.

Para la deteccin simultnea de coliformes totales y Escherichia coli se puede utilizar la prueba desustrato enzimtico. En este caso el grupo de coliformes totales se define incluyendo todas lasbacterias que presentan la enzima beta-D-galactosidasa, que hidroliza el sustrato cromognico (porejemplo, ONPG) liberando el cromgeno. Como E. coli se incluyen todas las bacterias que danpositiva la reaccin de coliformes totales y que tienen actividad beta-glucuronidasa, que hidroliza elsustrato fluorognico (por ejemplo, MUG), liberando el fluorgeno.

Tambin se usa como indicador de contaminacin fecal el grupo Estreptococos fecales queincluyen especies de Estreptococos grupo D de Lancefield (Enterococcus faecalis, E. faecium,Streptococcus equinus, S. bovis) y algunas subespecies y una especie del grupo Q (Streptococcusavium). El grupo Enterococos estara includo dentro de estreptococos fecales y comprende lasespecies Enterococcus faecalis y E. faecium y sus subespecies (origen humano) y tambin se usacomo indicador de contaminacin fecal en agua.

El hbitat normal de los estreptococos fecales es el intestino del hombre y los animales de sangrecaliente, por lo tanto son indicadores de contaminacin fecal, sobre todo en muestras de lagos,estuarios, ros, etc. La identificacin de las especies puede proporcionar informacin sobre lafuente de contaminacin debido a que algunas especies son especficas de sus huspedes; porejemplo, una predominancia de S. bovis o S.equinum indicara una contaminacin por heces nohumanas.

El recuento de hetertrofos totales consiste en un mtodo estandarizado para determinar ladensidad de bacterias hetertrofas, mesfilas aerobias y anaerobias facultativas en el agua. As seobtiene informacin til que se estudia junto con el ndice de coliformes; tambin se le usa paracontrolar un proceso de tratamiento de agua o para verificar la calidad del agua tratada, luego derecorrer toda la red de distribucin.

Tambin interesa estudiar la presencia o el recuento de Pseudomonas aeruginosa en distintos tiposde agua (potables, recreacionales, de industrias, etc.)

Otro grupo de indicadores que ha comenzado a utilizarse en aguas lo constituyen los colifagos. Loscolifagos son bacterifagos de coliformes que se encuentran siempre que haya coliformes totales yfecales. De acuerdo a estudios de correlacin entre nmero de colifagos y coliformes en agua, se

podra utilizar el ndice de colifagos como ndice de calidad sanitaria de agua. Adems, como sonms resistentes a la cloracin que los coliformes, pueden ser mejores indicadores de desinfeccinque stos ltimos.

El mtodo de enumeracin se basa en la formacin de playas de lisis. Los colifagos (bacterifagos)infectan y se multiplican en bacterias sensibles a ellos. Esto provoca la lisis celular de esasbacterias y liberacin de partculas virales que infectarn a las clulas bacterianas adyacentes. Amedida que stas bacterias se vayan lisando, se formarn zonas claras, conocidas como playasde lisis, entre el crecimiento confluente de la bacteria utilizada. La cepa utilizada en los ensayos es

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una cepa de E. coli sensible a la infeccin por colifagos (ATCC 13706). La metodologa empleadaest descripta en el Standards Methods for the examination of water and wastewater".

BIBLIOGRAFA

Los mtodos de referencia para los anlisis antedichos se pueden encontrar en:

- "Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater", APHA-AWWA-WPCF, 20th Ed.Normas UNIT: 856-91, 857-91, 858-91, 893-91, 894-91, 942-93, 943-93.Normas ISO (varias)

Las normas vigentes en nuestro pas respecto a la calidad microbiolgica de los diversos tipos deagua se pueden encontrar en:

- Normas de calidad de agua potable... OSE- Reglamento Bromatolgico Nacional Ordenanza P.E. 315/94- Ordenanza Bromatolgica Municipal ...................I.M.M (Decreto 27235)- Norma 833/90.......................UNIT

- Decreto 253/79 (12/89)................Poder Ejecutivo- Decreto 16235 (1974)..................Junta de Vecinos de Montevideo

Para el anlisis de diferentes tipos de muestras, y los lmites aconsejados se puede consultar:

- Standard Methods for the examination of Dairy Products", APHA, 16 th Ed., 1992.- U.S. Food and Drug Administration Bacteriological Analytical Manual, AOAC,Gaithersburg, MD,8th ed., 1995..- Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists, 16th Ed., 1995.- Microorganisms in foods 1 & 2" ICMSF.- USP 28.

- Reglamento Bromatolgico Nacional- Normas UNIT (varias)- Ordenanza Bromatolgica Municipal (IMM)- Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 1992, 3rd Ed.- Farmacopea Europea y suplementos- Normas ISO (varias)

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EJERCICIOS DE RECUENTOS

1) Se realiza un recuento en placa de una muestra slida por siembra incorporada de 0,5 mL encada placa en VRBA de las diluciones que se indican. Se incuba 24 hs a 35 C. Se cuentan lascolonias rojas desarrolladas. Informe claramente los recuentos para los siguientes resultados:

MuestraDilucin sembrada y nmero de ufc

10-2 10-3 10-4

1 0 0 0

2 190 28 0

3 > 300 114 9

4 5 0 0

2) Se realizaron recuentos por NMP en dos muestras de gelatina en caldo lauril triptosa. Se

sembraron tres tubos por dilucin, (1 mL de dilucin por tubo) y se incub a 35C durante 48horas. Cmo informara los recuentos si obtuvo los siguientes resultados?:

MuestraDilucin sembrada y tubos positivos

10-2 10-3 10-4

A 3/3 1/3 0/3

B 3/3 3/3 3/3

3) Disear un mtodo de recuento para cada uno de los siguientes casos:a) Determinar la aceptacin o rechazo de una muestra de carne a la que se le acepta unlmite de S aureus de 104 /g.b) Determinar la aceptacin o rechazo de una muestra de harina a la que se le exige menosde 100 microrganismos aerobios mesfilos por gramo.

4) En una muestra de almidn se exige una carga bacteriana menor de 105 /g. Cul de lossiguientes mtodos utilizara para el anlisis y cules no? Fundamente su eleccin y disee el o losexperimentos (diluciones a sembrar, medios, temperatura y tiempo de incubacin).

Recuento en placaRecuento microscpico directoNMPTurbidimetra

5) Explique que mtodo (volmenes a sembrar, medios, temperatura y tiempo de incubacin)utilizara para hacer el recuento de coliformes en agua potable si la exigencia es de 0/100 mL.

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6) Se realiz el recuento en una muestra de agua de pozo por filtracin. Se filtraron 10mL de ladilucin 1/10 (-1), se coloc la membrana en una placa de TSA y se incub por 48hs, se contaron30 colonias en la placa. Cmo se expresa el resultado?

7) Cmo informara el recuento por NMP de las siguientes muestras de agua de playa con lossiguientes resultados?

Muestra 1. (se sembr 1 mL de cada dilucin se incubaron los tubos a 35C por 48 hs.)

MedioDilucin sembrada y tubos positivos

-1 -2 -3

CLT 3/3 3/3 2/3

CLBVB (subcultivo) 1/3 0/3 0/3

Muestra 2. (se sembr 1 mL de cada dilucin se incubaron los tubos de CLT a 35C por

48 hs. y EC a 44,5 C por 24 hs.)

MedioDilucin sembrada y tubos positivos

-2 -3 -4

CLT 2/3 1/3 0/3

EC (subcultivo) 0/3 0/3 0/3

8) Las normas vigentes para la calidad microbiolgica del pescado fresco indican:n= 5, c=3, m=106 M=107 Hetertrofos mesfilos.

n= 5, c=3, m=104

M=106

Hetertrofos psicrfilos.n= 5, c=3, m=103 M=2x103 Staphylococcusaureus.n= 5, c=3, m=4 M=400 Coliformes fecales.

Cmo hara cada recuento? Especificar el mtodo, las diluciones, medios de cultivo y temperaturade incubacin.

9) Las normas de calidad microbiolgica de un producto farmacutico lquido de uso oral indican:un lmite de 500 ufc/mL para bacterias hetertrofas.

Se realiza el recuento del producto en TSA de dicho producto (que contiene parabenos) sembrando

1 mL (incorporado) de las diluciones que se indican y se obtienen los siguientes resultados:

Dilucin sembrada y nmero de ufc

0 -1 -2

3 40 5

De acuerdo a estos resultados qu puede concluir?

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Se realiza la validacin del procedimiento expuesto en el ejercicio anterior. Para ello se preparauna suspensin de un cultivo de E. coli. Se realiza el recuento de esta suspensin de E. coliy seobtiene:

Recuento en placa (TSA) en superficie (0,1mL)

Para realizar la validacin, se inocula 1 mL de la dilucin 7 de la suspensin de E. colipreparadaanteriormente y se agrega a cada una de las placas sembradas con las diluciones del productolquido (0, -1 y -2) y se obtiene el siguiente resultado:

Se considera el mtodo validado?Qu recomendaciones hara para analizar esta muestra? Podra utilizar otro mtodo?.

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Dilucin sembrada y nmero de ufc

-5 -6 -7

358 70 6

Dilucin sembrada de producto (+ suspensin) ynmero de ufc

0 -1 -2

55 113 75


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MUESTREO PARA ANALISIS MICROBIOLOGICO

La primera etapa del anlisis microbiolgico es la extraccin de la o las muestras de un lote ycualquier resultado carece de significado si la muestra no ha sido apropiadamente tomada. Es

responsabilidad del laboratorio de control constatar que la muestra que se analizar esrepresentativa del lote y rechazarla antes de realizar el anlisis si se tiene indicios de que no lo es.

Generalmente en los textos especializados se describen los protocolos para el muestreo en lasreas clnicas, de alimentos, de aguas y de medicamentos y es necesario referirse a ellos enprimera instancia. Aqu sealaremos algunas consideraciones generales aplicables a las tresltimas reas.

El lote es el nmero de unidades o la cantidad de un producto que ha sido sometido a las mismascondiciones durante un proceso determinado. Esta es una consideracin terica puesto que esdifcil asegurar la uniformidad durante la mayora de los procesos conocidos. Por ej. en unaesterilizacin por vapor no todas las zonas del autoclave alcanzan la misma temperatura, sinembargo se considera que todos los recipientes sometidos a ese proceso en esa instancia

constituyen un lote.

Se considera que una muestra o un conjunto de muestras son representativas de un lote cuandoreflejan, tanto como sea posible, la totalidad del lote.

Para determinar que la muestra es representativa y que no se ha alterado despus de la extraccindeben tenerse en cuenta las etapas de: recoleccin, transporte y preparacin para el anlisispropiamente dicho.

1) Recoleccin

Los planes de muestreo determinan el nmero, tamao y zonas de recoleccin de la muestra. Sedisean por criterios estadsticos teniendo en cuenta adems algunas caractersticas del productotales como:

- riesgo potencial para el consumidor, si el riesgo es alto se aumentar el nmero demuestras para dismimuir la probabilidad de que llegue al consumidor una muestra contaminada

- facilidad de homogeneizar el lote. Si la produccin es en batch y el producto es fcilmentemezclable, como un lquido, se requiere menor nmero de muestras que si no lo es; si el lote es unconjunto de unidades y se presume que no es de calidad uniforme entonces se extraernmuestras de los puntos donde se supone que la calidad es inferior los cuales se denominan puntoscrticos (en el ejemplo del autoclave stos seran las zonas donde se alcanza menor temperatura).

A su vez deber considerarse la homogeneidad dentro de la unidad o envase, p.ej. en un alimentocongelado hay un gradiente de temperatura durante el proceso de enfriamiento de tal manera quela zona central es la que tarda mas tiempo en alcanzar la temperatu

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