El cido gammahidroxibutrico (GHB) es un metabolito delGABA (aunque tambin se puede sintetizar a travs de otros com-puestos) que cumple los principales criterios para ser consideradocomo un neurotransmisor o un neuromodulador (Maitre, 1997;Maitre et al, 2000; Garca et al, 2006). En los ltimos aos elGHB ha experimentado un creciente inters social debido a suempleo como nueva droga de abuso, empezando a describirse en1995 los primeros cuadros de sobredosis, que han ido en aumen-to hasta la actualidad (Nicholson y Balster, 2001; Royo-Isaach etal, 2004).

En animales de experimentacin, se ha demostrado que la ad-ministracin de GHB provoca una serie de acciones farmacolgi-cas que incluyen la induccin de sedacin (Laborit, 1964), hipo-termia (Kauffman et al, 1990), reduccin de la agresin (Navarroy Pedraza, 1996), catalepsia (Navarro et al, 1996, 1998, 1999,2000), as como la aparicin de cambios electroencefalogrficossimilares a las crisis de ausencia descritas en humanos (Barnejeeet al, 1993). Asimismo, es conocido el importante potencial clni-co del GHB debido a su efecto teraputico en el sndrome de abs-tinencia a opiceos y a alcohol (Pedraza y Navarro, 2001a), a sueficacia para reducir los sntomas narcolpticos y a su utilidad pa-ra inducir el sueo (Vera y Navarro, 1996).

No obstante, estudios recientes sugieren la existencia de una po-sible neurotoxicidad tras el tratamiento prolongado de GHB en do-sis con potencial de abuso. Por un lado, la administracin subcr-nica de dosis bajas de esta sustancia (5 mg/kg, ip) en ratonesmachos y hembras, produce alteraciones de la memoria de trabajo

Efectos de la administracin subcrnica de cido gammahidroxibutrico(GHB) sobre la memoria de trabajo espacial en ratas

Francisca B. Garca, Carmen Pedraza, Jorge L. Arias* y Jos Fco. NavarroUniversidad de Mlaga y * Universidad de Oviedo

El GHB, una droga popularmente conocida como xtasis lquido, es una sustancia con potencial deabuso. Entre los posibles efectos secundarios descritos tras su consumo continuado se han referido am-nesia y deterioro de la memoria. Adems, estudios recientes indican la existencia de neurotoxicidad endeterminadas regiones cerebrales tras su tratamiento prolongado. El objetivo de este trabajo fue eva-luar el efecto de la administracin subcrnica de GHB ((10 y 100 mg/kg) sobre la memoria de trabajoespacial y los reflejos sensoriales y motores en ratas machos, utilizando el laberinto de agua de Morrisy una batera de tests sensoriomotores, respectivamente. Los resultados indicaron que los animales tra-tados con 10 mg/kg de GHB presentaban una mayor latencia de escape durante la fase de adquisicinen los das primeros y terceros de pruebas, respecto al grupo control (p

evaluada mediante el test del hole-board (Luna et al, 2002; D-vila et al, 2004). Adems, el tratamiento crnico con dosis bajas deGHB provoca alteraciones tanto de la memoria de trabajo como delreflejo de grasping en ratones machos (Luna et al, 2002; Garcaet al, 2002a). En esta misma lnea, la administracin subcrnica dedosis bajas de GHB en ratas macho (10 mg/kg, ip) se asocia a alte-raciones de la memoria de trabajo evaluada mediante el test delhole-board, afectando adems a la correcta manifestacin del re-flejo de grasping (Garca et al, 2002b; Garca et al, 2002c; Gar-ca et al, 2005). La implicacin de la corteza prefrontal en el refle-jo de grasping, as como la implicacin del circuito integrado porla corteza prefrontal e hipocampo en la regulacin de la memoriade trabajo espacial, indican que un posible deterioro en estas regio-nes podra ser el origen de las deficiencias registradas en las eva-luaciones conductuales (Matsumura et al, 1996; Thierry, 2000).

En la misma lnea, estudios histolgicos centrados en la cuanti-ficacin del nmero de clulas neuronales en la corteza prefrontal yen el rea CA1 del hipocampo tras la administracin subcrnica deGHB en ratas machos (10 mg/kg, ip) han evidenciado una reduc-cin del nmero de neuronas en ambas regiones (Garca et al,2003). Esta prdida neuronal registrada en el hipocampo y en lacorteza prefrontal tras la administracin subcrnica de GHB en do-sis con potencial de abuso podra ser indicativo de un dao neuro-txico, teniendo como consecuencia indirecta un funcionamientodefectuoso de aquellos procesos cognitivos o neurolgicos que re-gulan, lo que posiblemente se pondra de manifiesto en la realiza-cin de tareas conductuales que impliquen la participacin de talesprocesos (Matsumura et al, 1996; Thierry, 2000; Garca et al, 2003).

Nuestra investigacin tuvo como principal objetivo el estudiodel efecto de una administracin subcrnica de GHB sobre elaprendizaje espacial con demandas de memoria de trabajo, eva-luado mediante el laberinto de agua de Morris. De hecho, es am-pliamente conocido que lesiones hipocampales generan un dficiten el aprendizaje espacial, de modo que los animales son incapa-ces de resolver tareas espaciales cuando esta regin sufre algn ti-po de deterioro (Morris et al, 1982; Santin et al, 2001; Cimadevi-lla et al, 2005). Por otro lado, realizamos una evaluacin de unaserie de reflejos neurolgicos mediante una batera de tests senso-riales y motores. De este modo, pretendamos obtener informacinsobre aquellas regiones implicadas en la adecuada manifestacinde tales reflejos neurolgicos, as como sobre aquellos sistemas deneurotransmisin que parecen jugar un papel en su correcta ex-presin conductual (Matsumura et al, 1996).

Metodologa

Animales

Para la realizacin del primer experimento se utilizaron 20 ra-tas macho albinas de la cepa Wistar con un peso comprendido en-tre 250 y 300 gr. Los animales llegaron al laboratorio con una edadaproximada de cinco semanas, siendo adquiridos en el Serviciode Animales de Laboratorio de la Universidad de Oviedo. stosfueron alojados en grupos de dos en jaulas de plstico transparen-te (Tecniplast-Letica, Madrid), con unas dimensiones de 34 20 21 cm. Las condiciones ambientales en el animalario del laborato-rio se controlaron cuidadosamente, manteniendo a los animalesbajo condiciones de luz estandarizadas (luz blanca desde 20:00hasta 8:00; oscuridad desde 8:00 hasta 20:00), temperatura cons-tante (20 2 C), y agua y comida accesible desde las jaulas du-

rante el perodo de habituacin y tratamiento. Entre la llegada delos animales al laboratorio y el comienzo del experimento se deja-ron diez das para la habituacin de los animales a las citadas con-diciones. La limpieza de las jaulas se llev a cabo dos veces porsemana, tarea realizada siempre por la misma persona.

Frmacos

El frmaco empleado fue el GHB (cido -hidroxibutrico), ad-quirido en los Laboratorios Sigma (Madrid, Espaa). Dicha sus-tancia fue disuelta en solucin salina y administrado por va intra-peritoneal (ip), proporcional al peso del animal. A los animales delgrupo control se les administr el mismo volumen de suero salino.

Aparatos

Se emple una piscina circular similar a la descrita por Morriset al (1982) con las siguientes dimensiones: 150 cm de dimetroy 40 cm de altura. La plataforma de escape se encontraba 1,5 cmpor debajo del nivel del agua, cuya temperatura se mantuvo cons-tante (24 1 C) a lo largo del experimento. Se plante el uso deun sistema txico como criterio a seguir para la navegacin espa-cial de los animales. Concretamente, se aplicaron las condicionesambientales ptimas para determinar el empleo de estrategias t-xicas durante el aprendizaje espacial, de modo que los animalesdeban aprender a emplear patrones motores estereotipados paralocalizar el camino hacia la plataforma de escape, aprendiendoseries de movimientos de orientacin. As pues, la habitacin seencontraba iluminada por bombillas de color rojo para que losanimales permanecieran en oscuridad. Adems, se anularon lasposibles seales extralabernticas, tanto visuales como auditivas,que permitieran la orientacin del animal usando estrategias car-togrficas.

Procedimiento

Los animales fueron aleatoriamente distribuidos en tres gruposde tratamiento. Todos los animales recibieron un tratamiento sub-crnico, durante 12 das, con suero fisiolgico o con 10 o 100mg/kg de GHB. El da 11 de tratamiento se realiz la habituacinal laberinto, de modo que todos los animales pasaban por tres en-sayos de una duracin de 60 segundos cada uno sin plataforma. Elda 12 cada animal pasaba la batera de tests sensoriales y motorestras alcanzar el pico mximo de concentracin en plasma de GHB,es decir, 30 minutos despus de la ltima administracin (Maitreet al, 2000). La batera de tests sensoriales y motores se compusode: 1. abduccin; 2. grasping; 3. extensin; 4. flexin; 5. tacto;6. vestibular; 7. auditiva; 8, pupilar; 9. sacudida; 10. plataforma;11. barra; 12. hocico; 13. olfacin y 14. righting. El dficit encada test se cuantific en funcin de una escala de gravedad de trespuntos: 0, ausencia de afectacin; 1, afectacin leve; 2, afectacingrave (Ottani et al, 2003).

Posteriormente, se procedi a iniciar la evaluacin del aprendi-zaje espacial mediante el laberinto de agua de Morris, utilizndo-se para ello un protocolo estandarizado que permita evaluar me-moria de trabajo espacial (Cimadevilla et al, 2004, 2005). Aspues, ste consista en la evaluacin de la memoria de trabajo es-pacial mediante un entrenamiento diario de cuatro das con unasimple sesin de dos ensayos por da (un primer ensayo de adqui-sicin y un segundo ensayo de retencin). En cada ensayo las ra-

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tas eran introducidas en la piscina desde uno de los cuatro cua-drantes imaginarios en que sta se divida (A, B, C o D), de modoque stas deban encontrar la plataforma de escape que se encon-traba localizada en otro de los cuadrantes. La duracin mxima decada ensayo era de 60 segundos (si el animal no encontraba la pla-taforma tras los 60 segundos el experimentador guiaba al animalhacia sta), siendo la permanencia del animal en la plataforma de15 segundos tras alcanzarla. El intervalo entre los ensayos era de30 segundos, donde el animal era introducido en su jaula. Puestoque se demandaba el uso de una memoria de trabajo espacial me-diante estrategias de orientacin txicas, la localizacin de la sali-da del animal y de la plataforma de escape era constante en cadasesin de adquisicin/retencin (ya que el animal deba alcanzar laplataforma utilizando series de movimiento de orientacin), perovariaba entre los diferentes das de entrenamiento.

Resultados

Reflejos neurolgicos

Los datos obtenidos mediante los tests sensoriomotores fueronanalizados mediante la prueba exacta de Fisher, ya que se tratabade muestras aleatorias independientes y cada animal era clasifica-do en una de las tres categoras excluyentes (0= ausencia de afec-tacin; 1= afectacin leve; 2= afectacin grave), ya que los datosevaluados se encontraban en escala nominal y las frecuencias es-peradas fueron menores de cinco. No obstante, debemos tener encuenta que el nmero de sujetos no era el mismo para cada grupoexperimental, lo que determin el uso de porcentajes para facilitarla comparacin entre los distintos grupos de tratamiento (vase fi-gura 1). As pues, tan slo se encontraron diferencias significati-vas en el reflejo de grasping (p

subcrnica de GHB en ratas adolescentes ocasiona un dficit en laadquisicin de la memoria espacial, de modo que los animales tra-tados con 100 mg/kg de GHB presentan una latencia de escapesignificativamente mayor en comparacin con los animales no tra-tados con esta sustancia. Por otro lado, algunos estudios han pues-to de manifiesto que la administracin subcrnica de dosis bajas eintermedias de GHB tiene como consecuencia una prdida neuro-nal en aquellas regiones potencialmente susceptibles a un daoneurotxico ocasionado por el tratamiento continuado de esta sus-tancia, tales como la corteza prefrontal y el rea CA1 del hipo-campo (Garca et al, 2003), lo que podra generar alteraciones enlos procesos cognitivos regulados por estas estructuras.

Son numerosos los estudios que han evidenciado que las drogasestimulantes que afectan al sistema monoaminrgico y que, portanto, presentan un perfil farmacolgico similar al GHB, tales co-mo la anfetamina y la cocana, alteran determinados procesos cog-nitivos (Pedraza y Navarro, 2001a; Slamberov et al, 2005). Diver-sos trabajos centrados en el estudio de los efectos del tratamientocontinuado de cocana han demostrado que tras su administracinen ratas adultas y adolescentes, as como tras su exposicin prena-tal, se producen alteraciones que afectan al aprendizaje espacial,describindose deficiencias significativas en la adquisicin de lamemoria de trabajo (Melnick et al, 2001; Santucci et al, 2004). Es-tos mismos resultados son descritos en ratas adultas expuestas pre-natalmente a metanfetamina, encontrndose efectos similares trassu administracin crnica (Slamberov et al, 2005). No obstante,algunos autores han planteado que posiblemente las alteracionesdescritas en aprendizaje espacial se deban a deficiencias en la me-moria de reconocimiento, de manera que los animales tratados conmetanfetamina o sustancias similares son incapaces de discriminarentre objetos familiares y nuevos, lo que dificultara la realizacinde aquellas tareas que suponen un uso adecuado de la memoria detrabajo, proceso cognitivo donde tienen una especial relevancia lacorteza prefrontal y el hipocampo como estructuras reguladoras.

En este sentido, debemos tener en cuenta que corteza prefron-tal e hipocampo son dos estructuras del SNC que presentan unadensidad media-alta de receptores para GHB (Pedraza y Navarro,2001b), y que algunos estudios recientes indican que la actividadde las neuronas prefrontales se encuentra modulada por la dopa-mina, estando adems la interaccin entre GHB y dopamina am-pliamente documentada. Por tanto, podramos inferir una interre-lacin entre ambos sistemas de neurotransmisin en estas regionesmoduladoras de procesos cognitivos (Maitre, 1997; Howard y Fei-genbaum, 1997; Bernasconi et al, 1999; Navarro et al, 1998; Lunaet al, 2004). Si consideramos que el tratamiento prolongado deGHB produce alteraciones importantes en el sistema de neuro-transmisin dopaminrgico, e incluso que podra inducir neuroto-xicidad, ello podra tener como consecuencia la afectacin de losprocesos cognitivos controlados por este sistema de neurotransmi-sin, as como daar aquellas estructuras con receptores GHBr-gicos en sus terminales (Maitre, 1997; Bernasconi et al, 1999; Li-dow et al, 2003). En esta misma lnea, la existencia de nivelesexcesivos de zinc o el tratamiento con psicoestimulantes como lacocana y la metanfetamina tambin han mostrado producir altera-ciones en el sistema dopaminrgico, generando como consecuen-cia un deterioro de aquellos procesos cognitivos que modula (Mel-nick et al, 2001). De este modo, la muerte celular producida enregiones como la corteza prefrontal y el rea CA1 del hipocampotras la administracin prolongada de GHB afectara a su correctofuncionamiento y, por tanto, a aquellos procesos cognitivos que re-gulan (Kesner et al, 2000).

Numerosos trabajos apuntan a una implicacin de la cortezaprefrontal en la modulacin de la memoria de trabajo, de modoque esta rea es de vital importancia para un ptimo rendimientoen este proceso cognitivo (Kesner et al, 2000). As, se ha eviden-ciado que un dao neurotxico en diferentes reas de la cortezaprefrontal producira una alteracin en la ejecucin de tareas quesuponen una participacin de la memoria de trabajo, plantendose

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70

60

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0DA 1

Latencias d

s escape (se

gundos)

DA 2 DA 3

10 mg/kg100 mg/kgSalino

DA 4Figura 2. Medias ( ETM) de las latencias de escape de los animales en funcin del tratamiento recibido. * p

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la especificidad de las reas prelmbicas e infralmbicas en este ti-po de memoria (Collette y Van der Linden, 2002). Por tanto, po-demos considerar que un dao producido a nivel de la corteza pre-frontal podra provocar alteraciones en la realizacin de pruebasque supongan un uso adecuado de la memoria de trabajo espacial.Por otro lado, la integracin de las pistas distales o proximales ne-cesarias para el aprendizaje y que van a permitir la orientacin es-pacial de los animales tiene lugar en el perodo de adquisicin delaprendizaje, donde cobra especial relevancia la memoria de traba-jo como memoria transitoria, puesto que el animal debe relacionarmomento a momento las pistas disponibles con aquellas que le se-rn tiles para la localizacin de la plataforma de escape (Izquier-do et al, 1999). Igualmente, se ha descrito que el neocrtex tieneuna especial relevancia en la navegacin espacial, de modo queuna afectacin de la corteza entorrinal y perirrinal, de la cortezaprefrontal y de la corteza cingular anterior, podra suponer proble-mas en la adquisicin durante el aprendizaje espacial. Adems, undao generado en la corteza prefrontal tambin puede suponer pro-blemas en procesos de planificacin, de manera que se ha postula-do que su lesin provocara una inadecuada representacin delcurso requerido de movimientos. As, aunque el hipocampo es unaestructura crtica en la memoria espacial y sus conexiones con lacorteza prefrontal desempean un papel importante en la correctamanifestacin de la memoria de trabajo espacial, la memoria detrabajo mantendra como eje central a la corteza prefrontal, por loque una lesin de la misma posiblemente sera ms significativa enel proceso cognitivo que regula (Jdar-Vicente, 2004).

Por otro lado, las conexiones existentes entre el rea CA1 delhipocampo y la corteza prefrontal han llevado a plantear una rela-cin entre ambas estructuras que estara mediando ciertos proce-sos cognitivos, entre los que destacan aquellos relacionados con lamemoria espacial (Wall y Messier, 2001). As, se ha propuesto uncircuito neuronal entre el hipocampo y la corteza prefrontal iner-vado por el sistema dopaminrgico ascendente, que supondra una

va esencial por la que la informacin espacial se integrara en fun-ciones cognitivas y en la planificacin de procesos motores me-diados por la corteza prefrontal. De este modo, la administracinde GHB (posible agonista dopaminrgico) podra estar influen-ciando la conexin de la corteza prefrontal a travs de sus inerva-ciones dopaminrgicas con otras estructuras igualmente implica-das en procesos cognitivos, tales como el hipocampo, y comoconsecuencia de ello la realizacin de las tareas de memoria espa-cial demandadas. En suma, una disfuncionalidad del sistema do-paminrgico tanto en la corteza prefrontal como en el hipocampopodra tener como consecuencia alteraciones a nivel de procesoscognitivos que impliquen un uso satisfactorio de la memoria detrabajo espacial modulada por este circuito aurorregulatorio (Ta-naka, 2002).

Con respecto al deterioro observado en el reflejo de gras-ping, debemos tener en cuenta que ste es una respuesta neurol-gica que se controla desde la corteza prefrontal, por lo que la rea-lizacin inadecuada del reflejo de grasping, e incluso laausencia de aparicin del mismo, podra ser una consecuencia deun dao neurolgico ocasionado en esta regin (Matsumura et al,1996). No obstante, diversos trabajos han evidenciado que un d-ficit dopaminrgico podra tambin suponer una manifestacininadecuada de este reflejo neurolgico (Negrotti et al, 2005). Enconclusin, tanto la afectacin de la memoria de trabajo espacialcomo el deterioro del reflejo de grasping sealan a la cortezaprefrontal como posible regin perjudicada por el tratamiento pro-longado de GHB.

Agradecimientos

Agradecemos la ayuda tcnica de Piedad Burgos y Begoa Val-ds. Trabajo financiado por el MEC (SEJ2004/07445/PSIC) y laConsejera de Educacin y Ciencia de la Junta de Andaluca (CTS-195).

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