Objetivo: Determinar del Coeficiente Volumétrico de Transferencia de Oxígeno kLa, por el método Iodométrico, en erlemeyer, y por el método dinámico, en reactor de tanque agitado. Introducción: La mayoría de los bioprocesos industrialmente importantes son aerobios; en estos procesos, el oxígeno es un nutriente importante y es utilizado por los microorganismos para el crecimiento, el mantenimiento y producción de metabolitos. La escasez o exceso de oxígeno afecta el sistema biológico en general y por ende los rendimientos principalmente de producto; así, es importante garantizar un suministro adecuado oxígeno al caldo de cultivo, ya sea garantizando una gran área de transferencia de masa y/o mediante el uso de un dispositivo adecuado. De esta manera, es importante realizar una estimación adecuada de la velocidad de trasferencia de oxigeno (OTR) a diferentes escalas y bajo diferentes condiciones de operación, para el favorecimiento de vías metabólicas que benefician el crecimiento y producción de cualquier metabolito de interés. En cultivos aerobios esta etapa es crítica en la selección, diseño y posterior escalado del proceso [3]. Trasferencia de materia gas-liquido

En la figura se muestra la situación en la interfase entre las fases gas y líquido que contienen el componente A. supóngase que se transfiere A desde la fase gas hacia la fase líquida. La concentración de A en el líquido es CAL y CALi en la interfase. En el gas, la concentración es CAG y CAGi en la interfase. CAGi y CALi pueden relacionarse si se supone que existe equilibrio en la interface, esto es válido para concentraciones diluidas de la mayoría de los gases, por lo tanto, puede escribirse La velocidad de transferencia de materia de A, a través de la capa límite de gas y de líquido como:

(1)

(2)

La ecuación (1) solo es válida cuando el soluto A es muy soluble en el líquido, por ejemplo en la

transferencia de amoniaco a agua. Por el contrario, si A es poco soluble en el líquido por ejemplo

oxígeno en una solución acuosa, la resistencia a la transferencia de materia está en la fase liquida y

deberá usarse la ecuación (2).

Las células desarrolladas en cultivos aerobios toman el oxígeno del líquido. La velocidad de transferencia de oxigeno del gas al líquido es, por lo tanto de vital importancia, especialmente cuando existen elevadas densidades celulares, es decir, cuando el crecimiento de las células se encuentre limitado por la disponibilidad de oxígeno en el medio. La ecuación (2) expresa la velocidad de transferencia de oxigeno del gas al líquido, donde NA es la velocidad de transferencia de oxigeno por unidad de volumen de fluido (OTR, por sus siglas en inglés) (mol m-3 s-1), kL el coeficiente de transferencia de materia de la fase liquida (m s-1), a el área interfacial liquido-gas por unidad de volumen de fluido (m2 m-3), CAL la concentración de oxígeno en el cultivo (mol m-3) y C*

AL la concentración de oxígeno en el cultivo en equilibrio con la fase gas (mol m-3). La concentración de equilibrio C*

AL se conoce también como la solubilidad del oxígeno en el caldo de cultivo. La diferencia (C*

AL - CAL) entre las concentraciones de oxigeno máxima posible y la existente en el líquido representa la fuerza impulsora para la transferencia de materia. La solubilidad del oxígeno en soluciones acuosas a temperatura y presión ambiente es solo, aproximadamente, de 10 ppm. Esta cantidad de oxigeno es rápidamente consumida en los cultivos aerobios y debe ser renovada constantemente para mantener la demanda celular de oxígeno. Esto no es fácil de conseguir debido a la baja solubilidad del oxígeno, lo que hace que la diferencia de concentración (C*

AL - CAL) sea siempre muy pequeña. El diseño de los fermentadores para las operaciones aerobias debe tener en cuenta estos factores y proporcionar unas condiciones óptimas de transferencia de materia [2]. Factores que afectan a la demanda de oxígeno La velocidad a la que las células consumen oxígeno en los fermentadores determina la velocidad a la que este debe transferirse desde el gas al líquido. Muchos son los factores que influyen en la demanda de oxígeno (OUR, por sus siglas en inglés), siendo los más importantes la especie celular utilizada, la fase de crecimiento del cultivo y la naturaleza de la fuente de carbono en el medio. En cultivos discontinuos, la velocidad de consumo de oxígeno varía con el tiempo, debido principalmente a dos razones. En primer lugar, la concentración de células aumenta durante el transcurso del cultivo y la velocidad total de consumo de oxígeno es proporcional al número de células presentes. Además también varía la velocidad de consumo de oxígeno por célula, conocida como velocidad especifica de consumo de oxígeno.

(3) Donde Qo es la velocidad de consumo de oxígeno por unidad de volumen de medio o (OUR) (g L-1 s-1), qo la velocidad especifica de consumo de oxígeno (s-1) y x es la concentración de células (g/L). La demanda de oxígeno de un organismo (qo) depende en primer lugar de la naturaleza bioquímica de la célula y de su medioambiente nutricional. Sin embargo, cuando el nivel de oxígeno disuelto en el medio

se sitúa por debajo de un cierto nivel, la velocidad de consumo de oxigeno depende también de la concentración de oxígeno en el líquido.

La dependencia de qo con CAL se muestra en la figura. Si CAL es superior a la concentración de oxígeno crítica Ccrit, qo es una constante, máxima e independiente de CAL. Si CAL es menor que Ccrit qo muestra una dependencia aproximadamente lineal con la concentración de oxígeno. Para eliminar las limitaciones de falta de oxígeno y permitir que el metabolismo celular funcione a su mayor velocidad, la concentración de oxígeno disuelto en cada punto del fermentador debe ser superior a la condición crítica Ccrit. El valor exacto de Ccrit depende del organismo utilizado, pero en condiciones de operación normales varía generalmente entre el 5 y el 10% de la concentración de saturación del aire. En estado estacionario no puede existir acumulación de oxígeno en ningún lugar del fermentador, por lo que la velocidad de transferencia de oxigeno desde el gas debe ser igual a la velocidad de consumo de oxigeno por la células. Si se iguala NA en la ecuación (2) a Qo en la ecuación (3) se obtiene la siguiente ecuación:

(4)

Donde kLa se utiliza para caracterizar la capacidad de transferencia de oxigeno de los fermentadores. Si kLa para un determinado sistema es pequeño, la capacidad del reactor para suministrar oxigeno es limitada. Mediante la ecuación (3) puede predecirse la respuesta del fermentador a cualquier variación en las condiciones de operación de transferencia de materia. Por ejemplo, si la velocidad de metabolismo permanece constante pero kLa aumenta, por ejemplo, por aumentar la velocidad de agitación la concentración de oxígeno disuelto CAL debe aumentar para que la igualdad de la ecuación (3) se conserve. De igual manera, si aumenta la velocidad de consumo de oxigeno por las células permaneciendo constante kLa, CAL debe disminuir [2]. Transferencia de oxígeno en fermentadores La velocidad de transferencia de oxígeno en los medios de cultivo se ve afectada por varios factores físicos y químicos que varían el valor de kL o el de a, o el de la fuerza impulsora de la transferencia de materia (C*

AL - CAL). kL es relativamente constante e independiente de las condiciones imperantes. Si se necesita una mejora sustancial de las velocidades de transferencia, es más efectivo centrar la atención

en aumentar el área interfacial. Aspectos diferentes a considerar, referentes al diseño y operación de fermentadores en relación a su efecto sobre la transferencia de oxígeno serian: tamaño del área interfacial o tamaño de burbuja, tipo de difusor y de impulsor, composición del gas suministrado, velocidad de agitación, presión, propiedades físicas y químicas del medio de cultivo (viscosidad, pH, temperatura, composición) y agentes antiespumante [2]. Medición de la concentración de oxígeno disuelto La concentración de oxígeno disuelto CAL en fermentadores se mide generalmente mediante el uso de un electrodo de oxígeno disuelto. Este dispositivo mide la presión parcial del oxígeno disuelto o tensión de oxígeno en el medio de fermentación, y no la concentración de oxígeno disuelto. Para convertir la respuesta a concentración es necesario conocer la solubilidad del oxígeno en el líquido a la temperatura y presión de la medida. También se debe tener en cuenta que las fermentaciones no se realizan utilizando agua y oxígeno puros, debido a que la presión parcial de oxígeno en la fase gas y la presencia de material disuelto en el líquido, son los dos factores que más afectan la solubilidad del oxígeno. Medición de kLa La determinación de kLa en biorreactores es esencial para establecer la eficiencia de la aireación y para cuantificar los efectos de las variables de operación sobre el suministro de oxígeno disuelto. En cualquier método que se utilice para medir kLa, las condiciones de medida deben ser lo más similares posibles a las existentes en el fermentador durante la operación. El balance de masa para el oxígeno disuelto en un medio de cultivo bien mezclado se puede establecer como:

(4)

Donde dC/dt es la velocidad de acumulación de oxígeno en la fase líquida, OTR representa la velocidad de transferencia de oxígeno del gas al líquido, descrita en la ecuación (2), y OUR es la velocidad de absorción de oxígeno por los microorganismos, descrito en la ecuación (3). Van’t Rirt [7] ha recopilado diferentes técnicas existentes para medir kLa las cuales se pueden clasificar así: Métodos indirectos: estos se realizan en ausencia de biomasa, cuando estas reacciones bioquímicas no ocurren, OUR = 0. En este caso, la ecuación (4) se puede simplificar a:

(5)

Los métodos indirectos a su vez se dividen en métodos químicos y físicos. Los métodos químicos fueron los primeros en ser aplicados ampliamente. Estos métodos pueden dar valores más altos que los reales, debido a que la velocidad de absorción se ve favorecida por las reacciones químicas, las cuales consumen el oxígeno en la fase líquida rápidamente. Dentro de los métodos químicos encontramos el método de oxidación del sulfito de sodio y el método de Absorción de CO2. Los métodos físicos emplean la respuesta de la sonda de oxígeno a cambios en la concentración en el gas disuelto en el medio, bajo condiciones no estacionarias. Estos métodos son hoy en día los más utilizados para la estimación de transferencia de oxígeno, ya que se basan en la medición de la

concentración de oxígeno disuelto en el líquido durante la absorción o desorción de oxígeno en la solución. Uno de estos métodos es el método dinámico con burbujeo de un gas inerte [3]. Métodos directos: En estos métodos se tiene en cuenta el consumo de oxígeno por parte de los microorganismos, por lo que en el cálculo de kLa se debe tener en cuenta el OTR y el OUR. El más conocido de estos métodos es el método dinámico [3]. Método de oxidación del sulfito de sodio Este método se basa en la reacción de sulfito de sodio, con el oxígeno disuelto para producir sulfato, en presencia de un catalizador (generalmente un catión divalente de Cu+ 2 o Co+ 2) [1]; la reacción puede expresarse como:

SO3-2 + ½ O2 SO4

-2

La velocidad de esta reacción es mucho más rápida que la velocidad de transferencia de oxígeno (OTR), por lo tanto, la velocidad de oxidación es controlada por la velocidad de transferencia de masa, y al medir la velocidad global, podemos determinar la velocidad de transferencia de masa. El procedimiento experimental consiste en llenar el biorreactor con un volumen determinado de solución estándar de sulfito de sodio (Na2SO3), que contiene Cu+2, llevar el experimento a las condiciones de agitación y temperatura deseadas, a intervalos de tiempo regulares tomar volúmenes conocidos de muestra. Mezclar cada muestra con una solución estándar de yodo en exceso, y finalmente esta solución se titula con una solución estándar tiosulfato de sodio (Na2S2O3), usando solución de almidón como indicador del punto final. Las reacciones son:

SO3

-2 + I2 + H2O SO4

-2 + 2 I- + 2 H+

2 S2O3 -2 + I2 S4O6

-2 + 2 I -

El yodo tiene una baja solubilidad en agua, sin embargo el complejo triyoduro (I3-) es muy soluble, de

modo que las soluciones de yodo se preparan disolviendo I2 en una solución concentrada de yoduro de potasio KI, así que es realmente el triyoduro la especie que se usa en la titulación. Método dinámico Los métodos dinámicos se basan en la técnica propuesta por Taguchi y Humphrey [6], la medición se divide en dos secciones como muestra la figura.

Primero se mide la actividad respiratoria de microorganismos que crecen activamente. Si se suspende el suministro de gas al biorreactor, la concentración de oxígeno disuelto disminuirá a una velocidad igual al consumo de oxígeno por la respiración de los microorganismos (OUR). Bajo estas condiciones la ecuación (4) se convierte en:

(6)

Es posible obtener la OUR de la pendiente de la recta en la sección de no aireación; sin embargo, se debe tener precaución de no dejar bajar la concentración de oxígeno disuelto hasta una concentración critica, para asegurar que qo permanezca constante. Inmediatamente después de llegar a un porcentaje bajo de oxígeno, reanudamos la aireación hasta que la concentración permanezca constante. En esta segunda parte el balance de masa para el oxígeno disuelto en un medio de cultivo es el dado por la ecuación (4).

Tomando la ecuación anterior como una ecuación lineal, kLa se obtendrá como pendiente, al graficar ΔOD/Δt vs OD utilizando los valores de OD y tiempo obtenidos en esta región [5]. Metodología: Para el desarrollo de la práctica considerarán dos sesiones:

- Primera sesión (Octubre 8, 2012): Método de la oxidación de sulfito. Cada grupo desarrollará su parte práctica y generará sus propios datos experimentales

- Segunda sesión (Octubre 22, 2012): Método Dinámico. Esta será una práctica demostrativa; se realizará en el Laboratorio de Bioconversiones 19-303, usando un biorreactor de laboratorio de 5 L, con un cultivo de Saccharomyces cerevisiae. Se definirán 5 condiciones de aireación – agitación diferentes, que permitan generar 5 valores diferentes de KLa. Cada grupo asistirá a la toma de datos en una sesión de 30 min, en el siguiente orden:

2:00 PM: Grupo 1: Jacqueline Betancur 2:30 PM: Grupo 2: Susana Calle 3:00 PM: Grupo 3: Diego Chicaiza 3:30 PM: Grupo 4: Ana María Bernal 4:00 PM: Grupo 5: Isabel Cristina Ortega

Método de oxidación del sulfito de sodio Se preparan los siguientes tratamientos:

Erlenmeyer de 250 mL sin Bafles con 50 mL de solución de Na2SO3 0.2 N. Erlenmeyer de 250 mL sin Bafles con 100 mL de solución de Na2SO3 0.2 N. Erlenmeyer de 250 mL con Bafles con 50 mL de solución de Na2SO3 0.2 N. Se agrega el catalizador (CuSO4, 1M), hasta alcanzar una concentración final de 10-3M. Este momento se toma como tiempo cero del experimento. A intervalos de 1/2 hora se extrae una muestra con pipeta midiendo exactamente 2 ml y se adicionan sobre 3 ml de solución de I2 (aproximadamente 0,2 N). El exceso de I2 se titula por retorno con Na2S2O3 0,075 N, con 2 gotas de solución de almidón 1% como indicador. Adicionalmente, se toma una medida de la temperatura de los medios para cada tiempo. Con los datos obtenidos se grafica el volumen de Na2S2O3 gastado en función del tiempo y a partir de la pendiente de dicha grafica se calcula el valor de KLa empleando la siguiente expresión:

Siendo C*AL: Solubilidad del O2 (mol/L), N: Concentración del tiosulfato (mol/L), Vm: volumen de Na2SO3

(L), m: Pendiente (L /s) Método Dinámico. Para la determinación de kLa mediante el método dinámico, inicialmente se prepara un pre inoculo con una concentración de 80 g/L de levadura comercial saccharomyces cerevisiae y 36 g/L de glucosa, esto se hace con el fin de activar la levadura; a partir de este se inocula el biorreactor con una concentración final 7g/L de levadura y un medio de cultivo apropiado (medio de composición igual al usado en la práctica de Cinética Microbiana). Antes de inocular se debe realizar la calibración del electrodo a las condiciones de aireación, agitación y temperatura seleccionadas dependiendo el grupo de trabajo (ejemplo, 0.5 vvm, 350 rpm y 30C). Una vez se inocula el biorreactor y antes de iniciar las mediciones se debe esperar hasta que se estabilice la lectura de OD. Luego de 2 horas de cultivo, se inicia el experimento suspendiendo la aireación al biorreactor (punto A); en este momento se registran los datos de OD cada 30 segundos hasta que la concentración de oxígeno

disuelto llegue una concentración crítica no inferior al 10% del valor de saturación (punto B). La pendiente de la recta resultante corresponde a la velocidad de consumo de oxigeno por parte de la biomasa presente.

Donde C representa la concentración de oxígeno disuelto; µ corresponde a la velocidad especifica de crecimiento de biomasa, y X la concentración de biomasa. Seguidamente, se reinicia la aireación y se registra nuevamente los datos de OD a intervalos de tiempo de 30 segundos. La curva resultante (BC) corresponde a la diferencia entre la velocidad de transferencia de oxígeno al medio líquido y la velocidad de consumo de oxígeno por parte de la biomasa presente.

Reordenando se obtiene:

Esta expresión puede representarse en forma gráfica con la concentración de oxígeno disuelto en el medio liquido C1 como ordenada, contra [dC1/dt + µ(O2)X] como abscisa. La pendiente de la recta resultante corresponde al inverso del coeficiente volumétrico de oxígeno disuelto KLa. La recta se construye con los valores de las tangentes a la curva BC.

Para realizar los cálculos se debe tener en cuenta que los datos colectados están dados en porcentaje de oxígeno disuelto (OD); se pueden obtener los valores de CLA por medio de la relación,

(7) Siendo b una constante de proporcionalidad que depende de la presión, temperatura y composición del gas de entrada y de la composición y temperatura del medio de cultivo, Si se está oxigenando con aire a una presión de 0.87 psi, 20 C en un medio con una composición de 40 g/l de sacarosa, b = 6.829 x 10-5 kg O2 m

-3 %-1[4]. RESULTADOS ESPERADOS: 1. Realizar los cálculos necesarios para la preparación de las distintas soluciones. 2. Deducir la expresión a partir de la cual se evalúa el kLa por el método del sulfito. 3. Realizar los respectivos cálculos para determinar valores de kLa tanto para el método del sulfito como para el método dinámico. 4. Comparar/analizar los resultados obtenidos a partir de los diferentes tratamientos y de los diferentes métodos usados. 5. Describir otras técnicas de determinación experimental del kLa. Bibliografía [1] Cooper CM, Fernstorm GA, Miller SA. Performance of agitated gas–liquid contactors. Ind Eng Chem 1944 [2] Doran P. 1995. Bioprocess engineering principles. Academic Press [3] Garcia F., Gomez E. 2009. Bioreactor scale-up and oxygen transfer rate in microbial processes: An overview. Biotechnology Advances 27 [4] Orozco F., Rodríguez M. 2012. Escalado de bioprocesos y entrenamiento en operación de biorreactores. Medellín - Colombia [5] Orozco F., Sepúlveda G, Trejo G, Zamilpa A, Rodríguez M. 2009. Análisis fenomenológico de la transferencia de oxígeno en biorreactores con células de Azadirachta indica. XIII Congreso Nacional de Biotecnologia y Bioingenieria. Guerrero, México [6] Taguchi H, Humphrey AE. Dynamic Measurement of the volumetric oxygen transfer coefficient in fermentation systems. J Ferment Technol 1966 [7] Van't Riet K. Review of measuring methods and nonviscous gas–liquid mass transfer in stirred vessels. Ind Eng Chem Process Des Dev 1979