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Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals 2012 1

A P A R T A D O 2 . 3 .

ENFERMEDADES DE LOS PECES

C A P T U L O 2 . 3 . 0 .

INFORMACIN GENERAL

A. OBTENCIN DE MUESTRAS

1. Evaluacin del estado sanitario de la unidad epidemiolgica

1.1. Tipos de muestras que deben utilizarse para las pruebasEl tipo de muestra y la cantidad de muestras que deben recogerse dependen de la enfermedad o agentepatgeno, del tamao de los animales y del objetivo de la prueba (es decir, si se trata del diagnstico de unaenfermedad manifiesta, la deteccin de peces portadores subclnicos de agentes patgenos o una vigilanciaespecfica para demostrar la ausencia de una enfermedad determinada). En la Gua de la OIE para laVigilancia Sanitaria de los Animales Acuticos(2009) y en el Captulo 1.3 del Cdigo Sanitario de la OIE paralos Animales Acuticos se ofrece informacin sobre el diseo y la evaluacin de los sistemas de vigilanciapara animales acuticos, y en los captulos de este Manual Acutico dedicados a cada enfermedad se ofrecendetalles sobre los requisitos de las muestras.

1.2. Especificaciones en funcin de la poblacin de peces

En la Gua de la OIE para la Vigilancia Sanitaria de los Animales Acuticos (2009) y en el Captulo 1.4 del

cdigo Sanitario de la OIE para los Animales Acuticos se ofrecen datos generales. Los detalles concretossobre los requisitos de las muestras para cada enfermedad de la lista de la OIE se ofrecen en cada uno de loscaptulos correspondientes de este Manual Acutico. En ausencia de pruebas que indiquen lo contrario, eldiseo de un sistema de vigilancia para demostrar la ausencia de enfermedad en un pas, zona ocompartimiento precisa un nivel mnimo de muestras adecuado para una prevalencia supuesta del 2%utilizando una prueba que se considere sensible al 100%, y para mantener el esa ausencia de enfermedad,debe realizarse un muestreo adecuado para una prevalencia supuesta del 5 al 10%.

1.3. Especificaciones en funcin del estado clnico

En el caso de infeccin clnica, adems de alevines o vsceras enteras, otros rganos que tambin debentomarse son el rin anterior, el bazo y el corazn o el encfalo para la mayora de pruebas de deteccin devirus (branquias e intestino cuando se pretenda detectar el herpesvirus koi), piel o msculo cuando sepretenda diagnosticar el sndrome ulcerante epizotico, y piel y aletas para detectar Gyrodactyluls salaris. Las

muestras de diez peces clnicamente enfermos deben ser suficientes para la/s prueba/s de deteccin deagentes patgenos en cada unidad epidemiolgica. Para detectar portadores subclnicos de virus o para lavigilancia especfica en la que se exija una gran cantidad de muestras, las muestras pueden combinarseformando muestras compuestas como se indica en cada captulo especfico del Manual Acutico.

1.4. Especificaciones en funcin del tamao de los peces

1.4.1. Para las enfermedades de la lista, excepto la herpesvirosis de la carpa koi y la encefalopata yretinopata virales

Alevines y alevines con saco vi tel ino: se obtiene el pez entero pero se retira el saco vitelino si lo hay.

Peces de entre 4 y 6 cm: se extraen las vsceras enteras, incluido el rin. Puede obtenerse un trozo de

encfalo tras separar la cabeza a nivel del borde posterior del oprculo y presionando lateralmente.

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Captulo 2.3.0. Enfermedades de los peces: Informacin general

2 Manual Acutico de la OIE 2012

Peces de ms de 6 cm: se extrae el rin, el bazo y el corazn o el encfalo y/o los tejidos adecuadospara el agente patgeno especfico que se desee detectar (consltense los detalles en los captulossobre cada enfermedad en este Manual Acutico).

Peces adultos: se extrae el lquido ovrico, el esperma y/o los tejidos adecuados para el agentepatgeno especfico que se desee detectar (consltense los detalles en los captulos sobre cadaenfermedad en este Manual Acutico

1.4.2. Para el sndrome ulcerante epizotico (SUE)

Cualquier tamao de pez: rin, hgado, tejido muscular (para detalles especficos vase el Captulo2.3.2. Sndrome ulcerante epizotico).

1.4.3. Para Gyrodactylussalaris

Cualquier tamao de pez:piel y aletas (para detalles especficos vase el Captulo 2.3.3. Girodactilosis[Gyrodactylussalaris]).

1.4.4. Para la herpesvirosis de la carpa Koi (HVK)

Peces de entre 4 cm y adultos: se extraen las branquias, el rin, el bazo, el encfalo y tejidosintestinales en funcin de la prueba utilizada (para detalles especficos vase el Captulo 2.3.6.Herpesvirosis de la carpa Koi).

1.4.5. Para la encefalopata y retinopata virales(ERV)

Peces de entre 2 y 4 cm: se toma la cabeza entera.

Peces de entre 4 cm y adultos:se toma el encfalo y posiblemente los ojos y la medula espinal (paradetalles especficos vase el Captulo 2.3.11. Encefalopata y retinopata virales).

2. Procesado general de las muestras

2.1. Examen macroscpico

En el caso de las enfermedades de la lista de la OIE, el examen macroscpico se utiliza principalmente paradetectar signos clnicos del sndrome ulcerante epizotico o Gyrodactylus salaris, pero va seguido de unexamen microscpico de preparaciones histolgicas para el primero, o de preparaciones hmedas deraspados de piel/aletas para el segundo.

2.2. Examen virolgico

2.2.1. Transporte y tratamiento de las muestras con antibitico

Se depositan muestras compuestas de rganos o de lquidos ovricos en viales estriles y se guardan a4C o sobre hielo hasta que se extrae el virus en el laboratorio. Lo ideal es llevar a cabo la extraccin delvirus en un plazo de 24 horas tras recoger los peces, pero tambin es aceptable un plazo de 48 horas sila temperatura se mantiene a 0C4C, o plazos ms largos en el caso de muestras de enfermedadesclnicas que se hayan congelado a -80C. Sin embargo, debe evitarse la congelacin de muestras

destinadas a la deteccin de portadores subclnicos.

Las muestras de rganos tambin pueden transportarse al laboratorio introducindolas en viales quecontengan medio de cultivo celular o solucin salina equilibrada de Hank (HBSS) con antibiticos quesupriman el crecimiento de contaminantes bacterianos (un volumen de rgano en al menos cincovolmenes de lquido de transporte). Las concentraciones de antibitico adecuadas son: gentamicina

(1000 g ml1) o penicilina (800 Unidades Internacionales [IU] ml1) y estreptomicina (800 g ml1). Almedio de transporte tambin pueden aadirse compuestos antifngicos como Mycostatin o

Fungizone, a una concentracin final de 400 IU ml1. Puede aadirse suero o albmina (510%) paraestabilizar el virus si el transporte va a durar ms de 12 horas.

2.2.2. Extraccin de virus

Este procedimiento debe llevarse a cabo a temperaturas inferiores a los 15C (preferiblemente a 0 a

10C)

Se decanta el medio suplementado con antibitico para separarlo de la muestra de rganos.

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Manual Acutico de la OIE 2012 3

Se homogeneizan las muestras de rganos compuestas en medio de transporte a una dilucin finalde 1/10 con un mortero o un homogeneizador elctrico hasta obtener una pasta.

Se centrifuga el homogenado en una centrfuga a 25C a 2.000-4.000 gdurante 15 minutos, serecoge el sobrenadante y se trata durante cuatro horas a 15C o bien durante toda la noche a 4C

con antibiticos, como gentamicina 1 mg ml1. Si el envo de la muestra se ha llevado a cabo en unmedio de transporte (es decir, con exposicin a antibiticos) el tratamiento del sobrenadante con

antibiticos puede omitirse. El tratamiento con antibiticos hace innecesaria la filtracin por filtros demembrana.

De igual forma, las muestras de lquido ovrico pueden tratarse con antibiticos para controlar lacontaminacin microbiana, pero no deben diluirse ms de cinco veces en el medio que contieneHBSS y antibitico.

Las muestras de lquido ovrico deben centrifugarse como los homogenados de rganos, y sussobrenadantes deben utilizarse directamente en pasos posteriores.

2.2.3. Tratamiento para neutralizar virus enzoticos

Los peces a menudo son portadores subclnicos de virus endmicos, como birnavirus (por ejemplo, el dela necrosis pancretica infecciosa [VNPI]), que inducen un efecto citoptico en cultivos celularessusceptibles y, por tanto, complican el aislamiento y la identificacin de los agentes patgenos encuestin. En este tipo de situaciones, la infectividad de los virus enzoticos debe neutralizarse antes dellevar a cabo pruebas de deteccin de virus de la lista del Cdigo Sanitario de Animales Acuticos. Sinembargo, cuando es importante determinar si est presente uno de los virus enzoticos, las muestrasdeben analizarse en presencia y en ausencia de anticuerpos neutralizantes (NAb).

Para neutralizar los birnavirus acuticos, se mezclan volmenes iguales (200 l) de una solucin de unoo ms NAb contra los serotipos de birnavirus autctonos con el sobrenadante a analizar. Se deja que lamezcla reaccione durante 1 hora a 15C o durante toda la noche a 4C antes de inocularla enmonocapas celulares susceptibles. El ttulo de la solucin de NAb utilizada debe ser de al menos 2000 enuna prueba de reduccin del 50% de placas frente a los serotipos vricos presentes en la zona geogrficaen cuestin.

Cuando las muestras proceden de un pas, regin o poblacin o unidad de produccin de pecesconsiderados libres de infecciones vricas enzoticas, este tratamiento del homogenado de rganos debeomitirse.

Este enfoque tambin puede utilizarse para neutralizar otros virus enzoticos de la zona analizada.

2.3. Examen parasitario

En el Captulo 2.3.3. Girodactilosis (Gyrodactylus salaris) se ofrecen detalles concretos.

2.4. Examen fngico

En el Captulo 2.3.2. Sndrome ulcerante epizotico se ofrecen detalles concretos.

B. MATERIALES Y PRODUCTOS BIOLGICOS NECESARIOS PARA EL AISLAMIENTO YLA IDENTIFICACIN DE AGENTES PATGENOS DE LOS PECES

1. Virus de los peces

1.1. Lneas celulares de peces

Las siguientes lneas celulares de peces se utilizan para detectar los agentes patgenos vricosmencionados en el Manual Acutico:Epitelioma papuloso de carpa (EPC)Alevines de mojarra de oreja azul (BF-2)Piscardo (FHM)Gnadas de trucha arco iris (RTG-2)

Embrin de salmn real (CHSE-214)Rin ceflico de salmn (SHK-1)Rion de salmn del Atlntico (ASK)

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Aleta de ronco (GF)Aleta de carpa Koi (KF-1)Encfalo de carpa (CCB)

Channa striata(SSN-1)

1.2. Medios de cultivoEl medio mnimo esencial de Eagle (EMEM) tradicional con sal de Earle suplementado con suero fetal bovinoal 10% (FBS), agentes antimicrobianos y L-glutamina 2 mM es el ms utilizado en los cultivos de clulas depeces.

Sin embargo, el medio de Stoker, que es una forma modificada del anterior y est formado por unaconcentracin doble de ciertos aminocidos y vitaminas, se recomienda en concreto para potenciar elcrecimiento celular, utilizando las mismas suplementaciones que antes + un 10% de fosfato de triptosa.

Estos medios estn tamponados con bicarbonato sdico, tris-hidroximetil aminometano (Tris) 0,16 M, HCl, o,preferiblemente, cido N-2-hidroxietil-piperacina-N-2-etanosulfnico (HEPES) 0,02 M. La utilizacin debicarbonato sdico solo se restringe a los cultivos celulares preparados en recipientes muy bien cerrados.

Como alternativa, para ciertas lneas celulares, como SHK-1, se recomienda el medio de Leibovitz (L15)

suplementado con FBS (al 5% o 10%), L-glutamina (4 mM) y gentamicina (50 g ml1).

Para el crecimiento celular, el contenido en FBS del medio suele ser del 10%, mientras que para el aislamientode virus o la produccin de virus puede reducirse al 2%. De forma similar, el pH del medio de cultivo para elcrecimiento celular es de 7,3-7,4 y se ajusta a 7,6 para la produccin de virus o las pruebas de deteccin devirus.

La composicin de las mezclas de agentes antimicrobianos ms utilizados es penicilina (100 IU ml1) y

dihidrostreptomicina (100 g ml1). Se aade micostatina (50 IU ml1) si es probable que se produzcacontaminacin fngica. Pueden utilizarse otros agentes antimicrobianos o concentraciones de los mismossegn considere el tcnico, en funcin de la sensibilidad a los antimicrobianos de las cepas bacterianas ofngicas con las que se encuentre.

1.3. Controles positivos para virus y preparacin del antgeno1.3.1. Nomenclatura de los virus

Virus de la necrosis hematopoytica epizotica (VNHE)

Virus de la necrosis hematopoytica infecciosa (VNHI)

Virus de la anemia infecciosa del salmn (VAIS)

Herpesvirus Koi (HVK)

virus de Oncorhynchus masou(VOM)

Iridovirus de la dorada japonesa (IVDJ)

Virus de la viremia primaveral de la carpa (VVPC)

Virus de la septicemia hemorrgica viral (VSHV)

Virus de la encefalopata y retinopata virales (VERV) tambin denominado virus de la necrosisnerviosa viral (VNNV).

1.3.2. Produccin de virus

Para la produccin in Vitro de la mayora de cultivos madre de estos virus, deben inocularse cultivos demonocapas celulares (consltense los apartados pertinentes de este Manual Acutico) en recipientes decultivo tisular adecuados (por ejemplo, frascos de plstico) con multiplicidades de infeccin (m.d.i.)

bastante bajas, es decir, de 102a 103unidades formadoras de placas (UFP) por clula.

Las temperaturas preferibles para la propagacin del virus son las siguientes:

15C para VNHI, VSHV, VOM y VERV (genotipo BFNNV) y VAIS

20C para VVPC, HVK y VERV (genotipos BFNNV, SJNNV y TPNNV)

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22C para VNHE

25C para IVDJ y VERV (genotipos RGNNV y SJNNV)

30C para VERV (genotipo RGNNV)

1.3.3. Conservacin y almacenaje de cultivos vricos madre

Se centrifugan los cultivos celulares a 2-5C y a 2.000-4.000 g durante 15 minutos y a continuacinse diluyen los sobrenadantes que contienen el virus para obtener ttulos vricos de una media de

106UFP ml1.

Se dispensan las suspensiones vricas resultantes en viales estriles a razn de 0,30,5 ml cadauno.

Se congela y guarda cada serie de suspensiones madre vricas estndar a -80C o en nitrgenolquido, y se comprueba el ttulo de cada suspensin vrica madre a intervalos peridicos si no se hautilizado desde la ltima comprobacin.

Liofilizacin: se pueden guardar inculos de cepas vricas estndar durante largos periodos (dcadas)liofilizndolas. Para ello, suspensiones vricas en medio de cultivo celular suplementado con un 10% desuero fetal bovino se mezclan (v/v) con un volumen igual de medio crioprotector (como hidrolizado delactoalbmina al 20% en agua destilada) antes del procesado. Se sella o tapa al vaco y se guarda a 4C,

en la oscuridad.

2. Tcnicas

2.1. Serologa

2.1.1. Produccin de antisueros y anticuerpos policlonales de conejo contra virus de peces

Existen varias formas de generar en conejos anticuerpos contra virus de peces. Sin embargo, el ttulo y laespecificidad estn influidos por el programa de inoculacin que se utilice. Para producir antisueros quevayan a ser utilizados en los procedimientos de aislamiento y/o identificacin de virus descritos msadelante puede utilizarse los siguientes protocolos de inmunizacin.

2.1.1.1 Antisueros contra el virus de la necrosis pancretica infecciosa

Inyeccin intravenosa de 50100 g de virus purificado el da 0, seguida de un recordatorio idntico elda 21, y sangrado 5-7 das despus. Los conejos pueden volver a ser utilizados si no se sangran porcompleto.

2.1.1.2 Antisueros contra otros virus

Los protocolos de inmunizacin alternan una inyeccin intramuscular o intradrmica con futurosrecordatorios por va intravenosa:

Da 0: Inyeccin principal, 5001.000 g de virus purificado se mezclan (v/v) con adyuvante

(incompleto de Freund u otros1 adyuvantes que se consideran ms aceptables) administrando unvolumen total de 1,2 ml. Este antgeno se administra al conejo como inyecciones intradrmicas envarios puntos (2 puntos a cada lado) una vez el animal ha sido rasurado.

Da 21: Se toma una muestra de unos 2 ml de sangre y se comprueba su reactividad (neutralizacin,fluorescencia); se vuelve a inyectar por va intravenosa la misma cantidad de virus purificado que enla inyeccin principal, pero sin adyuvante. Antes de la segunda inyeccin intravenosa, el conejo debeser tratado con prometazina (12 mg por va intramuscular) para prevenir una posible respuestaanafilctica.

Da 28: Se toma una muestra de sangre, se comprueba la reactividad del suero y se sangra o vuelvea inyectar el conejo en funcin de los resultados.

En el caso de los rabdovirus, este procedimiento de inmunizacin est bien adaptado a la produccinde antisueros que se utilizan en la inmunofluorescencia y en el enzimoinmunoanlisis. No obstante, unmtodo ms eficiente de produccin de antisueros neutralizantes es la inyeccin intravenosa regular sin

1 La utilizacin de los adyuvantes completos de Freund puede estar restringida en contextos de bienestar animal. Losadyuvantes sintticos alternativos son el dimicolato de trehalosa o el monofosfato lpido A.

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adyuvante (0,2 ml) cada 3-4 das (dos veces a la semana). Pueden ser necesarias incluso 15inyecciones; 1 semana despus de la ltima inyeccin, debe recogerse y analizarse una muestra desuero.

2.1.3. Procesado y almacenaje de sueros inmunes

Tras la coagulacin de la sangre, se recoge y centrifuga el suero a 20 C y se calienta durante 30

minutos a 56C. Se filtra el suero resultante inactivado por calor por un filtro de membrana (de 450 nm detamao de poro) y se guarda temporalmente a 4C durante el tiempo necesario para comprobar sureactividad y especificidad y para comprobar que estas propiedades no resulten afectadas por lascondiciones de conservacin (por ejemplo, la congelacin o la liofilizacin). Los sueros estriles deconejo pueden guardarse durante al menos 2 meses a 4C sin riesgo de que se alteren sus propiedades.Se distribuyen (normalmente en pequeos volmenes) y se congelan a -20C o se liofilizan.

Pueden extraerse inmunoglobulinas (Ig) de antisueros mediante mtodos convencionales adecuadospara la purificacin de Ig. La unin selectiva a la protena A constituye un mtodo fiable y eficaz. Laconcentracin de soluciones de Ig se ajusta a los valores exigidos para la posterior preparacin oalmacenaje de conjugado.

Conservacin de Ig: Se mezcla una solucin de Ig con una concentracin de 2 mg/litro con glicerolestril puro (v/v) y se guarda a -20C. Tambin pueden prepararse soluciones de Ig con una

concentracin superior, utilizando tambin glicerol.

2.1.4. Anticuerpos monoclonales de ratn

A lo largo de los ltimos aos se han generado anticuerpos monoclonales (MAb) contra la mayora devirus de peces. Algunos de estos, aisladamente o en forma de dos o tres MAb asociados, han dado lugara reactivos biolgicos adecuados para la identificacin de grupos de virus (NPI, SHV, NHI). Otros MAbs,tomados individualmente o como componentes de conjuntos de Ab, permiten una tipificacin precisa deVSHV y VNHI. Estos MAb pueden obtenerse en los Laboratorios de Referencia de la lista que aparece alfinal de este Manual Acutico.

Tericamente, los IgG monoclonales de ratn pueden procesarse y guardarse igual que los IgGpoliclonales. Sin embargo, la reactividad de ciertos MAb puede quedar perjudicada por procesos comolos enzimticos, el marcaje con sustancias radiactivas o la liofilizacin. Por tanto, es necesario analizarcmo influyen en distintos MAb las condiciones en las que se utilizarn.

2.2. Microscopa directa

Las muestras para el examen mediante microscopa directa de frotis o improntas de tejidos deben examinarsecuanto antes tras la recogida. Siempre que sea posible deben utilizarse ejemplares vivos, o frescos,refrigerados a 4C o fijados con formalina tamponada al 10% cuando no se disponga de ejemplares vivos. Sise dispone de un laboratorio de campo adecuado, debe utilizarse para procesar y examinar las muestras cercadel lugar donde se han recogido.

2.3. Tcnicas histolgicas

2.3.1. Fijacin e inclusin de tejidos

Para la histologa solo deben tomarse muestras de ejemplares vivos o moribundos de peces con lesionesclnicas. Los tejidos retirados se fijan de inmediato en formalina tamponada al 10%. Se utilizan al menosdiez volmenes de fijador por cada volumen de muestra de tejido y se deja fijar durante al menos 24horas. Tras retirar el fijador, las muestras de tejido se deshidratan en concentraciones crecientes deetanol, se aclaran en un agente miscible en cera, como el xileno, y a continuacin se incluye en parafinamediante los protocolos estndar.

2.3.2 Corte y tincin de tejidos

Se realizar cortes de unos 5 m de espesor a partir del bloque. Se monta cada corte sobre un porta, seretira la cera con agente miscible en cera, como el xileno o Clearene, y se rehidrata.

Para los exmenes de la mayora de enfermedades, los cortes a continuacin pueden teirse conhematoxilina y eosina (H/E), mediante el siguiente procedimiento:

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Retirada de la cera

1. Se sumergen los portas en Clearene para retirar la cera, durante un mnimo de 2 minutos.

2. Se repite el paso 1 en xileno o Clearene.

3. Se sumergen en alcohol al 1005 para retirar el disolvente, durante un mnimo de 2 minutos.

4. Se repite el paso 3 en alcohol al 100% limpio.

Tincin

5. Se lavan bajo el chorro de agua del grifo (RTW) durante 25 minutos. Los portas deben estartransparentes, no turbios.

6. Se sumergen en una solucin de hematoxilina durante 3 minutos

7. Se vuelven azules bajo el RTW durante 510 minutos (o carbonato de litio saturado); no puedenvolverse excesivamente azules.

8. Se sumergen en cido/alcohol durante un mximo de 10 segundos.

9. Se lavan en RTW (o carbonato de litio) hasta que estn azules.

10. Se comprueba al microscopio si el citoplasma est transparente y los ncleos azules.

11. Se sumergen en eosina acuosa durante 3 minutos.

12. Se lavan bien en RTW para diferenciar la eosina.

Deshidratacin, lavado y montaje

13. Se lavan bien en alcohol al 70% pero no durante demasiado tiempo, puesto que este elimina laeosina.

14. Se sumergen en alcohol al 100% durante 12 minutos.

15. Se repite el paso 14 en alcohol limpio.

16. Se sumergen en alcohol/Clearene 50/50 durante 12 minutos.

17. Se sumergen en Clearene.

18. Se repite con un bao de Clearene limpio, los portas deben estar transparentes.

19. Se montan en medio de montaje DPX (distiereno, plastificante y xileno) y se dejan secar.

Para observar granulomas e hifas fngicas, como ocurre en el sndrome ulcerante epizotico, puedeutilizarse una tincin fngica general, como la de Grocott-Gomori, en lugar de H/E.

2.3.3 Preparacin de portas para la inmunohistoqumica

Es importante observar que una fijacin prolongada puede enmascarar los antgenos de inters. Portanto, se recomienda aplicar una fijacin mnima garantizando al mismo tiempo una conservacin ptima(24-48 horas). La fijacin se puede reducir ms cuando se utilizan trozos pequeos de tejido. Sinembargo, se recomienda incorporar un paso de recuperacin de antgeno (incluido en el protocolo que seindica a continuacin) siempre que sea posible. A continuacin, se indica un protocolo estndar deinmunohistoqumica que se usa de forma sistemtica en laboratorios de histologa, pero debido aposibles variaciones entre anticuerpos y a los kits de deteccin comerciales, es probable que cada cualtenga que optimizar la tcnica en funcin de sus propios objetivos. Dichos objetivos incluiran factorescomo la determinacin del ttulo ptimo de anticuerpos, que es la dilucin ms alta que da lugar a latincin especfica ms intensa y al mismo tiempo menor tincin de fondo inespecfica. Adems, esposible que cada cual tenga que plantearse la posibilidad de corregir la duracin de la incubacin delreactivo.

1. Se llevan a cabo los pasos 15 del apartado 2.3 2.

2. Se enjuagan los portas en dos cambios de Tween 20 al 0,2% en PBS durante 2 minutos.

3. Se lleva a cabo la recuperacin del antgeno colocando los portas en una cubeta Coplin de plsticoque contenga tampn citrato de sodio y se coloca sobre una rejilla de una vaporera situada dentrode una olla a presin.

4. Se calienta la olla a presin con calor intenso hasta que el indicador de salida de vapor indique quese ha alcanzado la presin mxima.

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5. Se reduce la temperatura y se deja sobre un calientaplatos unos 10 minutos manteniendo lapresin.

6. Se retira del calientaplatos y se deja enfriar y evaporar unos 20-30 minutos en una campana degases antes de abrirla.

7. Se extra la cubeta Coplin de la olla a presin y se sustituye el tampn citrato de sodio por agua degrifo tibia seguida de agua de grifo fra y agua destilada. Esto sirve para enfriar los portas

progresivamente.

8. Si es necesario, se lleva a cabo un bloqueo de la actividad biotina/avidina endgena (a) se incubanlos protas durante 15-20 minutos en avidina al 0,005% en PBS (b) se enjuaga en PBS y acontinuacin (c) se incuban en biotina al 0,005% en PBS durante 15-20 minutos. Como alternativa,se utiliza un sistema de bloqueo comercial de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Estonormalmente se lleva a cabo en tejidos que contienen altos niveles de biotina, como el hgado, elrin o el bazo.

9. Se enjuagan los portas brevemente en agua de grifo.

10. Se enjuagan los portas en Tween 20 al 0,2% en PBS durante 2 minutos.

11. Se inclinan para retirar el reactivo y se secan alrededor del corte de tejido asegurando que el cortese mantenga hmedo.

12. Se incuban con anticuerpo primario a 25C durante 30 minutos con una rotacin orbital suave si sedispone de ella.

13. Se enjuagan los portas en Tween 20 al 0,2% en PBS de una botella de lavado.

14. Se inclinan para retirar el reactivo y se secan alrededor del corte de tejido asegurando que el cortese mantenga hmedo

15. Se incuban con anticuerpo secundario biotinilado a 25C durante 10 minutos con una rotacinorbital suave si se dispone de ella.


17. Se inhibe la actividad peroxidasa endgena colocando los portas en perxido de hidrgeno al 0,3%en PBS con azida sdica al 0,1% durante 10-15 minutos a temperatura ambiente.


19. Se incuba con el complejo comercial preferido de deteccin de estreptavidina marcada conperoxidasa a 25C durante 10 minutos con una rotacin orbital suave si se dispone de ella.


21. Se aplica cromgeno DAB a los portas y se desarrolla el producto de la reaccin realizando unseguimiento al microscopio durante el tiempo ptimo. La duracin variar en funcin del producto deDAB utilizado.

22. Se detiene la reaccin colocando los portas en agua de grifo.

23. Se lleva a cabo una potenciacin cromgena (opcional) colocando los portas en sulfato de cobre al0,5% en PBS durante 1-5 minutos a 25C con una rotacin orbital suave.

24. Se enjuagan en agua destilada.

25. Se aplica una tincin de contraste con hematoxilina de Harris durante 2-3 minutos.

26. Se enjuagan con agua.

27. Se deshidratan, se aclaran y se montan.

Preparacin del reactivo

PBS-Tween 20 (0,2%): Solucin salina tamponada con fosfato 10 litros

Tween 20 2 ml

Tampn citrato de sodio: Citrato de tri-sodio (dihidrato) 2,94g

Agua destilada 1 litro

Tween 20 0,5 ml

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Se mezcla para disolver, se ajusta el pH a 6,0 con HCl 1 N antes de aadir el Tween 20. Se guarda estasolucin a temperatura ambiente un mximo de 3 meses o a 4C si el periodo de almacenaje va a sersuperior.

2.4. Microscopa electrnica

La microscopa electrnica (de transmisin o de barrido) es una til herramienta de investigacin para elestudio de las enfermedades de los animales acuticos. No obstante, estos mtodos no se suelen utilizar en eldiagnstico sistemtico de las enfermedades de los peces de la lista de la OIE, de modo que en este ManualAcutico no estn descritos.

2.5. Utilizacin de tcnicas moleculares para anlisis y diagnstico confirmativos

Se han desarrollado tcnicas moleculares, como sondas de cido nucleico y una reaccin en cadena de lapolimerasa (PCR) para identificar muchos agentes patgenos de los animales acuticos. Sin embargo, comoocurre con muchas otras tcnicas de diagnstico, la ventaja de la sensibilidad a menudo queda contrarrestadapor problemas de interpretacin o susceptibilidad a problemas tcnicos. Al utilizar la PCR como mtodo dediagnstico, es importante el diseo de cebadores y sondas, la utilizacin de controles, y la validacin delmtodo de PCR elegido. La PCR puede depender bastante de las condiciones en las que se ejecuta y puedeestar muy sujeta a la contaminacin del laboratorio por productos de PCR previos, lo cual da lugar a falsos

positivos. As pues, aunque en esta versin del Manual Acutico se incluyen varios protocolos de sondas decido nucleico y de PCR como mtodos de diagnstico o confirmativos para peces, siempre que ha sidoposible se han especificado tcnicas bien conocidas (como el aislamiento del virus) como mtodos estndarde deteccin. Siempre que se utilicen estas tcnicas moleculares ms recientes, deben llevarse a cabo concautela y prestando especial atencin a la utilizacin de controles positivos y negativos apropiados.

2.5.1. Preparacin y tipos de muestras

En el caso de estas tcnicas, las muestras deben prepararse para conservar el cido nucleico delpatgeno. Asimismo, las muestras destinadas a anlisis con mtodos basados en anticuerpos debenconservarse para retener los puntos antignicos reactivos a los anticuerpos utilizados.

Las muestras destinadas a anlisis basados en el cido nucleico o en anticuerpos deben manipularse yempaquetarse con muchsimo cuidado para minimizar la posible contaminacin cruzada entre muestras oque el material se deteriore antes de poder realizar la prueba. Para prevenir la contaminacin, debenutilizase recipientes nuevos (bolsas de plstico o frascos para muestras). Dentro de cada recipiente ocontenedor para grupos de muestras debe introducirse una etiqueta impermeable con los datoscorrespondientes.

Algunos de los mtodos adecuados para la conservacin y transporte de muestras destinadas a pruebasmoleculares o basadas en anticuerpos son los siguientes:

Ejemplares vivos conservados en hielo o refrigerados: en el caso de los ejemplares que puedentransportarse rpidamente al laboratorio para ser analizados en un plazo de 24 horas, las muestrasse introducen en bolsas de muestra envueltas de una cantidad suficiente de hielo hmedo en unacaja isotrmica y se envan al laboratorio.

Ejemplares enteros congelados: se escogen ejemplares vivos segn el objetivo del muestreo, secongelan rpidamente en el campo utilizando hielo seco triturado, o se congelan en un laboratorio

de campo mediante un congelador mecnico a -20 C o temperaturas inferiores. Se prepara eintroduce la etiqueta en el recipiente con las muestras, se introducen las muestras en una cajaisotrmica con una cantidad suficiente de hielo seco, y se envan al laboratorio.

Muestras conservadas en alcohol: en las zonas donde el almacenaje y el envo de muestrascongeladas son problemticos, puede utilizarse etanol al 90-95% para conservar, guardar ytransportar ciertos tipos de muestras. Se preparan para el envo segn los mtodos descritosanteriormente.

Tejidos fijados para hibridacin in-situ e inmunohistoqumica: para este fin, sern adecuados losmtodos clsicos de conservacin de tejidos. Normalmente la formalina tamponada es una buenaopcin si posteriormente van a utilizarse sondas moleculares. Para respetar el ADN, la sobre-fijacin (de ms de 24-48 horas) en particular deber evitarse.

2.5.2. Conservacin del ARN y el ADN en los tejidos

Se corta el tejido realizando un corte de menos de 0,5 cm en una dimensin y se sumerge en 10volmenes de RNAlater (por ejemplo, una muestra de 0,5 g requiere unos 5 ml de RNAlater). Los

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rganos pequeos, como los riones, el hgado y el bazo pueden guardarse enteros en RNAlater. Estasmuestras pueden guardarse a 4C durante un mes, a 25C durante 1 semana o indefinidamente a -20Co temperaturas inferiores. Los tejidos de archivo tratados con RNAlater se guardan a -20C otemperaturas inferiores.

2.5.3. Extraccin de ADN

Para la extraccin de ADN, se trituran los tejidos en 10 volmenes de tampn de extraccin (NaCl [100mM], cido etilendiaminotetraactico [EDTA, 25 mM], a pH 8, y dodecil sulfato de sodio [SDS, 0,5%])

suplementado con proteinasa K (100 g ml1). Tras una incubacin durante toda la noche a 50C, seextrae el ADN mediante un protocolo estndar de fenol/cloroformo, y se precipita con etanol. Para aislarel ADN de los tejidos conservados en RNAlater, simplemente se retira el tejido del RNAlater y se tratacomo si se acabara de tomar la muestra. La mayora de tejidos se pueden homogeneizar directamenteen tampn de lisis o de extraccin.

Teniendo en cuenta las limitaciones de tiempo y los riesgos para el personal del laboratorio, los kitscomerciales pueden constituir alternativas tcnicas satisfactorias. La utilizacin de kits comerciales debevalidarse comparndolos con un protocolo estndar de fenol/cloroformo antes de utilizarsesistemticamente en laboratorios de diagnstico.

2.5.4. Extraccin de ARN

Para aislar ARN de tejidos conservados en RNAlater, simplemente se retira el tejido del RNAlater y setrata como si se acabara de tomar la muestra. La mayora de tejidos se pueden homogeneizardirectamente en tampn de lisis o de extraccin.

Teniendo en cuenta las limitaciones de tiempo y los riesgos para el personal del laboratorio, los kitscomerciales pueden constituir alternativas tcnicas satisfactorias. La utilizacin de kits comerciales debevalidarse comparndolos con un protocolo estndar de fenol/cloroformo antes de utilizarsesistemticamente en laboratorios de diagnstico.

2.5.5. Preparacin de portas para la hibridacin in-situ

Para la hibridacin in-situ (ISH), deben fijarse los tejidos de peces en formalina tamponada durante unas24 horas y a continuacin incluirse en parafina segn mtodos histolgicos estndar, como se describeen el apartado 3.3. Los cortes deben tener un grosor de 5 m y se deben depositar sobre portas

recubiertos de aminalquilsilano, que a continuacin se hornean durante toda la noche en un horno a40C. Se retira la cera de los portas sumergindolos en xileno durante 10 minutos. Este paso se repiteuna vez y a continuacin se elimina el disolvente sumergindolos en dos baos sucesivos de etanolabsoluto de 10 minutos cada uno. A continuacin, los cortes se rehidratan mediante inmersin en unaserie de diluciones de etanol. El protocolo puede exigir un paso de permeabilizacin de membrana que

permita el acceso al ADN diana. Para este fin, los cortes se tratan con proteinasa K (100 g ml1) entampn TE (Tris [50 mM], EDTA [10 mM]), a 37C durante 30 minutos. Para las pruebas de ISH, esfundamental teir un porta que se sepa que es positive y uno que se sepa que es negativo, para eliminarfalsos positivos debidos a una tincin inespecfica/tincin en los bordes, y falsos negativos debidos aerrores en el protocolo de tincin.

3. Otros tipos de informacin necesaria

El origen geogrfico de las muestras debe definirse mediante el nombre del lugar de recogida junto con suscoordenadas geogrficas o su localizacin en el curso de un ro o en una masa de agua. Tambin es indispensableconocer el nombre de la persona que ha recogido la muestra, la empresa, la fecha, el momento, el nombre de lamasa de agua y una descripcin del lugar. Adems, se debe registrar la informacin que permita una trazabilidad dela muestra desde el lugar donde se recogi hasta el lugar donde se almacenar o el laboratorio donde se analizar,y tambin en el interior de dichas instalaciones. Las instalaciones donde se guarde deben registrar informacinsobre el mtodo de conservacin, el lugar donde est guardada y la fecha y hora de almacenaje en cada armario onevera de almacenaje, adems de informacin sobre la temperatura de almacenaje (la cual, preferiblemente,deber registrarse sin interrupcin). Esta informacin debe poder asociarse a un nico cdigo de muestra paratodas las muestras. En el caso de los laboratorios, la fecha de recepcin, la informacin sobre el lugar dealmacenamiento, la fecha de anlisis, los datos del anlisis y la fecha del informe deben guardarse para todas lasmuestras identificadas con un solo cdigo. Estos datos facilitarn mucho la trazabilidad de posibles problemas conla muestra y proporcionarn la garanta de que las muestras se manipularn adecuadamente.

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