2.2 espectroscopía de absorción
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2.2 Espectroscopía de absorción en el
visible y en el UV
• La absorción que se lleva a cabo tanto en la región visible como ultravioleta del
espectro, depende de las transiciones electrónicas de la molécula, la cual al
absorber energía del fotón, pasa a un estado excitado; este cambio se suele
representar por:
• M + hѵ M* .
• Es conveniente considerar en espectroscopia UV-visible que la frecuencia de un
haz de radiación que incide en una sustancia permanece invariable y que dicha ѵ
está determinada por la fuente emisora, por el contrario tanto la velocidad de
radiación y la longitud de onda dependen de la condición del medio que atraviesa,
un ejemplo de esto es que la velocidad de propagación de la radiación en el vacío o
en el aire difieren muy poco y llega a alcanzar su valor máximo que es de 3 x 10 8
m/s siendo λ independiente.
• Sin embargo en cualquier otro medio material, la velocidad de la radiación
disminuye a causa de la interacción de la radiación con la materia; en el caso de λ
está decrece igualmente; para el vidrio que es el material más utilizado como
recipiente de una muestra en espectroscopia, la λ se acorta en casi 200 nm o más.
2.2.1 Fundamento de la absorción de radiación
visible por una muestra.
• Cuando un haz de radiación incide sobre una sustancia transparente parte de esta
energía es absorbida y el resto transmitida. Si la energía incidente tiene λ de la
región visible que comprende de los 380- 700 nm y el medio a través del cual tiene
que pasar, absorbe selectivamente ciertas longitudes de onda, el color observado
corresponderá a las λ de la energía transmitida.
• Esto es, si una sustancia absorbe luz visible esta tendrá color, el cual no es
correspondiente a la luz que absorbe, existiendo una relación inversa entre el color
absorbido y el color observado. En la tabla No. 2.3 se muestra esta relación:
Color absorbido Longitud de onda Color observado
Violeta 560-580 Amarillo verdoso
Verde-azulado 595-610 Naranja
Azul-verdoso 610-750 Rojo
Amarillo 400-435 Violeta
Rojo-naranja 490-500 Azul verdoso
Rojo o púrpura 500-560 Verde-azul
• El color de la luz absorbida es complementario del color de la propia solución por
ejemplo; una disolución que contiene proteínas presenta el color violeta al utilizar
el reactivo de Biuret para su identificación, aparece de ese color porque transmite
el color violeta del espectro pero absorbe el color amarillo; por lo que se debe
utilizar en el caso de un fotómetro un filtro color amarillo y en el caso de utilizar un
espectrofotómetro se debe hacer considerar una λ que vaya de los 400-435 nm
para llevar a cabo el análisis de proteínas colorimétricamente.
2.2.2 Características generales de los instrumentos
utilizados para espectroscopia de absorción en el
visible en el laboratorio.
• En la actualidad se cuenta con equipos muy completos para poder llevar a cabo
técnicas espectroscópicas basadas en los fenómenos de emisión, absorción,
fluorescencia o dispersión de la luz con altos límites de confianza.
• Las compañías como Bausch and Lomb, Varian, Perkin Elmer y Hewlett Packard se
han dedicado por años al diseño, construcción y operación de estos equipos cuyas
características de los instrumentos usados en la espectrofotometría e absorción de
la región visible así como los diferentes tipos se mencionan a continuación:
• Fuente de radiación. Las mediciones por encima de los 350 nm, se suelen llevar a
cabo con lámparas de filamento incandescente, por lo general de tugsteno que
suministra suficiente energía radiante en la región de λ donde se va a medir la
absorción, además de mantener de forma constante una intensidad de luz durante
todo el tiempo que transcurra durante el análisis.
• Estas lámparas son económicas con excelente estabilidad; una lámpara especial es
la de tugsteno-halógeno que es suficientemente brillante para los trabajos en la
región visible-UV.
• Monocromadores. Son dispositivos que permiten utilizar cierta región de λ, su
función principal consiste en proporcionar una energía radiante con valores muy
estrechos de λ con una banda espectral reducida por lo que facilitan seleccionar la
λ con la que se va a trabajar como se muestra en la figura No. 2.5.
• Los monocromadores como el de Ebert o de Littrow cuentan con una rendija de
entrada que proporciona una imagen óptima del haz de luz proveniente de la
lámpara, un espejo cóncavo colimador que produce el paralelismo de la luz entre
la rendija de entrada y de salida con ayuda de un prisma reflejante o rejilla,
produciendo como efecto una banda espectral deseada.
• Celda o cubeta. Se trata de recipientes que van a contener la muestra por lo
general líquida; su función además de la anterior consiste en transmitir la energía
radiante en la λ que nos interesa; las celdas de vidrio son apropiadas para la región
visible, las de cuarzo o con alto contenido en sílice se usan en UV, mientras que las
de algunas sales como el KCl son empleadas en espectroscopia IR.
• Las celdas son dispositivos importantes de la instrumentación, algunas de ellas
tienen 1 cm de paso de luz, pero pueden presentar caminos ópticos de fracciones
de milímetro o hasta 10 cm o aún más. Por ello la celda debe estar debidamente
certificada y deben ser llenadas de tal forma que el haz de luz pase a través de la
solución. También es necesario asegurarse de la posición de la misma en el
compartimiento del instrumento al igual que su limpieza para evitar interferencias.
• Detector. Son detectores fotoeléctricos el más sencillo es un fototubo; estos tubos
están construidos al vacio, en su interior están conectados un par de electrodos
como se muestra en la figura No. 2.6, en los que se mantiene un potencial y que
asoman a través de una ventana que permite la entrada de la radiación
transmitida. La superficie del electrodo negativo es fotosensible; esto quiere decir
que, cuando el electrodo se irradia con los fotones provenientes de la luz, los
electrones son expulsados a la superficie llegando a través de un diferencial de
potencial al electrodo positivo y estableciendo una corriente en el circuito, la cual
es medida como % de transmitancia o Absorbancia.
• Las características que se desean encontrar en un detector son: sensibilidad
elevada en la región espectral, respuesta lineal, tiempo de respuesta rápida, bajo
nivel de ruido. Sin embargo estos factores se deben de evaluar en la práctica. (Day,
1989).
• Amplificación y lectura. Ya que el detector percibe el haz de radiación proveniente
de la muestra, cualquier cambio en la intensidad de radiación debido a la
absorción, se detecta como señal. Esta señal amplificada del detector se utiliza
para situar a un atenuador óptico, de modo que la radiación del haz de la muestra
se conserve a la misma intensidad.
• La proporción de atenuación requerida constituye una lectura directa de la
absorción por parte de la muestra.
2.2.2.1 Colorímetro o fotocolorímetros
• El colorímetro Spectronic 20 de Bausch and Lomb (ver fig. No. 2.7) es considerado
como un espectrofotómetro de un solo haz de gran popularidad, estos
fotocolorímetros son el tipo más simple de espectrofotómetros de absorción
basado en la operación de un solo haz, en que la muestra se examina para
determinar la cantidad de luz absorbida a cierta λ.
• Los resultados se comparan con una solución de referencia (por lo general un
disolvente puro como lo es el agua destilada), con la que se lleva a cabo una
medición por separado. Los cambios de intensidad de la fuente y de sensibilidad
del detector limitan a los instrumentos de un solo haz a mediciones con una λ
seleccionada por un filtro aplicable a sistemas absorbentes con bandas de
absorción anchas.
• Para utilizar un colorímetro es necesario conocer el máximo de absorción de la
sustancia analizada. La λ se fija manualmente y después la solución de referencia
se coloca en la trayectoria de la luz y se ajusta el instrumento para que de una
lectura de 0% de Transmitancia cuando se cierra el obturador y no pasa luz al
detector y de 100% cuando se abre el obturador.
• Después de llevar a cabo estos ajustes (se dice de forma equivocada calibrar el
equipo a 0% de absorbancia y 100% de transmitancia), se coloca la muestra en la
trayectoria de la luz y se lee la absorbancia que se relaciona con la concentración,
ya sea por medio del uso de una curva de calibración o de métodos algebraicos
apropiados.(Willard,1986)
• Uno de los requerimientos de los instrumentos de un solo haz es un alto grado de
estabilidad tanto de la fuente de luz como del detector, ya que las fluctuaciones
causan lecturas erróneas. En la fig. No. 2.8 se muestra un fotómetro de filtro de un
solo haz de lectura directa. El trayecto óptico va simplemente de la fuente de luz a
través del filtro y de la porta muestra al detector.