2012

3B-2

GUIA DE PRÁCTICAS

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE TECNOLOGÍA MÉDICA

LABORATORIO CLINICO Y ANATOMIA PATOLÓGICA

HISTOTECNOLOGÍA

AUTOR: PROFESOR ASCARZA GALLEGOS ANGELO

F-GA-04A-3 Rev. Enero 2005

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PRACTICA Nº 1

HISTOTECNOLOGÍA: BIOSEGURIDAD Y TOMA DE MUESTRAS

Marco Teórico

Es la ciencia que estudia los fundamentos técnicos y la secuencia de manipulaciones necesarias para llevar a cabo el análisis de los tejidos de los seres vivos.

Bioseguridad es un concepto amplio que implica una serie de medidas orientadas a proteger al personal que labora en un laboratorio, visitantes y al medio ambiente que pueden ser afectados como resultados de la actividad Histotecnológica

La calidad es un modelo de gestión y un estilo de dirección implantado en los laboratorio de Histotecnología.

Muestra Histológica es toda muestra de tejidos obtenida de un individuo o animal sano con la finalidad de investigar su estructura y composición normales.

Competencia Específica

Explica los fundamentos de las técnicas histotecnológicas como metodologías científicas coadyuvantes en el diagnóstico histopatológicoPropone procedimientos de Bioseguridad y Calidad como elementos fundamentales en Histotecnología.

Material y Métodos

Rótulos de Bioseguridad. Microscopio Binocular. Baño de Flotación Micrótomo de Rotación Manual. Lámina Histológica de Piel Lámina Histológica de Cerebro. Lámina Histológica de Hígado. Acido Clorhídrico QP Formaldehido al 40% Alcohol Absoluto Acido Pícrico


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Piezas Anatômicas Completas fijadas Instrumental y Material de disección

Procedimiento

Observa y esquematiza los procedimientos en Histotecnología, desde la toma de muestras hasta la lámina histológica. Redacta protocolos y esquemas de Bioseguridad y Calidad acorde con las distintas metodologías laboratoriales en Histotecnología.Cuestionario

1. ¿Cuáles son los principales procedimientos Histotecnológicos?2. ¿Cuales son las características macroscópicas de las piezas anatómicas?3. ¿Cuál es la definición de Calidad que mas se adapta en Histotecnologia?4. ¿Cuales son las principales normas de bioseguridad en Histotecnología?

Fuentes de Información

Carson F. Histotechnology. Chicago: ASCP; 2006. Garcia Del Moral R. Laboratorio de anatomía patológica. México D.F.:

McGraw Hill; 2010. Prophet E, Mills B, Arrington J, Sobón L. Métodos histotecnológicos.

Washington, D.C.: ARP; 2009.

PRACTICA Nº 2

FIJACIÓN DE TEJIDOS

Marco Teórico

Es la interrupción de los procesos degradativos que aparecen tras la muerte celular, tratando de conservar la estructura y composición tisular lo más cercanamente posible a como se encontraba en el organismo vivo.


Describe diversos tipos de fijadores como elementos fundamentales en la obtención de Histogramas.Explica los fundamentos de los diferentes procedimientos de fijación en Histotecnología.

Material y Métodos

Agua Destilada.


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Formaldehído al 40%. Alcohol Absoluto Acido Pícrico Acido Acético Glacial Cloruro de Mercurio. Dicromato Potásico. Sulfato Sódico. Piezas Anatómicas Completas Equipo de Disección Alcoholimetro

Procedimiento

Observa y ejecuta los procedimientos de Fijación en diversos tipos de tejidos. Prepara fijadores específicos para cada tipo de coloración según el tipo de análisis a realizar.

Cuestionario

1. ¿Cuales son los componentes del Fijador Bouin?2. ¿Cuales son los componentes del Fijador Zenker?3. ¿Cual es el tipo de Formol ideal?4. ¿Cuál es el porcentaje de Formaldehído ideal en una solución fijadora?


Lillie R. Biological stains. 8 ed. Baltimore: Waverly; 2008. Sheehan D, Hrapchak B. Histotechnology. 2 ed. Columbus: Battelle; 2006. Troyer H. Histochemistry. Boston: Little, Brown And Company; 2006.

FORMOL SALINO

Se utiliza para prevenir el choque osmótico que provoca el empleo de disoluciones de formaldehído en agua destilada.

Preparación: Disolver 9 gramos de Cloruro de Sodio en 1000 mL de Formalina al 10%

FORMALINA NEUTRA

Se utiliza para neutralizar el exceso de Ácido Fórmico generado por la oxidación espontánea del Formaldehído.

Preparación: Añadir a la solución de Formalina al 10% una pequeña cantidad de Carbonato Cálcico insoluble que quedaba depositado en el fondo del recipiente.


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FORMOL TAMPONADO

Se utiliza para prevenir el choque osmótico que provoca el empleo de disoluciones formaldehído en agua destilada, así como el deposito de Pigmento Formólico que ocurre a pH inferior a 6.

Preparación: Como amortiguador se emplea el tampón fosfato calibrado n pH 7,0 – 7,2

Formalina Pura: 100,0 mL Agua Destilada: 900,0 mL

Fosfato Sódico Monobásico: 4,0 gr Fosfato Sódico Dibásico: 6,5 gr

FORMOL ÁCIDO

Se utiliza para fijar tejido nervioso en la preparación de algunas técnicas de Impregnación Argéntica.

Preparación: Añadir una parte de Ácido Acético Glacial a 99 partes de Formalina al 10%. Con ello se consigue un pH en torno a 2.

FORMOL CÁLCICO

Se utiliza en técnicas de Histoenzimología, ya que los iones de calcio estabilizan las moléculas enzimáticas, cuando es empleado a 4º C.

Preparación: Añadir Cloruro Cálcico al 1 por 100 a una solución de Formalina Neutra o Tamponada al 10%.

BOUIN

Ácido Pícrico 2%(750 mL) + Formol (250 mL) + Ácido Acético Glacial (50 mL)

ZENKER

Zenker Stock = Cloruro Mercúrico (5gr) + Dicromato Potásico (2,5 gr) + Sulfato Sódico (1gr) + H2O (1L)

Solución de Trabajo de Zenker = Zenker Stock (95mL) + Formaldehido 40% (5mL)

PRACTICA Nº 3


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PROCESAMIENTO DE TEJIDOS

Marco Teórico

Las muestras para estudio Anatomopatológico pueden ser procesados de muy diversas maneras, en función de:

La naturaleza de la muestra

Tipo de estudio a a realizar

El Procesamiento de Tejidos para estudios Anátomo Patológicos consiste en:

Deshidratación.-: Es el proceso que tiene por finalidad la eliminación completa del agua de la muestra tisular para que el tejido pueda embeber ( absorber ) otros reactivos que no sean Hidrosolubles.

Aclaración.- Se trata de un proceso por el cual se consigue la sustitución del Agente Deshidratante (Alcohol) por una sustancia “miscible” con el Medio de Inclusión (Parafina) que va a utilizarse. A este proceso también se le llama “Desalcoholización”.

Infiltración.- Es el proceso que tiene por objeto “Infiltrar”=“Rellenar” el tejido con el medio de Infiltración. El objetivo es: ocupar completamente con Parafina los espacios intra y extracelulares inicialmente ocupados por el agua.

Competencias Especificas

Describe el Procesamiento de Tejidos como elemento fundamental en la obtención de Histogramas.Detalla los fundamentos de los distintos procedimientos durante el Procesamiento de Tejidos.

Material y Métodos

Agua Destilada Alcohol Absoluto Xilol Parafina Estufa Alcoholimetro Sulfato de Cobre Cubetas de Procesamiento Pipetas Piezas Anatómicas Completas Equipo de Disección


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Cassettes Plásticos para Inclusión en Parafina

Procedimiento

Acondiciona estaciones de procesamiento histotecnológico para diversos tipos de tejido.Observa y ejecuta los procedimientos de Deshidratación, Aclaramiento e Impregnación.

Cuestionario

1. ¿Cuál es la función del Alcohol?2. ¿Cuál es la función del Xilol?3. ¿Cuál es la función de la Parafina?4. ¿Qué cambios físicos ocurren en el tejido en cada estación?


Garcia Del Moral R. Laboratorio de anatomía patológica. México D.F.: McGraw Hill; 2010.

Prophet E, Mills B, Arrington J, Sobón L. Métodos histotecnológicos. Washington, D.C.: ARP; 2009.

Lillie R. Biological stains. 8 ed. Baltimore: Waverly; 2008.

Bateria de Procesamiento

Agua Corriente 15¨Alcohol al 60% 1 horaAlcohol al 70% 1 horaAlcohol al 80% 1 horaAlcohol al 96% 1 horaAlcohol Absoluto I 1 horaAlcohol Absoluto II 1 horaAlcohol Absoluto III1 horaXilol I 1 horaXilol II 1 horaXilol III 1 horaParafina I 1 horaParafina II 1 horaParafina III 1 hora

PRACTICA Nº 4


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MICROTOMIA

Marco Teórico

Es la ciencia que se encarga de estudiar, analizar e interiorizar los fundamentos de funcionamiento y uso del Micrótomo, así como los procesos y accesorios relacionados.

PARTES

Todos los Micrótomos poseen idénticos principios básicos de funcionamiento:

Portabloque

Portacuchilla

Mecanismo de Avance

Existen 6 tipos de Micrótomos:

• Micrótomo de Balanceo

• Micrótomo de Rotación

• Micrótomo de Deslizamiento

• Micrótomo de Congelación

• Criostato

• Ultramicrótomo


Describe los procedimientos de Microtomía como elemento fundamental en la obtención de Histogramas.Explica los fundamentos de los distintos procedimientos de Microtomía en Histotecnología.

Material y Métodos

Micrótomo de Rotación Automático Baño de Flotación Cuchilla Descartable Perfil Bajo Laminas Biseladas Pincel Pelo de Camello Colapiz Pinza Mosquito


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Bloques de Parafina con Tejidos Canastilla Portaláminas Lapiz Punta Diamante

Procedimiento

Observa los procedimientos de Microtomía en Histotecnología.Ejecuta los procedimientos de retallado, enfriamiento, fijación de bloque, orientación del portabloque y portacuchilla, debastado y sección.

Cuestionario

1. ¿Cuales son los procedimientos en Microtomía?2. ¿Cuáles son los tejidos que presentan mas resistencia a la sección?3. ¿Qué sucede si no se enfría el bloque de parafina a seccionar?4. ¿Qué sucede si no se vierte Colapiz en el Baño de Flotación?


Sheehan D, Hrapchak B. Histotechnology. 2 ed. Columbus: Battelle; 2006. Troyer H. Histochemistry. Boston: Little, Brown And Company; 2006. Vacca L. Laboratory manual of histochemistry. New York: Raven; 2006.

PRACTICA Nº 5

COLORANTES Y COLORACIONES

Marco Teórico

Se define un COLORANTE como: “Sustancia líquida que puesta en contacto con un tejido, se une a él, de forma perdurable, transmitiendole su color”

CLASIFICACIÓN DE LOS COLORANTES SEGÚN SUS GRUPOS CROMOFOROS

Se distinguen 8 grupos de Colorantes:

A) Colorantes derivados del Xanteno

B) Colorantes derivados del Benceno

C) Colorantes derivados del Naftaleno

D) Colorantes derivados de la Acridina


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E) Colorantes derivados de Antraquinona

F) Colorantes derivados del Difenilmetano

G) Colorantes derivados de las Ftalocianinas

H) Colorantes derivados de Iminas Quinónicas

CLASIFICACIÓN DE LOS COLORANTES SEGÚN SUS GRUPOS AUXOCROMOS

Se distinguen 5 grupos de Colorantes:

A. Colorantes Básicos

B. Colorantes Ácidos

C. Colorantes Neutros

D. Colorantes Indiferentes

E. Colorantes Metacromáticos


Describe los procedimientos de la preparación de reactivos, insumos y colorantes como elemento fundamental en la obtención de histogramasExplica los fundamentos de los distintos procedimientos en las coloraciones.

Material y Método

Agua Destilada Cristales de Hematoxilina Eosina Yellow Oxido Rojo de Mercurio Alumbre Potásico o Amonio Alcohol Etílico Material de Vidrio Cocinilla Electrica

Procedimiento

Observa y ejecuta los procedimientos de preparación de reactivos, insumos y colorantes. Acondiciona diversas baterías de coloración.

Cuestionario


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1. ¿Como se prepara la solución de Hematoxiiina?2. ¿Cuales son los diversos tipos de Hematoxilina existentes?3. ¿Cómo se prepara la solución de Eosina?4. ¿Cuáles son las maneras de almacenamiento de insumos, colorante sy

reactivos?



Lillie R. Biological stains. 8 ed. Baltimore: Waverly; 2008. Sheehan D, Hrapchak B. Histotechnology. 2 ed. Columbus: Battelle; 2006.

HEMATOXILINA DE HARRIS

PROCEDIMIENTO TECNICOHematoxilina ( cristalizada ) 1 grEtanol absoluto 10 mLDisolver calentando suavementeAlumbre Potasico o Amonico 20 grAgua destilada 200 mLDisolver en caliente. Añadir la solución de Hematoxilina y llevar a ebullición. Cuando comienza a hervir se añade:Oxido Rojo de Mercurio 0,5 gr

EOSINASolución Matriz: 1 gramo de eosina Y hidrosoluble en 20 mL de Agua Destilada, añada 80 Ml de Etanol al 95%Solución Diaria: A una parte de Solució Matriz añada 3 partes de Etanol al 80% y 0,5 mL de Ácido Acetico Glacial por cda 100 mL del colorante

ROJO DE CONGO 01 gramo de Rojo de Congo en 100 mL de Agua Destilada

FUCSINA BASICA Al 1%: 01 gramo de Fucsina Basica en 100 mL de Agua Destilada

ESCARLATA DE BIEBRICH 01 gramo de Escarlata de Biebrich en 100 mL de Agua Destilada

VERDE CLARO Solución Matriz: 0,2 gramos de Verde Claro, SF amarillento en 100 mL de Agua Destilada, añada luego 0,2 mL de Ácido Acético Glacial


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Solución Diaria: 10 mL de la Solución Matriz de Verde Claro en 50 mL de Agua Destilada

CARBONATO DE LITIO Solución al 0,5%: 0,5 gramos de Carbonato de Litio en 100 mL de Agua Destilada Solución Saturada: 1,54 gramos de Carbonato de Litio en 100 mL de Agua Destilada

HEMATOXILINA FERRICA DE WEIGERT Solución Matriz A: 01 gramo de Hematoxilina en 100 Ml de Etanol al 95% Solución Matriz B: 4,0 mL de Cloruro Ferrico al 29%, 95 mL de Agua Destilada y 01 mL de Ácido Clorhídrico Concentrado.

SOLUCIÓN DIARIA DE HEMATOXILINA FERRICA DE WEIGERT Partes iguales (100mL) de soluciones matrices A y B. La solución diaria de la Hematoxilina Ferrica de Weigert puede usarse por aproximadamente dos semanas.

SOLUCIÓN DE YODO Solución de Gram: 01 gramo de Yodo, 02 gramos de Yoduro de Potasio en 300 mL de Agua Destilada

PRACTICA Nº6

COLORACIÓN DE PAPANICOLAO

Marco Teórico

La Coloración de Papanicolaou, se denomina así en honor a George Papanicolaou, quien en el año de 1941, publica una técnica de coloración que permite correlacionar cambios citológicos vaginales con el ciclo menstrual de las mujeres y el diagnostico de casos asintomáticos de neoplasia intrauterina.

Es un método de tinciones policromáticas que consta de una Tinción Nuclear y una Tinción Citoplasmática.

Tiene 2 ventajas:

1. Núcleo nítido, con buena definición del detalle, pudiendo evidenciarse el patrón de cromatina.

2. Citoplasma de aspecto transparente, que permite apreciar los grados de diferenciación celular y actividad metabólica.

La Coloración de Papanicolaou utiliza 3 colorantes:

1. Hematoxilina


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2. Orange G

3. EA-50

La Coloración de Papanicolaou tiene 4 pasos principales:

a. Fijación

b. Tinción Nuclear

c. Tinción Citoplasmática

d. Aclaramiento


Describe los procedimientos de la Coloración de Papanicolao como elemento fundamental en la observación celular de un extendido cérvico vaginalExplica los fundamentos de los distintos procedimientos de la Coloración de Papanicolao

Material y Método

Agua Destilada Solución de Trabajo de Hematoxilina de Harris Solución Orange G Solución de EA50 Xilol Laminas Fijadas con Extendidos Cérvico Vaginales Alcohol: 100%, 96%, 80%, 70% Cubetas de Coloración Canastillas de Coloración Bálsamo de Canadá

Procedimiento

Observa el procedimiento Histotecnológico de la Coloración de PapanicolaoAcondiciona la batería de coloración de Papanicolao.Ejecuta la Coloración de Papanicolao.

Cuestionario

1. ¿Cuál es la función de la solución de Hematoxiiina de Harris?2. ¿Cuales es la función del Orange G?


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3. ¿Cuál es la función del EA50?4. ¿Cuál es la función del Agua Amoniacal?





COLORACIÓN DE PAPANICOLAOU

1.-Fijación en Alcohol Éter >=15’

2.-Enjuagar en Agua Corriente 2’

3.-Hematoxilina de Harris 7’


5.-Alcohol Acido 1% 2”


7.-Agua Amoniacal 10”


9.-Alcohol Etílico de 96% 1’

10.-Orange G 3’

11.-Alcohol Etílico de 96% 30”

12.-EA50 2’



15.-Alcohol Absoluto 30”

16.-Alcohol Absoluto 30”


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17.-Xilol 2’

18.-Xilol 1’

Resultados:

Se observan células de los diferentes estratos del epitelio vaginal y del endo y exocervix, con diferentes tonalidad de coloracion, Eosinófilas y Cianófilas. Se pueden observar las caracteristicas estructurales del núcleo color violeta asi como determinadas pigmentaciones en los citoplasmas.

PRACTICA Nº7

COLORACIÓN DE HEMATOXILINA EOSINA

Marco Teórico

HEMATOXILINA DE HARRIS

Es la Hematoxilina mas utilizada en la coloración rutinaria de los núcleos celulares, debido

a) Su estabilidad (se conserva entre 6 y 12 meses)

b) Su facilidad de manejo.

Es una “Coloración Regresiva”: Primero se sobrecolorea y luego se retira el exceso de colorante por “Diferenciación”

EOSINA

Es un derivado Hidroxixanténico Halogenados con 3 grupos anilo.

Las diferentes Eosinas se diferencian por el tipo y numero de átomos Halógenos que contienen

Eosina Y: cuatro átomos de Bromo

Eosina B: dos átomos de Bromo

En general la Eosina tiene autofluorescencia espontánea y colorean los tejidos de diversas tonalidades entre rojo y rosa.

La Eosina se difunde fácilmente entre las estructuras tisulares, sobre todo en las mas compactas, a las cuales tiñen debido a que por su carácter Ácido son


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atraídos fuertemente hacia los radicales Básicos de la Histidina, Lisina y Arginina presentes en las proteínas titulares.


Describe los procedimientos de la Coloración Hematoxilina - Eosina como elemento fundamental en la obtención de Histogramas.Explica los fundamentos de los distintos procedimientos de la Coloración Hematoxilina - Eosina.

Material y Método

Agua Destilada Solución de Trabajo de Hematoxilina Solución de Trabajo de Eosina Xilol Alcohol: 100%, 96%, 80%, 70% Cubetas de Coloración Canastillas de Coloración Bálsamo de Canada

Procedimiento

Observa el procedimiento Histotecnológico de la Coloración de Hematoxilina – Eosina.Acondiciona la batería de coloración de Hematoxilina – Eosina.Ejecuta la Coloración de Hematoxilina – Eosina.

Cuestionario

5. ¿Cuál es la función de la solución de Hematoxiiina?6. ¿Cuales es la función de la Solución de Eosina?7. ¿Cuál es la función de los Agentes Deshidratantes?8. ¿Cuál es la función del Acido Clorhídrico?



BATERIA DE COLORACIÓN DE HEMATOXILINA--EOSINA


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1.- Estufa 60’

2.- Xilol 5’

3.- Xilol 5’

4.- Alcohol Absoluto 5’


6.-Alcohol 96º 5’



9.-Agua Destilada 5’

10.-Hematoxilina 5’

11.-Agua Destilada 30”

12.- Agua Acida 1% 2”

13.- Agua Destilada 30”

14.- Agua Amoniacal 10”


16.- Eosina 2’


18.- Alcohol 70º 5’





23.- Xilol 5’

24.- Xilol 5’

Montar con Bálsamo de Canadá o Entellan

Resultados: Núcleos Violeta y Citoplasmas Rosados


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PRACTICA Nº8

PRIMERA EVALUACIÒN TEORICA

PRACTICA Nº9

TINCIÓN PARA AMILOIDES: ROJO DE CONGO

MARCO TEÓRICO

La coloración con rojo Congo funciona sobre la base de enlaces por puente dehidrógeno con el componente de hidrato de carbono del substrato. El amiloide,teñido por el rojo Congo, muestra un llamativo bicromatismo bajo la luzpolarizada, los sedimentos muestran sectores verdes luminosos sobre fondooscuro, mientras que otros materiales, como colágeno, que también sonteñidos por el rojo Congo, no muestran este efecto.


Describe los procedimientos de la Coloración Rojo de Congo como elemento fundamental en la tinción de amiloides.Explica los fundamentos de los distintos procedimientos de la Coloración Rojo de Congo.

Material y Método

Como material de partida se usan cortes con un espesor de 4-5 μm, de tejidosfijados con formol, incluidos en parafina.

ReactivosSolución 1: Solución de rojo Congo 100 mlSolución 2: Solución de KOH 2 x 100 mlNecesario adicionalmente:Hematoxilina en solución según Gill III 500 mlHematoxilina en solución según Gill II 500 ml

Procedimiento

Observa el procedimiento Histotecnológico de la Coloración Rojo de Congo.Acondiciona la batería de coloración Rojo de Congo.Ejecuta la Coloración Rojo de Congo.


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Cuestionario

1. ¿Cuál son los amiloides?2. ¿Qué colorante actúa a nivel celular?3. ¿Cuál es la función del Rojo de Congo?4. ¿Qué color toman los amiloides?



TécnicaEtapa TiempoDesparafinar en forma típica los cortes y rehidratar.Enjuagar en agua destilada. 1 min.Teñir en solución de hematoxilina según Gill III o Gill II 5 min.Enjuagar en agua corriente del grifo 5 min.Teñir en solución de rojo Congo 10 min.Enjuagar en agua destiladaDiferenciar en solución de KOH 30 - 40 segundosEnjuagar en etanol del 96 % 30 segundos*Enjuagar en etanol del 96 % 30 segundos*Deshidratar en etanol del 100 % 1 min*Deshidratar en etanol del 100 % 1 min*Aclarar en Neo-Clear® 5 min.Aclarar en Neo-Clear® 5 min.Montar con Neo-Mount®

ResultadoNúcleos azul obscuroAmiloide al trasluz rosa a rojoAmiloide bajo luz polarizada metacromasia verdeTejido conjuntivo rojo claro

PRACTICA Nº10

COLORACIÓN PARA CARBOHIDRATOS: REACCIÓN DE PAS

Marco Teórico


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La histoquímica es la aplicación de reacciones químicas y bioquímicas en la técnica histológica, con el fin de localizar y determinar de manera científica ciertas sustancias o su actividad.

En todas estas reacciones o bien se tiñe la sustancia que buscamos o los colorantes reaccionan químicamente con ella, como es el caso del PAS.

Los hidratos de carbono o glúcidos son polialcoholes oxidados (polihidroxicetonas o polialdehidos). Los polisacáridos son glúcidos formados por la unión de muchas moléculas de monosacáridos (mas de 10). Entre los polisacáridos además de los polisacáridos simples como el glucógeno destacan los polisacáridos complejos.

Los polisacáridos complejos se dividen en 3 grandes grupos:

Mucopolisacaridos que pueden dividirse en :

Mucopolisacaridos neutros

Mucopolisacaridos ácidos

Mucoproteínas

Mucolípidos.


Describe los procedimientos de la Reacción PAS como elemento fundamental en la obtención de HistogramasExplica los fundamentos de los distintos procedimientos de la Reacción del Ácido Periódico de Schiff.

Material y Método

Agua Destilada Acido Peryodico Reactivo de Schiff Fucsina Básica Acido Clorhídrico Concentrado Metabisulfito Sódico Xilol Laminas con Tejidos Desparafinados Alcohol: 100%, 96%, 80%, 70% Cubetas de Coloración Bálsamo de Canadá

Procedimiento


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Observa el procedimiento Histotecnológico de la Reacción del Ácido Periódico de Schiff. Acondiciona la batería de la Reacción del Ácido Periódico de Schiff. Ejecuta la Reacción del Ácido Periódico de Schiff.

Cuestionario

1. ¿Cuál es la función del Acido Peryódico?2. ¿A que nivel actúa los Colorantes de Contraste?3. ¿Cuál es la función del Reactivo de Schiff?4. ¿Qué tonalidad adquiere la estructura celular?





PROCEDIMIENTO TÉCNICO DEL PAS

Fijación:

o Formol al 4 % o Líquido de Carnoy o Bouin.

o Ácido Periódico……………0.5 % p/v.

o Reactivo de Schiff:

Fucsina básica (CI: 42510)………… 1g.

Agua destilada……………………... 200 ml.

Disolver la fucsina en 200 ml de agua (d) hirviendo.

Dejar enfriar hasta aproximadamente 50º C. y filtrar

Posteriormente agregar 20 ml de HCl 1N. Después enfriar hasta 25º C y añadir 1g de Bisulfito sódico o Metabisulfito potásico (sódico).

Mantener en la oscuridad. El liquido tarda unos 2 días o a veces 24h en tornarse de color amarillo que indica que está listo para su uso.


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Añadir 2g de carbón activado, mezclar y filtrar hasta que desaparezca el color.

La solución debe conservarse en el refrigerado protegido de la luz.

o Baño de Ácido Sulfuroso o Agua sulfurosa:

o Ácido Clorhídrico (HCl) 1N…………… 5 ml.

o Metabisulfito sódico 10 %……………... 6 ml.

o Agua (d)………………………………... 100 ml.

o Colorante de contraste: Hematoxilina, Orange G o Van Gieson.

Técnica de Tinción:

Desparafinar e hidratar (xilol y decrecientes alcoholes)

Ácido periódico 0.5 %…………………………………… 5 min.

Lavar en agua (d).

Reactivo de Schiff……………………………………….. 15- 30 min.

Aclarar en 3 baños de agua sulfurosa…………………… 2 min. Cada uno.

Lavar en agua corriente

Colorante de contraste

Lavar con agua corriente.

Deshidratar, aclarar y montar.

PRACTICA Nº12

COLORACIÓN PARA TEJIDO CONECTIVO: TRICRÓMICA SEGÚN MASSON

Marco Teórico

Las coloraciones trícromas permiten visualizar de forma selectiva fibras musculares, fibras colágenas, fibrina y eritrocitos por el empleo combinado de tres soluciones colorantes diferentes. Los métodos originales se emplearon sobre todo para la diferenciación de fibras colágenas y musculares. La selección de los colorantes empleados, que se diferencian por


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su tamaño de molécula, produce una coloración diferenciada de los distintos componentes tisulares.La tinción de Masson-Goldner ofrece las siguientes ventajas: el método puede realizarse con material fijado en formol; previa tinción nuclear con hematoxilina férrica de Weigert se tiñen los componentes tales como musculatura, citoplasma y eritrocitos con azofloxina y solución de anaranjado G.Seguidamente se contratiñe el tejido conectivo con solución de verde luz SF.


Describe los procedimientos de la Coloración Tricrómica según Masson como elemento fundamental en la tinción de Tejido ConectivoExplica los fundamentos de los distintos procedimientos de la Coloración Tricrómica según Masson.

Material y Método

Cortes parafínicos de 3-5 μm de espesorSolución 1: Solución de azofloxina 500 mlSolución 2: Solución de ácido fosfovolfrámico-anaranjado G 500 mlSolución 3: Verde luz SF en solución 500 mlSolución 4: Ácido acético 10% 500 ml

Procedimiento

Observa el procedimiento Histotecnológico de la Tinción para Tejido Conectivo: Tricrómica según MassonAcondiciona la batería de coloración Tricrómica según MassonEjecuta la Coloración Tricrómica según Masson

Cuestionario

5. ¿Cuál es la función de la Soluciona de Azofloxina?6. ¿A que nivel actúa el ácido fosfovolfrámico-anaranjado ?7. ¿Cuál es la función del Verde Luz?8. ¿Qué tonalidad adquiere la estructura celular?



Lillie R. Biological stains. 8 ed. Baltimore: Waverly; 2008. Sheehan D, Hrapchak B. Histotechnology. 2 ed. Columbus: Battelle; 2006.


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PROCEDIMIENTO DE LA COLORACIÓN PARA TEJIDO CONECTIVO: TRICRÓMICA DE MASSON

Etapa - TiempoXileno 5 min.Xileno 5 min.EtOH 100% 30 segundosEtOH 100% 30 segundosEtOH 96% 30 segundosEtOH 96% 30 segundosEtOH 70% 30 segundosEtOH 70% 30 segundosHematoxilina de Weigert 5 min.Agua corriente del grifo, fluente 5 min.Enjuagar en ácido acético del 1 % 30 segundosSolución de azofloxina 10 min.Enjuagar en ácido acético del 1 % 30 segundosSolución de ácido fosfovolfrámico-anaranjado G 1 min.Enjuagar en ácido acético del 1 % 30 segundosVerde luz SF 2 min.Enjuagar en ácido acético del 1 % 30 segundosEtOH 70 % 30 segundosEtOH 96 % 30 segundosEtOH 100 % 30 segundosEtOH 100% 30 segundosEtOH 100% 2 min.Xileno 5 min.Xileno 5 min.

PRACTICA Nº13

COLORACIÓN PARA MICROORGANISMOS: ZIEHL NIEELSEN

Marco Teórico

La tinción de Ziehl-Neelsen (BAAR) es una técnica de tinción diferencial rápida y económica, para la identificación de microorganismos patógenos, por ejemplo M. tuberculosis .

Fue descrita por primera vez por dos médicos alemanes, Franz Ziehl (1859 a 1926), un bacteriólogo y Friedrich Neelsen (1854 to 1894), un patólogo.


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http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Friedrich_Neelsen&action=edit&redlink=1

http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Franz_Ziehl&action=edit&redlink=1

http://es.wikipedia.org/wiki/Mycobacterium_tuberculosis

http://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n_diferencial

Este método se basa en que las paredes celulares de ciertos parásitos y bacterias contienen ácido graso|ácidos grasos (por ejemplo, el ácido micólico) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloración con alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes básicos. Por esto se denominan ácido-alcohol resistencia|bacilos ácido-alcohol resistentes o BAAR.


Describe los procedimientos de la Coloración Ziehl Nieelsen como elemento fundamental en la obtención de HistogramasExplica los fundamentos de los distintos procedimientos de la Coloración Ziehl Nieelsen

Material y Método

Agua Destilada Acido Peryodico Cristales de Fenol Fucsina Acida Hematoxilina Acido Clorhídrico Concentrado Metabisulfito Sódico Xilol Laminas con Tejidos Desparafinados con probada infección al M.

tuberculosis Alcohol: 100%, 96%, 80%, 70% Cubetas de Coloración Bálsamo de Canadá

Procedimiento

Observa el procedimiento Histotecnológico de la Coloración ZN.Acondiciona la batería de la Coloración Ziehl Nieelsen.Ejecuta la Coloración Ziehl Nieelsen.

Cuestionario

1. ¿Cuál es la función del Acido Peryódico?2. ¿A que nivel actúa la Hematoxilina?3. ¿Cuál es la función de la Fucsina Acida?4. ¿Qué tonalidad adquiere la estructura del M. tuberculosis?



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TECNICA PARA MICROORGANISMOS: ZIEHL NIEELSEN

Reactivos

1. Ácido Periódico 5%

2. Carbol Fucsina de Ziehl (fucsina fenicada). Preparar mezclando en el orden dado:

0,5 g fucsina básica

50 cc agua destilada

5 cc etanol absoluto

2,5 g cristales de fenol derretidos

3. Hematoxilina

4. Alcohol Ácido 1%:

Alcohol de 70º

Ácido Clorhídrico

El procedimiento es el siguiente:

1. Desparafinar e hidratar los cortes

2. Ácido periódico 5%, 10 min

3. Lavar con agua destilada

4. Fucsina fenicada, 15 min

5. Decolorar en alcohol ácido al 1%

6. Lavar con agua destilada

7. Hematoxilina, 10 min

8. Azulidificar con, por ejemplo, carbonato de litio

9. Deshidratar, aclarar y montar preparaciones


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Resultados

BAAR: Rojo. Núcleos: Azul.

PRACTICA Nº15

INMMUNOHISTOQUÍMICA: INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA E INDIRECTA

Marco Teórico

INMUNOHISTOQUÍMICA

Técnicas de Inmunofluorescencia

Generalidades sobre Métodos Inmunohistoquímicos

Los métodos Inmunohistoquímicos sirven para detectar Antígenos celulares o tisulares mediante Reacciones Antígeno-Anticuerpo.

Para visualizar el lugar donde ocurre la reacción antígeno anticuerpo es preciso emplear un Trazador o Marcador.

El marcaje puede realizarse con:

Fluorocromos: Técnicas de Inmunofluorescencia

Enzimas: Técnicas Inmunoenzimáticas

Iones Metálicos en Forma Coloidal: Técnica Inmuno Oro

Isótopos Radioactivos

El Antígeno puede detectarse tanto por: “Marcaje Directo” del Ac: Técnicas Directas “Marcaje Secundario” del Ac: Técnicas Indirectas

Técnicas de Inmunofluorescencia Directa.- Se utiliza un Anticuerpo especifico Conjugado a un Fluorocromo, frente al Antígeno que se desea detectar.


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Técnicas de Inmunofluorescencia Indirecta.- Se utiliza en un primer paso un Anticuerpo Especifico NO marcado (Ac Primario). En una segunda fase se utiliza un Anticuerpo marcado con el correspondiente Fluorocromo (Ac Secundario) que reacciona de forma especifica con el Anticuerpo Primario.


Describe los procedimientos en Inmunofluorescencia como elemento fundamental en la detección de Antígenos y Anticuerpos.Explica los fundamentos de los distintos procedimientos en Inmunofluorescencia

Material y Método

Microscopio de Fluorescencia Laminas con Tejidos seccionados en Criostato Sueros de Pacientes con Enfermedades Autoinmunes Acetona PBS Antisuero Primario Conjugado (Fluoresceína) Cámara Húmeda PBS Glicerol Gelatina Lámina Histológica Preparada de Riñón

Procedimiento

Observa el procedimiento Histotecnológico en InmunofluorescenciaEjecuta los procedimientos en Inmunofluorescencia

Cuestionario

1. ¿Cuál es la función del Acido Peryódico?2. ¿A que nivel actúa la Hematoxilina?3. ¿Cuál es la función de la Fucsina Acida?4. ¿Qué tonalidad adquiere la estructura del M. tuberculosis?



TÉCNICA DE INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA (tejido congelado)


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PROCEDIMIENTO TÉCNICO

1.-Se realizan cortes en el criostato de aproximadamente 5 micras de espesor.

2.-Se delimita mediante un circulo realizado con un lápiz de diamante alrededor de cada sección, la superficie de incubación con los anticuerpos ( utilizar portaobjetos diseñados específicamente para metodologías Inmunohistoquímicas ).

3.- Fijar en acetona fría a -20ªC entre 5 y 15 minutos

4.- Secar los cortes al aire

5.- Realizar 3 lavados en PBS de 10 minutos c/u.

6.- Drenar el exceso de PBS y secar alrededor del circulo usando un pañuelo de papel.

7.- Cubrir la sección con el Antisuero Primario Conjugado, a la dilución óptima determinada previamente. La incubación se realizará en cámara húmeda a temperatura ambiente y durante 30 minutos.

8.- Realizar otros 3 lavados como en el paso 3 y secar igualmente en torno al circulo.

9.- Montar utilizando un medio hidrosoluble especifico para Inmunofluorescencia o en su defecto en PBS Glicerol gelatina. Sellar los bordes del cubreobjeto con polivinilalcohol.

10.- Almacenar a 4ªC hasta su lectura en un microscopio de fluorescencia preservando en todo momento de la luz

Resultados:

Marcaje con FITC Fluorescencia verde manzana

Marcaje con TRITC Fluorescencia rojo anaranjada

Observaciones

La técnica de Inmunofluorescencia se usa fundamentalmente en el diagnostico de la patología renal y de determinadas lesiones cutáneas.


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TECNICA DE INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA

PROCEDIMIENTO TÉCNICO

Modo de Operar

1.-Diluir en PBS el suero que se desee probar. Para la mayor parte de auto anticuerpos puede emplearse una dilución a 1/10, para detectar Anticuerpos frente a los Islotes de Langerhans y se debe emplear el suero sin diluir.

2.-Incubar las secciones de tejido elegidas con el suero problema, durante 30 minutos a temperatura ambiente o bien toda la noche a 4ªC.

3.-Realizar 3 lavados en PBS de 10 minutos cada uno.

4.-Drenar el exceso de PBS.

5.-Incubar con el conjugado de Inmunoglobulina anti Ig Humana y Fluorocromo a la dilución optima durante 30 minutos en cámara húmeda.

6.-Decantar el antisuero y realizar 3 lavados con PBS de 10 minutos cada uno.

7.-Montar en medio hidrosoluble específico para Inmunofluorescencia

Resultados

Marcaje con FITC: Fluorescencia verde manzana

Marcaje con TRITC: Fluorescencia rojo anaranjado

Observaciones: Los sueros que resulten positivos pueden titularse haciendo diluciones seriadas del suero problema e indicando la dilución mas alta a la que la técnica resulta positiva. Por ejemplo, si se señala que unos anticuerpos antimicrosomiales son positivos con un titulo de 1/1600 quiere decirse que esta es la dilución mas alta a la que la inmunotinción resulta positiva.


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2012

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