SEÑALES CELULARESSEÑALES CELULARES

20092009

hpzhpz

Un mitógeno estimula la división Un mitógeno estimula la división celularcelular

Comunicación celularComunicación celular Los organismos multicelulares necesitan mecanismos Los organismos multicelulares necesitan mecanismos

de comunicaciónde comunicación Dependen de señales extracelularesDependen de señales extracelulares Depende también de un sistema de proteínas capaz Depende también de un sistema de proteínas capaz

de responder a estas señales hacia un camino de responder a estas señales hacia un camino específicoespecífico

Estas proteínas incluyen proteínas receptoras de Estas proteínas incluyen proteínas receptoras de superficie y una variedad de proteínas señalizadoras superficie y una variedad de proteínas señalizadoras intracelulares.intracelulares.

Entre estas proteínas están kinasas, fosfatasas, Entre estas proteínas están kinasas, fosfatasas, proteínas que unen GTP y otras.proteínas que unen GTP y otras.

El final de cada señal es una proteína blanco que El final de cada señal es una proteína blanco que activa y cambia el comportamiento de la célula.activa y cambia el comportamiento de la célula.

Dependiendo del efecto de la señal estas proteínas Dependiendo del efecto de la señal estas proteínas blanco pueden ser proteínas reguladoras de genes, blanco pueden ser proteínas reguladoras de genes, canales ionicos, componentes del metabolismo, canales ionicos, componentes del metabolismo, partes del citoesqueleto, y otras.partes del citoesqueleto, y otras.

Una señal intracelular activada Una señal intracelular activada por una molécula señal por una molécula señal

extracelularextracelular La molécula señal se La molécula señal se

une a la proteína une a la proteína receptora activando las receptora activando las señales proteicas señales proteicas intracelulares.intracelulares.

La señal intracelular La señal intracelular interactúa sobre una interactúa sobre una proteína blanco proteína blanco alterándola y alterándola y produciendo un cambio produciendo un cambio en el comportamiento en el comportamiento de la célulade la célula

SEÑALES QUIMICAS ENTRE CELULASSEÑALES QUIMICAS ENTRE CELULAS

Moléculas de SeñalizaciónMoléculas de Señalización Moléculas que indican a una célula cómo Moléculas que indican a una célula cómo

proceder.proceder. Actúan como ligando para las células blanco).Actúan como ligando para las células blanco). Las células (blanco) diana poseen receptores Las células (blanco) diana poseen receptores

para captar estas moléculas e iniciar la para captar estas moléculas e iniciar la respuesta.respuesta.

Son :Son : NeurotransmisoresNeurotransmisores HormonasHormonas Mediadores químicos localesMediadores químicos locales

Las moléculas señales pueden actuar a distancias cortas Las moléculas señales pueden actuar a distancias cortas o largaso largas

A) Dependiente de A) Dependiente de contactocontacto, ,

especialmente importantes en especialmente importantes en el desarrollo y respuesta el desarrollo y respuesta inmuneinmune

B) Paracrina,B) Paracrina, señal liberada al exterior y señal liberada al exterior y

actúan sobre las células actúan sobre las células vecinas. Se destruyen vecinas. Se destruyen rápidamenterápidamente

C) Señales sinápticasC) Señales sinápticas de neuronas que transmiten de neuronas que transmiten

señales a lo largo de los señales a lo largo de los axones y liberan axones y liberan neurotransmisores en las neurotransmisores en las sinapsis situadas lejos del sinapsis situadas lejos del cuerpo de la célula.cuerpo de la célula.

D) EndocrinasD) Endocrinas Depende de células que Depende de células que

secretan hormonas a la secretan hormonas a la circulacióncirculación

La unión de la La unión de la molécula señal molécula señal

extracelular puede ser extracelular puede ser en receptores de en receptores de

superficie o receptores superficie o receptores intracelularesintracelulares

MOLECULAS DE SEÑALIZACIONMOLECULAS DE SEÑALIZACIONHidrófilicas. Receptores de SuperficieHidrófilicas. Receptores de Superficie

Dentro de este grupo están los neurotransmisores, las hormonas Dentro de este grupo están los neurotransmisores, las hormonas proteicas y glucoproteínas y los mediadores locales.proteicas y glucoproteínas y los mediadores locales.

Estas moléculas se degradan a los pocos minutos de ser liberados Estas moléculas se degradan a los pocos minutos de ser liberados y median respuestas de corta duración. y median respuestas de corta duración.

Activan proteínas receptoras de la superficie de la membrana Activan proteínas receptoras de la superficie de la membrana plasmática.plasmática.

Tras la unión al ligando, el complejo receptor-ligando queda Tras la unión al ligando, el complejo receptor-ligando queda atrapado en una vesícula de endocitosis revestida por clatrina y es atrapado en una vesícula de endocitosis revestida por clatrina y es endocitado.endocitado.

El ligando es destruido y el receptor, o bien es destruido o El ligando es destruido y el receptor, o bien es destruido o reciclado hacia la membrana plasmática.reciclado hacia la membrana plasmática.

MOLECULAS DE SEÑALIZACIÓNMOLECULAS DE SEÑALIZACIÓN

1.1. Neurotransmisores (señalización sináptica):Neurotransmisores (señalización sináptica): producidos y liberados producidos y liberados por las neuronas en la terminación sináptica y actúan sólo sobre la por las neuronas en la terminación sináptica y actúan sólo sobre la célula postsináptica. La señalización es casi instantánea.célula postsináptica. La señalización es casi instantánea.

2.2. Hormonas (secreción endocrina):Hormonas (secreción endocrina): son liberadas hacia la sangre y son liberadas hacia la sangre y transportadas por ella hasta la célula diana, que pueden estar situadas transportadas por ella hasta la célula diana, que pueden estar situadas muy lejos de las células que secretaron la hormona, por lo que ésta muy lejos de las células que secretaron la hormona, por lo que ésta puede tardar minutos e incluso horas en llegar.puede tardar minutos e incluso horas en llegar.

3.3. Mediadores químicos locales (secreción paracrina)Mediadores químicos locales (secreción paracrina) que son que son producidos por muchos tipos de celulares y, tan pronto como son producidos por muchos tipos de celulares y, tan pronto como son liberados, son rápidamente absorbidos o destruidos, de modo que sólo liberados, son rápidamente absorbidos o destruidos, de modo que sólo actúan sobre las células localizadas en su entorno inmediato actúan sobre las células localizadas en su entorno inmediato (secreción autocrina, mismo tipo de célula). (secreción autocrina, mismo tipo de célula).

Señal autocrina. Señal autocrina. Cuando la señal es recibida por un receptor Cuando la señal es recibida por un receptor

de la misma célula estas responden de la misma célula estas responden coordinadamente como un grupocoordinadamente como un grupo

Una célula animal depende de Una célula animal depende de múltiples señales extracelularesmúltiples señales extracelulares

Las diferentes células pueden Las diferentes células pueden responder diferentemente a la responder diferentemente a la

misma molécula señal misma molécula señal extracelularextracelular

MOLECULAS DE SEÑALIZACIONMOLECULAS DE SEÑALIZACIONHidrófobas. Receptores intra citoplasmáticosHidrófobas. Receptores intra citoplasmáticos

Hormonas esteroides y tiroideas, la vitamina D, los retinoles, los Hormonas esteroides y tiroideas, la vitamina D, los retinoles, los eicosanoides (prostaglandinas, prostaciclinas, tromboxanos y eicosanoides (prostaglandinas, prostaciclinas, tromboxanos y leucotrienos) el NO y el CO.leucotrienos) el NO y el CO.

Las hormonas hidrófobas permanecen mucho tiempo en la sangre Las hormonas hidrófobas permanecen mucho tiempo en la sangre y median respuestas de larga duración.y median respuestas de larga duración.

Al ser liposolubles pasan fácilmente a través de la membrana Al ser liposolubles pasan fácilmente a través de la membrana plasmática (difusión simple) y activan proteínas receptoras en el plasmática (difusión simple) y activan proteínas receptoras en el citoplasma.citoplasma.

El complejo receptor-hormona es introducido en el núcleo de la El complejo receptor-hormona es introducido en el núcleo de la célula donde se une a la cromatina y regula la trascripción de un célula donde se une a la cromatina y regula la trascripción de un pequeño número de genes (respuesta primaria).pequeño número de genes (respuesta primaria).

Estos genes pueden activar a otros genes y dar lugar a una Estos genes pueden activar a otros genes y dar lugar a una respuesta secundaria retardada.respuesta secundaria retardada.

MOLÉCULAS DE SEÑALIZACIÓN HIDRÓFOBAS

El gas óxido nítrico (NO) se une El gas óxido nítrico (NO) se une directamente a una enzima al directamente a una enzima al

interior de la célula blancointerior de la célula blanco

Respuesta inducida por un Respuesta inducida por un receptor nuclear de la hormonareceptor nuclear de la hormona

Tres clases de receptores de Tres clases de receptores de superficiesuperficie

Diferentes Diferentes clases de clases de señales señales

intracelulares intracelulares a lo largo de a lo largo de un camino de un camino de señales desde señales desde un receptor de un receptor de

superficie superficie hasta el hasta el núcleonúcleo

RECEPTORES LIGADOS A PROTEÍNAS GRECEPTORES LIGADOS A PROTEÍNAS G

Señales a traves de la Señales a traves de la unión de proteínas G a unión de proteínas G a

receptores de la receptores de la superficie superficie celularcelular

Los receptores ligados a proteína G Los receptores ligados a proteína G es una gran familia que se es una gran familia que se

encuentra en todos los eucariontes.encuentra en todos los eucariontes.

Receptores ligados a proteínas GReceptores ligados a proteínas G::

Activan o inactivan indirectamente una enzima ligada a la Activan o inactivan indirectamente una enzima ligada a la membrana plasmática (generalmente la adenil ciclasa), o membrana plasmática (generalmente la adenil ciclasa), o bien un canal iónico separado del receptores. bien un canal iónico separado del receptores.

La interacción receptor-enzima (o canal) está mediada por la La interacción receptor-enzima (o canal) está mediada por la proteína G, que se une al GTP.proteína G, que se une al GTP.

La unión del receptor al ligando activa una cadena de La unión del receptor al ligando activa una cadena de acontecimientos que alteran la concentración de una o más acontecimientos que alteran la concentración de una o más moléculas señal intracelulares, denominados mensajeros moléculas señal intracelulares, denominados mensajeros intracelulares, mediadores intracelulares o segundos intracelulares, mediadores intracelulares o segundos mensajeros; AMP cíclico (cAMP) y el Ca++.mensajeros; AMP cíclico (cAMP) y el Ca++.

AA su vez, estos mensajeros actúan alterando el su vez, estos mensajeros actúan alterando el comportamiento de otras proteínas diana de la célula.comportamiento de otras proteínas diana de la célula.

Una vez activada la Una vez activada la proteina G por formación proteina G por formación

de GTP se activa la de GTP se activa la formación de adenil formación de adenil ciclasa que activa la ciclasa que activa la

proteina regulatoria del proteina regulatoria del gen CREB etc.gen CREB etc.

Señales a traves de la unión de enzima a los Señales a traves de la unión de enzima a los receptores de la superficie.receptores de la superficie.

Activación de una enzima ligada a la Activación de una enzima ligada a la membrana plasmática (adenil ciclasa)membrana plasmática (adenil ciclasa)

La activación de la adenil ciclasa altera la concentración del La activación de la adenil ciclasa altera la concentración del cAMP.cAMP.

Casi siempre esta alteración es un incremento de la concentración Casi siempre esta alteración es un incremento de la concentración de cAMP, pero también puede ser que se reduzca la de cAMP, pero también puede ser que se reduzca la concentración.concentración.

El cAMP se sintetiza a partir del ATP, por la enzima adenil ciclasa.El cAMP se sintetiza a partir del ATP, por la enzima adenil ciclasa. Es rápida y continuamente degradada por la fosfodiesterasa del Es rápida y continuamente degradada por la fosfodiesterasa del

cAMP.cAMP. El aumento de los niveles de cAMP estimula una proteína quinasa El aumento de los niveles de cAMP estimula una proteína quinasa

dependiente de cAMP, que fosforila determinadas proteínas dependiente de cAMP, que fosforila determinadas proteínas dianas en residuos de serina o treonina, desencadenando una dianas en residuos de serina o treonina, desencadenando una serie de señales intracelulares.serie de señales intracelulares.

Receptores catalíticos (ligados a enzimas):Receptores catalíticos (ligados a enzimas):

Son proteínas transmembranosas con un dominio citoplasmático Son proteínas transmembranosas con un dominio citoplasmático que bien está asociado a una enzima o actúa como enzima.que bien está asociado a una enzima o actúa como enzima.

Esta enzima es generalmente del tipo proteína quinasa específica Esta enzima es generalmente del tipo proteína quinasa específica de tirosinas.de tirosinas.

La enzima puede ser también una proteína quinasa de La enzima puede ser también una proteína quinasa de serina/treonina.serina/treonina.

La fosforilación desencadena una cascada de nuevas La fosforilación desencadena una cascada de nuevas fosforilaciones proteicas que dan lugar a una serie de señales fosforilaciones proteicas que dan lugar a una serie de señales citoplasmáticas.citoplasmáticas.

Mediante unas proteínas Ras, estas señales llegan al núcleo, Mediante unas proteínas Ras, estas señales llegan al núcleo, alterando se expresión génica, de modo que se activan unos alterando se expresión génica, de modo que se activan unos genes y se reprimen otros.genes y se reprimen otros.

Regulación de la actividad Regulación de la actividad RASRAS

Señales mediadas por RASSeñales mediadas por RAS Ligando:Ligando: factor de crecimiento fibroblastos,factor de crecimiento fibroblastos, factores crecimiento epitelial, factor de factores crecimiento epitelial, factor de

crecimiento plaquetario, stem cell factorcrecimiento plaquetario, stem cell factor Receptor:Receptor: Tirosino-kinasa (RTK) Tirosino-kinasa (RTK) Dimerización y fosforilaciónDimerización y fosforilación Activación proteína intermediaria GNRPActivación proteína intermediaria GNRP Activación proteína G RAS, fosforilación Activación proteína G RAS, fosforilación Proteína GAP inactiva RASProteína GAP inactiva RAS (mutaciones RAS en gran proporción (mutaciones RAS en gran proporción de tumores)de tumores) RAS activada activa proteína kinasa RAFRAS activada activa proteína kinasa RAF RAF activa MEK por fosforilaciónRAF activa MEK por fosforilación La kinasa ERK puede entrar al núcleo y La kinasa ERK puede entrar al núcleo y

activa ciertos factores de transcripciónactiva ciertos factores de transcripción por fosforilación.por fosforilación. Modula la transcripción.Modula la transcripción.

Señales por ligandos TGF Beta y por BMP

SEÑAL QUE HEMOS SEÑAL QUE HEMOS TERMINADOTERMINADO

GRACIASGRACIAS

Regulación de la Regulación de la expresión génicaexpresión génica

HPZ 2009HPZ 2009

Regulación de la expresión Regulación de la expresión génicagénica Genes se expresan transcribiéndose en moléculas de RNA

• Todas las células tienen la misma información genética.• Variabilidad en la forma y función celular.• Multiplicación y diferenciación celular.• Ausencia o presencia de proteínas específicas.• Los genes se expresan reguladamente• La expresión de los genes puede ser permanente y en todos los tipos de células por la función desempeñada: genes housekeeping o restringido a un tejido específico.• Control de la expresión génica a través de proteínas reguladoras.• Respuesta a estímulos ambientales activando o desactivando genes específicos en forma permanente o temporal.• Además, modificaciones de la cromatina, metilación del DNA, acetilación de histonas pueden regular la expresión génica (mecanismos epigenéticos)

Control de degradación del RNA

mRNA degradado

Control transcripcional

Control post-transcripcional

Control en el transporte

Control traduccional

Control en la degradación proteica

Control pre-transcripcional

Transporte al Citoplasma

Proteína

Proteína degradada

DNA

Pre-mRNA

mRNA maduro

Niveles de Regulación GénicaNiveles de Regulación Génica

La regulación génica puede ocurrir a nivel:La regulación génica puede ocurrir a nivel:

• Pre- transcripcional

• Transcripcional

• Post-transcripcional

• Traduccional

• Post-traduccional

•Velocidad de síntesis de proteínas

•Velocidad de degradación de proteínas

•Modificaciones post-traduccionales

•Destinación diferencial

•Etc, etc….

Regulación Post-traduccionalRegulación Post-traduccional

Niveles de Regulación GénicaNiveles de Regulación Génica

• Pre- transcripcional

Estímulo externo:

inducción hormonal, factores de crecimiento, moléculas señales o intermediarios para la inducción de la transcripción.

Interacciones inductivas Interacciones inductivas durante el desarrollo del ojodurante el desarrollo del ojo

Mecanismos Mecanismos pretranscripcionalespretranscripcionales

Ligando: factor de crecimiento Ligando: factor de crecimiento fibroblastos,fibroblastos,

Factores crecimiento epitelial, factor de Factores crecimiento epitelial, factor de crecimiento plaquetario, stem cell factorcrecimiento plaquetario, stem cell factor

Receptor: Tirosino-kinasa (RTK)Receptor: Tirosino-kinasa (RTK) Dimerización y fosforilaciónDimerización y fosforilación Activación proteina intermediaria GNRPActivación proteina intermediaria GNRP Activación proteína G RAS, fosforilacion Activación proteína G RAS, fosforilacion Proteína GAP inactiva RASProteína GAP inactiva RAS (mutaciones RAS en gran proporción (mutaciones RAS en gran proporción de tumores)de tumores) RAS activada activa proteina kinasa RAFRAS activada activa proteina kinasa RAF RAF activa MEK por fosforlizaciónRAF activa MEK por fosforlización La kinasa ERK puede entrar al nucleo y La kinasa ERK puede entrar al nucleo y

activa ciertos factores de transcripciónactiva ciertos factores de transcripción por fosforilación.por fosforilación. Modula la transcripción.Modula la transcripción.

Pre-transcripcionales

Niveles de Regulación GénicaNiveles de Regulación Génica

• Transcripcional

Promotor core o básico Caja TATA (posición -30)

Elementos proximales ~ 20bp (hasta -200)

Enhancers y silenciadores ~ 100-200 bp con elementos de control de 8-20 bp (distancias variables)

Estructura básica de un promotor Estructura básica de un promotor eucarionteeucarionte..

Elementos proximales Core

Río arriba Río abajo

Caja GC Caja CAAT Caja TATA

ESPECÍFICOS

Promotor: secuencias necesarias para el inicio de transcripción

Regulación a nivel transcripcional

Regulación a nivel transcripcional.

Regulación a nivel transcripcional....

R, retinalCNS, sistema nervioso centralS: Células de Schwann G, general

Uso de promotores alternativos.La distrofina en distintos tejidos tienen promotores diferentes

L, lymphocyteC, corticalM, muscleP, Purkinje

Gen Distrofina:Xp2179 exones2,4 MB

Niveles de Regulación GénicaNiveles de Regulación Génica

• Post-transcripcional

1. Modificación del extremo 5’: Adición de CAP (7-

metilguanosina )

2. Modificación del extremo 3’: Poliadenilación y uso de secuencias de término alternativas

3. Remoción de intrones: splicing alternativo

4. Edición del RNA

Procesamiento del RNA. Regulación Procesamiento del RNA. Regulación a nivel post transcripcional. a nivel post transcripcional.

Regulación a nivel post-transcripcional...Regulación a nivel post-transcripcional...

Splicing alternativoSplicing alternativo

EJ: GEN DE LA FIBRONECTINA Múltiples exones 75 kb

El mRNA de la fibronectina del fibroblasto tiene los exones EIIIB y EIIIA. En el hepatocito carece de éstos.

-tropomyosin: Uso de promotores alternativos•Splicing alternativo y Secuencias de término alternativas

Hígado.Une receptores de LDL presentes en todas las células.Transporta lípidos y colesterol

Intestino delgado. Transporta lípidos.

En el cerebro de mamíferos, la edición del RNA produce cambios significativos en las propiedades funcionales de receptores de importantes neurotransmisores tales como glutamato y serotonina.

Cambio de C a U enla base 6666 ocasiona un codón de término en el APO del intestino.

Regulación post transcripcional...Regulación post transcripcional... Edición del RNAEdición del RNA

Modificación del DNA o del core de histonas que regulan la actividad génica, sin alterar la secuencia del DNA.

Se puede transmitir después de la división celular a las células hijas.

Mecanismos:

Metilación del DNA

Modificación de histonas.

Exclusión alélica

Imprinting

Factores epigenéticos.Factores epigenéticos.Epigenética: “Fuera de la genética convencional”

C mC

Metil transferasa

Regulación de la actividad Regulación de la actividad transcripcional.transcripcional.

Metilación del DNA Metilación del DNA

Características asociadas con cromatina transcripcionalmente activa e inactiva

Característica Cromatina transcripcionalmente activa

Cromatina transcripcionalmente inactiva

conformación de la cromatina

conformación abierta y extendida

Conformación altamente condensada, particularmente en heterocromatina (facultativa y constitutiva)

metilación del DNA Relativamente no metilada, especialmente en regiones promotoras

Metilada, incluyendo en regiones promotoras

acetilación histonas Histonas acetiladas Histonas desacetiladas

metilación de histonas Histonas metiladasHistonas no metiladas

Metilación del DNA. Islas CpG

• Islas CpG: segmentos de 200-2.000 bp con una alta concentración de dinucleótidos CpG.• 56% de los genes humanos tienen islas CpG cercanas al extremo 5’.• Housekeeping genes permanecen no metilados por lo que se expresan en todos los tejidos. • Genes tejido específicos permanecen no metilados SOLO en tejidos donde deben expresarse.

• La inactivación del cromosoma X es un proceso regulado que se produce en hembras de mamíferos durante la embriogénesis Blastocisto.

XIST codifica para un RNA de 17 kb poliadenilado que no se traduce y es inestable (200 a 1000 / célula ). También se transcribe Tsix.

XIST es un gen localizado dentro de una región denominada XIC (Xq13.2)

• Unos pocos genes del cromosoma X inactivo, 15% permanecen activos, incluyendo el gen XIST.

•La inactivación se mantiene a lo largo de la vida.

Exclusión alélica por Inactivación del cromosoma X

• Cromatina de Barr

• Síndrome de Turner (45,X) no tienen cuerpos de Barr, Síndrome de Kleinfelters (47, XXY) sí tiene

• Hipótesis Lyon – uno de los dos cromosomas X en hembras se inactiva. Si hay múltiples cromosomas X, todos excepto uno se inactivan. “compensacion de dosis”

Exclusión alélica por Inactivación del cromosoma XExclusión alélica por Inactivación del cromosoma X

XIST : Transcrito específico del Cromosoma

Centro de Inactivación del cromosoma X, XIC

Metilación en citosina en regiones CpG en promotores y alta compactación.

150Mb 1168 Genes conocidos.1.500 potenciales

Xq13

Xist

Xist

Xist

Activo

Inactivo

Factores bloquean la expresión de XIST del X activo

RNA XIST RNA interactúa con factores de estabilización

XIST se expresa en ambos cromosomas X en hembras.

El RNA Xist se distribuye y cubre el cromosoma X que lo sintetiza

Exclusión alélica por Inactivación del cromosoma X

Metilación de Xist para silenciarlo

Exclusión alélica por reordenamiento programado del DNA.

Un mamífero sintetiza 107- 1011

diferentes tipos de anticuerpos

Cada linfocito B sintetiza sólo un tipo de anticuerpo

Heavy chain IGH 14 86 30 9 11 Light k chain IGK 2 76 0 5 1 Light l chain IGL 22 52 0 7 7

Componente Locus Cromosoma Número de segmentos génicosV D J C

Generación de variabilidad en las inmunoglobulinas

Unión VJ (recombinación) en linfocitos B

Unión DJ

Unión VDJ

Exclusión alélica por reordenamiento

programado del DNA.

Generación de variabilidad en las inmunoglobulinas

PUFF en Drosophila

Sitio de eritropoiesis y tipos de Sitio de eritropoiesis y tipos de cadenas en el desarrollo cadenas en el desarrollo

humanohumano

Familia de las beta globinas en el cromosoma 11Familia de las beta globinas en el cromosoma 11

Región controladora de Región controladora de locus (LCR)locus (LCR)

Super enhancers Super enhancers (intensificadores)(intensificadores)

El LCR está ubicado entre El LCR está ubicado entre 6 a 22 Kb rio arriba del 6 a 22 Kb rio arriba del gen globina epsilongen globina epsilon

Interacción entre LCR y Interacción entre LCR y los genes globina es los genes globina es polarizado. Los genes polarizado. Los genes globina mas cercanos se globina mas cercanos se abren primero y los mas abren primero y los mas lejanos después. lejanos después.

Metilación de los genes globina en Metilación de los genes globina en células sanguíneas humanas células sanguíneas humanas

embrionariasembrionarias

GRACIASGRACIAS