Identificación bacteriana: Taxonomía filogenética. Evolución microbiana.

La fisiotaxonomía consiste en la asignación de nombre a los microorganismo para poder organizarlos de cierta forma e identificarlos a partir de 3 dominios bases (Arqueobacterias, Bacterias y eucariotas)

Taxonomía = Clasificación

La taxonomía se basa en criterios (algunos relacionados con la evolución) y características en comunes con el fin de identificar sus propiedades para un mejor entendimiento funcional y estructural de los M.O.

En química un buen ejemplo de taxonomía es la tabla periódica, donde los elementos se ordenan en función de su configuración electrónica.

La teoría evolutiva es una de las bases de la taxonomía por agrupamientos de especies en función de algún ancestro en común y su similitud.

La filogenia es la utilidad de las clasificaciones.

Para poder hacer taxonomía se postuló como base al ribosoma, cuya función es la síntesis e proteína y está compuesto mayoritariamente por RNAr que tiene una estructura compleja y con ciertas secuencias variables y que no son constantes utilizadas para hacer comparaciones entre distintas especies y a partir de esto se definieron los 3 dominios nombrados anteriormente.

El dominio procarionte contiene a los microorganismos carente de núcleo donde las arqueas no forman parte de agentes patógenos hasta la fecha. En cuanto a dominio las células eucariotas son de mayor tamaño que las células procariotas y poseen organelos, dentro de ellos se puede destacar a la microcondria y al cloroplasto quien poseen ADN y ribosomas, es por lo cual la información genética de una célula no solo está contenida en su núcleo, sino también en estos organelos, y es por lo mismo que se cree que estos eran microorganismos independientes que fueron endocitados por las celulas eucariotas y parte de su ADN se integro al núcleo (Teoría endosimbiótica de la evolución) el cual es un proceso que se cree que aun ocurre. Un respaldo de lo anterior es observar que es lo que ocurre con la actividad de la mitocondria y el cloroplasto cuando son expuestos a algún antibiótico. Experimentos han demostrado que sus actividades disminuyen. Otro respaldo es la similitud de ADN de estos organelos con el de las bacterias.

En cuanto al origen de la vida se cree que el primer organismo apareció alrededor de 1.000 millones de años y en ese mismo momento se puso en curso el proceso de evolución. Muchas bacterias han evolucionado rápidamente, incluso se han llegado a hacer experimentos con respecto a esto y una de los aspectos evolutivos de estos M.O. es la tolerancia ante ciertos fármacos que es justamente una de las aéreas de estudio para el desarrollo de fármacos.

Analisis de M.O.

Eventos previos :

1. Toma de muestra: Flora bucal: Se toma muestra mediante un isopoPunsión Lumbar: Involucra rotura de huesos para tomar LCRMuestra de SangreOrina

2. Rotular de buena manera la muestra con la información correspondiente y situarla en un contenedor adecuado

3. Análisis de laboratorioSe procede a realizar distintas pruebas, dentro de ellas se recurre con frecuencia al microscopio con una tinsión previa (colorear los M.O.)

De acuerdo con el análisis con microscopio se puede hacer dos tipos

a)Examen directo: Donde el medio de refracción de la luz es un aceite y no el aire y permite alcanzar un aumento mejor y la muestra debe ser teñida. La tinsion mas frecuente es la tinsion de Gram (Clásica, de mayor utilidad)

b) Microscopía de campo oscuro: Se basa en hacer incidir la luz en distintos ángulos laterales para obtener un mayor grado de resolución o calidad

Otras técnicas de identificación bacteriana:

Baciloscopía Muy utilizado para el diagnostico de Tuberculosis.

1. Se le pide al paciente que tosa en un recipiente para recoger su muestra,

2. La muestra se vierte a un porta-objeto 3. Tratamiento con acido para luego teñir con colorantes (ya que en este

situación la bacteria es capaz de retener el colorante).4. Finalmente se acompaña de una tinsion azul para revelar la existencia

de restos celulares.

Siembra de M.O. Medios selectivos : Impide el crecimiento de algunos M.O. ya que este

medio contiene péptidos y proteínas que solamente favorece la sobrevivencia de algún tipo de M.O. en especial.

Medios indicadores : Bacterias crezcan y cambien de color dependiendo de la especie

Tipos de Medios Líquido : Se denominan caldo de

cultivo.

Sólido: Se aplica un polímero llamado Agar-agar (se obtiene a partir de las algas) que ayuda aislar la bacteria con la ayuda de una asa de platino que contiene un pequeño circulo, se sumerge en la muestra y se transporta a un porta objeto . Posteriormente se obtiene las bacterias que han crecido independiente una de la otra (Separadas). Existen 2 tipos de Agar-agar:

Agar chocolate: Consiste en el mismo polimero enriquecido con sangre de cordero a alta temperatura, donde los glóbulos rojos se lisan y liberan su contenido nutritivo al medio para bacterias "exigentes", denominadas bacterias fastidiosas.

Agar Sangre: A menor temperatura para no dañar los glóbulos rojos ya que las bacterias sembradas en este tipo de medios liberan sustancias para producir la lisis de los eritrocitos reconocidas mediante zonas claras mas del porta-objeto con respecto a la sangre contenida en él. Este medio sirve para identificar bacterias hemolíticas.

Medio diferencial : Un ejemplo de ellos es sembrar bacterias en un medio de lactosa y aquellas que aprovechan este polisacárido para su crecimiento adopta un color debido al pH ácido que se genera y aquellas que no la utilizan adoptan otro color diferente

Fisiotaxonomía bacterianaAsignación de un nombre para la bacteria tomando como referencia la capacidad de esta para metabolizar ciertos compuestos o nutrientes al igual que en una marcha analítica

En clinica se ocupan indicadores. Consiste en una barra donde se aplican distintos nutrientes o compuestos (cada zona adopta un color especifico) y todas estas zonas son cultivadas con el mismo M.O. Los cambios de colores se

traducen en un código asociado a una secuencia de números el cuál se ingresa en un programa computacional y este programa indica el nombre de la bacteria. Esto se utiliza para llevar a cabo un tratamiento adecuado contra la bacteria.

Identificación por anticuerpos (Inmunoglobulina)Reconocimiento altamente especifico. Uno de ellos es por aglutinación. La bacteria se resuspende en suero fisiologico y se agrega el anticuerpo. Si hay reconocimiento se observaría la formación de grumos que correspondería a la unión del anticuerpo con su antígeno (Conglomerado que precipita)

Test de ELISA, "Enzyme Linked Immunoabsorbent Assay" (Ensayo inmunoenzimático ligado a enzimas)Consiste en una placas solidas plásticas cargadas positivamente las cuales se someten al siguiente tratamiento

1. Como la placa está cargada positivamente, las bacterias se anclan a la placa debido a la interacción de esta con las proteínas contenidas en la superficie del M.O.

2. Se vierte sobre la placa alguna proteina para rellenar las espacios cargados positivamente

3. Se vierte un anticuerpo especifico que se unirá a la bacteria.4. Se vierte un segundo anticuerpo que reconoce al primer anticuerpo y

que está asociado a una enzima. Esta enzima cataliza una reacción que genera color. Este color muchas veces se puede cuantificar para conocer la cantidad de bacteria presente

Otra "versión" del test de ELISA es la inmunofluorescencia, que consiste en la asociación a un compuesto fluorescente en lugar de una enzima la cual emite color al unirse con su antigeno, evento perceptible al microscopio.

ElectroforesisConsiste en la ruptura de la bacteria para producir una liberación de su contenido proteico, estas proteínas se vierten sobre un gel, se aplica un campo eléctrico y las proteínas se ordenan de acuerdo a su peso molecular. Posteriormente las proteínas se tiñen y se obtienen bandas.

Muchas veces el bandeo no permite distinguir una bacteria de la otra (debido a la cantidad de proteinas) por lo cual se procede a una tinsion más especifica con anticuerpos (Western blot).

FagotipificaciónConsiste en el reconocimiento de las bacteria mediante su lisis. Estas bacterias se siembran y son infectadas por un tipo de virus llamado Bacteriófago, el cual produce esta muerte de la bacteria. El análisis posterior se trata de identificar estas zonas donde hubo lisis ya que es en ellas donde ocurrió algún reconocimiento especifico.

Uso de la hibridación de ADNOtra forma de reconocimiento bacteriano es a partir del ADN de una bacteria identificada:

1. El ADN conocido se disocia y solamente una de las dos hebras se une a un compuesto fluorescente. Esta molecula de ADN unido a un compuesto fluorescente es lo que se llama "sonda"

2. Por otro lado, la muestra "problema" que es la bacteria en cuestion se adhiere a un papel de microcelulos

3. El papel de microcelulosa junto a la bacteria se sumerge a una solución con pH extremadamente básico

4. El ADN a ese pH se disocia5. Se agrega la "sonda" y donde hubo hibridación se emite fluorescencia

gracias al compuesto fluorescente.

Southern BlotReconocimiento de ADN con anticuerpos asociados a compuestos fluorescentes.

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Técnica que sirve para ampliar una secuencia de ADN para su estudio obteniéndose múltiples copias a partir de poca muestra, el cual optimiza la identificación bacteriana.