HONGOSHONGOS(MÉTODO DE COLORACIÓN DE PAS )(MÉTODO DE COLORACIÓN DE PAS )

Conjunto de seres vivos que incluyen desde Conjunto de seres vivos que incluyen desde organismos unicelulares a organismo organismos unicelulares a organismo pluricelulares macroscópicos. Están pluricelulares macroscópicos. Están formados por células eucarióticas con una formados por células eucarióticas con una pared rígida y se caracterizan por ser pared rígida y se caracterizan por ser móviles , presentan nutrición heterótrofa por móviles , presentan nutrición heterótrofa por absorción y reproducción sexual y asexual. absorción y reproducción sexual y asexual.

Los hongos unicelulares: Microorganismo Los hongos unicelulares: Microorganismo poseen forma redondeada (Levaduras o poseen forma redondeada (Levaduras o conidias). La mayoría de los hongos son conidias). La mayoría de los hongos son pluricelulares: están formados por pluricelulares: están formados por hifas :Células cilíndricas alargadas, hifas :Células cilíndricas alargadas, linealmente largos, filamentosos, linealmente largos, filamentosos, tabicadas.tabicadas.Las hifas: Formas micelios visibles macroscópicamente, algunos hongos microscópicos pueden causar diversas enfermedades :micosis. Células fúngicas microscópicas : Se visualizan en forma directa en fluidos o por Coloraciones Histoquímica y Especiales en tejidos.

ESTRUCTURA CELULAR :ESTRUCTURA CELULAR :

Células fúngicas : Eucarióticas poseen Células fúngicas : Eucarióticas poseen núcleo, RE, AG, las mitocondrias y un núcleo, RE, AG, las mitocondrias y un citoesqueleto, ribosomas citoesqueleto, ribosomas (citoplasma ), membrana celular, (citoplasma ), membrana celular, pared rígida (Recubierta constituida pared rígida (Recubierta constituida por polisacáridos).por polisacáridos).

PARED CELULAR: CAPAS O ESTRATOS:PARED CELULAR: CAPAS O ESTRATOS:

1.- QUITINA,2.- CELULOSA1.- QUITINA,2.- CELULOSA: : Estructuras a Estructuras a morfas (Glucanos, mánanos), tiene morfas (Glucanos, mánanos), tiene proteínas asociadas a los polisacáridos y proteínas asociadas a los polisacáridos y lípidos. lípidos.

La pared celular : Exoesqueleto rígido La pared celular : Exoesqueleto rígido que protege a la célula, algunos órganos que protege a la célula, algunos órganos unicelulares producen capsulas unicelulares producen capsulas (Polisacáridos mucilaginosos).(Polisacáridos mucilaginosos).

MORFOLOGÍA :MORFOLOGÍA :

1.- HONGOS UNICELULARES: 1.- HONGOS UNICELULARES: Células aisladas ovales : 3 -10 um de Células aisladas ovales : 3 -10 um de diámetro (levaduras).diámetro (levaduras).2.- HONGOS PLURICELULARES:2.- HONGOS PLURICELULARES:Células alargadas- cilíndricas: 3-12 um Células alargadas- cilíndricas: 3-12 um de diámetro lineales, filamentosas, de diámetro lineales, filamentosas, ramificadas y tabicadas(hifas). ramificadas y tabicadas(hifas).

CLASIFICACIÓN:CLASIFICACIÓN:

1.- MORFOLOGIA: 1.- MORFOLOGIA:

- - Filamentosas :Hifas.Filamentosas :Hifas. - Redondeadas: Conidias - Redondeadas: Conidias - Esporas: Ovaladas o redondas - Esporas: Ovaladas o redondas - Filamentos con esporas - Filamentos con esporas

2.- SEGÚN LA ENFERMEDAD QUE 2.- SEGÚN LA ENFERMEDAD QUE PRODUCE:PRODUCE:

A) MICOSIS SUPEA) MICOSIS SUPERFICIAL: RFICIAL: Piel, pelo, uñas. Ejm;Piel, pelo, uñas. Ejm;Malassezia furfur , Nocardia, Minutissima, Malassezia furfur , Nocardia, Minutissima, Nocardia minutissima, Nocardia tenuis, Nocardia minutissima, Nocardia tenuis, Cladosporium wornecku, Trichophyton.Cladosporium wornecku, Trichophyton.

B) MICOSIS PROFUNDA O SISTEMICA: B) MICOSIS PROFUNDA O SISTEMICA: Ubicado Ubicado en los tejidos profundos. Ejm:en los tejidos profundos. Ejm:Actinomices, Nocardia asteroides, Histoplasma Actinomices, Nocardia asteroides, Histoplasma capsulatum.capsulatum.

METODOS DE COLORACION MAS METODOS DE COLORACION MAS USADOS PARA LA DETERMINACION USADOS PARA LA DETERMINACION DE HONGODE HONGOS:S:

1.- METODO DE COLORACION DE PAS1.- METODO DE COLORACION DE PAS

2.- METODO DE COLORACION DE GROCOTT2.- METODO DE COLORACION DE GROCOTT

3.- METODO DE COLORACION DE GRIDLEY.3.- METODO DE COLORACION DE GRIDLEY.

4.- METODO DE COLORACION DE GIEMSA.4.- METODO DE COLORACION DE GIEMSA.

5.- METODO DE COLORACION DE GRAM.5.- METODO DE COLORACION DE GRAM.

I.- OBJETIVO: I.- OBJETIVO: DEMOSTRARDEMOSTRAR la presencia de la presencia de HONGOSHONGOS en en CORTES DE TEJIDOS CORTES DE TEJIDOS HISTOLOGICOS.HISTOLOGICOS.

II.- FIJACIÓNII.- FIJACIÓN: Formalina neutra al 10%, : Formalina neutra al 10%, estabilizada. estabilizada.

III.- MICROTOMIAIII.- MICROTOMIA: En parafina. 4-6 micrones. : En parafina. 4-6 micrones.

ACIDO PERYODICO DE SCHIFF (PAS)

IV.- SOLUCIONES:IV.- SOLUCIONES:

Acido peryódicoAcido peryódico ………………………0.5 g ………………………0.5 gAgua destiladaAgua destilada ………………….. .100.0 ml………………….. .100.0 ml

Acido clorhídrico, g. esp. 1.19……………..83.5 mlAcido clorhídrico, g. esp. 1.19……………..83.5 mlAgua destiladaAgua destilada ……………………….916.5 ml……………………….916.5 ml

1.- SOLUCIÓN ACIDO PERYODICO 0.5%1.- SOLUCIÓN ACIDO PERYODICO 0.5%

2.- SOLUCIÓN DE ACIDO CLORHÍDRICO 1N2.- SOLUCIÓN DE ACIDO CLORHÍDRICO 1N

Fucsina básica………………………..……...Fucsina básica………………………..……... 1.0 g1.0 gAgua destilada, calentar a 60 °C………….200.0 mlAgua destilada, calentar a 60 °C………….200.0 mlLlevarlo a punto de ebullición.Llevarlo a punto de ebullición.Dejarlo enfriar y luego agregarDejarlo enfriar y luego agregarMetabisulfito de potasioMetabisulfito de potasio………………………………………………………… 2.0 g2.0 gAcido clorhídrico 1N………………………………..10.0 Acido clorhídrico 1N………………………………..10.0 mlmlDejarlo aclarar durante 24 horas y luego agregarDejarlo aclarar durante 24 horas y luego agregarCarbón activado………………………………........ 0.5 Carbón activado………………………………........ 0.5 gg

Agitar durante 1 minuto, luego filtrarlo a través Agitar durante 1 minuto, luego filtrarlo a través de papel de filtro grueso. Repetir la filtración de papel de filtro grueso. Repetir la filtración hasta que la solución aparezca incolora. Mantener hasta que la solución aparezca incolora. Mantener en la refrigeradora.en la refrigeradora.

3.- REACTIVO SCHIFF DE COLEMAN3.- REACTIVO SCHIFF DE COLEMAN

4.- SOLUCIÓN DE HEMATOXILINA DE MAYER (C. 4.- SOLUCIÓN DE HEMATOXILINA DE MAYER (C. 9)9)

O SOLUCIÓN DE HEMATOXILINA DE HARRIS O SOLUCIÓN DE HEMATOXILINA DE HARRIS (C. 9)(C. 9)

V.- PROCEDIMIENTO:V.- PROCEDIMIENTO:

1.- Desparafinizar e hidratar hasta llegar al 1.- Desparafinizar e hidratar hasta llegar al agua destilada.agua destilada.

2.- Oxidar en la solución de ACIDO 2.- Oxidar en la solución de ACIDO PERYODICO durante 5 minutos.PERYODICO durante 5 minutos.

3.- Enjuagar en agua destilada.3.- Enjuagar en agua destilada.4.- Colocar en el 4.- Colocar en el REACTIVO DE SCHIFF DE REACTIVO DE SCHIFF DE

COLEMAN COLEMAN durante 15 minutos.durante 15 minutos.5.- Lavar con agua tibia durante 10 5.- Lavar con agua tibia durante 10

minutos.minutos...

..6.- 6.- Contrastar con la solución de Contrastar con la solución de

HEMATOXILINA DE MAYER durante 15 HEMATOXILINA DE MAYER durante 15 minutos, o la solución de minutos, o la solución de HEMATOXILINA de HARRIS durante 6 HEMATOXILINA de HARRIS durante 6 minutos.minutos.

7.- Lavar con agua corriente durante 15 7.- Lavar con agua corriente durante 15 minutos.minutos.

8.- Deshidratar y aclarar a través de alcohol etílico al 95%. alcohol; etílico absoluto y xilol. 2 cambios. 2 minutos cada uno.

9.- Montar con bálsamo de Canadá o un medio resinoso.

VI.- RESULTADOS: VI.- RESULTADOS:

Hongos……………………………………Rojo a púrpuraHongos……………………………………Rojo a púrpura

Núcleos…………………………………..AzulNúcleos…………………………………..Azul

Glucógeno. mucina y algunas Glucógeno. mucina y algunas

Membranas básales………….....Rojo a púrpuraMembranas básales………….....Rojo a púrpura

Hongos color rojo a púrpura, núcleos azules

METODO DE COLORACION DE METODO DE COLORACION DE GROCOTTGROCOTT

I.- OBJETIVO:I.- OBJETIVO: DEMOSTRARDEMOSTRAR la presencia la presencia de de HONGOSHONGOS en en CORTES DE TEJIDOS CORTES DE TEJIDOS HISTOLOGICOS.HISTOLOGICOS.

II.- II.- FIJACIÓN: FIJACIÓN: Formol al 10%.Formol al 10%.

III.-III.-MICROTOMÍAMICROTOMÍA: : Cortar secciones de Cortar secciones de parafina de 5 micrómetros de grosor.parafina de 5 micrómetros de grosor.

IV.-SOLUCIONES:IV.-SOLUCIONES:

1.- SOLUCION DE ACIDO CROMICO AL 5%1.- SOLUCION DE ACIDO CROMICO AL 5%Ácido crómico………………………………5,0 g Ácido crómico………………………………5,0 g Agua destilada…………………………100,0 mlAgua destilada…………………………100,0 ml

2.-SOLUCION DE NITRATO DE PLATA AL 5%2.-SOLUCION DE NITRATO DE PLATA AL 5%Nitrato de plata…….…………………….5,0 gNitrato de plata…….…………………….5,0 gAgua destilada c.s.p……………….100,0 mlAgua destilada c.s.p……………….100,0 ml

3.-SOLUCION DE METENAMINE AL 3% Hexametilenotetramino………..….3,0 g

Agua destilada…..………………..100,0 ml

4.- SOLUCION DE BORAX AL 5%4.- SOLUCION DE BORAX AL 5% Bórax………………………………..5,0 g Bórax………………………………..5,0 g

Agua destilada……..………100,0 mlAgua destilada……..………100,0 ml

5.- SOLUCION STOCK DE NITRATO DE 5.- SOLUCION STOCK DE NITRATO DE PLATA-METANAMINE:PLATA-METANAMINE:

Solución de nitrato de plata al 5%...5,0 ml Solución de nitrato de plata al 5%...5,0 ml Solución de metenamine al Solución de metenamine al 3%.....100,0 ml3%.....100,0 ml

Se forma un precipitado blanco, pero Se forma un precipitado blanco, pero inmediatamente agitar para disolverlo.inmediatamente agitar para disolverlo.

6.-SOLUCION DE TRABAJO DE NITARTO DE PLATAMETENAMINE:

Solución de bórax al 5%..............2,0 ml Agua destilada……………………………..25,0 ml Combinar y añadir Solución stock de nitrato

de platametanamine………….……25,0 ml

7.- SOLUCION DE DISULFITO DE SODIO AL 1% Disulfito de sodio……..……………………1,0 g

Agua destilada……………………………100,0 mL

8.-CLORURO DE ORO AL 0,1% Solución de cloruro de oro 1 %.....10,0 mL

Agua destilada………………….…..………90,0 mlAgua destilada………………….…..………90,0 ml

Esta solución puede ser usada repetidamente.Esta solución puede ser usada repetidamente.

9.- SOLUCIO DE TIOSULFATO DE SODIO AL 2%9.- SOLUCIO DE TIOSULFATO DE SODIO AL 2%Tiosulfato de sodio……………………… 2,0 gTiosulfato de sodio……………………… 2,0 g

Agua destilada...........................100,0 mlAgua destilada...........................100,0 ml

10.- SOLUCION STOCK DE LIGHT GREEN SF 10.- SOLUCION STOCK DE LIGHT GREEN SF YELLOWISH:YELLOWISH:

Light Green sf yellowish (C.l. 42095)…Light Green sf yellowish (C.l. 42095)… 0,2 g0,2 g

Agua destilada………………………….……….100,0 mlAgua destilada………………………….……….100,0 ml

Ácido acético glacial……………………………..0,2 mlÁcido acético glacial……………………………..0,2 ml

11.- SOLUCION DE TRABAJO DE LIGHT GREEN SF 11.- SOLUCION DE TRABAJO DE LIGHT GREEN SF YELLOWISHYELLOWISHSolución stock de light green sf yellowish.10,0 mlSolución stock de light green sf yellowish.10,0 ml

Agua destilada…………………………………………Agua destilada…………………………………………50,0 ml50,0 ml

V.- PROCEDIMIENTO:V.- PROCEDIMIENTO:

1. Desparafinar e hidratar hasta agua 1. Desparafinar e hidratar hasta agua destilada. Las láminas previamente destilada. Las láminas previamente coloreadas con otros colorantes coloreadas con otros colorantes pueden ser usados removiendo el pueden ser usados removiendo el cubreobjetos en xilol y corriendo a cubreobjetos en xilol y corriendo a través de alcoholes hasta agua.través de alcoholes hasta agua.

2. Oxidar en 2. Oxidar en SOLUCION DE ACIDO SOLUCION DE ACIDO CROMICO AL 5% CROMICO AL 5% por una hora.por una hora.

3. Lavar en agua corriente por pocos 3. Lavar en agua corriente por pocos segundos.segundos.

4. 4. Enjuagar en Enjuagar en DISULFITO DE SODIO AL DISULFITO DE SODIO AL 1% 1% por 1 minuto para remover por 1 minuto para remover cualquier residuo de ácido crómico. cualquier residuo de ácido crómico. Lavar en agua corriente por 5 a 10 Lavar en agua corriente por 5 a 10 minutos.minutos.

5. Lavar con 3 ó 4 cambios de agua 5. Lavar con 3 ó 4 cambios de agua destilada.destilada.

6. Colocar en SOLUCION DE TRABAJO DE NITRATO DE PLATA-METENAMINE en la estufa a 58 a 60 °C por 30 a 60 minutos hasta que los tejidos se tornen de color marrón amarillento. Usar pinzas cubiertas con parafina para poder remover las láminas de esta solución. Lavar en agua destilada y chequear bajo el microscopio. Los hongos pueden estar marrón oscuro en este estado.

7. Enjuagar en seis cambios de agua 7. Enjuagar en seis cambios de agua destilada.destilada.

8. Dar tono en 8. Dar tono en SOLUCION DE CLORURO DE SOLUCION DE CLORURO DE ORO 0,1% ORO 0,1% por 2 a 5 minutos.por 2 a 5 minutos.

9. Enjuagar en agua destilada.9. Enjuagar en agua destilada.10. Remover la plata no reducida con 10. Remover la plata no reducida con

SOLUCION DE TIOSULFATO DE SODIO SOLUCION DE TIOSULFATO DE SODIO AL AL 2%2% por 2 a 5 minutos. Lavar en agua por 2 a 5 minutos. Lavar en agua corriente.corriente.

11. Contrastar con 11. Contrastar con SOLUCION DE TRABAJO SOLUCION DE TRABAJO DE LIGHT GREEN SF YELLOWISH por 30 DE LIGHT GREEN SF YELLOWISH por 30 a 45 segundos.a 45 segundos.

12. Lavar en agua corriente. Deshidratar, 12. Lavar en agua corriente. Deshidratar, aclarar y montar en bálsamo de aclarar y montar en bálsamo de Canadá.Canadá.

VI.- RESULTADOS: VI.- RESULTADOS: Los hongos………………. Negro la Los hongos………………. Negro la

mucina………………………... gris oscuro mucina………………………... gris oscuro y el y el fondo……………………………… verde pálido.fondo……………………………… verde pálido.

NOMBRE DESCRIPCIÓN COLORACIÓN

Actinomices sp Filamentos ramificados,delicados, <1 micrón de

diámetro

GrocottGram-positivoGiemsa-PAS

Nocardia asteroides Organismos largos, filamentosos, 0.5 a 0.1 micrón de diámetro, que se ramifican en ángulo recto

GrocottGram-positivoGiemsa

HistoplasmaCapsulatum

Pequeños, formas ovoides esferuladas, de 2-4 micrones de diámetro

GrocottGridley Fungus

Blastomycetes Esporas redondas y ovaladas con paredes gruesas.

GrocottGridley fungus

Criptococcus neoformans

Esporas con paredes delgadas de 2 a 20 micrones de diámetro

MucicarminGram positivoAzul de Alcian,Grocott, Gridley Fungus Hierro coloidal

HONGOS – TECNICA DE COLORACIÓN

HIFAS DE HONGOS

COLORACION HISTOQUIMICA - ESPECIALESCOLORACION HISTOQUIMICA - ESPECIALES

METODO DE METODO DE COLORACION COLORACION

OBJETIVO O OBJETIVO O PROPOSITOPROPOSITO

RESULTADOS RESULTADOS

PAS PAS Hongos Hongos Hongos = Rojo a Hongos = Rojo a purpura purpura

Núcleos = AzulesNúcleos = Azules

GROCOTTGROCOTT Hongos Hongos Hongos = NegroHongos = Negro

Mucina = Gris oscuroMucina = Gris oscuro

Fondo = Verde pálidoFondo = Verde pálido

GRIDLEYGRIDLEY Hongos (Micelio y Hongos (Micelio y conidia)conidia)

Micelio = Purpura Micelio = Purpura intensointenso

Conidia = Rojo intenso Conidia = Rojo intenso a purpuraa purpura

Fondo = AmarilloFondo = Amarillo

FITEFITE Nocardia (Hongos)Nocardia (Hongos) Nocardia = Rojo Nocardia = Rojo purpurapurpura

Fondo = Azul pálidoFondo = Azul pálido

COLORACION ESPECIALESCOLORACION ESPECIALES

METODO DE METODO DE COLORACION COLORACION

OBJETIVO O OBJETIVO O PROPOSITOPROPOSITO

RESULTADOS RESULTADOS

GIEMSAGIEMSA Hongos Hongos Hongos = AzulHongos = Azul

Citoplasma = RosaCitoplasma = Rosa

Núcleo = Azul Núcleo = Azul

GRAMGRAM Hongos (Nocardia, Hongos (Nocardia, actinomicetes)actinomicetes)

Hongos = AzulHongos = Azul

H-E H-E Hongos (micelio)Hongos (micelio) Hongos = Rojo Hongos = Rojo purpurapurpura

WEIGERT Hongos (micelio)Hongos (micelio) Hongos = Negro o Hongos = Negro o marrón marrón

AZUL DE AZUL DE TOLUIDINATOLUIDINA

Hongos (micelioHongos (micelio Hongos = Azul Hongos = Azul

Paciente A.A. Corte histopatológico de tejido cerebral (Hematoxilina eosina, 250 X). Se aprecia reblandecimiento cerebral incipiente, zonas

hemorrágicas y abundantes MICELIOS ANCHOS, NO TABICADOS, ramificados en ángulos rectos y agudos, típicos de hongos del género

Mucor.

 Paciente A.A. Corte histopatológico de la carótida interna (coloración de Weigert para fibras elásticas y de Grocott para hongos, 250 X). En color negro, puede identificarse la capa elástica interna y en gris oscuro se observan abundantes MICELIOS del tipo Mucor. En el campo superior

izquierdo, se aprecia parte del trombo con algunos micelios

Coloración con azul de Toluidina. Se aprecian racimos de estructuras fúngicas de forma redonda (esporoblastos) en estroma

medio y profundo.