1a- microorganismos

8/17/2019 1a- Microorganismos

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Carrillo L. 2005. Microbiología Agrícola

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1. Microorganismos Los organismos más sencillos tienenuna sola célula y como se miden enmicrómetros (µm) se los conoce comomicrobios o microorganismos. Laorganización unicelular se observa enprotozoos, levaduras, algunas algas y lamayoría de las bacterias. Un tipo más

complejo de organización biológica es lade los microorganismos pluricelulares.Aunque surgen en general a partir deuna sola célula, en estado maduroconstan de varias célulaspermanentemente unidas de un modocaracterístico, lo cual le confiere unaforma típica. Los ambientes capaces de albergar a losmicroorganismos reflejan el amplioespectro de evolución de los mismos.Viven en mares y agua dulce, enpresencia y en ausencia de aire, a temperaturas comprendidas entre los puntos decongelación y ebullición del agua. Algunos han desarrollado ciclos de vida queincluyen una fase de latencia en respuesta a la falta de nutrientes. Losmicroorganismos se hallan capacitados para acometer una extensa gama dereacciones metabólicas y adaptarse a diferentes ambientes (1). Por su poco pesopueden ser transportados por las corrientes de aire y estar en todas partes, pero lascaracterísticas del ambiente determinan cuáles especies pueden multiplicarse. En el suelo un conjunto de microorganismos compiten entre sí para obtenernutrientes y energía. Al mismo tiempo, los productos de su metabolismo alteran la

composición química del hábitat. Más aún, los propios microorganismosevolucionan en respuesta a la presión del ambiente (3). En un suelo agrícola estánpresentes alrededor de 1010 microbios por g de suelo y constituyen una biomasa deaproximadamente 1500 kg por Ha, lo cual corresponde a un cordero por cien m2.Un gramo de suelo fértil puede contener 5 m de micelio fúngico, 108 célulasbacterianas, 106 esporos de actinomicetos (4).

En los animales monogástricos la población bacteriana alcanza su máximo nivelen el intestino grueso y tiene impacto metabólico sobre el hospedador. En elrumiante la acción de los microorganismos que degradan la celulosa, contenidos enla panza o rumen, permiten al animal alimentarse de forrajes (5).

Figura 1.1.Tamañorelativo de algunosmicroorganismos (2)




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Numerosas especies bacterianas, algunas veces junto a protozoos y algasmicroscópicas, proliferan en las áreas expuestas a la humedad. El 99% de toda laactividad microbiana en un ecosistema abierto ocurre sobre las superficies (6).

Las bacterias unicelulares y los actinomicetos filamentosos son procarióticos. Sus

células carecen de membrana nuclear y mitocondrias, además poseen un solocromosoma que se encuentra libre en el citoplasma y una pared celular rígida. Lascélulas de los procariotas son, en general, mucho menores que las de los eucariotas;unas 10 veces menor en medidas lineales y por lo tanto unas 1000 veces menor envolumen (1).

Los mohos y levaduras forman parte de los hongos. Las levaduras sonunicelulares en condiciones normales mientras que los mohos crecen como unsistema ramificado de filamentos. Se trata de organismos eucarióticos cuyas células,al igual que las de protozoos y algas, tienen un núcleo cerrado por una doblemembrana porosa y llevan como mínimo dos cromosomas, a más de veinte en

algunas especies (7). Los protozoos del suelo se alimentan de bacterias y presentanmovimientos ligados a la fagocitosis que es la ingestión de partículas medianteinvaginación de la membrana citoplasmática y formación de vesículas intracelulares(4).

Las bacterias son organismos pequeños, que miden uno o varios micrómetros. Las

levaduras, en cambio, miden entre 6 y 12 µm. Los mohos son pluricelulares yaunque sus células aisladas miden a lo sumo 25 µm de largo, su conjunto sedistingue a simple vista. Los hongos con reproducción sexual pueden tener cuerposfructíferos de gran tamaño como los champiñones y otras setas, formados pormillones de células (7).

1.1. Dominios y reinos

Las dificultades lógicas para ubicar a los microorganismos en los vegetales o losanimales desaparecieron al admitir un tercer reino, el de los protistas. Este reino

incluía a todos aquellos organismos que se diferencian de las plantas y los animales

Figura 1.2. Esquema de células pro y eucariótica(8)




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por su falta de especialización morfológica, siendo la mayoría unicelulares. Luegolos protistas fueron divididos en dos grupos claramente definidos sobre la base dela estructura celular. Los eucarióticos eran protistas superiores. Este grupocomprendía a los protozoos, hongos y algas. Los procarióticos eran protistas

inferiores e incluían a las diversas bacterias y cianobacterias (2). Otra clasificación delos seres vivos estaba fundada en el reconocimiento de cinco reinos (9).

Los estudios ultraestructurales, bioquímicos y de la biología molecular hicieroninsostenible la permanencia de estos reinos, y los procariotas fueron ubicados en losdominios Bacteria y Archaea mientras que el dominio Eucarya congrega a losmicroorganismos en tres reinos: uno comprende a los protozoos con y sinmitocondrias junto a los mixomicetos, otro abarca las algas y los oomicetos,mientras que el tercero contiene a los hongos (10). La importancia de esto últimoradica en que los microbios estudiados por los fitopatólogos han sido distribuidosentre los reinos Chromista, Fungi y Protozoa, aunque se ha sugerido transferir los

oomicetos que están en Chromista a un nuevo reino llamado Straminipila (11).Cuadro 1.1. Dominios y reinos(10, 11)

Tipo celular Dominio Reino Ejemplos Animalia esponjas, corales, gusanos, moluscos,

insectos, vertebradosPlantae musgos, hepáticas, coníferas,

plantas con floresChromista oomicetos, algasProtozoa mixomicetos, protozoos

eucariótico Eucarya

Fungi levaduras, mohos, setas, bejines

Bacteria bacterias, actinomicetos,mixobacterias, cianobacteriasprocariótico

Archea arquibacterias

El dominio Arquea abarca dos divisiones y congrega a especies metanógenas,halófilas, termoacidófilas e hipertermófilas. El dominio Bacteria comprende a unagran variedad de organismos procarióticos. La división Proteobacterias contieneaquellos que necesitan de fuentes nutritivas orgánicas, por ejemplo Azotobacter yPseudomonas en el suelo y Escherichia coli en el intestino , así como especies queposeen pigmentos para la fotosíntesis (Chromatium), otras que dependen solamente

de compuestos inorgánicos como Thiobacillus y Desulfovibrio, y las mixobacterias. Ladivisión Gram-positivas abarca especies con una pared similar, entre ellas seencuentran las bacterias lácticas de los productos lecheros y los vegetales endescomposición (Streptococcus, Lactobacillus), las formadoras de endosporos comoBacillus y Clostridium, y los actinomicetos. La división Cianobacterias reune a losmicrobios con fotosíntesis semejante a la de las plantas, mientras que las divisionesde Bacterias Verdes contienen especies fototróficas con bacterioclorofila quedependen o no de los sulfuros. Además hay otras 11 divisiones menores (1). Los virus no fueron considerados pues son partículas acelulares, diferentes detodos los otros microorganismos, que pueden proliferar y replicarse solamentedentro de células vivas. Por otra parte, parece que las células eucarióticas surgieron




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de antepasados procarióticos, pues hay pruebas del origen bacteriano demitocondrias y cloroplastos (9).

1.2. Organismos eucarióticos

Una célula eucariótica contiene orgánulos definidos por membranas, que cumplenfunciones esenciales tales como la producción de energía en las mitocondrias y loshidrogenosomas de los hongos y protozoos anaeróbicos, la síntesis de proteínas enlos ribosomas adheridos al retículo endoplásmico, la síntesis y el almacenamientode glicoproteínas en el aparato de Golgi, la fotosíntesis en los cloroplastos de lasalgas (1). Los cromosomas eucarióticos están asociados a una clase de proteínas básicasllamadas histonas, y experimentan movimientos en el momento de la divisióncelular. Como en los procariotas, la información contenida en el ADN estransportada por los ARN mensajeros del núcleo hacia el citoplasma, donde estainformación es descodificada y da lugar a la síntesis de las proteínas en losribosomas (12).

Toda proteína destinada a la ruta secretora tiene una secuencia terminal (señalpéptido) que es distinguida por una partícula reconocedora, la que forma uncomplejo con el ribosoma en la membrana del retículo endoplásmico. Apenasformada la proteína comienza su traslado y llega al lumen del retículoendoplásmico donde una endoproteasa específica quita la señal, entonces tienelugar el ensamblaje (plegado y formación de puentes disulfuro) y la N-glicosilación.Después deja el retículo endoplásmico en una vesícula y es transportada al aparatode Golgi donde ocurren ulteriores modificaciones. De allí salen las proteínas otra

vez en vesículas para sus diversos destinos, hacia la membrana citoplasmática(secreción) o los lisosomas (digestión de moléculas) (13).

La mayor parte de la energía obtenida por la oxidación de glucosa y ácidos grasoses transformada en energía química utilizable por la célula mediante la síntesis delATP en la cadena respiratoria. Estas reacciones ocurren en las mitocondrias. Tienendos membranas y la interna está invaginada en crestas. Los pliegues contienen loscomponentes de la cadena de transporte de electrones y la ATP sintasa. También unpequeño número de proteínas es sintetizado en los ribosomas de la matrizmitocondrial, la que contiene también su propio ADN pues estos orgánulos estándotados de la capacidad de multiplicarse (14).

Todas las estructuras se desplazan por el citoplasma a lo largo de pequeños tuboshuecos, los microtúbulos, que son polímeros de tubulina nucleados por elcentrosoma (15). La organización de los microtúbulos en flagelos y cilias, permite aalgunos eucariotas unicelulares nadar en el medio en que se encuentra (16).

1.2.1. Protozoos Los protozoos constituyen un grupo muy heterogéneo de microorganismoseucarióticos, unicelulares y móviles (con algunas excepciones). El ciclo de vidacomprende dos fases: una de actividad, durante la cual se desplazan, nutren yreproducen; otra de reposo o enquistamiento. Se los agrupan en: rizópodos que sedesplazan por pseudópodos (amebas y testáceos o foraminíferos), flagelados con




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uno o más flagelos, ciliados dotados de cilias y dos núcleos (macro y micronúcleo),y esporozoos parásitos (1).

En su mayoría son organismos heterotróficos aerobios osmótrofos o fagótrofosque se alimentan de bacterias, levaduras, algas u otros protozoos. Carecen de pared

celular y la membrana citoplasmática contiene esteroides. En los flagelados yciliados, el límite con el entorno es una membrana elástica y gruesa llamadapelícula, y estos protozoos tienen estructuras especializadas para captar el alimento.Por otra parte las amebas, con sólo la membrana citoplasmática o plasmalema,encierran las partículas alimenticias con los pseudópodos y en su citoplasma sedistingue una zona externa (ectoplasma) homogénea, contráctil y con pocosorgánulos, y una zona interna (endoplasma) más fluída y heterogénea que contienea la mayoría de los orgánulos. Unas placas de silicatos diversos o carbonato decalcio recubren a las amebas testáceas, adheridos a la célula en algunos puntos. Las vacuolas contráctiles o de regulación hídrica poseen movimientos de

turgencia y expulsión y son visibles en algunas especies. Las cilias y los flagelosnacen de un gránulo o cuerpo basal inmerso en el citoplasma, y están constituídospor fibrillas longitudinales dispuestas en pares, uno central y nueve periféricos. Enalgunos ciliados hay hileras de cilias sobre toda el área celular mientras que en otrosque viven adheridos a superficies sólidas sólo presentan cilias alrededor de ladepresión bucal (17).

Los protozoos anaeróbicos parásitos, comoGiardia, carecen de mitocondrias y se lossuele llamar arqueozoos. Los ciliadosanaeróbicos del rumen y el intestino de lastermitas son fermentadores y poseen

hidrogenosomas (19). Los protozoos se encuentran en ambienteshúmedos, muchos viven en el suelo y elagua, algunos forman parte de la microbiotanormal de los animales y unos pocos sonparásitos. Participan en el equilibriobiológico del suelo pues consumen grandescantidades de bacterias, una ameba ingierealrededor de 40.000 bacterias entre cadadivisión celular. La población de flagelados y

amebas en el suelo es del orden de 103 - 105 /g, la de ciliados 103/g y la de rizópodostestáceos 103 - 104/g (4).

Preparado en fresco Para apreciar las células eucarióticas en agua estancada osuspensión de suelo, se coloca una gota entre porta ycubreobjetos y se observa primero con el objetivo 10x y luegocon el 40x (18).

Figura 1. . Protozoos (17)




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1.2.2. Mixomicetos Los mixomicetos son organismos eucarióticos mucosos que forman plasmodio yluego un cuerpo fructífero de colores destacados, sobre troncos y hojas endescomposición o postes viejos, y miden de 0,5 a 1 cm .

La asociación celular en los llamados hongos mucilaginosos está mediada por lainteracción entre proteínas unidas a carbohidratos de una célula y receptoresformados por oligosacáridos específicos de otra. De este modo, la diferenciación delos mixomicetos desde una formasomática (unicelular) hasta la formacohesiva (agregada) va acompañadade la aparición de lectinas yglicoproteínas específicas en lasuperficie celular (20).

Las esporas liberadas de los cuerpos

fructíferos germinan sobre unasuperficie húmeda y producenmixoflagelados que nadan o bienmixamebas. Éstos se alimentan de losnutrientes líquidos o por fagocitosisde bacterias, levaduras, esporasfúngicas, etc. Las células flageladaspierden luego su flagelo y entran enun estado ameboide. Estas células son mononucleadas y suelen conjugarse para darmixozigotos. Estas amebas diploides se fusionan para dar un plasmodio (estructuramultinucleada). Luego el plasmodio da origen al cuerpo fructífero o esporangio con

numerosos esporas haploides (21).

1.2.3. Algas Son organismos fototróficos eucarióticos, uni o pluricelulares. Muchas especiesexisten como células aisladas móviles, algunas forman agrupaciones de célulasidénticas inmóviles embebidas en una matriz gelatinosa (palmeladas), mientrasque en otras asociaciones hay diferentes clases decélulas especializadas. Las algas pluricelulares sonfilamentosas y suelen llegar a ser muy grandes y demorfología compleja.

Los cloroplastos contienen clorofila a y pigmentosaccesorios para llevar a cabo una fotosíntesisoxigénica, y por lo común tienen pirenoides queactúan como centros de formación de almidón. Loscolores de las algas dependen de los pigmentos queposeen, así las clorofíceas son verdes, las rodófitasrojas, las feófitas pardas y las xantofíceas verdeamarillentas. Los dinoflagelados tienen flagelos que emergen deun punto común de la célula y algunos poseenparedes celulares prominentes formadas por placas

que suelen tener celulosa. Las diatomeas son Figura 1.5. Algas(23)

Figura 1.4. Estructuras de mixomicetos(17)




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unicelulares, coloniales o filamentosas, se encuentran en una amplia variedad deformas y tienen paredes duras que contienen sílice. La tierra de diatomeas estáformada por estas cubiertas fósiles.

En la mayoría de los grupos de algas las células reproductoras son flageladas, pero

en algunos lo son solamente las gametas masculinas y en unos pocos ambasgametas son inmóviles. En la reproducción asexual la célula madre sufre una fisiónlongitudinal y las células hijas se alejan, pero en las algas coloniales las nuevascélulas siguen dentro de la matriz. Las algas pluricelulares suelen multiplicarse porformación de zoosporas o por división transversal de las células de los filamentos,alargándose éstos (22). Las algas del suelo viven en la proximidad inmediata a la superficie o sobre lamisma. Predominan, las diatomeas, clorofíceas y xantofíceas ubicuas. La humedadóptima es del 40 al 60% de la capacidad de retención del agua por el suelo. Las algaslibres o liquenizadas constituyen el estado inicial de la vegetación en rocas y suelos

minerales infértiles (4). Por otra parte, las diatomeas y los dinoflageladosconstituyen los principales grupos del fitoplancton marino. Las algas son utilizadas como alimentos en algunas partes del mundo y en generalcontienen cantidades apreciables de vitaminas. Algunas algas producen toxinasextracelulares o las liberan por descomposición bacteriana de las “floraciones” dealgas en el mar. Los dinoflagelados Gymnodinium y Gonyaulax producenneurotoxinas que son concentradas dentro de los moluscos que se alimentan porfiltración (almejas, mejillones, ostras) y producen un envenenamiento paralizantecuando son ingeridos (23). Las algas rojas proporcionan la carragina y el agar, y las algas pardas losalginatos. Estos polisacáridos son utilizados como agentes espesantes y gelificantes.

El agar es el agente gelificante de elección para los medios de cultivomicrobiológicos, pues lo hidrolizan muy pocos organismos (1).

1.2.4. Hongos Los hongos secaracterizan por tenernúcleo verdadero,carecer de pigmentosfotosintéticos y poseerun micelio. La paredcelular de la mayoríade los grupos estáconstituida por quitina,glucanos ymanoproteínas, en loszigomicetos por quitosano, quitina y ácido poliglucurónico y en los oomicetos porcelulosa y otros glucanos (21). La pared celular del micelio de los hongosfilamentosos, o mohos, semeja un extenso sistema tubular por el que avanzaprotegido el citoplasma para su dispersión y búsqueda de nutrientes (7). Losfilamentos que constituyen el micelio reciben el nombre de hifas. Las hifas puedenestar separadas en secciones generalmente multinucleadas, por medio de septos

perforados o bien carecer de ellos.

Figura 1.6. Rhizopu, un moho con esporangios (24)




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Observación de los hongos Suspender en agua, líquido de montar, lactofenol o azul de algodón al hacer el preparado ycon ayuda de dos agujas separar los filamentos, colocar un cubreobjetos. Lactofenol: disolver 20 g de fenol en 20 mL de agua, agregar 20 mL de ácido láctico y 40 mL

de glicerol. Azul de algodón: disolver 0,1 g de colorante en 100 mL de ácido láctico, o de lactofenol. Líquido de montar: mezclar 50 mL de acetato de potasio al 2%, con 20 mL de glicerina y 30mL de etanol 96º (11).

En condiciones naturales, los mohos se reproducen asexualmente en la mayoría delos casos y las estructuras sexuales sólo aparecen cuando las circunstancias sonfavorables. Los hongos asexuales o anamorfos, generan varias clases de esporas pormitosis del núcleo celular (mitosporas), que tienen diversa forma y son mono opluricelulares (21).

La morfología de las estructuras que contienen las esporas es muy variable. El

color de la mayoría de los mohos se debe a sus esporas asexuales. Éstas sedesarrollan en el extremo superior de las estructuras especializadas que seextienden en el aire a partir del micelio somático, conocidas como esporóforos (7).Las esporas pueden estar encerradas en un esporangio o ser externas (conidios), y almadurar son esparcidas por el viento o transportadas por los insectos.

Medida de los microorganismos Se usa un ocularautoenfocable con una escalaarbitraria dividida en cienpequeñas partes iguales, a

veces numeradas, la que debecalibrarse con la escalagrabada en un portaobjetosllamado micrométrico quetiene 1 mm de largo y ciendivisiones de diezmicrómetros cada una. Enfocar al portaobjetos ymover éste de modo que suescala quede paralela a la delocular. Observar cual número delas pequeñas divisiones de 10µm grabadas en elportaobjetos coincide con unnúmero entero de lascontenidas en el ocular.Calcular el valor enmicrómetros correspondientea una división pequeña de la

escala del ocular mediante la regla de tres simple. Calibrar la escala del ocular para cada aumento del microscopio. Tener en cuenta que las rayasdel ocular siempre tendrán el mismo espesor mientras que las del portaobjetos irán

engrosándose al cambiar los objetivos (25).




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Los mohos suelen reproducirse también a través de las esporas sexuales(teleomorfos), generadas por meiosis del núcleo diploide (meiosporas). En lameiosis, el número de cromosomas se divide por la mitad y las esporas contienensólo un cromosoma de cada par homólogo. La condición diploide se restablece

cuando dos estructuras haploides se unen, completando el ciclo vital. Los mohos alos que no se les conoce ciclo sexual, se consideran hongos imperfectos.

Los ascomicetos producen sus esporas sexuales dentro ascos, generalmentecontenidos en un cuerpo fructífero complejo llamado ascoma. Algunos ascomasmacroscópicos tienen los ascos en la superficie de estructuras con forma de copa(Peziza) o dentro de cuerpos cerrados hipógeos (Tuber ). Los zigomicetos ( Mucor )producen zigosporas a veces visibles a ojo desnudo mientras que los oomicetos(Phytophthora) forman oosporas.

Los basidiomicetos desarrollan sus esporas sexuales en el exterior de los basidiosque se hallan en un cuerpo fructífero, comúnmente macroscópico, denominado

basidioma. Las esporas se forman bajo el sombrero de las setas, sobre laminillas( Agaricus) o poros (Suillus), en el reverso de los hongos en estante (Trametes), odentro de los bejines(Lycoperdon). Este grupotambién comprende a loscarbones y las royas,organismos de interésagronómico por serparásitos vegetales. Algunos macromicetosforman asociaciones

simbióticas con árboles,por ejemplo Boletus yTuber, y otros crecen sobrelos troncosdescomponiendo lamadera, por ejemplo Coriolus y Xylaria (21).

La mayoría de las especies de los hongos unicelulares conocidos como levaduras,se han clasificado desde el punto de vista de la reproducción. En la multiplicaciónasexual, generalmente una célula madre da lugar a diversas células hijas por laformación repetida de yemas en la superficie, pero en unas pocas levaduras ocurre

por escisión celular luego de la duplicación del núcleo (26). Los ascomicetos incluyen a las levaduras cuya célula diploide sufre meiosis yforma las ascosporas haploides dentro del asco, por ejemplo Saccharomyces cerevisiaeempleada para la fabricación del pan y la fermentación alcohólica. Un númeroreducido de levaduras se encuentran entre los basidiomicetos. Las levaduras que sereproducen sólo de forma asexual se ubican entre los hongos imperfectos, comoCandida tropicalis (7).

1.2.5. Líquenes Un líquen está constituído por un hongo (el micobionte) junto a una o más algasy/o cianobacterias (el fotobionte), viviendo en una relación simbiótica como un

cuerpo estable. Las especies costrosas están firmemente adheridas a las rocas o

Figura 1.7. Esquema de una levadura una seta(11, 24)




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troncos, los líquenes foliosos tiene aspecto de hojas adosadas laxamente al sustrato,mientras que los fructicosos están unidos por un solo punto a la superficie de lostroncos y tienen forma diversa. Los líquenes se pueden dispersar por varias vías y los fragmentos secos son

llevados por el viento. Algunas especiesliberan pequeños acúmulos de algas ymicelio fúngico, conocidos como soredios.Otras producen líquenes en miniaturallamados isidios, que se desprenden ydispersan con facilidad. La mayoría de lasespecies poseen peritecios o apoteciosdesde los cuales se liberan las ascosporasdel hongo (21). Muchos líquenes son sensibles a la

polución urbana y fabril, y sirven paraindicar el grado de contaminaciónambiental (19).

1.3. Microorganismos procarióticos

La célula procariótica posee una cubierta celular muy diferente a la de loseucariotas y tiene solamente dos sistemas internos principales: una moléculacircular de ADN con cadena helicoidal doble y un citoplasma no diferenciadodonde se halla inmerso ese ADN. La longitud del anillo de ADN que codifica todala información genética de la célula apenas es superior a un milímetro (7). El

citoplasma contiene gran número de ribosomas que cumplen la función de enlazarlos aminoácidos formando proteínas. Los ribosomas procarióticos son máspequeños que los eucarióticos (1).

Un gen, o unidad de información genética, está representado por una secuenciaespecífica de bases en un segmento contínuo del ADN. El conjunto de genes sedenomina genoma. La doble hélice formada por las dos cadenas de nucléotidos

Figura 1.9. Paredes celulares de bacterias (28, 29)

Figura 1.8. Tipos de líquenes (27)




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consta de varios millones de pares de bases y la información total de la bacteria sedespliega en un conjunto de varios miles de genes. En las bacterias, la informacióngenética codificada en un gen es transferida a un ARN mensajero (ARN-m) durantela transcripción. Los aminoácidos son reunidos en una cadena polipeptídica, según

la secuencia determinada por el ARN-m, en un proceso de traducción que implicala participación de los ARN que transfieren los aminoácidos (ARN-t), losribosomas, varias enzimas y ATP (trifosfato de adenosina, con alta energía). En losprocariotas y eucariotas la clave genética y la bioquímica esencial de latranscripción y la traducción son las mismas, pero no así las señales de control (12).

La flexibilidad metabólica de una bacteria es enorme. Debido al pequeño tamaño,una bacteria esférica tiene espacio para no más que cien mil moléculas de proteínas.Las enzimas no están corrientemente dentro de la célula, sino que su síntesis esinducida por la presencia del sustrato en el ambiente (1).

1.3.1. Bacterias

Las paredes celulares de muchos de los procariotas poseen un componentequímico común: el péptidoglucano o mureína, que es el responsable de la forma yconsistencia de la pared. El péptidoglucano es un extenso polímero compuesto porβ−subunidades alternas de N-acetilglucosamina y ácido N-acetilmurámico. Estaúltima molécula es similar a la N-acetilglucosamina, pero tiene una unidad de ácidoláctico unida al tercer átomo de carbono de la glucosa. El ácido láctico sirve comopunto de unión a una cadena lateral lineal constituída unos pocos aminoácidos D oL. Las moléculas de péptidoglucano que rodean la célula están entrelazadas entre símediante puentes formados por estos aminoácidos (1).

Aislamiento de microbios del polvo ambiental Vertir en una caja de Petri unos 15 mL de agar estándar estéril, previamente licuado en bañoda agua hirviente. Dejar gelificar y luego exponer la placa al aire dejando sedimentar el polvoambiental durante 30-60 minutos. Incubar a 27-30ºC. A los dos y siete días examinar lascolonias presentes. El agar estándar contiene: triptona 5 g, extracto de levadura 5 g, glucosa 1 g,fosfato dipotásico 2 g, agar 15 g, agua 1 L (30).

La cantidad de péptidoglucano de la pared de las células bacterianas varía desdeel 90% en la pared de algunas bacterias Gram-positivas hasta menos del 10% en lasbacterias Gram-negativas. El término Gram-positivo hace referencia a la capacidadpara retener el colorante violeta cuando se agrega alcohol, al hacer la tinción deGram. Las bacterias Gram-negativas no retienen a este colorante (7). La penicilina yotros antibióticos β-lactámicos que interfieren con la biosíntesis de la pared celularllevan a la producción de protoplastos carentes de pared bajo condiciones osmóticasapropiadas. El término esferoplasto se suele usar para los casos en que persistenrestos de pared (1).

La pared celular de las bacterias Gram-positivas contiene pequeñas cantidades deproteínas y polisacáridos, a menudo también ácidos teicoicos (polímeros de ribitol-fosfato o glicerol-fosfato unidos mediante enlaces fosfodiéster) o de ácidosteicourónicos. Estos ácidos están unidos al péptido-glucano por los fosfatos. En lasproteobacterias, Gram-negativas, la capa interna de la pared celular es pobre enpéptidoglucano y la capa externa rica en lipoproteínas y lipopolisacáridos, los

cuales constituyen más del 80% del peso seco de la pared. El espacio entre la




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membrana externa y la capa de péptidoglucano, llamado periplásmico, contiene ungran número de proteínas enzimáticas.

Tinción de Gram Tomar con un asa una porción de cultivo bacteriano, depositarlo sobre una gota de agua yhacer un extendido sobre un portaobjetos. Dejar secar y fijar por calor. Ponerlo sobre un

soporte y cubrirlo con una solución de violeta cristal.Luego de 1 minuto agregar solución de iodo.Después de 1 minuto, lavar con agua. Decolorar conalcohol 96°. Lavar con agua y cubrir con unasolución de safranina durante 1 minuto. Lavar conagua y secar. Colocar una gota de aceite para inmersión. Llevar elportaobjetos a la platina de un microscopio. Mirar através del objetivo de bajo aumento (10x) y una vezenfocado el objeto mover el revólver para colocar el

objetivo de inmersión en aceite (100x). Levantar elcondensador acercándolo a la platina. Ajustar elenfoque mediante el tornillo micrométrico. Regular lacantidad de luz por medio del diafragma. Las bacterias Gram-negativas se tiñen de rojoanaranjado y las Gram-positivas adquieren color violeta. Cristal violeta: disolver 1 g de colorante en 20 mLde etanol 96° y añadir 80 mL de oxalato de amonio al1%. Safranina: disolver 0,25 g de colorante en 10 mL de

etanol 96° y agregar 90 ml de agua. Solución de yodo: mezclar en un mortero 1 g deiodo y 2 g de ioduro de potasio, disolver con 100 mL

de agua(31).

La capa de péptido-glucano está rodeada por una membrana externa compuestade lipopolisacáridos y fosfolípidos con proteínas en túnel (porinas) que laatraviesan. El lipopolisacárido consiste en un disacárido de glucosamina cuyosgrupos alcohol están esterificados con fosfatos y ácidos grasos de 12, 14 ó 16carbonos (lípido A), unido a unpolisacárido externo (12).

Los micoplasmas son bacteriascarentes de pared celular yparecen protoplastos, pero sonmás resistentes a la lisis osmóticadebido a la naturaleza de sumembrana citoplasmática, la quetiene esteroles o lipoglucanos (1).

La membrana citoplasmáticabacteriana constituye solamente 8-15% del peso celular seco ycontiene alrededor del 70-90% delos lípidos celulares. Esta Figura 1.10. Membrana citoplasmática (2)




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membrana, de unos 5 nanómetros de grosor, consiste de una doble capa lipídica conlos extremos hidrofóbicos de los fosfolípidos en el interior y las cabezas hidrofílicasexpuestas sobre ambas superficies. También tiene incorporadas proteínas que laatraviesan o están inmersas parcialmente en ella. Otras proteínas que se hallan en la

superficie de la membrana son conocidas como proteínas periféricas (20). Las proteínas de la membrana intervienen en la entrada y salida de sustancias dela célula, y son específicas para grupos de moléculas estrechamente relacionadas.Las sustancias hidrofóbicas difunden fácilmente pero no los iones. La membrana se extiende y repliega hacia el interior del citoplasma formando lossitios donde se genera la energía respiratoria (mesosomas) y fotosintética (tilacoidesy cromatóforos) en las bacterias que posean tales actividades metabólicas. Otrasbacterias (por ejemplo Nitrobacter , Nitrosomonas, Nitrosococcus) tienen paquetes deláminas paralelas, algunas de las cuales están conectadas a la membranacitoplasmática (12).

Muchas bacterias están dotadas de flagelos que lespermiten moverse. Si los flagelos se encuentranconcentrados en uno o ambos extremos de la célula sedenominan polares; si están distribuídos por toda lasuperficie reciben el nombre de peritricos (7).

Los flagelos posibilitan la quimiotaxis, que es elmovimiento hacia la fuente de nutrientes o elalejamiento de un entorno químicamente hostil. Laproteína del flagelo, flagelina, está unida a un ganchoasociado a un cuerpo basal que causa el movimientogiratorio del mismo. La base del flagelo está anclada

en la membrana citoplasmática, asociada al péptidoglucano y en las Gram-negativas a la membranaexterna (1). Las bacterias sin flagelos carecen demovimiento, excepto aquéllas que se deslizan sobre elsustrato, por ejemplo Cytophaga.

Coloración de flagelos Dejar correr una gota del cultivo líquido de 12-18 horas, sobre un portaobjetos nuevo, limpio y tibio. Secar al aire. Mezclar en el momento de usar: 2 mL de alumbre de potasio al 12%, 1 mLde ácido tánico al 20%, 1 mL de agua, 1,5 mL de etanol 96° y 0,3 mL de fucsina básica al 6% enetanol 96°. Volcar de inmediato sobre el portaobjetos y dejar 10 minutos. Lavar con agua. Las

bacterias y los flagelos se tiñen de color rojo (25). Se puede inferir la motilidad de las bacterias al observar su desplazamiento rápido a través delcampo microscópico cuando se enfoca una gota de cultivo reciente, colocada entre porta ycubreobjetos(18).

La superficie bacteriana Gram-negativa también suele tener otras estructurasproteicas filamentosas, las fimbrias (pili I) que participan en la adhesión a diversassuperficies, por ejemplo las mucosas animales, y los pelos de conjugación (pili F)(32). A veces las bacterias acumulan capas de polisácaridos sobre la superficie exteriorcomo ocurre con Leuconostoc mesenteroides, organismo que convierte rápidamente a

una solución de azúcar de caña en una jalea de dextrano (1,6-α-glucano), o

Figura 1.11. Ubicación de losflagelos bacterianos (12)




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Acetobacter aceti variedad xylinum, el cual secreta celulosa formado una cubiertacoriácea que rodea a las células y da cohesión a la colonia (12). La cápsula es unacapa densa y bien definida de polisacáridos (Derxia gummosa) o polipéptidos(Bacillus anthracis), mientras que la capa mucosa es una masa difusa de polímero. La

cápsula no es esencial para la vida y no siempre está presente, en muchos casos elmaterial capsular puede ser separado en forma de limo, por agitación uhomogeinización. Otras bacterias, como Sphaerotilus natans, forman una vaina oenvoltura tubular de heteropolisacáridos que contiene una cadena de células (1).

Coloración negativa Sobre un portaobjetos se mezcla una gota del cultivo con tinta china, o nigrosina al 10%, y secoloca un cubreobjetos. La cápsula aparece como un halo claro alrededor de la célula(31).

Numerosas eubacterias y también arqueobacterias, poseen una envoltura exteriorproteica o capa S que suelen perder en las condiciones óptimas del laboratorio. Esta

capa favorece la adhesión al sustrato para permitir la acción de las exoenzimas enlas bacterias saprobias y la virulencia en las patógenas (33).

Aislamiento de bacterias esporuladas Calentar una suspensión de suelo por 10 minutos en un baño de agua a 80ºC. Flamear el asahasta que tenga color rojo brillante y dejar que se enfríe dentro de la zona de convección delmechero. Tomar una gota de la suspensión y extenderla sobre la superficie de una placa de agarestándar estéril haciendo las primeras estrías. Flamear el asa y hacer la segunda serie de estrias

con el asa vacia. Flamear otra vez el asa y hacer la tercera seriede estrías con el asa vacía. Incubar las cajas con la tapa hacia abajo a 25-30ºC durante 48 hs.Después de la incubación en la estufa, el crecimiento es confluente en los trazos iniciales y lascolonias están bien aisladas a lo largo de las últimas estrías(30).

Un pequeño grupo de eubacterias que se encuentran en el suelo (Bacillus,Clostridium, Sporosarcina) poseen endosporos. Son células cuyas moléculas puedenencontrarse en estado vítreo lo que les confiere la cualidad de permanecer latentes

por muchos años, y resultan altamente resistentes al calor y otros agentes físicos asícomo a productos quimiotóxicos que causanla muerte de las células somáticas. Puesto enel ambiente apropiado, el endosporo daorigen a una nueva bacteria (7).

Los endosporos contienen ácidodipicolínico, una substancia no hallada en laforma somática, en la proporción de 10-15%del peso seco del esporo. Son varias lascubiertas que rodean al citoplasma delendosporo: membrana citoplasmática, pared Figura 1.12. Formación de endosporo (12)

1a- microorganismos

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