Espectroscopía RMN: Un poco de historia

1924 Wolfang Pauli propuso las bases teóricas de RMN. Sugirió que ciertos núcleos atómicos tienen propiedades de spin y momento magnético

1924 W. Stern y O. Gerlach observaron el momento magnético nuclear.

1946 Bloch y Purcell realizaron el primer expto de RMN de protones con muestras de agua y parafina sólida.

1967 Richard Ernst propuso un método de transformada de Fourier que incrementó la sensibilidad y rla resolución del RMN.

1971 Jean Jeener propuso la el NMR 2D - COSY1975 Richard Ernst reportadon el primer espectro de RMN-2D

con 13C del hexano1986 Kurt Wuthrich reportaron la primer estructura de proteína

resuelta por RMN

2

1nm 10 102 103 104 105 106 107

(the wave) X-ray UV/VIS Infrared Microwave Radio Frequency

(the transition) electronic Vibration Rotation Nuclear

(spectrometer) X-ray UV/VIS Infrared/Raman NMR

Fluorescence

Espectroscopía RMN

Estructura de proteínas por NMR de alta resolución

• Se observan los protones (1H)

• Es diferente de la cristalografía de rayos X donde la estructura se determina midiendo la densidad electrónica de los átomos con más de un electrón(C, N, O).

• La proteína esta en solución

Estructura de proteínas por NMR de alta resolución

• Se observan los protones• Se asignan las resonancias de los protones a aminoácidos individuales. La resonancias de los protones se resuelven por diferencias por desplazamientos químicos• Las distancias protón-protón intra-residuo y entre residuos se miden mediante los acoplamientos dipolares• Los ángulos de torsión se miden mediante acoplamientos J• Con las distancias y los ángulos de torsión se determinan las estructuras terciarias y secundarias.

Estructura de proteínas por NMR de alta resolución

• Los protones tienen una propiedad llamada momento angular de spin

• Se comportan como si fueran barritas magnéticas alineadas a favor o en contra de un campo magnético

• Estas barritas magnéticas pueden interaccionar unas con otras

Bo

S

N

S

N

Los átomos 13C y 15N también tienen un momento angular de spin e interaccionan con 1H

Bo

N

H

C

H

C

C

HH

H

La magnetización puede ser transferida entre 1H, 13C y15N estableciendo nuevas conexiones

Desplazmientos químicosAcoplamientos J (mediante enlaces)Acoplamientos dipolares (mediante el espacio)

N

H

C

H

C

C

HH

H

N

H

C

H

C

C

HH

H

N

H

C

H

C

C

HH

H

N

H

C

H

C

C

HH

H3D HSQC - NOESY para los contactos intraresiduo

Desplazmientos químicosAcoplamientos J (mediante enlaces)Acoplamientos dipolares (mediante el espacio)

La magnetización puede ser transferida entre 1H, 13C y15N estableciendo nuevas conexiones

HNCAHNCOCAHNCOCACB, etcHSQC-TOCSY

Propiedades de spin de un núcleo atómico

Qué es el spin? •Spin es un propiedad fundamental de la naturaleza al igual que la carga o masa.

•Spin es la medidad del momento angular (rotación alrededor de un eje) y por tanto el...•Spin viene en múltiplos de 1/2 (0, 1/2, 1, 3/2, 2, 5/2…) y puede ser + o -. •Protones, electrones y neutrones poseen spin.

•Los electrones, protones y neutrones individuales tienen un spin de ½

•Los núcleos atómicos que estaán compuestos de protones y neutrones también tienen spin.

•El spin de un núcleo atómico está determinado por el número de protones y neutrones del núcleo

e-

Algunos núcleos tienen un número de spin cuántico diferente de 0

Los núcleos con un número másico impar tienen un número de spin cuántico de no entero

13C, 1H, 31P tienen un spin I = 1/2 17O tiene un spin I = 5/2

Los núcleos con número másico par y nro atómico par tienen un número cuántico de spin igual a 0

ie. 12C

Los núcleos con un número másico par y nro atómico impar tienen un número cuántico de spin igual a 1

i.e. 2H, 14N tienen spin I = 1

Núcleo Z (nro atómico)

N (nro de neutrones)

I (número cuántico de spin)

1H 1 0 1/22H 1 1 1

12C 6 6 013C 6 7 1/214N 7 7 115N 7 8 1/216O 8 8 017O 8 9 5/219F 9 10 1/231P 15 16 1/232S 16 16 0

Visión de la mecánica cuámtica

Mz

Visión de mecánica clásica

Un núcleo con spin I=1/2 sometido a un campo magnético posee un momento magnético alineado a lo largo de eje

e-

e-

Una corriente pasando por un alambre enrollado induce un campo magnético

e-e-

Un campo magnético alterno en un alambre enrollado induce una corriente

Bo

Magneto externo

Magentización neta alineada a lorgo del eje Z del campo magnético

15

HO-CH2-CH3

ωo

Campo débil

Campo fuerte

•

La intesidad de los picos es proporcional al nro de H

Un espectro de 13C de una proteína

Espectro 13C de un dominio SH3 de (aprox. 70 a.a.):

200MHz 1D 13C de la proteína SH3 de gallina

Espectro HSQC

Permite medir el acoplamiento entre distintos átomos

Espectro HSQC de una Acylphosphatase (104 a.a.) correctamente plegada

Cada pico corresponde a una amida

Detectando y localizando uniones de ligandos

La mayoría de las técnicas analíticas pueden determinar si hay o no unión a la proteína de interés. El NMR nos dice si hay y donde es.

La manera más común es medir una titulación de ligando mediante HSQC a diferentes concentraciones

[Ligando] baja

[Ligando]media

[Ligando]alta

Dinámica por RMN: intercambio H/D

Una vez que se obtiene un espectro HQSC se puede estudiar la dinámica conformacional por RMN (desde minutos a días)

Se realiza intercambiando el agua del buffer por D2O

No D2O

1er HSQC después D2O

t = 60 min

Resultados de HDX

Como conocemos cuales picos corresponden a cada aminóacido podemos identificar cuales están más protegidos del solvente

Resultados de estructura por RMNLas estructuras por RMN producen un ‘ensemble estructural’

Se toma la estructura promedio o la 'mejor' estructura (aquella que mejor se ajusta a la estereoquímica)

Dinámica por NMR

Como observamos a la proteína un solución se mueve como lo hace in vivo.

El RMN es el único método en que todas las escalas de tiempo son observables

Virtualmente todos los tipos de movimiento de proteínas son observables

Aplicaciones de RMN

Resolución de estructuras de proteína.

Proteína en solución. No requiere cristales

Condiciones similares a las fisiológicas

Puede realizarse en membrana

Aplicaciones de RMN

Dinámica molecular

Es la técnica más poderosa para estudiar movimientos de los átomos en un a proteína

Permite observar movimientos rápidos de 10-20ns hasta lentos de useg o mseg

Aplicaciones de RMN

Plegamiento de proteínas

Permite conocer el estado de plegamiento y determinar el contenido de proteína desplegada.

Permite estudiar intermediarios de plegamiento.

Aplicaciones de RMN

Unión de ligandos

Permite deteminar la unión de ligandos e inclusive otras proteínas a la proteína de interés.

Determina la unión con constantes de disociación bajas (uM-mM)

Determina el sitio de contacto.

Muy útil en screening de ligandos o inhibidores.