148.206.53.84148.206.53.84/tesiuami/uam21285.pdf · espectro completo cubre una amplia gama de...
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. , .
r .. - c
MATRICULA :
TELEFONO :
JLICENCIAm .
TRIMESTRE LECTIVO :
HORAS A LA SEMENA :
TITULO : 1
/ NOMBRE DEL ASESOR :
LUGAR DE REALIZACION :
TORRES ALVAREZ MARIA DEL CARMEN.
87346552.
6 81 39 66.
INGENIERIA DE LOS ALIMENTOS.
92 - P.
20 Hrs. DE LUNES A VIERNES.
ESPECTROSCOPIA ULTRAVIOLETA VISIBLE Y
SU APLICACION AL ESTUDIO DE PROTEINAS.
M. en Q. SALVADOR R. TELLO SOLIS.
LABORATORIO DE BIOFISICOQUIMICA.
DEPARTAMENTO DE QUIMICA. (R-209)
DIVISION DE CIENCIAS BASICAS E
I NGEN IERI A.
21 DE OCTIBRE DE 1991.
7 DE MAYO DE 1992 -J
..
,*<. Casa abierta al tierno0
UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA
BIOL. IvúIco A W L 1 0 PEREZ HERNANDEZ. SECRETARIO ACADEMICO. DIVISION DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD. P r e s e n t e .
Por medio de la presente le informo a Usted que la alumna MARIA DEL CARlw TORRES ALVAREZ, matrícula 87346552, de la Licenciatura en Ingeniería de los Alimentos terminó satisfactoriamente su proyecto de servicio social, bajo mi dirección.
La alumna TORRES ALVAREZ desempeñó su proyecto de servicio social con el tema: * Espectroscopía ultravioletahisible y su aplicación al estudio de proteínasr.
Todos los objetivos que se plantearon fueron alcanzados, y cabe mencionar el gran interés y dedicación que demostró la alumna TORRES ALVAREZ, durante la realización de su proyecto.
Sin más por el momento, le saluda.
ATENTAMENTE.
"CASA ABIERTA AL TIEMPO"
M J en Q. SALVADOR R. TELLO SOLIS. DEPARTAMENTO DE QUIMICA. A S E S O R .
8 . t . S . #
UNIDAD IZTAPALAPA Av. Michoacán y La Purísima, Cal. Vicentina, Iztapalapa. D.F. C.P. 09340. Tel.: 686-03-22
r-
. . TELEFAX (5) 686-89-99 TELEX UAMME 176496
OBJEUOVOS GENERALES :
- Conocimiento teórico práctico de la espectroscopía ultravioleta
visible.
- Estudio de la desnaturalización térmica de proteínas por
espectroscopía diferencial en la región del ultravioleta.
OBJEUOVOS PARUOCUQARES :
- Espectroscopía Ultravioleta -Visible.
- Manejo y operación de un espectrofotómetro de Ultravioleta -
Visible.
- Estudio de la desnaturalización térmica por espectroscopía
diferencial de una proteína (Lisozima).
r.
.. . r.
... r-
PAG. I. - OBJETIVOS
I I. - GENERALIDADES
2.1 Espectro Electromagnético. 1 2.2 Propiedades corpusculares de la radiación
electromagnética. 3 2.3 Interacción de la radiación con la materia. 5 2.4 Tipos de interacción. 6 2.5 EsDectros de absorción de radiación ultravioleta-
visible. 2.6 Tipos de electrones que producen absorción. 2.7 Transiciones electrónicas.
111. - INSTRUMENTACION
3.1 Fuentes de radiación. 3.2 Monocromadores. 3.3 Tipos de celdas. 3.4 Tipos de detectores. 3.5 Instrumentos para la fotometria ultravioleta-
3.6 Sistema óptico. visible.
IV. - APLICACION
4 .1 Introducción 4.1.1 Perturbación por solvente 4.1.2 Pertuebación térmica
4.2 Material 4.3 Método experimental
V.- RESULTADOS Y DISCUSION
VI.- CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS
VII. - BIBLIOGRAFIA
VI I I. - ANEXOS Láminas
9 13 16
25 27 29 30
32 35
40 41 42
44 45
46
54
55
ESPECTROSCOPIA ULTRAVIOLETA VISIBLE
Y SU APLICACION AL ESTUDIO DE PROTEINAS
GENERALIDADES:
ESPECTRO ELECTROMAGNETIC0
La radiación electromagnética es un tipo de energía que se transmite por el espacio a la velocidad de la luz.
Para caracterizar muchas de las propiedades de la radiación electromagnética, es conveniente adjudicar una naturaleza ondulatoria a
su propagación y describir estas ondas con parámetros como amplitud (A), y periocidad; esta Última puede ser descrita en términos de tres cantidades distintas:
Longitud de onda (A) '
Número de onda (Ü)
Frecuencia ( u )
(LAMINA 1 )
FIGURA 1 . Representación esquemática de un haz de radiación
monocromática de longitud de onda (A) y amplitud máxima (A). (LAMINA 2)
I +Longitud de onda, X-4 I I I I
5i
o u .- t 2 0 o o L o a y.
I
! I Tiempo o distancia
1
La longitud de onda es la distancia entre crestas, o distancia
lineal entre máximos o minimos sucesivos de una onda. Para expresar la longitud de onda se utiliza un gran número de unidades y puesto que el espectro completo cubre una amplia gama de longitudes de onda (Figura
21, son usadas varias unidades para describir las distintas zonas. En el caso de la región ultravioleta se expresa generalmente en nanómetros (nm).
(LAMINA 3)
La frecuencia ( V I es el número de ondas que pasan por un punto
determinado en una unidad de tiempo o el número de oscilaciones del
campo por segundo, y por consiguiente tiene como unidad el inverso del segundo; la denominación de esta unidad es el Hertz ( Hz I .
La frecuencia y la longitud de onda de las radiaciones electromagnéticas están relacionadas atravez de la ecuación:
Donde:
c = velocidad de la luz
A = longitud de onda
El número de onda ( Ü I , es el número de ondas por centímetro, por lo que su unidad es el inverso del centímetro.
El número de onda y la frecuencia están directamente relacionadas por la velocidad de la luz, por lo que se Útiliza indistintamente cualquiera de las dos cantidades. La relación existente es :
- u ( cm-' * velocidad de la luz (cm/seg) = u (seg-')
2
-. .
-.-
FIGURA 2. Regiones del espectro electromagnético. (LAMINA 4 )
, I 240 I24 12.4 1.24 0.124 0.012 0.WI eiectrb voitios
2850 285 28.5 2.85 ullmol 28.5 2.85 kcal/mol 285
--__------ I0.m i.Oo0 100 IO I 0.1 cm-'
Y Y 3 x 10'0cps 3 x IO" 3 x IO" 3 x IO" 3 x IO" 3 x 10'Qcps ----____------
0.01 an 0.1 cm I cm 10cm
PROPIEDADES CORPUSCULARES DE LA RADIACION ELECTROMAGNETICA
El modelo ondulatorio para la radiación no explica completamente
los fenómenos asociados con la absorción o la emisión de energía radiante; para estos procesos es necesario considerar la radiación
electromagnética como un flujo de partículas discretas de energía llamadas fotones. la energía de un fotón es proporcional a la
frecuencia de la radiación. (1)
3
La radiación absorbida por una molécula puede ser utilizada en tres formas diferentes:
1) Para causar una exitación electrónica.
2) Para causar cambios en el movimiento vibracional.
3) Para causar cambios en el movimiento rotacional.
(LAMINA 51
La radiación infrarroja es capaz de producir cambios en los
estados vibracionales y rotacionales de la molécula, cuando esta absorbe pequeñas cantidades de energia, sin embargo, cuando absorbe cantidades de energia mayores, como en el caso de la luz visible y
ultravioleta, se producen cambios en los niveles de energía de los
electrones. ( 7 )
c
(LAMINA 6)
4
INTERACCION DE LA RADIACION CON LA MATERIA
Cuando la radiación pasa del vacio a la superficie de una porción
de materia el vector eléctrico de la radiación interacciona con los átomos y moléculas del medio, dependiendo de la naturaleza de esta interacción se puede dar lugar a una transmisión, absorción o la dispersión de la radiación. (2)
(LAMINA 7)
El índice de refracción ( v 1 de un medio es una medida de su
interacción con la radiación, y se define por:
v = c / v
donde:
c = velo'cidad de la luz
V = número de onda
La transmisión puede representarse como la retención momentanea de la energia radiante que causa una breve polarización de los iones, átomos o moléculas, seguida de su nueva emisión en todas direcciones
cuando las particulas regresan a su estado original. No hay cambio neto de energia en este proceso, la frecuencia de la radiación es constante
y la velocidad de propagación disminuye de acuerdo al tiempo requerido para que se produzca el proceso.
La dispersión es la variación del índice de refracción de una sustancia con la frecuencia o la longitud de onda.
La radiación dispersada es transmitida en todos, los ángulos a
5
partir de la radiación original, y su intensidad aumenta con el tamaiio de las partículas; con partículas de dimensiones coloidales la dispersión es suficientemente intensa para que pueda verse a simple vista. (3.4)
El proceso de absoción sucede cuando una radiación pasa por una
capa transparente de un sólido , líquido o gas eliminandose selectivamente ciertas frecuencias. La energía electromagnética se transfiere a los átomos o moléculas que constituyen la muestra, como
resultado de ello estas partículas pasan del estado de más baja energía
a estados de mayor energía o estados exitados. ( 1 )
TIPOS DE INTERACCION
Espectro electrónico.
c
La energía electrónica es la que poseen átomos y moléculas debido a la energía cinética y potencial de sus electrones.
La energía cinética del electrón resulta de su movimiento y la
potencial resulta de la interacción con otros electrones y con el
núcleo.
Para los electrones de un átomo existen varios niveles de energía permitidos que dependen de cuatro números cuánticos, resultantes de la ecuación de onda para cada caso particular. ( 4 )
Espectro molecular
Las moléculas tienen niveles energéticos electrónicos análogos a
6
.. .
los niveles de energía electrónicos en los átomos. Los orbitales moleculares surgen de la interacción de los orbitales átomicos de las especies que forman las moléculas.
Si dos orbitales "so* de dos átomos A y B interaccionan uno con otro, se producen dos orbitales moleculares, uno de ellos es de baja
energía con respecto al orbital "s" original y se denomina orbital de
unión (u) el otro es de alta energía y se denimina orbital de antiunión
(u').
(LAMINA 8)
FIGURA 3
I / \
E - S Atom0 .
\
\
\
A '\ /
I J I
El espectro electrónico de una molécula resulta de una transición entre 2 niveles electrónicos de diferente energía. Por otra parte, la
transición de un orbital molecular de unión a otro de antiunión para un
par de orbitales atómicos ' Is" se denota como: u ---->o *. P P
(LAMINA 9)
FIGURA 4
Del mismo modo la transición entre dos orbitales de unión y de
antiunión que se origina de dos orbitales "p" se denota como: o --->u * P P
FIGURA 5
y tratándose de dos orbitales pi de unión y de antiunión, la
transición se representa como: II ---->II *. ( 3 ) P P
FIGURA 6 (LAMINA 10)
lT* P \ \ / \ / \
I / o I' P \
8
. ., . . , .... . , ... ..,. , ., . . ,<, , .. *._C<I.."I _c__..- --- -I-_*" .~..~.,~ ...l..l__. "-1.~.
ESPECTROS DE ABSORCION DE RADIACION ULTRAVIOLETA VISIBLE
Los métodos colorimétricos visuales están basados en la comparación de una solución colorida de concentración desconocida con una solución más colorida de concentración conocida.
La porción ultravioleta visible del espectro electromagnético se extiende desde 190 nm hasta 900 nm.
(LAMINA 11)
La región ultravioleta comprende dos zonas espectrales: el ultravioleta cercano que abarca de 200 a 380 nm y el lejano o de vacío,
situado por debajo de 200 nm hasta 10 nm. ( 8 )
La región visible comprende desde 380 nm hasta 780 nm como se observa
en la tabla 1. (6)
c
Longitud de onda Color Color observado
< 380
380 - 435
435 - 480
480 - 490
ultravioleta
violeta verde - amarillo azul amarillo
azul - verde naranja
490 - 560 verde - azul rojo 500 - 560
560 - 580
580 - 595
595 - 650
650 - 780
> 780
verde purpura vere - amarillo violeta amar i 1 lo azul naranja azul - verde rojo verde - azul infrarrojo cercano
9
Cuando las moléculas interaccionan con la energía radiante en la región visible y ultravioleta, la absorción de energía consiste enel desprendimiento de un electrón externo de la molécula.
La absorción de la radiación ultravioleta - visible usualmente resulta de las transiciones electrónicas que se producen como consecuencia de la exitación de los electrones de enlace, con acompañamiento de cambios vibracionales y rotacionales en el caso de
sustancias moleculares.
La absorción molecular en esta región depende de la estructura
de la molécula, la energía es absorbida en cuantos, elevando electrones
desde orbitales de baja energía ( estado base 1 a orbitales de mayor energía ( estado exitado 1. (9) Solo ciertos estados son posibles en una molécula por razones de mecanica cuántica, y la diferencia de energía entre un, estado base y el exitado es igual a la energía agregada por el cuanto, solo en ciertas frecuencias puede ser
absorbido. En muchas estructuras electrónicas, no ocurre la absorción
en la región ultravioleta, la espectrofotometría es más confinada para sistemas conjugados. (61
(LAMINA 13)
La energía total de una molécula es la suma de su energía
electrónica o de unión, su energía vibracional y su energía rotacional.
ETotai = Esic + Erot + Evlb
(LAMINA 14)
La magnitud de estas energías disminuye en el siguiente orden: energía eléctrica, energía vibracional y energía rotacional; la
10
energia absorbida en la región ultravioleta produce cambios en la
energia electrónica de la molécula que resulta de las transiciones de
los electrones de Valencia de la molécula. Estas transiciones consisten en la exitación de un electrón desde un orbital molecular lleno hasta un orbital de mayor energía (orbital antienlace). el orbital de antienlace se designa por un asterisco y se indica la transición de la
siguiente manera n-->n*. ( 8 )
La relación entre la energia absorbida en una transición electrónica y
la frecuencia ( u ) , longitud de onda ( A ) y número de onda (Ü) de la
radiación que produce la transición es:
A E = h u = h c / A = h Ü c
Donde: h = cte. de Planck c = velocidad de la luz
E = energía absorbida en la transición electrónica
en una molécula.
(LAMINA 15)
La energia absorbida depende de la diferencia de energia entre el
estado básico y el exitado, cuanto menor es la diferencia de energía, mayor es la longitud de onda de absorción. Un exceso de energía en el estado exitado puede dar la desasociación o ionización de la molécula o
bién puede emitirla en forma de calor. (12)
El espectro de absorción que se origina de una transición electrónica simple en la región ultravioleta - visible debe ser una
línea discreta y simple. No se obtiene una linea con estas características debido a que la absorción elentrónica queda sobrepuesta a los niveles rotacional y vibracional.
11
En moléculas complejas que contien muchos átomos. debido a la cercanía de su espaciamiento da lugar a bandas de absorción amplias.
Las principales caracteristicas de una banda son: su posición e intensidad. La posición de la absorción corresponde a la longitud de onda de la radiación de la energía.
(LAMINA 16)
La intensidad de la absorción depende de la probabilidad de interacción entre la energía de radiación y el sistema electrónico
para elevar el estado básico. (13)
La absorcón con c > lo4
c < lo3 es una absorción de baja intensidad.
es una absorción de alta intensidad y con mar
max
La intensidad de la absorción se puede expresar como transmitancia
(TI. Que esta definida por :
T = I / I o
Donde: IO = Intensidad de la energía radiante que incide
en la molécula. I = Intensidad de la energía radiante que sale de
la molécula.
De la Ley de Lambert - Beer se deriva una expresión para la intensidad de la absorción, que establece la relación entre la transmitancia, el
espesor de la muestra y la concentración de las especies absorbentes.
( 4 1.
1 2
Donde: K = Coeficiente de absorción.
c = Concentración del soluto.
b = Longitud de la trayectoria a través de la muestra.
A = Absorbancia.
(LAMINA 17)
Cuando c se expresa en moles por litro y b en centímetros la expresión se transforma en :
A = ~ c b
Donde:
E = absortividad molar
Si c se expresa en g/l, la ecuación se representa de la siguiente
manera:
A = a b c
La intensidad de la banda de absorción en el ultravioleta se expresa
como E (absortividad molar 1. InaX
TIPOS DE ELECTRONES QUE PRODUCEN ABCORCION
Existen dos tipos de electrones que tienen la característica de
absorción en una molécula:
1) Los que participan directamente en la formación de enlaces entre átomos y se asocian así con más de un átomo.
2 ) Electrones exteriores no enlazados o no compartidos, situados principalmente en átomos como óxigeno, halógenos, azufre y nitrógeno.
13
(LAMINA 18)
El enlace que forman los electrones es covalente porque se desplazan en el campo hacia dos centros atómicos, reduciendo al mínimo
las fuerzas coulómbicas de repulsión entre estos centros. Los campos localizados entre átomos ocupados por electrones de enlace se llaman
orbitales moleculares. Cuando se combinan dos orbitales atómicos
resulta un orbital. molecular de enlace de baja energía o un orbital molecular antienlace de alta energía. (2)
En la figura 7 se representa las energías de los distintos tipos de orbitales moleculares. (1) (LAMINA 191
Antienlace +rT----
Antienlace
enlace
Enlace
Los orbitales moleculares con enlaces sencillos en las moléculas se designan como orbitales sigma ( D 1, y los electrones correspondientes son electrones sigma; estos orbitales sigma poseen
simetría rotacional alrededor del eje del enlace.
El doble enlace en las moléculas orgánicas contiene dos tipos de orbitales molecularec: un orbital sigma ( D y un orbital pi ( n). Los
orbitales pi se forman por la superposición paralela de orbitales
1 4
atómicos, y sus funciones características y densidades de carga poseen un plano nodal de oscilación en su eje de Valencia. En sistemas no saturados, los electrones A determinan, fundamentalmente, los estados
de energía de los recubrimientos electrónicos, excitables por la absorción de luz visible o ultravioleta. ( 4 )
En la figura 8 se observa la distribución de los electrones en
orbitales moleculares sigma y pi.
b b b
7T*
D b
Existen moléculas orgánicas que contienen electrones que no forman
enlaces, estos electrones no cmpartidos o no enlazados se representan
con el símbolo ( n 1. En general el nivel de energía de un electrón sin enlace se encuentra entre dos orbitales de enlace y antienlace. Los electrones n, en el caso de los elementos de las dos primeras
filas de la tabla periódica, son electrones p. En la figura 9 se ilustran los tres tipos de electones de Valencia para el caso del
f ormaldehído. (5)
FIGURA 9
TRANSICIONES ELECTRONICAS
Se conoce desde hace mucho tiempo que las sustancias coloreadas deben su color a la presencia de uno o varios enlaces no saturados. A
estos enlaces o grupos hsaturados covalentemente que son responsables
de la activadad electrónica, se les denomina cromóforos, por ejemplo:
C = C , C = O , N = N etc.
(LAMINA 20)
En la tabla 2 se muestran algunos cromóforos orgánicos comunes y
la localización aproximada de sus máximos de absorción. Los datos de
posición e intensidad pueden servir solamente para identificación de grupos funcionales, porque la posición de los máximos también es afectada por el disolvente y los detalles estructurales de las
moléculas. Además, los picos suelen ser anchos debido a efectos vibratorios; por lo tanto es dificil así, la determinación precisa de la posición del máximo. (1, 6 1
1 6
TABLA 2
Resumen de transiciones y estructura elecirónica
o n
n
w y n n
n-n
vr-w y n
w aromático
w-w aromático
Etaiio: o-+.* 135 n + o * 167 Agua
Metdiiol n+o* 183 I-hexanotiol )I n+o* 224 Yodiiro de n-butilo n -t o* 257 Etileiio n+n* 165 Acetileno n+n* 173 Acetona n+n* cerca de 150
n + o * 188 n+n* 279
1.3.biitsdieno n+ n* 217 256: 1,3,5-hexatrieiio T + T*
*icroleina 7i++ 210 n + 7i* 315
Benceno n + w* aromático cerca dc 180 w + w* aromático cerca de200 w + %* aromático 255
Estireno % + w* aromático 244
- 7,000
500 126 486
10,000 6,000 -
1,860 15
21,000 35,000 1 1,500
14 60,000 8,000
215 12.000
- R K K K R Ei El B ~
K w + n* aromáticq 282 450 B vr + w* aromático 208 2,460 Ei
(hiperconjugado) c- w + w* aromático 262 174 E aromático Acetofenoiia 7i + w+ aromático 240 13,000 K
w + w* aromático 278 1,110 B n+n* 319 50 R
Fenol vr + w* aromático 210 6,200 Ei (auxocmmico ) n + w* aromático 270 1,450 E
w-a aromáticos . Toliieno
vr-w y n
vr-n aromáticos
*Banda R. radikdariig alrnián: Randa K. Lonjugiorte alemán: Banda R, bencenoide: Randa E. etil0iico.w
Algunos grupos que, por s í mismos, no producen color en una
sustancia pueden incrementar el poder colorante del cromóforo. Tales
grupos se conocen como Auxocromos, que por definición es un grupo
funcional que no absorbe en la región ultravioleta, pero produce el efecto de desplazar los picos de los cromóforos a longitudes de onda
más largas y aumentar sus intensidades; algunos ejemplos típicos son: C - B r , C - O H , C - N H 2 , C - C 1 c - I etc. (3,5)
2 ' 2 )
(LAMINA 21)
1 7
Las moléculas orgánicas saturadas no presentan ninguna absorción en las regiones del visible y del ultravioleta cercano (190 - 900 nm). La introducción de un auxocromo en el sistema saturado normalmente
desvía el máximo de absorción hacia longitudes de onda más bajas. Sin embargo, la presencia de un cromóforo produce absorción en la región
comprendida entre 190 y 900 nm. La longitud de onda correspondiente al máximo de absorción, h varia con el tipo de cromóforo. De aquí que
en las moléculas más sencillas se puede identificar la presencia de grupos cromóforos por el examen de sus espectros de absorción.
IMX
Los factores que gobiernan las h. de los cromóforos son: La
diferencia de electronegatividades de los elementos que conforman el
doble enlace y la relativa facilidad para formarlo. La posición de las bandas de absorción de los cromóforos depende marcadamente de sus
al rededores.
IIIaX
Desplazamiento batocrómico: Es el cambio de la absorción a una mayor longitud de onda, debido a un efecto del disolvente o sustitución
de un grupo, llamado también "desplazamiento al rojo".
L
(LAMINA 221
Desplazamiento Hipsocrómico: Es el cambio de absorción a una menor longitud de onda debido a un efecto del disolvente o sustitución de un grupo, llamado también "desplazamiento al azul", generalmente se observa con un aumento en la polaridad del solvente. (8,131
(LAMINA 23)
Un incremento en la intensidad de la banda de absorción se denomina efecto Hipercrómico y un decremento en la intensidad es
18
i L1-131- -.- ..... "--1-*- _. -* *-__ .X_.__. I _I__ . ., ~ ,.,... . ._I ".-
C"
I
c- Las caracteristicas de absorción de las moléculas orgánicas en la
región ultravioleta-visible dependen de las transiciones que puedan .,,.
...- ocurrir y del efecto del disolvente.
Las transiciones entre ciertos niveles de energía por la absorción de la radiación comunmente encontradas son cuatro y se presentan en la tabla 3. (6)
Tabla 3. Transiciones electrónicas y niveles energéticos.
(LAMINA 24)
Transición Región del espectro electrónico
o- --->e* Ultravioleta al vacio
n --->o-*
n --->n* 11 --->n*
Ultravioleta lejano
Ultravioleta
Ultravioleta cercano y visible
Transición o----->~*
La energía requerida para inducir este tipo de transición es muy grande como se observó en la figura 7, y corresponde a las frecuencias
radiantes de la región ultravioleta al vacío. El metano es un ejemplo de esta transición porque solo contiene enlaces sencillos C - H exhibiendo un máximo de absorción en 125 nm. El etano tiene un pico de absorción en 135 nm ya que en este participan electrones de enlace C-C,
donde la fuerza de enlace es menor que C-H; por lo tanto se requiere menos energía para la exitación y el pico de absorción se observa a una longitud de onda mas larga.
19
La transición n ---->u*
Es una transición de alta energía, pero requiere menor energía que el tipo de transición anterior . La radiación puede provocar la transición en la región de 150 a 250 nm, el mayor número de picos aparece por debajo de 200 nm. Este tipo de transición la presentan los compuestos saturados que contienen átomos con pares de electrones compartidos, tal como oxígeno, nitrógeno, azufre o los halógenos que tienen electrones
no enlazados.
Los requerimientos de energía para tales transiciones depende de la clase de enlace átomico y de la estructura molecular.
Los máximos de absorción tienden a desplazarse a longitudes de onda mas cortas en presencia de disolventes polares como el agua o etanol.
Las absortividades molares (E) asociadas con es$e tipo de absorción son
intermedias en magnitud.
En la tabla No 4 se presentan algunos ejemplos de este tipo de
absorción.
hnax E
ínm) 1 / cm * mol max
Compuec to
CH30H
CH3C1
CH3 I
167
184
173
258
1480
150
200
365
(LAMINA 25)
20
Transiciones n ---->a*
También se les denomina bandas "R", con frecuencia aparecen en el espectro cuando las modificaciones de la estructura molecular introduce bandas adicionales a menores longitudes de onda. Cuando las bandas adicionales hacen su aparición la transición n --->E se desplaza a una
mayor longitud de onda, pero puede quedar hundida en bandas de mayor intensidad. Este tipo de transición esta asociada con el grupo
carbonilo y es observado en la región de 270 a 290 nm, para la
absorción de la radiación se requiere la presencia de un grupo
funcional insaturado para proporcionar los orbitales n.
9
Las absortividades molares para los picos relacionados con este tipo de transición son bajas y caen en el intervalo de 10 - 100 1 cm'*mol,
son desplazados a longitudes más cortas al aumentar la polaridad del
disolvente (cambio hipsocrómico o azul), este efecto surge de la mayor
solvatación del par de electrones no enlazados que reduce la energía
del orbital "n". Se útiliza en la identificación de aldehídos y
ce tonas. c
Transiciones R --->n*
Las bandas atribuidas a esta transición son las "K". Se requiere la presencia de un grupo funcional insaturado para proporcionar los
orbitales n. Las absortividades molares son bajas y caen en el intervalo de 1000 a 10.000 1 cm-' mol-'. Aparecen en el espectro las moléculas que tienen estructuras conjugadas y moléculas arómaticas que
tienen sustituciones cromofóricas, por ejemplo: butadieno, estireno, benzaldehído. etc.
Estas transiciones de los sistemas dieno y polieno son muy sensibles a la polaridad del disolvente, los dobles enlaces de hirocarburo no son polares. Sin embargo las absorciones corrrespondientes a enonas quedan
21
sometidas al desplazamiento batocrómico, el cual frecuentemente va acompañado de un aumento en la intensidad conforme se incrementa la polaridad del disolvente. El desplazamiento al rojo resulta
probablemente de la reducción del nivel de energía del estado exitado que acompaña a la interacción dipolo - dipolo y enlazamiento de hidrógeno.
En el tratamiento orbital molécular se considera, que los
electrones II son desplazados aún más por el proceso de conjugación, los orbitales comprenden así cuatro centros atómicos o más, el efecto de
este desplazamiento es reducir el nivel de energía del orbital II* y
darle menor caracter de antienlace. Los' máximos de absorción son
desplazados, como consecuencia a longitudes de onda más largas.
La absorción de multicromóforos ,en una molécula son aproximadamente activas siempre que los cromóforos orgánicos estén separados entre s í por más de un solo enlace. La conjugación de los
cromóforos ejerce un profundo efecto en las propiedades de los
espectros. Las longitudes de onda de los picos de absorción para
sistemas conjugados son sencibles a los tipos de grupos adheridos a los
átomos de doble enlace. (2,4,5,8,10)
FIGURA 10. Espectros de absorción del benceno. a) Solución de benceno en disolvente etanol. b) vapor de benceno.
I I , I
I I I I
230 240 250 260 270 Wavelength, nm
22
Los espectros de ultravioleta de los hidrocarburos aromáticos se caracterizan por tres conjuntos de bandas que se originan por las transiciones A--->XI. Por ejemplo, el benceno tiene un fuerte pico de
absorción en 184 nm ( c = 60 000); una banda más débil llamada c2 en 204 nm ( E = 7 900 1 ; y un pico aún más débil en 256 nm (E.,~= 200) .
La banda a la longitud de onda mayor en el benceno y en muchos
compuestos aromáticos contiene una serie de picos agudos quue surgen de la superposición de transiciones vibracionales entre las transiciones
elctrónicas básicas. Los disolventes polares tienden a eliminar esta
estructura fina, lo mismo que ciertos tipos de sustitución.
La sustitución con grupos no saturados produce un efecto más radical sobre las bandas de absorción, las intensifica y desvía su longitud de
onda. ( 7 )
max
max
Las bandas "B" (bandas de bencenoide) son características de los espectros de moléculas aromáticas y heteroaromáticas. El benceno
muestra una banda de absorción amplia, con picos múltiples o estructura fina, en la región del ultavioleta cercano entre 230 - 270 nm. Cuando un grupo cromofórico esta unido al anillo aromático, las bandas "B", se observan a mayores longitudes de onda que las transiciones R ---> n*
mas intensas. (14)
FIGURA 11. Espectros de absorción del benceno, naftaleno y ant raceno.
r
2.0 'i..i.";l\.,, ' 1
210 250 300 350 390 Wavelength. nm
23
El efecto de los axocromos sobre las bandas del benceno se explica en relación con la interacción de los electrones no compartidos con el niicleo de benceno. La sustitución del benceno con grupos polares que contienen electrones no compartidos (auxocromos) produce un corrimiento de las bandas de absorción hacia longitudes de onda superiores, y
además las intensifica. (5.8.13)
2 4
INSTRUMENTACION
Un espectrofotómetro fotoeléctrico de registro moderno consiste de cinco areas o secciones ( 8 ) :
1 ) Fuente de radiación 2) Monocromador 3) Fotómetro
4) Area de muestra 5) Area de detector
( M I N A 26)
1 ) FUENTES DE RADIACION - Las fuentes de radiación para la espectrofotometría de absorción
poseen dos condiciones básicas. Primeramente deben proporcionar la
suficiente energía radiante a lo largo de toda la región de longitudes de onda en la que se medirá la absorción. Y en segundo, deben mantener
una intensidad constante por encima del intervalo de tiempo durante el
que se realicen medidas. Generalmente, en las regiones ultravioleta y visible del espectro, la intensidad de las fuentes no constituye un problema. (23)
( M I N A 27)
Lámparas de descarga de hidrógeno o deuterio
La fuente de radiación para la región ultravioleta del espectro
2 5
consiste en lámparas de descarga de hidrógeno o deuterio operadas a
bajas presiones (aproximadamente 0.2 - 0 . 5 torr) y bajo voltaje.
El uso de deuterio en lugar de hidrógeno intensifica el brillo, es decir la luminancia de tres a cinco veces.
A longitudes de onda inferiores a 360 nrn, estas lámparas de descarga proporcionan una radiación fuerte y continua que cubre las necesidades
en la región ultravioleta. A longitudes de onda superiores a 360 nrn, la descarga posee una baja intensidad con líneas de emisión sobrepuestas
al espectro continuo, lo que generalmente impide su utilización en la región visible.
Lámparas incandescentes de tungsteno
,
Las mediciones arriba de 350 nm hasta 900 nm generalmente se
realizan con lámparas de filamento incandescente que dan un espectro continuo en todo el intervalo. En estas lámparas se calienta un filamento de alambre, generalmente tungsteno, hasta la incandescencia
por medio de la corriente eléctrica. El filamento se encuentra en un bulbo de vidrio herméticamente sellado al vacío o con gas inerte.
Las lámparas de tungsteno y halógeno son una clase especial de lámparas
incandescentes que contienen yodo añadido a los gases normales de relleno. En la envolvente se utiliza cuarzo para tolerar altas temperaturas de operación de la lámpara. Estas lámparas conservan mas de 90 % de su luz inicial a lo largo de su vida Útil. (22,231
26
FIGURA 12 (LAMINA 28)
'..,
Lampara de tungsteno
2) MONOCROMADOR
Un monocromador consta en general de: Una rendija de entrada que proporciona una imagen óptica estrecha de la fuente de radiación, un
colimador que hace paralela la radiación procedente de la rendija de
entrada, una red o prisma para dispersar la radiación incidente, otro
colimador para reformar las imágenes de la rendija de entrada sobre la rendija de salida, y una rendija de salida para aislar la banda
espectral deseada bloqueando toda la radiación dispersada excepto la del intervalo deseado.
La función primordial de un monocromador es proporcionar un haz de energía radiante con una longitud de onda nominal y una anchura de la
banda dada. La función secundaria de un monocromador consiste en el
21
ajuste del rendimiento de energia. El flujo luminico que emerge la rendija de salida puede variarse ajustando el ancho de la rendija. Sin
embargo una rendija excesivamente amplia, producirá desviaciones
respecto a la ley de Beer. Por el contrario, los anchos de la rendija
excesivamente pequeños generan rendimientos de baja energía, afectando la sensibilidad analitica como resultado de la degradación de la razón señal - ruido, la cual es provocada por l o s altos voltajes aplicados al fotomultiplicador para detectar señales débiles.
(LAMINA 29)
Se utilizan espejos o lentes para colectar la radiación procedente de una fuente y dirigirla a la rendija de entrada del monocromador.
El funcionamiento de un monocromador comprende tres factores
correlacionados: resolución, poder de captación de la luz y pureza de la radiación de salida. La resolución depende de la dispersión y perfección la formación de la imagen; mientras que la pureza está determinada principalmente por la cantidad de radiación dispersada.
(24)
Fuente luminosa
FIGURA 13 I
:I fl \ W Rendija MONOCROMAWR Re& de
j e entrada de sa'ida muestras
hlonocroniador de prima
Angulo de rejilla
Refuerzo mnStructor de la mdiaci6n rnonocromdtlra. en una rejilla de rcfleri6n
2 8
3) AREA DE MUESTRA
La celdas que contienen las disoluciones de la muestra y de la referencia deberán tener sus ventanas perfectamente paralelas y
perpendiculares al haz de radiación.
Las celdas utilizadas en espectrofotometría ultravioleta - visible, por lo general tienen 1 cm de paso optico, aunque se puede utilizar celdas desde 0.1 hasta 10 cm.
Las celdas deben construirse con materiales que noabsorban la
radiación en la región de interés. para la región ultravioleta visible
se utilizan generalmente celdas de sílice fundido o de cuarzo ya que son transparentes desde 190 nm hasta cerca de 3 - 4 pm en la región
infrarroja.
Existen celdas de material plástico, de bajo costo que se utilizan en la región visible.
Las celdas deben limpiarse escrupulosamente antes y después de ser utilizadas, para lo cual se recomienda el uso de ácido nítrico o de
agua regia. Las soluciones de dicromato no se pueden utilizar debido a
su tendencia a ser absorbidas por el vidrio. Las celdas deberán
enjuagarse completamente y secarse evitando el uso de estufas de secaso
o de flama, ya que puede existir variación en el espesor de las mismas.
(21,231
FIGURA 14 (LAMINA 30)
Celda de Cuarzo
2 9
4 ) AREA DE DETECTOR
Un detector es un transductor que convierte la radiación electromagnética en un flujo de electrones y , posteriormente, en una corriente o voltaje en el circuito de lectura.
Existen detectores de un solo elemento como l o s fotodiodos de estado sólido, l o s tubos fotoemisores, los tubos fotomultiplicadores
y otros detectores de elementos múltiples, como los detectores con configuración de estado sólido.
Las características más importantes para cualquier tipo de detector son: sensibilidad espectral, respuesta a la longitud de onda, ganancia y tiempo de respuesta.
(LAMINA 31)
1
Tubos fotoemisores
Los tubos fotoemisores al vacúo son combinaciones simples de fotocátodo - ánodo alojados en una cubierta al vacío.
El fotocatodo opera según el principio de que se emiten electrones desde algunos materiales en proporción directa al número de fotones que
inciden en su superficie. Para una eficiencia Óptima, la superficie del
fotocátodo debe tener el máximo coeficiente de absorción posible para
la radiación incidente.
Tubos Fotomultlipicadores
Los fototubos multiplicadores de electrones son una combinación de un cátodo fotoemisivo y una cadena interna de dinodos multiplicadores
30
de electrones. En la figura 15 se presentan los dos diseños más populares, el de caja circular y el de configuración en línea.
(LAMINA 32)
Los haces de radiación que pasan al area del detector se enfocan en tubos fotomultiplicadores separados que generan un voltaje proporcional a la energia incidente en los detectores. El desbalance de voltaje
producido de la absorción de energía en el haz de la muestra, se balancea por medio de un voltaje equivalente que se deriva de una porción de alambre deslizante. La plumilla del registrador se desplaza
con los contactos en el alambre deslizante, (21,23,24)
FIGURA 15
Los fotodiodos operan según un principio completamente distinto al de los detectores anteriormente descritos. La construcción de un diodo de silicio plano con unión p - n , se indica en la figura 16.
31
- La mayoría de estos dispositivos detectan Únicamente radiación
visible y en el infrarrojo cercano. La respuesta de estos diodos
es, por lo menos, un orden de magnitud superior que los tubos fotoemisivos al vacío, y muchos ordenes de magnitud menos que los tubos
r̂
-- c1
_. fotomultiplicadores. (231 r..
FIGURA 16 (LAMINA 331
P
L..
c
h
c
L
F
L
c
6-
P-
*
P-.
- F.
*..
F-
.- c
-. ... -.
r.
r.
.. F.
-.
F-
v
Respalda Cnpr !I Capa P Regidn inirinrcca de oro
Rerpa¡da Cnpr !I C.P. P Regidn' inirinrcca de oro
Instrumentos para la fotometría ultravioleta - visible
Desde el punto de vista de ingeniería este tipo de sistemas están limitados por el detector, es decir que el factor limitante debe ser el ruido generado por el detector.
La medida del funcionamiento se define por lo general como la precisión
o la exactitud fotométrica.
En términos de construcción se puede reconocer la diferencia entre las rutas de radiación de simple y de doble haz. (23)
3 2
Muchas de las ventajas de los espectrofotómetros son resultado directo
de la capacidad de los microprocesadores utilizados en la automatización de instrumentos. Por ejemplo, existen instrumentos comerciales completamente digitalizados y acoplados a calculadoras estadisticas programables que realizan la adquisición de datos sin intervención del analista, los almacenan, calculan espectros de primera y segunda derivada, localizan la posición del pico e integran su area.
El tipo más simple de espectrómetro de absorción se basa en la
operación con un solo haz, en el cual la muestra se examina para
determinar la cantidad de radiaión absorbida a una longitud de onda
dada.
Estos intrumentos se utilizan básicamente para la determinación cuantitativa de un solo componente cuando se análiza un gran número de muestras similares. (5 ,24)
En los instrumentos de doble haz la radiación monocromática se
divide en dos componentes con potencias radigntes similares. Un haz
pasa a través de la muestra, y el otro a través de la disolución de referencia o "blanco". Sin embargo, la potencia radiante en el haz de referencia varia con la energía de la fuente, la transmisión del monocromador, la trasmisión a través del material de referencia y la respuesta del detector, son factores que varían con la longitud de
onda. (24)
Los espectrofotómetros de barrido de doble haz presentan un cambio continuo en función de la longitud de onda. Uno de los haces se
destina, permanentemente, a la disolución de referencia o blanco, y el
otro a la muestra. A medida que se barre el intervalo de longitudes de onda, se realiza una comparación automática de las transmitancias de la muestra a los de la referencia.
La operación automática elimina muchos ajustes manuales que consumen tiempo, especialmente en los análisis cualitativos donde se deben
3 3
trazar curvas complejas a lo largo de una amplia gama espectral. (23)
Por ejemplo el espectrofotómetro Varian UV-Vis-NIR (Ratio
Recording/Scanning Double - Beam) (para registro y barrido de doble
haz), tiene una gama de longitudes de onda de 185 hasta 3152 nm,
diez velocidades de barrrido y anchuras de banda ecpectrales desde
0.07 a 3.6 nm para el intervalo ultravioleta - visible.
Los detectores, las fuentes y las redes se controlan automáticamente,
Incluyendo una impresora digital de 18 caracteres, microprocesadores
interconstruidos que permiten seleccionar los formatos de salida,
calibración automática de cero, reducción de datos, tratamiento
estadístico de estos, las rutinas de cálculo de otras alternativas y
se encuentran disponibles muchos accesorios como: celdas termostáticas,
programadores automáticos de cinco celdas, adaptadores para
microceldas y un accesorio para reflectancia.
Otro ejemplo es el espectrofotómetro Ultravileta visible Lambda 7 de Perkin Elmer que es un equipo de doble haz, de alto funcionamiento
y versatilidad, posee un amplio rango de longitud de onda, doble monocromador Óptico con rendija halográfica concava (600 líneas/mm)
como premonocromador, monocromador principal con rendija halográfica
(1440 líneas/mm) detector fotomultiplicador y fuentes de radiación
detungsteno y deuterio. (21)
El espectrofotómetro incluye los siguientes modulos:
1) Espectrómetro
2) Unidad de computo 3) Unidad de manipulación visual (pantalla) 4 ) Graficador
34
FIGURA 17 (LAMINA 34)
SISTEMA OPTIC0 c
El sistema óptico es mostrado en la figura 18 para proporcionar una imagen representativa en tres dimenciones de sus componentes y en
la figura 19 se muestra su disposición optomecánica. (LAMINAS 35, 36)
La configuración óptica incluye una rendija doble del sistema monocromador. El premonocromador es una rendija halográfica concava con 600 líneas / mm, mientras que el monocromador principal tiene una rendija halográfica con 1440 líneas / mm.
El disco filtro contiene una serie de filtros ópticos y una ventana abierta, Los discos son rotados por un motor simple. Un montaje de un brazo soporta el espejo plano M2, que puede ser levatado o bajado en sincronización con el disco filtro.
35
Cuando el brazo es bajado, la radiación de la lámpara de deuterio (DL) es bloqueda, mientras la radiación de la lámpara de tungsteno (HL) es reflectada desde el espejo plano M2 a la rendija halográfica concava
G1.
La radiación emitida por la fuente es dispersada a la rendija para producir un espectro. De acuerdo a la posición rotacional de la rendija G1, un segmento de este espectro es reflectado atraves de la cara
posterior del disco filtro.
La posición rotacional de la rendija G1 es sincronizada para que la rendija G2 tenga correlación con la longitud de onda producida.
El disco filtro se hace coincidir con la posición rotacional de la
rendija de reflectancia G2.
Cuando el brazo es levantado, la radiacibn de la lampara de deuerio (DL) da a la rendija G1 y es reflectada a traves de la ventana abierta del disco filtro. Durante el cambio de filtro o fuente, el equipo para su revisión y registro es parado hasta que el cambio es completo.
Posteriomente el haz de luz se converge por el campo del lente (FL). y pasa atraves de la rendija SA, despues es colimado por el espejo
colimador M3.
La rendija reflectante dispersa el haz de luz produciendo un espectro.
La posición rotacional de la rendija selecciona efectivamente un segmento del espectro, reflectandolo al espejo colimador M3. y desde ahi se selecciona la abertura de salida sobre la rendija montada SA.
La abertura de salida restringe el segmento del espectro para el rayo de luz monocrornática deseado.
La rendija montada contiene cuatro pares de rendijas escalonadas para seleccionar y preever el paso de bandas espectrales.
El rayo de luz emergido desde la abertura de salida es ahora reflectado
3 6
I-
por el espejo plano M4 y el espejo esférico M5 al obturador (divisor
del haz).
El area R del obturador (C), es una superficie de un espejo la cual reflecta la luz al espejo esférico M6 creando un haz de referencia.
Cuando el obturador rotatorio se encuentra en posición de su area S, la luz pasa para dar al espejo esferico MS, creando un haz de muestra.
Las imagenes que salen de la rendija de salida son transportadas para un foco dentro de la celda de trabajo y la celda de referencia.
El rayo una vez que paso a traves de la muestra y lareferencia en sus celdas respectivamente, el rayo de la referencia es reflectado directamente para el detector multiplicador, mientras el rayo de la
muestra es reflectado via espejo plano M6 para el detector.
Solo opticamente los espejos pares son empleados en los rayos de la muestra y la referencia. El número de reflecciones, el ángulo de reflección y la trayectoria optica son identica,s en ambas radiaciones.
Estas medidas garantizan las condiciones fotométricas optimas para toda
la longitud de onda.
Para permetir el mínimo volumen de muestra análizada en microceldas y para toda aplicación, incluyendo microceldas flujo. El rayo de luz
puede ser producido en el area de la celda activa. (21)
L
c 37
r V'
w
-. FIGURA 18 Imagen representativa del Sistema Optico.
p_
%_
c.
... z-
* ..
C"
..- c
.-.
....
¿- L
c
HL
DL
. <
38
FIGURA 19 Disposici6n Optomecinica d e l Sistema Optico
-..
?-
3 9
APLICACION
Como un ejemplo de aplicación de la espectroscopía Ultravioleta-Visible, se hizo estudio de la desnaturalización térmica de lisozima.
I NTRODUCCION:
Las técnicas espectroscópicas de absorción ultravioleta son muy utilizadas para obtener información sobre la conformación de proteínas
en solución, a diferentes grados de resolución; esto también es
aplicable para la espectroscopía visible, sin embargo, a causa de que algunos grupos cromóforos de los aminoácidos no absorben luz visible,
los estudios en esta región estan limitados para proteínas conjugadas,
compie jos proteína-coenzina e interacciones de proteinas con iones
metálicos de transición que absorben luz visible. (14.15)
Las técnicas de espectroscopía ultravioleta que comunmente se usan
se clasifican como:
1) Técnicas en las que los cambios en el espectro de cromóforos son estudiados bajo condiciones dinámicas de interés bilógico (pH, estado
de agregación, conformación e interacción del sustrato con el inhibidor).
2) Técnicas en las que los cambios experimentales se estudian bajo condiciones estáticas.
Estas técnicas a su vez se clasifican como "Técnicas de perturbación
4 0
c epectral"; las alteraciones espectrales pueden ser producidas por
medios físicos o quimicos. &.
..-
L..
c
- r-
. ..
...
.. ..
.
Físicos: - Presión - Temperatura
Químicos: - PH - Composición del disolvente
(LAMINA 37)
Generalmente estas técnicas se usan para el estudio de proteinas
en su conformación nativa y en su conformación desnaturalizada para la
aplicación de la espectroscopía diferencial, que se basa en la
comparación del espectro obtenido de la proteína en su estado desnaturalizado provocado por alguna alteración ya sea física o
quimica. Las altaraciones más comunes son las causadas por la composición del disolvente y la térmica. (l&, 17)
Peturbación por solvente
En métodos recientes bajo condiciones favorables, los grupos
cromóforos de las proteinas son expuestos al disolvente para medir los
cambios producidos por alteraciones en la composición del disolvente.
La magnitud de la perturbación es proporcional al producto de
polarizabilidad del disolvente y al coeficiente de absorción de la
transición electrónica provocada, cuando no hay interacción específica
entre el disolvente y el cromóforo. Las diferencias obtenidas en el espectro de proteínas se debe a sus grupos cromóforos aromáticos
En la alteración de la composición del disolvente, por adición de perturbantes, no se debe alterar la conformación de la proteina, es
4 1
decir, no se debe alterar a los cromóforos ocultos en el interior de la
proteína.
Generalmente la relación lineal entre la magnitud de la perturbación y
la concentración de los perturbantes indica la ausencia de los cambios conformacionales; además pueden usarse mediciones auxiliares para
establecer la constancia en la conformación de la proteína.
Algunos perturbantes tienen un efecto muy pequeño o no tiene sobre la conformación de las proteínas, a ciertos valores de pH y fuerza íonica las proteínas tiene gran estabilidad: pero a otras condiciones (particularmente pH extremos) l os mismos perturbantes pueden desestabilizar su conformación nativa.
Los cambios conformacionales se deben a interacciones fuertes del
perturbante con la proteína, estas interacciones hacen del perturbante
un agente desnaturalizante y las interacciones débiles pueden también causar pequeños cambios conformacionales.
En las técnicas de perturbación por disolvente solo cromóforos
seleccionados son perturbados bajo ciertas condiciones, a diferencia con las técnicas de perturbación térmica donde todos los cromóforos son modificados por los incrementos de temperatura. ( 1 8 )
Perturbación Térmica.
Los cambios en el espectro producidos por variaciones en la temperatura han sido usados para estudios termodinámicos de desnaturalización de proteinas, estos cambios en la absorción del espectro son producidos por una alteración del ambiente cromóforo,
causada por la temperatura e induciendo a un cambio conformacional.
(LAMINA 38)
4 2
Cuando existe una diferencia en temperatura entre la muestra y la referencia que produzca cambios en la absorción, pero no en la conformación de la proteína, puede usarse como un método de perturbación espectral. ( 19 )
Los grupos cromóforos de una proteína sufren cambios en la absorción debido a que la temperatura induce cambios en el medio en el
cual están localizados.
Los cromóforos rodeados, por un disolvente liquido uniforme con
i polaridad definida, son función de la temperatura (comunmente lineal), esto no sucede para microambientes en el interior de la proteina.
(LAMINA 39)
La polaridad del solvente produce un cambio a rojo en el espectro de los cromóforos, puesto que la polarizabilidad esta directamente relacionada con la densidad del disolvente, la-cual normalmente decrece
con la temperatura.
La polarizabilidad y el cambio al rojo en el espectro pueden decrecer con incrementos en temperatura, causando un cambio en el espectro a
longitud de onda corta, cambio al azul. (18)
(LAMINA 401
Una excepción a esta generalización, aparece cuando se usa como
disolvente agua, al incrementar la temperatura del medio incrementa el cambio al rojo en el espectro a longitud de onda larga, (desplazamiento al rojo).
Si el ambiente de los cromóforos es sustituídopor un disolvente orgánico, su espectro de absorción puede sufrir un desplamiento al
azul, con un incremento en la temperatura.
43
De acuerdo a la convención usual un cambio al rojo produce una
diferencia positiva en el espectro y un cambio al azul una diferencia negativa.
La conformación nativa de una proteína es aquella en la que posee actividad biológica y la cual puede perderse en el proceso llamado desnaturalización. El proceso de desnaturalización puede estudiarse en el equilibrio, siendo reversible en las condicones adecuadas. (25)
( M I N A 411
La técnica usada para la perturbación térmica es directa. la celda
utilizada para determinar la absorción tiene una chaqueta integral. La disolución de referencia se mantiene a temperatura constante, generalmente de 10 a 20 'C, por medio de un baño y la muestra se
mantiene a temperaturas mayores.
Es conveniente el uso de termostatos integrados a las tapas de las celdas para determinar la temperatura de las disoluciones, puesto que alterando la temperatura de los compartimentos de la muestra y de la
referencia se puede afectar la calibración de la longitud de onda del espectrofotómetro, por lo que es necesario mantener los compartirnentos
de las celdas a temperatura constante para obtener mayor precisión.
(15)
MATERIAL :
Lisozima Sigma Co. {EC 3.2.1.1.17) de huevo, tres veces
cristalizada, dializada y liofilizada.
Celdas de cuarzo de 1 cm de paso Óptico y 1.2 rnl de volumen.
Espectrofotómetro Shimadzu UV / Vis, modelo J 160.
Baño de temperatura constante.
Agua destilada y desíonizada en un sistema millipore
c .
r. 4 4
, , . ..---..._I____.- ,.,. -I_--*-- ----- .-
METODO EXPERIMENTAL:
Se preparó una disolución de licozima a una concentración de 0.5
mg/ml.
Se obtuvo el espectro de referencia de la proteína nativa frente a
agua, figura 20.
En ambas celdas, referencia y trabajo se colocó la misma
disolución y se obtuvo el espectro Ultravioleta- visible de 200 a 350 nm. a una temperatura de 25'C.
FIGURA 21
u. v.
u. v.
Celda referecia
Licozima (O. 05 mg/ml)
Temperatura constante A 25'C
Celda trabajo
Lisozima (O. 05 mg/ml)
Temperatura variable
Los espectros diferenciales se obtuvieron por variaciones de la
temperatura en la celda de trabajo, manteniendo constante la temperatura en la celda de referencia. La temperatura de la celda de trabajo se aumentó a una velocidad de 1 OC / min. Obteniendose espectros diferenciales cada 5 'C.
4 5
RESULTADOS Y DISCUSION
En la figura 20 se muestra el espectro diferencial de la proteína en estado nativo frente a agua.
FIGURA 20 LAMINA 42
4 6
+ 2 . 0 0 a *
- El M : 'Ll\ 3 5 0 . 0 : 2 2 0 . 0
pi . 5 0 0 ( A / D I U . > .
+ 0 . 0 0 a ,
En la figura 22 se presentan espectros diferenciales
ultravioleta-visible para la desnaturalización térmica de la lisozima.
FIGURA 22
a) Espectro a 25 OC LAMINA 43
+ 0 . 25A
0 . 1 0 0 ( C I / D I U . >
"I----- ..
NI.! - 0 . 2 5 A
2 2 0 . 0 2 0 . 0 í N M / D I U . ) 350 . o
Es el espectro correspondiente al estado inicial de la
desnaturalización; es decir, cuando la muestra en la celda de trabajo y
en la celda de referencia se encuentran a la misma temperatura.
4 7
b) Espectro a 51’C. LAMINA 44
+ 0 . 1 0 A -
o ( A
En el espectro se observa la aparición de una banda negativa a 290
nm.
4 8
c) Espectro a 60.9'C. LAMINA 45
..
l-----7 + o . 10A
0 . 0 5 0 (A/DIU.), A
a'
'. '. I -,
I - 0 . 1 0 A i
NM 2 2 0 . 0 Z O . O ( N M / D I U . ) 3 5 0 . 0
Se observa en el espectro un aumento en la intensidad
correspondiente a la banda de 290 nm., la aparición de otra banda
negativa a 279 nm. y una banda positiva a 240 nm.
4 9
, __ ~ 111 -._ ----- --. ---o--"-
.I
".
+ -. d) Espectro a 76OC. LAMINA 46
i
0 . 8 5 0 ( A / D I U . ) c
>
-0 * 1 0cl . - NI1
2 2 8 . o Z O . O ( N M / D I I J . ) 3 5 0 . 0
i
0 . 8 5 0 ( A / D I U . ) c
>
-0 * 1 0cl . - NI1
2 2 8 . o Z O . O ( N M / D I I J . ) 3 5 0 . 0
En el espectro aparecen las mismas bandas negativas encontradas en l os espectros anteriores, a 290 y 279 nrn. Se observa un aumento en la
intensidad de la banda positiva de 240 nm. y la aparición de otra banda
positiva a 300 nm.
50
e) Espectro a 91OC. LAMINA 47
Se observa un aumento en la intensidad de todas las bandas positivas y
negativas, y se puede decir que hay una pérdida total de la estructura
secundaria de la proteína.
51
f) Espectro a 25 'C despues de la desnaturalización.
LAMINA 48
! / t - 0 . 1 O h I
N 11 2 2 0 . 0 2 0 . O ( N M / D I U . ) 3 5 0 . 0
Se observa ademas que en la región comprendida por el espectro
diferencial (240 - 290 nm. 1, el espectro de la proteína
desnaturalizada, en su parte negativa, muestra la misma tendencia que
el espectro de la proteína nativa frente a agua, apreciandose un corrimiento de esa parte del espectro de la proteína desnaturalizada
hacia longitudes de onda menores.
5 2
Estos espectros diferenciales de ultavioleta- visible tienen la misma
tendencia que el espectro de absorción del triptofano cuando este es
perturbado (261, es decir, los cromóforos del tipo imido1 son afectados, exponiendose al solvente cuando la lisozima es desnaturalizada térmicamente.
Se observa que los picos negativos de 290 y 279 nm. son características del triptofano libre.
Además se estudio si el proceso era reversible, para esto se dejo
enfriar la muestra a 25OC y se obtuvo el espectro diferencial; se observa que este espectro es diferente del obtenido inicialmente a
25OC..
53
CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS
c
c
En este trabajo se realizó la desnaturalización térmica de la
proteína lisozima seguida por espectroscopía ultravioleta-visible deternimándose cualitativamente que el proceso de desnaturalización puede ser de más de una etapa, y que no es un proceso reversible.
La espectroscopia diferencial ultravioleta-visible en función de la temperatura tiene aplicaciones de suma importancia para el estudio de la estabilidad térmica y el proceso de desnaturalización de las proteínas; esta técnica es aplicable además para la determinación cuantitativa de propiedades termodinámicas tales como Go Y H0
durante el proceso de desnaturalización; así como para el cálculo de la
constante de equilibrio entre el estado nativo y el desnaturalizado.
, También aplicando los resultados espectroscópicos que se obtienen
de esta técnica al modelo de dos estados se puede determinar el número de etapas que intervienen en la desnaturalización de una proteína.
En nuestro caso se propone realizar nuevamente la
desnaturalización en un equipo que permita una mayor sensibilidad para
la obtención de los espectros y en el control de la temperatura de las
celdas, ya que, esta técnica es muy sensible a errores experimentales. Así como, para poder obtener mejores resultados y aplicar el modelo de dos estados para realizar los cálculos termodinámicos correspondientes.
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PROYEC-I-O I N I (:I AL UEI.. SERVI Ci O SOCI A L .
- NOMBRE:
- TELEFONO PARTICULAR:
- MATRICULA:
- L I CENCI ATURA:
- TRIMESTRE LECTIVO:
- HORAS SEMANA:
- LUGAR DONDE SE REALIZARA:
- FECHA DE I N I C I O :
- FECHA DE TERMINACION:
- CLAVE:
- NOMBRE DEL ASESOR. PUESTO Y
ADSCRI PC I ON :
- TITULO DEL PROYECTO:
- FIRMA DEL ALUMNO:
- - FIRMA DEL ASESOR:
T o r r e s A l v a r e z Ma. Carmen .
6-81-39-66 . 87346552 . I n g e n i e r l a de los A l i m e n t o s . C i e n c i a s B i o l 6 g i c a s y de l a S a l u d . Unidad I t tapa lapa .
91 - 0 .
De 16: O0 a 20: O0 'horas.
20 h o r a s a l a semana Cde Lunes a
V i e r n e s > . 1
Laborator io de B i o f i s i c o q u l m l c a del
Depar tamento de Quimica . CR-209>
21 de O c t u b r e de. 1991
7 de Mayo de 1 9 d . \
M.en Q. S a l v a d o r ' R . T e l l o Solls . C o o r d i n a d o r de Laboratorl os de Qul mica
C i e n c i a s B á s i c a s e I n g e n i e r l a . " E s p e c t r o s c o p l a U l t r a v i o l e t a V i s i b l e
y s u a p l i c a c i ó n a l e s t u d i o de
pr otel n a s " .
Alvarez Ma. Carmen
4
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Casa abierta al tiempo
UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA
cktiibrís 18, 1991.
Dr. JOSE RAMIREZ PULIDO DIRECTOR DE LA DIVIS ION DE CIENCIAS BIOLOGICAC Y DE LA SALUD. P R E S E N T E .
Por medio de l a presente informo a Usted que l a alumria TORRES ALVAREZ MARIA DEL CARMEN, matricula 87346552. de l a LicenciaLura en Ingenier ia de los Alimentos, prestará s u servicio s o c i a l ba jo mi dirección.
E l tema e l e g i do para l a rea l i zac i6n del servicio s o c i a l de l a ~
alumna TORRES A L V A R U MARIA DEL CARMEN es: *ESPECTROSCOPIA ULTRAVIOLETA / VISIBLE Y SU APLICACION AL ESTUDIO DE PROTEIN-
E l interes de l tema e l e g i d o es poder ap l i car l a espectroscopla u l t rav io l e ta/v is ib l e a l es tudio de l a desnaturalizacidn térmica de una protelna. en par t i cu lar , una proteasa ácida.
La fecha. de i n i c i o será el 21 de Octubre de 1991 y l a de terminacidn el 7 de Mayo de 1992.
Las act iv idades del s e r v i c i o soc ia l l a s desarro l lará l a alumna TORRES ALVAREZ MARIA DEL CARWEN, de Lunes a V i e rne s de 10:OO a 20:OO Horas, en el Laboratorio de Biof isicoqulmica CR-2OQl. de l Departamento de Qulmica.de l a D i v i s i ó n de Ciencias BAsicas e Ingenier la .
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el momento, l e saluda. . .
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'. . SOLICITUD DE INSCRXPCION
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Mexico, D . F . a 25 d e Ck tuhr e d e 1991.
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Dr . JOSE RAMI REZ PULI DO. DIRECTOR DE LA DIVISION DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE L A SALUD. U n i v e r s i d a d Autónoma M e t r o p o l i t a n a , Unidad I z t a p a l a p a . P R E S E N T E .
En cump l im i en t o d e l r e g l a m e n t o de Servicio Social a n i v e l
LicenciaLura de n u e s t r a Universidad, me permito informar a Us t ed . q u e
el tema elegido p a r a l a real ización d e l Servicio S o c i a l es :
I' ESPECTROSCOPIA ULTRAVIOLETA / VIS IBLE Y
SU APLICACION AL ESrUOIO DE PROTEINAS '*.
La f e c h a de i n i c i o será el 21 de O c t u b r e de 1991 y l a de
t e r m i n a c i b n el 7 de Mayo de 1992. 1
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Las a c t i v i d a d e s de Servicio Socia l . l a s d e s a r r o l l a r é de 16:OO a
20: O0 h o r a s , e n el Laboratorio de B i o f i s i c o q u l m i c a del Departamento d e
Qul mi ca, C R-2093.
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E l proyecto s e r á d i r i g i do por el M. en Q. Salvador R. T e l l o Colls.
Coo rd inado r de Laboratorios de Qulmica de l a D i v i s i 6 n d e C i e n c i a s
B á s i cas e I ngeni er 1 a. .i
S i n mas por el momento. l e s a l u d a
A t en tamente
Torres Alvarez Ma. Carmen - 873465522 .
I n g e n i er 1 a de 1 os A l i men4os. C i e n c i a s B i o 2 6 g i c a s y de l a Sa lud .
.. . , . (JINSTANCIA No. =.C.C.
N! 16745 casaabiertadtianpo '
UNIVERSIDAD AUTONOMA METROWLITANA- IZTAPALAPA
Me permito hacer constar que para concluir la Licenciatura
en ING. DE LOS ALIMENTOS con área de concentraci6n en ________________-_____----____---- es requisito &ir
QUINIENTOS SESENTA Y NUEVE crBditos.
El aimno TORRES ALVAREZ MA. DEL CARMEN . .
con matrícula 87346552 qui& se encuentra,,cursando
la Licenciatura antes indicada, tiene cubiertos a la fecha . . .
CUATROCIENTOS OCHENTA Y' OCHO m t o s . ' , ,
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A solicitud del in- y para los fines que estime con - veniente, se extier& l a presente, en l a Ciudad de MSxico, Distrito Federal a los VEINTISIETE dfas del mes de
SEPTIEMBRE de mil mvecientos NOVENTA Y UNO.
Av. Mi$ouln y Pu-itimi, Cd. Viuniinr Mapalapa, O.F. C.P. 09340. Tel. 686.03.22 . , . , , .?; .. "& , ,., ,*, . ., , < , .I!, ,