12. análisis bacteriológico de alimentos

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12. ANÁLISIS BACTERIOLÓGICO DE ALIMENTOS

12.1. Introducción Los alimentos no son productos estériles. Algunos de ellos mantienen la población

microbiana en niveles bajos, como los tratados por calor, mientras que en los alimentos

fermentados alcanzan cifras importantes. En cualquier caso esta población varía dependiendo

del tipo de contaminación en origen, en el procesado del alimento o en su almacenamiento.

Como consecuencia, el alimento puede ser vehículo de microorganismos patógenos o de sus

toxinas, con riesgo para la salud del consumidor.

Los microorganismos que ocasionan problemas en los alimentos incluyen: parásitos,

bacterias, mohos y virus.

El objetivo de este capítulo es el estudio de algunas bacterias y mohos causantes de

toxiinfecciones, al ser ingeridas por el hombre, o de alteraciones durante la conservación de

los alimentos. 12.2. Muestreo El muestreo de alimentos destinados al análisis microbiológico es la operación que consiste

en separar un número determinado de muestras de un lote, remesa, partida, etc., con el fin de

obtener unos resultados analíticos fiables. Se pretende con ello obtener una muestra

representativa del total.

La necesidad de un muestreo adecuado se hace patente cuando cabe la posibilidad de que

existan gérmenes patógenos o sus toxinas, distribuidos de forma escasa o irregular en un

alimento o conjunto de alimentos del mismo origen. Asimismo, para saber si una remesa de

productos alimentarios cumple o no las normas microbiológicas legales para dicho producto.

12.2.1. NUMERO DE MUESTRAS

Para que el muestreo tenga utilidad estadística, se debe realizar sobre un número apreciable

de unidades de un lote o cualquier otra porción.

El número de muestras destinadas a un análisis microbiológico está en relación con la

precisión que se desee obtener en los resultados. Este número se suele fijar cuando se dispone

de muchas unidades, sobre todo en forma de lote.

Se suele sugerir que el número de muestras se corresponda con la raíz cuadrada del número

total de unidades constituyentes del lote. También que, teniendo en cuenta el volumen del

lote, se tome el 1 por 100 del total cuando el lote es grande y el 10 por 100, si el lote es

pequeño.

Estos sistemas citados son aplicables a lotes procedentes de industrias cuyo control se

desconoce. Si se trata de productos sometidos a un control regular, es suficiente analizar 5-10

muestras de cada lote.

El número de muestras recogidas en el muestreo constituye la muestra de campo o población.


12.2.2. MÉTODO DE MUESTREO ALEATORIO Este método consiste en separar del lote un número de muestras calculado previamente,

utilizando la tabla de números al azar. Dicha tabla está integrada por columnas y filas de

dígitos obtenidos mediante cálculos estadísticos (fig. 12.1).

Una vez establecido el número de muestras que se deben tomar del lote, se numeran

ordenadamente cada uno de los paquetes, contenedores o unidades del producto por

muestrear.

Si, por ejemplo, el lote está integrado por 200 unidades, su numeración se marcará del 1 al

200, correlativamente. Con un lápiz se señala un lugar cualquiera en la tabla de números al

azar, coincidiendo con un dígito o su proximidad. Este dígito sirve dc punto de partida para la

separación del número de muestras destinadas al análisis.

Supongamos que se ha punteado con el lápiz un lugar que corresponde a la fila 15 y a la

columna 10. Este número es el 1 y los que le siguen en las columnas 11 y 12 son el 4 y el 6.

En este caso, la unidad que se tiene que separar del lote es la marcada con el número 146. A

continuación se pasa a la fila 16 y a las mismas columnas 10, 11 y 12, a las que corresponde

el número 078, una nueva unidad que se separa del lote. Pasando a la fila 17, columnas 10, 11 y

12, figura el número 152, que será también separado del lote. Se procede de la misma forma hasta

obtener el número de muestras señalado previamente.


12.2.3 NORMAS GENERALES PARA EL MUESTREO Como la finalidad del muestreo en Microbiología Alimentaria es, principalmente, obtener una

muestra representativa del alimento para su análisis inmediato y conseguir resultados fiables

sobre su estado higiénico sanitario, es necesario que el producto, en el momento de su

análisis, reúna las mismas condiciones microbiológicas que tenía al ser muestreado. Por esta

razón, son necesarias unas pautas para conseguir la muestra idónea:

Los envases estarán perfectamente limpios, secos y estériles. Su tamaño guardará relación

con la muestra que se vaya a tomar. Serán herméticos e inaccesibles a cualquier

contaminación posterior a su esterilización. Se pueden utilizar:

� Envases de vidrio de boca ancha.

� Envases de plástico esterilizable.

� Bolsas de plástico esterilizable.

� Envases metálicos.

Instrumentos para la apertura de envases

� Tijeras estériles. � Pinzas estériles. � Cuchillos estériles. � Sondas estériles.

� Espátulas estériles y otros.

Etiquetas y material para marcar

Equipo de esterilización

� Autoclave pequeño.

� Horno.

� Mechero, quemador de gas o estufa eléctrica.

Refrigeración

� Neveras portátiles.

� Cajas de plástico aislantes para muestras refrigeradas y congeladas.

� Congelador portátil.

Líquido desinfectante

� Alcohol etílico al 70 por 100. � Algodón hidrófilo.

Control de temperatura

� Termómetro que marque entre —20 0C y ±100 0C.

Esterilización

El material de toma de muestras para el análisis microbiológico debe ser estéril; es necesario que se

haya sometido previamente a los métodos habituales de esterilización por calor seco (horno) o calor

húmedo (autoclave).


12.2.4 CONDICIONES PARA EL MUESTREO Para obtener la muestra representativa que se va a analizar posteriormente en el laboratorio,

se deben cumplir ciertas condiciones:

� A ser posible, las unidades de muestra se tomarán en sus envases originales, en los que se

enviarán al laboratorio.

� En ocasiones, las muestras que se deben recoger son únicas, circunstancia frecuente

cuando se trata de alimentos sospechosos de toxiinfección alimentaria.

� El muestreo sobre lotes, partidas, remesas, etc., se puede hacer siguiendo la técnica del

muestreo aleatorio, aplicando la tabla de números al azar, sobre un número de muestras

preestablecido.

� Si se trata de cajas grandes que contienen paquetes pequeños, se escogen al azar dichas

cajas y, por el mismo procedimiento, se separan los paquetes pequeños.

� Cuando los envases son muy grandes y difíciles de transportar, se toman, asépticamente,

muestras representativas y se pasan a envases estériles más pequeños.

� Los alimentos a granel se muestrean tomando porciones de distintas zonas con material

estéril y pasándolas, asépticamente, a envases esterilizados.

� Si el producto por muestrear tiene salida por un conducto, se desechan las primeras

porciones antes de tomar la muestra.

� Si son productos líquidos, se agitarán en su envase y se pasarán, asépticamente, a

recipientes estériles.

� Si la toma es de agua de un grifo, se desinfecta éste con alcohol. Luego se abre y se

desecha el agua que sale en las primeras porciones. Se cierra de nuevo el grifo y se flamea

la gota que queda pendiente hasta que emita vapores. A continuación se vuelve a abrir el

grifo, dejando fluir el agua durante 1-2 minutos antes de recogerla en el recipiente estéril

de la toma de muestras. Este será cerrado convenientemente en condiciones asépticas.

� Para productos sólidos (queso, jamón cocido, productos congelados y similares) se

tomarán las muestras en varias zonas con cuchillos, taladros, sierras, etc., estériles. Las

muestras se introducirán, asépticamente, en recipientes estériles.

� Es conveniente anotar la temperatura de almacenamiento del producto e incluso su propia

temperatura. Estos datos serán remitidos al laboratorio.

12.2.5 PREPARACIÓN DE LA MUESTRA PARA SU ENVIÓ AL LABORATORIO Una vez tomadas las muestras, se empaquetan de forma adecuada, según su naturaleza, para

evitar su rotura o deterioro. Los paquetes se etiquetarán y marcarán correctamente, cuidando

de que la etiqueta quede bien fijada para evitar que se pierda. La etiqueta irá numerada y

adecuadamente identificada para que concuerde con el informe del muestreo que debe

acompañar siempre a la muestra representativa. Este informe se identificará con los datos del

envase y recopilará todos los datos que puedan ser interesantes para el microbiólogo:

� Nombre y dirección de la persona que ha tomado las muestras.

� Nombre y dirección de la persona, empresa, etc., donde se han tomado las muestras.

� Fecha, lugar y hora en que se han tomado las muestras.

� Clase de alimentos que integran las muestras.

� Nombre del fabricante, importador, vendedor, comprador, etc.

� Razón por la cual se ha procedido al muestreo.

� Número, tamaño y marca de las unidades que forman el lote.

� Forma de transporte.

� Punto de origen y lugar de destino.


� Fecha de embarque y llegada del lote.

� Método de muestreo utilizado.

� Temperatura del producto en el momento del muestreo.

� Temperatura ambiental de almacenamiento.

� Forma de transporte y condiciones del envío de las muestras al laboratorio.

Todos estos datos, y otros que se consideren oportunos en cada caso, contribuirán a obtener

unos resultados analíticos correctos y coherentes.

Cuando las muestras sean restos de alimentos sospechosos de toxiinfección alimentaria, es

imprescindible remitir, junto con ellas, un protocolo debidamente cumplimentado donde se

incluyan los datos más precisos sobre la sintomatología de la enfermedad y otros detalles, así

como el estudio epidemiológico del caso. Todos estos datos son una ayuda extraordinaria

para el microbiólogo, que le conducirán a obtener resultados en el menor tiempo posible.

Las muestras, debidamente preparadas, etiquetadas e informadas, se precintarán, de tal forma

que, para abrirlas, sea preciso romper el precinto.

12.2.6 TRANSPORTE Y CONSERVACIÓN DE LAS MUESTRAS El espacio de tiempo transcurrido entre la toma de muestras y el comienzo del análisis en el

laboratorio debe ser lo más corto posible, para que en los resultados de los análisis quede

reflejada, con la mayor fidelidad, la flora que, cualitativa y cuantitativamente, estaba presente

en el alimento en el momento del muestreo.

Respecto al transporte, además de rápido, deberá mantener temperaturas de refrigeración o

congelación para los productos que lo requieran.

12.2.7 PREPARACIÓN DE LA MUESTRA PARA SU ANÁLISIS

1. La preparación de las muestras para su análisis microbiológico exige unas reglas de

manipulación aséptica muy estrictas, así como la utilización de material y diluyentes

estériles para evitar la contaminación exterior del alimento.

2. Si el alimento está integrado por diferentes componentes, se toman fracciones

representativas de cada una de ellas en superficie y en profundidad.

3. En caso de que transcurra un tiempo entre la toma de muestra y el análisis, se

mantendrá la muestra en refrigeración.

4. Homogeneización del alimento. Se pesan 10 g del alimento en una bolsa de plástico

estéril y se añaden 90 ml de caldo de triptona sal estéril. Se puede emplear un

homogeneizador comercial de paletas (Stomacher) para que la distribución de los

microorganismos en el medio sea homogénea. El triturado de la muestra se realiza al

menos durante 2 min, aunque el tiempo depende de la consistencia del alimento.

5. Realizar una serie de diluciones decimales seriadas en tubos con 9 ml de caldo de

triptona sal. En función de la carga microbiana esperada en el alimento se realizan las

diluciones que se crean convenientes (carne picada: 5 ó 6 diluciones decimales; puré

de patata 1 ó 2, etc).

Nota: hay que tener en cuenta para los cálculos del recuento de microorganismos que,

al añadir 90 ml de caldo de triptona sal a los 10 g de muestra, se está realizando la

primera dilución decimal (los 10 g de la muestra van a implicar aproximadamente 10

ml de volumen).


12.3. INVESTIGACIÓN DE DISTINTOS MICROORGANISMOS.

Son ensayos frecuentemente utilizados en análisis microbiológico de alimentos:

1. Recuento de microorganismos aerobios mesófilos totales (cap. 11)

2. Recuento de Enterobacteriaceas

3. Recuento e Identificación de Escherichia coli (cap. 11)

4. Determinación de Salmonella

5. Determinación de Staphylococcus (cap. 10)

6. Recuento de mohos (cap 7)

7. Recuento de Clostridium sulfitoreductores (cap. 11)

8. Clostridium perfringens

12.3.2. RECUENTO DE ENTEROBACTERIACEAE.

1. Añadir a partir de tres de las diluciones decimales 0,1 ml a 3 placas con el medio

VRBG. Con ayuda de una varilla acodada de vidrio extender el inóculo por toda la

superficie del agar.

2. Incubar las placas 24 horas a 37 C. Transcurrido este tiempo, se realiza el recuento.

Las colonias características de Enterobacteriaceae son de color violeta (fermentación

de la glucosa con producción de ácido) con un halo de precipitación alrededor

(precipitación de sales biliares).

3. Determinar el número de UFC de Enterobacteriaceae por gramo o mililitro de

muestra.

12.3.4. DETERMINACIÓN DE SALMONELLA

Salmonella es una enterobacteria patógena causante, a pesar de los controles, de importantes

trastornos gastrointestinales, por lo que resulta de interés su investigación en Microbiología

de los alimentos. La legislación española actual exige la Ausencia de Salmonella en 25 g de muestra.

La detección de Salmonella depende de utilizar los medios de cultivos adecuados, de forma

que permitan y favorezcan el crecimiento de un número de células iniciales muy bajo. Estas

bacterias se encuentran en condiciones estresantes y acompañadas de microorganismos

competidores, presentes en la muestra en un número mucho más elevado. Primero el medio

de cultivo ha de ser capaz de revivificar las Salmonella para seguidamente incubarlas en un

medio de enriquecimiento selectivo, que les permita competir favorablemente con el resto de

flora microbiana y reproducirse en número suficiente para ser identificadas.


Procedimiento:

1. Preenriquecimiento. Pesar 25 g del alimento en una bolsa de plástico estéril y añadir

225 ml de BPW. Homogeneizar la muestra en el triturador. Incubar la bolsa 16-18

horas a 37 ºC

2. Enriquecimiento en medios líquidos selectivos: Por separado añadir:

a. 1 ml de la muestra preenriquecida a un tubo con 10 ml de caldo Selenito Cistina1

(S-C) e incubarlo a 37 ºC durante 24 horas.

b. 1 ml de la muestra preenriquecida en 10 ml de caldo Bilis-Tetrationato-Verde Brillante de Müller-Kauffman2

(M-K) e incubar a 42-43 ºC durante

24 horas.

c. 0,1 ml de muestra preenriquecida en 10 ml. de caldo Rappaport-Vassiliadis peptona de soja (RVS), incubando a 42º ! 1º C durante 24 h.

Nota: esta etapa de enriquecimiento se puede llevar a cabo en diferentes medios

selectivos. En este capítulo empleamos los medios M-K y S-C, de diferentes

características, para recuperar todos los serotipos de Salmonella.

1. Aislamiento diferencial en medios sólidos selectivos: agitar los caldos de

enriquecimiento y, a partir de cada uno de ellos, realizar un agotamiento por estrías en

medios selectivos para Salmonella: a. Sulfito Bismuto3 (SB) b. Agar Hektoen4 (HK) c. Agar Verde Brillante (BGA) Incubar las placas a 37 ºC durante 24-48 horas.

Nota: En Agar sulfito bismuto la Salmonella typhi se presenta en colonias con

centro negro y borde claro traslúcido. Otras Salmonellas forman colonias más

pequeñas y negras si producen H2S. El brillo metálico característico de

Salmonella suele aparecer pasadas 24 horas de incubación (en medios

preparados 4-5 días antes). Arizona y citrobacter producen colonias grandes y

negro-grisáceas plomizas. En HK formando colonias verdeazuladas con o sin

centro negro (dependiendo de que sean SH2 positivas o no). Las bacterias

acompañantes, si aparecen, dan colonias de color salmón. En BGA las

colonias de Salmonella son rosas transparentes, virando el medio a un rosa

intenso. Las colonias de otro color no se tendrán en cuenta. Si se considera

conveniente, se pueden realizar a partir de las colonias identificadas como

Salmonella pruebas confirmativas bioquímicas y/o serológicas.

1seguir instrucciones para su preparación (no esterilizar en autoclave)





12.3.8 DETERMINACIÓN DE CLOSTRIDIUM PERFRINGENS El cultivo de Cl. perfringens exige:

1. Una atmósfera libre de oxígeno que se consigue:

a. Regenerando los medios de cultivo antes de ser utilizados

b. Cultivando en anaerobiosis

1. Utilizar medios selectivos que inhiban la flora competitiva, mediante la presencia de

agentes selectivos antibacterianos como: polimixina B, etc.

2. Incubación a 46 ºC, temperatura selectiva para aislamiento de Cl. perfringens del

resto de clostridium sulfito reductores.

Regeneración de los medios de cultivo

Las soluciones y medios de cultivo, en contacto con la atmósfera, contienen aire disuelto que

perjudica el crecimiento de las bacterias anaerobias estrictas. La regeneración tiene como

objetivo expulsar el aire de los medios.

Para regenerar los medios líquidos se mantienen los tubos en un baño de agua a 100 ºC

durante 10 min., dando pequeños golpes de vez en cuando para facilitar la eliminación de las

burbujas. Inmediatamente después se enfrían los tubos poniéndolos bajo el grifo de agua fría.

Para regenerar los medios sólidos, primero se funden en agua hirviendo. A continuación, se

mantienen en un baño de agua a 100 ºC durante 10 min. Enfriarlos a una temperatura de 47-

50 ºC con agua fría del grifo, y mantenerlos hasta el momento de su utilización en un baño de

agua a 47-50 ºC. Los medios regenerados se han de utilizar lo antes posible.

Procedimiento:

1. Preparar el medio de cultivo agar-sulfito-polimixina-sulfadiazina (SPS). .

2. Añadir 15 ml de SPS a 2 tubos estériles de 16 x 160 mm. Esterilizar.

3. Sacar los tubos rapidamente del autoclave y regenerarlos en un baño maria a 100 ºC.

4. Enfriar rapidamente y mantener atemperado a 45-50 ºC.

5. Sembrar 1 ml. de cada dilución decimal de la muestra, en los tubos con el medio

atemperado. La siembra se hace introduciendo la pipeta con el inóculo hasta el fondo

del tubo y depositándolo lentamente de abajo arriba.

6. Obturar los tubos añadiendo una capa de 1 cm de parafina estéril.

7. En posición vertical, colocar los tubos en una jarra para anaerobios. Eliminar el

oxígeno de la jarra.

8. Incubar a 46 ºC durante 24 h.

9. Recuento de puntos negros en el medio y calculo de nº de ufc x ml/gr.


12.4. ALIMENTOS PARA ANALIZAR Para proceder al análisis microbiológico de los alimentos indicados a continuación, se

procederá previamente a realizar un trabajo de búsqueda de información, recopilación

bibliográfica sobre el tema, planificación, organización y ejecución de la actividad según

normas de BPL. De forma indicativa, comprenderá los siguientes apartados:

1. Información general del grupo. Características del grupo de alimentos en que se

encuadra la muestra a determinar "Código Alimentario Español".

2. Definición de los diversos alimentos que encuadra el grupo.

3. Preparación de las muestras, métodos oficiales de análisis y criterios microbiológicos

(Orden, Real Decreto, Norma, BOE, DOC,...)

En el informe de la práctica se informará detalladamente de los siguientes aspectos:

� Recopilación de la información y documentación precisa para organizar la toma de

muestras.

� Identificación del protocolo de obtención de la muestra.

� Toma de muestras.

� Codificación de la muestra.

� Tratamiento de las muestras: homogenización y ajuste de las condiciones del ensayo

microbiológico.

� Almacenamiento, eliminación de la muestra.

� Verificación del cumplimiento de las normas de seguridad, higiene medioambientales

12.4.1. Hamburguesa de pollo

12.4.2. Mayonesa

12.4.3. Helados

12. análisis bacteriológico de alimentos

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