Traducción

Nirenberg

Tenía extracto crudo deE. Coli s30 que es capaz de sintetizar proteínas al incorporar aminoácidos marcados con 14C a partir de mRNA exógeno. Para obtener el mRNA exógeno se degrada el DNA de bacterias con DNAsas y así se evita la síntesis de mRNA endógeno.

mRNA + 14C-aa + 19 aa extracto celular de s30 11C-proteína

Esto se repitió 20 veces usando cada vez un aa diferente marcado. La proteína aparece marcada cuando el aa era Phe (el triplete UUU codifica apra Phe)

La polimerasa independiente del molde sirve para sintetizar mRNA

UTP + RNA Pol UUUUU (RNA)

Se puede hacer el mRNA con poli A, poli C o poli G, se realizan los 20 experimentos y se ve que con qué aa se marca la proteína.

Encontraron que los ribosomas aislados de E.Coli fijan un aminoacil-tRNAespecífico si está presente el correspondiente triplete en el mRNA. El método experimental fue el siguiente:

1) Sin ribosoma el aminoacil-Trna pasa por el filtro.2) Sin el aminoacil-tRNA el ribosoma no pasa por el filtro.3) En un tubo se mezclaban aminoacil-Trna, ribosomas y mRNA con solo un triplete que alcanza para formar el complejo.

Cuando se filtraba, si se encontraba que el aminoacil-tRNA marcado no pasaba por el filtro significaba que se unía a la secuencia del mRNA (se correspondía con el triplete). Por ejemplo: Phe-tRNApheUUU.

El código genético tiene varias características importantes

El código genético e casi universal. Con la misteriosa excepción de unas pocas variaciones que se han encontrado en mitocondrias, algunas bacterias y algunos eucariotas unicelulares.

El codón de inicio AUG señala el principio de cadenas polipeptidicas .AUG no solo es el codón de inicio de procariotas y eucariotas sino que también codifica residuos de Met.

Tres codones que no codifican ningún aminoácido son conocidos como codones de terminación. El código genético es degenerado, lo que significa que un aminoácido determinado puede ser especificado por más de un

codón. Solo la metionina y el triptófano tiene un único codón. Cuando un aminoácido tiene varios codones, la diferencia se encuentra entre los codones se encuentra normalmente en la

tercera base (en el extremo 3’). Por ejemplo la alanina. Cada organismo puede utilizar cualquier codón del aminoácido pero la distribución de cada codón no es similar. Por

ejemplo, la leucina que tiene 6 codones pero no hay 1/6 de cada codón. Entonces, en general, se prefiere un codón para cada organismo.

Genes que se solapan en diferentes marcos de lectura

En varios virus la misma secuencia de DNA de bases del DNA codifica dos proteínas diferentes al utilizar dos marcos de lectura diferentes. Esto se descubrió del DNA del bacteriófago φX174 que no contiene la cantidad de bases como para codificar 9 proteínas diferentes pero su genoma contiene secuencias génicas solapantes (B y E que tienen marcos de lectura diferente de A y D) junto a las demás zonas pueden codificar las 9 proteínas.

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Marco de lectura abierto (ORF)

En genética se llama marco abierto de lectura (siglas ORF del inglés Open readingframe) a cada una de las secuencias de ADN comprendida entre un codón de inicio (AUG) de la traducción y un codón de terminación, descontando las secuencias que corresponden a los intrones en caso de haberlas. Se encuentra acotado por los UTRs, o secuencias no traducidas.

En una secuencia de ADN cualquiera hay, a priori, 6 posibles sentidos en los que pueden aparecer marcos abiertos de lectura; dado que cada codón toma 3 nucleótidos, existen 3 posibles lugares de inicio para tomar los nucleótidos de 3 en 3, si se tomara un cuarto nucleótido como lugar de inicio, haría coincidir el marco abierto de lectura con el mismo que si se toma el primer nucleótido. A lo que hay que sumar los otros 3 posibles marcos abiertos de lectura si el ADN es traducido tomando como molde la hebra complementaria, dando el sentido de lectura opuesto.

Ribosoma

Ribosomas bacterianos

Cada célula de E.Coli contiene 15.000 o más ribosomas. Estos ribosomas tienen un diámetro de 18 nm y un coeficiente de sedimentación de 70s. Los ribosomas bacterianos están formados por dos subunidades de tamaño diferente:- La subunidad mayor 50scontiene dos moléculas de rRNA (5s o 23s) y 34 proteínas que se numeran de L1 a L34.- La subunidad menor 30scontiene una molécula de rRNA 16s y 21 proteínas las cuales se numeran de S1 a S21

Las dos subunidades ribosómicas tienen forma irregular. Estas se encajan de tal manera que se forma una hendidura a través de la que pasa el mRNA a medida que el ribosoma se desplaza a lo largo del mismo durante el proceso de traducción y del que emerge la cadena polipeptídicarecién sintetizada.

En el ribosoma encontramos tres sitios: A, P y E. Donde el E, es donde se encuentra el tRNA sin aminoácido unido que va a ser liberado.

Ribosomas eucariotas

Son más grandes y más complejos. Tienen un diámetro de unos 23 nm y un coeficiente de sedimentación de 80s. Además, posee dos subunidades cuto tamaño varía según la especie y son:- La subunidad mayor 60scontiene rRNA 5s, 5,8s y 28s. - La subunidad menor 40scontiene rRNA 18s.

En conjunto los ribosomas eucariotas contienen más de 80 proteínas diferentes.

Los RNA de transferencia

Los tRNA son relativamente pequeños y consisten en un sola hebra de RNA plegada en un estructura tridimensional precisa. Tal como se ha mencionado anteriormente existe al menos un tRNA por cada aminoácido aunque para algunos aminoácidos hay dos o más tRNA específicos. Se requieren al menos 32 tRNA para reconocer todos los codones de aminoácidos, si bien algunas células tienen más de 32.

Como mínimo ocho residuos nucleotídicos de todos los tRNA tienen bases modificadas infrecuentes, muchas de las cuales son derivados metilados de las bases principales.

La mayoría de los Trna tienen un residuo guanilato (pG) en el extremo 5’ teniendo todos la secuencia CCA(3’) en el extremo 3’.

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Tienen forma de hoja de trébol con cuatro brazos:- Brazo AA o aminoacidico lleva un aminoácido específico esterificado por su grupo carboxilo al grupo OH 2’ o 3’ del

residuo adenosina del extremo 3’ del tRNA.- Brazo del anticodón contiene el anticodón.- Brazo DHUque contiene el nucleótido infrecuente dihidrouridina.- Brazo TψCque contiene ribotimidina (T) y pseudouridina (ψ), que tiene un enlace carbono-carbono insólito entre

la base y la pentosa.

Síntesis de proteínas en procariotas

1. Activación de los aminoácidos

En la primera fase de la síntesis de proteínas, que tiene lugar en el citosol los 20 aminoácidos diferentes se esterifican con sus correspondientes tRNA por medio de aminoacil-trnasintetasas cada una de las cuales es específica para un aminoácido y uno o más tRNA correspondientes. En la mayoría de los organismos hay generalmente una aminoacil-trnasintetasa para cada aminoácido.

La reacción global catalizada por estas enzimas es:

Aminoácido + tRNA + ATP Aminoacil-tRNA + AMP + PPi (intermediario Mg+2)

2. Iniciación

En la iniciación de la cadena polipeptídica intervienen:

El ARN-t-Formilmetionina

Las subunidades ribosomales El ARN-m Enzimas Los factores de iniciación IF1, IF2 e IF3 Fuente de energía como GTP.

Las subunidades ribosomales están separadas cuando no están ocupadas en la síntesis de polipéptidos. Para poder iniciar la traducción es necesario que ambas subunidades se ensamblen. Se pueden distinguir tres fases en el proceso de iniciación:

Fase 1: Unión del mensajero (ARN-m) a la subunidad pequeña 30S de los ribosomas

estimulada por la acción del factor IF3.

En el primer paso, la subunidad ribosómica 30s fija IF-3 que impide que las subunidades 30s y 50s se combinen prematuramente y el IF-1 que tapa el sitio A de la subunidad 30s asegurando que el fmet-tRNAfmet se una solamente al sitio P y que ningún otro aminoacil-tRNA pueda unirse al sitio A durante la iniciación. A continuación se une el mRNA a la subunidad 30s de tal forma que el codón de inicio queda en un lugar específico. El iniciador AUG es conducido a su posición correcta en la subunidad 30s por una señal iniciadora, denominada secuencia de Shine-Dalgarno. Esta secuencia está formada por 4 a 9 residuos purinicos y es reconocida por un secuencia complementaria de rica en pirimidinas, con la que forma pares de bases cerca del extremo 3’ del rRNA 16s de la subunidad 30s. Esta interacción mRNA-tRNA fija el mRNA de modo que el AUG se posiciona de forma correcta para el inicio

de la traducción.

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Fase 2: El ARN-t-iniciador (ARN-t-Formilmetionina) se une al factor IF2 y a GTP y se situa en la Sede P.

En el segundo paso del proceso de inicio, el complejo formado por la subunidad 30s, IF-3 y Mrna forma ahora un complejo mayor al fijar IF-2, que ya está cargado con el GTP ya que es una proteína de unión a GTPy el fmet-tRNAfmet iniciador.

Fase 3: Unión de las dos subunidades ribosomales 30S y 50S mediante la hidrólisis del GTP unido a IF2 catalizada por una proteína

ribosomal. Una vez unidas ambas subunidades se sueltan o disocian los factores IF2 e IF3.

Con estos tres pasos se da lugar a un ribosoma 70s funcional denominado complejo de inicio, que contiene el mRNA y el fmet-tRNAfmet iniciador. Este complejo está preparado para los pasos de elongación.

3. Elongación

Una vez formado el complejo de iniciación se puede comenzar la elongación del polipéptido. La elongación o crecimiento de la cadena polipeptídica tiene lugar en esencia mediante la formación de enlaces péptídicos entre los aminoácidos sucesivos. Intervienen en este proceso, el peptidil-ARN-t, los aminoacil-ARN-t, ribosomas, ARN-m, enzimas, factores proteicos de elongación EF-Tu, EF-Ts y EF-G y fuentes de energía como GTP.

Fase 1: El aminoacil-ARN-t correspondiente al siguiente triplete del ARN-m

entra en la sede A dl ribosoma gracias a la intervención del factor EF-Tu. Para ello EF-Tu se une primero a GTP activándose y después el complejo activado (EF-Tu-GTP) se une al aminoacil- ARN-t. Después la hidrólisis de GTP a GDP favorece la entrada del aminoacil-ARN-t en la sede A y el complejo EF-Tu-GDP se libera.

Fase 2: La liberación del ribosoma del complejo EF-Tu-GDP esta mediada

por la intervención del factor de elongación EF-Ts. Este factor, EF-Ts, también interviene en la regeneración y activación del factor EF-Tu.

Fase 3: La transferencia de la cadena peptídica del peptidil-ARN-t que está

en la Sede P al aminoacil-ARN-t nuevo que ha entrado en la sede A. Esta reacción está catalizada por un enzima que es la peptidil-transferassa. Después el ribosoma avanza un codón sobre el ARN-m en la dirección 5'→3' (se transloca). Este paso se realiza gracias a la intervención del factor EF-G activado por la hidrólisis de GTP. En esta fase se libera el ARN-t descargado que estaba en la sede P y al moverse el ribosoma el péptidil-

ARN-t recién formado que estaba en la sede A pasa a ocupar la sede P.

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4. Terminación

La terminación de la cadena polipeptídica en bacterias tiene lugar cuando los ribosomas en su avance a lo largo del ARN-m se encuentran con cualquiera de los siguientes tripletes de terminación o codones de fin: UAA, UAG y UGA. Además, durante la terminación intervienen los factores proteicos de terminación RF1, RF2 y RF3. No hay ningún ARN-t que reconozca a los tripletes de terminación, son los factores de terminación o liberación los que se encargan de reconocer los codones de STOP. El factor RF1 reconooce los codone UAA y UAG y el factor RF2 identifica a los codones UAA y UGA. El factor RF3 también colabora en la reacción de terminación. Cuando el peptidil-ARN-t está en la sede P los factores de terminación en respuesta a la existencia de un codón de terminación en el ARN-m entran en la sede A. Como consecuencia el polipéptido se libera de la sede P, se disocian las dos subunidades del ribosoma y se libera el ARN-t que estaba en la sede P. Esta reacción de terminación se lleva a cabo mediante la hidrólisis de GTP.

Síntesis de proteínas en eucariotas

Inciación

Eif2facilita la unión inicial de Met-tRNAmetal la subunidad menor 40s del ribosoma. eIf2B, Eif3primeros factores que se unen a la subunidad 40s, facilitan los pasos siguientes. Eif4Aactividad helicasa que remueve la estructura secundaria del mRNA para permitir la unión a la subunidad 40s, parte

del complejo Eif4F. eIF4B se une el mRNAfacilitanto el escaneo del mRNA y localizar el primer AUG. Eif4Ese une al capuchón 5’ del mRNA, parte del complejo eIF4F. Eif4gse une a Eif4E y a PAB; parte del complejo Eif4F. Eif5promueve la disociación de todos los factores de iniciación de la subunidad 40s asi como prelude la asociación de la

subunidad 60s para formar el complejo de inicio 80s. Eif6facilita la disociación del ribosoma inactivo 80s en sus subunidades.

Uno de ellos, denominado proteína fijadora del casquete o Eif4E, se fija al casquete 5’ del mRNA facilitando la formación de un complejo entre el mRNA y la subunidad ribosómica 40s. A continuación se realiza un barrido del mRNA para localizar el AUG que señala el inicio del marco de lectura. Se requieren varios factores adicionales en esta reacción de barrido del mRNA y en la unión del complejo 80s completo en el que el Met-tRNAmet iniciador y el mRNA están unidos y listos para proceder la elongación.

Además la iniciación eucariota difiere de la procariota ya que el reconocimiento del AUG no sé por una secuencia como la se Shine-Dalgarno sino que está la secuencia de Kozak (aunque es erróneo decir que es similar a esta).

1) Formación del complejo GTP-Eif-2

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2) Eif-GTP se une a tRNA iniciador3) Se une la subunidad 40s (complejo 43s)4) Se estabiliza con Eif-3 y Eif-1 5) El cap se une a eIF-4F: compuesto por 4E, A y G en donde:

4E se une a cap 4A une ATP y tiene actividad RNA helicasa 4G ayuda a la unión al complejo 43s. Cuando se une el complejo 43s se desarma todo.

Regulación de la actividad eIF-4E

Eif-4E es el IF en menor nivel (determinante). Se regula a nivel de:

- Transcripción- Modificación (fosforilación)- Inhibición

Regulación del paso 1

1. Fosforilación de las proteínas de unión Eif4E permite separarla del capuchón 5’ y volver a reciclarse. La fosforilación es por parte de quinasas que forman parte de la cascada de señalización. Mnkfosforila a Eif4E los que la despega del capuchón 5’.

-Ver filmina 45- 2. Unión de las PABP a Eif4G.

- El control de la traducción de mRNAs heredados por vía materna es un elemento clave del desarrollode los primeros animales.

- Los mRNAs son sintetizados y almacenados durante el prolongado periodo de ovogénesis y son trasladados únicamente en respuesta a señales exógenas.

- Los ovocitos de Xenopuslaevis contienen mRNAsenmascadaros los cuales son activados durante la reentrada de las células en la meiosis (maduración de ovocitos) que es un proceso estimulado por la interacción de progesterona (señal hormonal) con la superficie del receptor.

Maskin is a CPEB-Associated Factor that Transiently interacts with Eif-4E

La poliadnilación puede ser nuclear y citoplasmática. Dos elementos en la región 3’UTRs (partes no traducidas del gen) del mRNA son necesarios para la poliadenilación: el

hexanucleotido AAUAAA y CPE (elemento de poliadenilación citoplasmática) al cual se le une CEPB. La poliadenilación inducida por la actividad de la CPEB es regulada por la fosforilación sitio específica. Esta modificación

puede ser importante para estabilizar la unión de CPSF (factor especifico de poliadenilación) al AAUAAA, un evento que probablemente es necesario para reclutar a la polimerasa poly(A).

En la fase S sucede los dicho anteriormente (CPEse le une CPEB que la fosforilase une CPSFcomienza poliadenilación a la cola poly(A) se une PABP). Cuando esto sucede se pasa a la fase M, en donde se separa eIF4E de Maskin y se une a Eif4G dando lugar al complejo de inicio de la traducción.

-Ver filmina 48-

Control de la síntesis de Hemoglobina por traducción

La síntesis de proteínas en reticulitos (donde se sintetiza la hemoglobina) es dependiente de la cantidad de hemo disponible. En deficiencia de hemo, la síntesis de proteínas es inhibida con incremento de la fosforilación de la subunidad α de la Eif2.

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La fosforilación de eif2 en deficiencia de hemo es el resultado de la activación de HRI . Cuando se fosforila Eif2 no puede unir GTP por lo que no pasa a ser activa y con esto tampoco puede unir el aa-tRnaNo hay formación del complejo de inicio de la traducción.

2. Elongación

1. El aa-Trna es tomado por el factor de elongación Eef-1 en presencia de GTP.2. Ocurre la transpeptidación.3. El tRNA sin aminoácido es desplazado desde el sitio P al E mientras el dipeptidil-tRNA es desplazado del sitio A al P. Este

proceso es facilitado por el factor de elongación Eef-2 y GTP.

-Ver filmina 52-

3. Terminación

Intervienen los factores de liberación (eRFs) Erf1 es estructuralmente similar a un tRNA. Se le une GTP para formar Eef1-GTP. Este complejo entra en el sitio A del

ribosoma, en donde es reconocido por el codón de stop. Entonces libera el polipéptido completo realizando un ataque nucleofilico a la unión ester entre el péptido y el tRNA que está en el sitio P.

La actividad catalítica de Eef1 es estimulada por el GTP y otro factor de liberación, Erf3.

TraslationalFrameshift

Cuando hay un corrimiento del marco de lectura puede ser que no se detenga la traducción. El factor de liberación 2 de E.Coli (RF2) regula su propia síntesis de la siguiente manera:

Bajo RF2: hay una pausa en la traducción y en lugar de leer el codón de stop UGA se corre a GAC por lo que se produce la síntesis de RF2. Además no hay RF2 que detenga la traducción-

Alto RF2: se lee el codón de stop, se une RF2 y termina la traducción.

Determinación de la síntesis de proteínas

El crecimiento de una cadena polipeptídica ¿empieza por el extremo amino-terminal o por el carboxilo terminal? La respuesta se obtuvo en los experimentos realizados por Howard Dintzis en 1961. Se incubaron reticulocitos que sintetizan hemoglobina de forma muy activa con leucina radiactiva. Se escogió la leucina porque aparece frecuentemente tanto en las cadenas α y β.

En las cadenas aisladas después d 60 minutos de incubación todos los residuos de leucina eran radiactivos. Sin embargo en las cadenas de globina aisladas sólo unos minutos después de adicionar leucina radiactiva las residuos Leu radiactivos se encontraban en el extremo carboxilo-terminal.

De estas observaciones se concluyó que las cadenas poli peptídicas se empiezan en el extremo amino-terminal y se alargan por adición secuencial de residuos al extremo carboxilo-terminal.

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