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■ introduCCión

Con el reciente descubrimiento de los mi-croARNs (miARNs), ARNs que no codifican para proteínas, un gran número de laboratorios han cen-trado sus investigaciones en esta familia de ARNs de pequeño tamaño. Los miARNs se encuentran en los genomas de plantas, animales y virus regu-lando la expresión génica, a nivel post-transcripcio-nal, mediante su unión a la región 3´ no traducida (3´-UTR) de mARNs específicos. Dependiendo del grado de complementariedad entre un miARN determinado y su transcrito diana, el miARN pue-de desencadenar la degradación del transcrito diana (cuando la complementariedad es casi perfecta) o a la inhibición de la traducción de la proteína. Aun-que la primera publicación sobre un miARN apare-ció hace más de 20 años, en los últimos años se ha producido un incremento en el número y diversidad de esta clase de ARNs reguladores. Actualmente se está realizando un gran esfuerzo para determinar cuándo, cómo y dónde se producen los miARNs y sus funciones en las células, tejidos y organismos.

Se piensa que cada miARN puede regular múltiples genes y que, en eucariotas superiores, existen más de mil genes de miARN.1 Algunos investigadores ya han mostrado evidencias de que los miARNs pueden actuar como reguladores de procesos bioló-gicos tan diversos como el desarrollo embrionario, el metabolismo graso, la secreción de insulina, la hematopoyesis, el desarrollo del músculo, la proli-feración y muerte celular, el desarrollo del cerebro y la diferenciación y mantenimiento de las células madre.2,3

■ la revoluCión de los arns de pequeño tamaño

Desde el descubrimiento de la estructura en do-ble hélice del ADN por Watson y Crick en 1953, la ruta estándar de flujo de información en una célula va desde ADN a ARN y posteriormente a proteína. La célula lee la información codificada en el ADN de los genes y usa el ADN como molde para sinte-tizar una hebra de ARN en un proceso denomina-

1El descubrimiento de los microARNs

Capítulo

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El papel de los microARNs en el cáncer2 ■

do “transcripción”. Este ARN mensajero, o mARN, viaja a través de la célula hasta los ribosomas, que son los sitios en donde se sintetizan las proteínas. Posteriormente los ribosomas leen el mARN para determinar qué aminoácidos deben ser secuencia-dos juntos en una misma proteína en un proceso denominado “traducción”. En esta ruta estándar de flujo de información, inicialmente el ARN es con-siderado como un intermediario. Se llegó a pensar que las enzimas y otros catalizadores biológicos eran exclusivamente proteínas. Posteriormente llegó la primera revolución del ARN en los años 1980 con los estudios realizados por Cech en donde descubrió la actividad enzimática del ARN.4 Este hallazgo permitió a los investigadores postular la “Teoría del mundo del ARN” en la cual el origen de la vida en la tierra pudo proceder a partir del ARN, en donde el ADN y las proteínas aparecerían posteriormente.5

En los últimos años los descubrimientos del ARN de interferencia (iARN) y microARN (miARN) desencadenaron la segunda revolución del ARN.6 El iARN interviene en un proceso de silen-ciamiento de la expresión génica mediante ARN de doble cadena (dsARN, doble strand RNA).7 Desde su descubrimiento se convirtió rápidamente en una he-rramienta experimental muy poderosa para descifrar la función de los genes. Los descubrimientos de los mecanismos del iARN no sólo clarificaron la ruta del ARN de interferencia, en donde el mARN de los genes que van a ser silenciados están marcados por pequeños ARN de interferencia (siARN), sino que también aportó conocimientos sobre otros mecanis-mos para silenciar genes como es el caso del bloqueo de la transcripción por metilación de la cromatina y la inhibición de la traducción. Un descubrimiento clave de los mecanismos bioquímicos del iARN es que los dsARN exógenos son convertidos a molécu-las de ARN de pequeño tamaño 21-22 nucleótidos (siARN). Los siARNs posteriormente dirigen la escisión y degradación de dianas de mARN comple-mentarias. En experimentos diseñados para encon-trar la distribución de los siARNs generados a partir

de los dsARN, los científicos se sorprendieron cuan-do encontraron ARNs de pequeño tamaño codifica-dos de forma endógena, incluido el let-7, el segundo miembro de la familia de miARN descubierto en el año 2000. Posteriormente, y gracias al gran esfuerzo para la clonación de este tipo de ARNs, se consiguió mostrar la gran variedad de miARNs existentes en metazoos.8-10 Actualmente se sabe que la regulación de la expresión génica por los miARNs es un fenó-meno natural y muy extenso, pues en genomas de más de 38 especies regulan rutas genéticas complejas. A continuación, en el siguiente apartado, se descri-be una breve historia sobre el descubrimiento de los miARNs.

■ Historia del desCubrimiento de los miarns

El descubrimiento de los miARNs surgió en los años setenta de la estrecha colaboración entre científicos, en concreto los tres científicos que des-cubrieron el primer miARN (lin-4) en C. elegans fueron Lee, Feinbaum y Ambros.11-14 En un princi-pio estos autores estaban interesados en un mutante de lombriz lin-4 descubierto en el laboratorio de Brenner en Sydney en los años setenta. Por aquel entonces no se cuestionaban la posible existencia de ARNs no codificantes o la regulación antisentido. La clonación de lin-4 comenzó durante el verano de 1988 y el grupo de Ambros fue capaz de clonar un fragmento de 700 pb. Estos científicos secuen-ciaron una y otra vez el fragmento varias veces pero no consiguieron encontrar una ORF (Open Reading Frame) o pauta abierta de lectura en todo el frag-mento. A pesar de los experimentos realizados con este fragmento no fueron capaces de eliminar su función. Fue entonces cuando se dieron cuenta de que lin-4 no podía codificar para ninguna proteína, pues ellos no se esperaban que pudiese transcribirse a un transcrito de tan sólo 22 pb. En este sentido estos autores no prestaron demasiada atención a la señal que aparecía en el fondo de los geles en sus

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ensayos de protección de la RNasa. A pesar de que ellos comprobaron que no codificaba para ninguna proteína, sí comprobaron que lin-4 era esencial para la sincronización del desarrollo posembrionario de los gusanos. Este descubrimiento fue muy sorpren-dente, ya que se sabía que la regulación génica en eucariotas era llevada a cabo por proteínas y no por moléculas de ARN. Fue en mayo de 1992 cuan-do finalmente los ensayos de protección de RNasa confirmaron que el mayor producto génico de lin-4 constaba de 22 pb.

Al mismo tiempo el grupo de Ruvkun mapeó la mutación lin-14 en su región no traducida 3´ o UTR (untranslated region). Después de que ellos se intercambiasen las secuencias de lin-4 y lin-14, Ambros y Ruvkun reconocieron simultáneamente la complementariedad antisentido de lin-4 y lin-14; pues existen múltiples sitios en la región no tradu-cida 3´ de lin-14 que son complementarios a lin-4. Los resultados de este descubrimiento fueron pu-blicados en 1993.13, 15

El segundo miARN, let-7 (LETha1), implicado también en el desarrollo de C. elegans fue descu-bierto en el año 2000.16, 17 Sin embargo, la búsqueda de homología usando la secuencia de let-7 contra todas las secuencias genómicas de D. melanogas-ter y humanas que por aquel entonces se estaban descubriendo, reveló que let-7 está conservado.18 De hecho, se vio que let-7 está filogenéticamente conservado en muchas especies, incluidos los me-tazoos.19 Además, la diana de let-7, denominada lin-41, también está filogenéticamente conservada entre las especies.19, 20 Esto provocó un inicio masivo en la búsqueda e identificación de microARNs en otras especies animales. El descubrimiento de let-7 coincidió con una etapa en la que los estudios me-canísticos y genéticos empezaban a revelar no sólo los mecanismos del ARN de interferencia, sino también la relación entre ambas rutas. Estos des-cubrimientos permitieron la creación de un nuevo campo de investigación en biología, la regulación génica mediante ARNs no codificantes de peque-ño tamaño.21 La identificación de las características

estructurales de los miARNs inició el desarrollo de estrategias de clonaje más eficientes que concluye-ron con el aislamiento de docenas de miARNs a partir de diferentes especies eucariotas. En el año 2000 ya se empieza a tener un mayor conocimiento sobre las generalidades de los miARNs y en el año 2001, tres grupos de investigación clonaron cientos de miARNs del nemátodo C. elegans.8-10 Mientras tanto, muchos proyectos genómicos se fueron com-pletando y los genomas clonados sirvieron como plataformas para predecir los miARNs basándose en sus propias características.22 Este hecho supuso un incremento significativo en el número de genes de miARNs. Actualmente existen un gran número de laboratorios que realizan actividades relaciona-das con la investigación de los miARNs, las cua-les a menudo proporcionan nuevos e importantes descubrimientos que son publicados simultánea-mente. Hasta ahora, los estudios realizados con C. elegans indican que los miARNs desempeñan un papel importante en el desarrollo celular. En este sentido, los animales que portan mutaciones tanto en el miARN lin-4 como en el let-7, muestran cuerpos anormales. Otros estudios revelaron que los miARNs son importantes para asegurar la expresión asimétrica de un receptor del gusto en C. elegans. 23, 24 Además, la alteración de miARNs específicos provoca defectos mayores tales como una inapropiada proliferación celular y diferenciación tisular, de gran importancia para el desarrollo del animal.25 Así, estos estudios indican que la alteración de las funciones de los miARN conduce a una diferenciación y prolifera-ción celular inadecuadas, constituyendo una marca o señal para el desarrollo tumoral. Recientemente se descubrió que dentro de las funciones de los miARN se incluyen el control de la proliferación celular, muerte celular, y metabolismo graso en moscas; desarrollo neuronal en nemátodos; modu-lan la diferenciación del linaje hematopoyético en mamíferos26; y controlan el desarrollo de las hojas y las flores en plantas.27-29

Una vez demostrada la implicación de lin-4 y let-7 en la regulación de la sincronización de las eta-

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pas de desarrollo larvario en C. elegans, estos ARNs minúsculos se empezaron a denominar ARNs tem-porales pequeños (stRNAs, small temporal RNAs). Posteriormente, con el descubrimiento de nuevos miARNs implicados en otros muchos procesos, se empezó a emplear un término más general para este tipo de ARNs de pequeño tamaño, microARN o miARN.

La ineficiencia obtenida en la búsqueda de ge-nes de miARN mediante métodos genéticos puede ser justificada por varios motivos. En primer lugar debido al pequeño tamaño de los miARNs y a su capacidad de tolerancia a las mutaciones (pues és-tas no le afectaban) hizo que los genes de miARNs fuesen difíciles de mutar mediante mutagénesis in-ducida o espontánea. Incluso si un miARN es mu-tado, los investigadores pueden incluso perderlo, ya que todos los esfuerzos realizados para el mapeo de una mutación se centran en las regiones codificado-ras de proteínas. Por último, muchos mutantes de miARN no pueden ser reconocidos en la búsqueda de fenotipos asociados a esa mutación debido a la gran redundancia de un mismo fenotipo asociado a diferentes mutantes de miARN.30

■ definiCión ClásiCa de un miarn

Desde su descubrimiento los miARNs fueron definidos como ARNs no codificantes que cum-plían los siguientes criterios de expresión y biogé-nesis.31 En primer lugar, un miARN maduro debía ser expresado como un tránscrito de aproximada-mente 22 pb que fuese detectable por análisis de ARN (Northern blot) o por otros métodos expe-rimentales tales como la clonación a partir de li-brerías de ARN de pequeño tamaño. En segundo lugar, los miARNs maduros debían originarse a partir de precursores con una estructura secundaria característica. En tercer lugar, los miARNs madu-ros debían ser procesados a través de la ruta Dicer, ya que se comprobó que en los mutantes deficientes de la ruta Dicer se producía una acumulación del

precursor. Otro criterio ampliamente utilizado es que la secuencia del miARN maduro y la estructu-ra secundaria, en forma de horquilla, estimada para cada miARN debía estar conservada en diferentes especies. Un miARN, para ser considerado como tal, debía reunir todos estos criterios. En la práctica existen posibles variaciones, pero para que una se-cuencia sea clasificada como un miARN es necesa-rio que se exprese, aunque sea a muy bajos niveles, y que sea originada a partir de un precursor en forma de horquilla.

Todas las aproximaciones para el descubri-miento de miARNs están basadas: a) en métodos experimentales, primero se establece la expresión de los ARNs de pequeño tamaño y, posterior-mente, se utiliza la bioinformática para identificar ARNs que reúnen los requisitos estructurales; b) en aproximaciones bioinformáticas, primero se predicen los posibles genes de miARN de todas las secuencias del genoma y, posteriormente, se emplean técnicas experimentales para validar estas predicciones y demostrar la expresión de las se-cuencias correspondientes.32

En la literatura, los miARNs con frecuencia se definen como moléculas de ARN de aproximada-mente 18-24 nucleótidos que se originan a partir de largos precursores y pueden regular la expresión de los genes. Esta definición biológica implica que los miARNs deberían tener una función demostrada. Sin embargo, sólo se conoce la función biológica de unos pocos miARNs, y el criterio establecido para la clasificación de los miARNs31 no incluye el requi-sito de que un ARN pequeño tenga que tener una función demostrada para ser considerado como un miARN. No obstante, se propuso la conservación filogenética (una indicación indirecta de una posi-ble función) como una evidencia que le permita ser considerado como un miARN. Por tanto, el término “miARN candidato” debería emplearse cuando no se conozca la función del miARN. Esto puede que no sea práctico, pues una vez que se obtengan evidencias sobre su expresión y biogénesis el término “candida-to” puede ser suprimido sin que se le haya asignado

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una función específica a ese gen. La terminología “miARN candidato” será empleada correctamente cuando el único criterio conocido sea la expresión de ese gen mediante la secuenciación de un único clon y la presencia de una horquilla no conservada.

Dejando a un lado la función de los miARNs, el objetivo principal de todos los expertos en biología molecular consiste en el establecimiento de un siste-ma uniforme para la consideración de los miARNs y prevenir clasificaciones erróneas de otros tipos de ARNs de pequeño tamaño como miARNs. Hasta día de hoy esta clasificación se está realizando co-rrectamente, pero dada la gran cantidad de datos que actualmente se están generando en el campo de los ARN de pequeño tamaño, es posible que en el futuro sea necesario establecer otro sistema de cla-sificación o modificar el ya existente.

Una de las preguntas que más les inquieta a los científicos es saber qué evidencia debe ser conside-rada para poder generar una definición de miARN que sea precisa y ampliamente aplicable. Cono-ciendo las funciones de los miARNs es de esperar que un miARN real regule un mARN diana. En este sentido no se quieren excluir de la definición a aquellos miARNs que activan un mARN diana, tampoco a aquellos que se unan a su mARN diana pero que no afecten su expresión. Estudios recientes muestran que las señales externas pueden funcionar liberando al mARN de su unión al miARN.33, 34 De este modo, un miARN puede afectar a la expresión de una diana sólo bajo condiciones in vivo especí-ficas y/o en algunos tejidos o líneas celulares, pero puede que los efectos reguladores no sean observa-dos bajo las condiciones experimentales empleadas.

El criterio de que un miARN necesita, para ser considerado como tal, interaccionar con una diana es muy probable que no sea apropiado, pues se sabe que diferentes copias de un mismo mARN en la misma célula pueden estar ocupados por un conjunto dife-rente de miARNs.35-37 Sin embargo, el criterio más apropiado posiblemente sea el de que un miARN tenga que ser procesado mediante la ruta Dicer. Se sabe que existen otros ARNs reguladores de pequeño

tamaño pero que son procesados por otras nucleasas, es por ello por lo que no son incluidos en la defini-ción de miARNs. De hecho, este criterio es preciso y se corresponde con la definición biológica intuitiva, aunque la ruta Dicer pueda convertirse en un miem-bro de la familia de las rutas de ARN de pequeño tamaño en cuyo caso este criterio definido tendría que ser reconsiderado. Demostrar que un ARN de pequeño tamaño se procesa en la ruta Dicer 38-40 o el hecho de que un miARN sea entregado al complejo proteico RISC (RNA-induced silencing complex) pue-de ser otra característica general de los miARNs, que pueda ser utilizada para su discriminación.

En el futuro las nuevas tecnologías, como por ejemplo la secuenciación masiva, permitirán el descubrimiento de un mayor número de ARNs de pequeño tamaño que se expresen y que, sin lugar a dudas, muchos de ellos resultarán ser identificados como candidatos de miARNs. El criterio más acep-tado a día de hoy para una clasificación de miARNs auténtica se sigue basando en la propia definición de miARN, aunque cada vez es más obvio que mu-chos de los criterios seleccionados presentan limi-taciones. Sin embargo, es prematuro y casi imposi-ble proponer un conjunto absoluto de criterios que sean aplicables a todos los sistemas. Para avanzar en el conocimiento de los miARNs y para poder proporcionar una estimación real del número total de miARNs codificados por el genoma humano o cualquier otro genoma de mamíferos, es imprescin-dible realizar ensayos de validación que establezcan la funcionalidad de cada uno de ellos.

■ identifiCaCión de miarns

El primer paso que debería de darse para poder entender los miARNs y sus funciones consistiría en el aislamiento e identificación de los miARNs expre-sados en las células y organismos de interés. Hasta día de hoy se vinieron empleando cuatro aproximaciones para aislar y predecir miARNs. Además del primer miARN, lin-4, investigaciones genéticas posteriores

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han identificado dos miARNs a mayores (let-7 y lsy-6) en Caenorhabditis elegans16, 41 y dos miARNs (Bantam y miR-14) en Drosophila.42, 43 La clonación de cADN y el posterior análisis de la secuencia han permitido la identificación de más de un ciento de miARNs en una gran diversidad de especies, desde nemátodos hasta mamíferos.44 Se desarrollaron un gran número de algoritmos informáticos que per-miten predecir miARNs a partir del genoma. Estas aproximaciones bioinformáticas rápidamente esti-maron la existencia de 2000 miARNs, incluyendo 100-300 miARNs en C. elegans, 96-124 miARNs en Drosophila, y más de 1000 en humanos.45, 46 Los análisis mediante Northern blot y microarray se em-plean con frecuencia para ensayar la expresión de ciertos miARNs en células específicas o tejidos. En este sentido, la creación de un organismo mutante puede ser la forma óptima de determinar la función normal de una molécula de miARN. Sin embargo, el análisis de mutantes no es aplicable en un gran número de mamíferos. Además, la sobreexpresión o la interacción de miARNs en células cultivadas también pueden proporcionar información acerca de la función de los miARNs.

En humanos aproximadamente el 50% de los miARNs ya han sido confirmados y se ha demos-trado que están localizados en la región intrónica del gen huésped, supuestamente transcrito con el gen huésped a partir del mismo promotor.47 Además, la mayoría de los miARNs en Drosophila y humanos están agrupados en los genomas y son coexpresa-dos.48,49 Los miARNs también están conservados en especies cercanas, como en ratón y humanos.50 Además, con frecuencia los miARNs están locali-zados en sitios frágiles del genoma, indicando su implicación en el desarrollo de enfermedades.51

■ identifiCaCión de miarns en librerÍas de arn de pequeño tamaño

La aproximación utilizada para la identificación de miARNs de novo es el empleo de librerías de

cADN de pequeño tamaño. Inicialmente se ideó un protocolo para la clonación de moléculas de ARN de interferencia de pequeño tamaño,52 aproxima-damente 22 pb, que resultó ser útil para identificar ARNs de pequeño tamaño endógenos, muchos de los cuales resultaron ser miARNs. Independiente-mente se produjeron variaciones de este protocolo aunque todas ellas siguen el mismo principio53 (Fi-gura 1-1): una muestra de ARN se separa en un gel de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes y se recupera la fracción de un tamaño de entre 20-25 pb. A continuación, los adaptadores 3´y 5´ se unen a los ARNs, se realiza una RT-PCR y los fragmentos resultantes se clonan en vectores para crear una librería de cADN. Los clones individuales posteriormente se secuencian y se analizan para de-terminar el origen genómico del ARN de pequeño tamaño.

Para la síntesis de la primera hebra, el adaptador 3´necesita unirse al miARN maduro para introducir un sitio al cual se pueda unir el cebador empleado mediante transcriptasa reversa. Para prevenir la re-circularización de los miARNs maduros y el adap-tador, generalmente se desfosforilan los ARNs de pequeño tamaño antes del ligamiento y el terminal-hidroxil 3´del adaptador 3´ se bloquea por incorpo-ración de un grupo no nucleótido durante la síntesis química del oligonucleótido.54 En otras variaciones del protocolo, el adaptador 3´ es preadenilado, eli-minando por tanto la necesidad de desfosforilar el ARN de pequeño tamaño.9, 55 De forma alternativa, la unión del adaptador 3´ puede ser sustituido si se le añade una cola poli(A) a los ARNs de pequeño tamaño usando una polimerasa poli(A).56 En este caso es imprescindible emplear oligo(dT) como ce-bador para la transcripción reversa.

Antes de la reacción de transcripción reversa, el adaptador 5´ se liga al producto del ligamiento del adaptador 3´purificado en gel y, si es necesario, fosforilado. El ligamiento del adaptador 5´puede ser omitido en aquellos protocolos que utilicen para la clonación del cADN la tecnología SMART (Clontech).10

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Finalmente, los cADNs amplificados por PCR se clonan en vectores para incrementar la longitud de la secuencia informativa obtenida a partir de cada clon secuenciado.8, 9, 54 El análisis en serie de la expresión génica (SAGE, Serial Analysis of Gene Expression) se empleó para incrementar el número medio de tags (pequeña secuencia nucleotídica de un transcrito) de ARNs de pequeño tamaño por clon desde 5 a 35, incrementando por tanto el ren-dimiento y reduciendo los costes de la secuencia-ción de las librerías de ARN de pequeño tamaño.57 Existen nuevas aproximaciones que están reempla-zando a las técnicas de secuenciación convenciona-les.58 Lu et al.59 aplicaron la secuenciación masiva para analizar los ARNs de pequeño tamaño del transcriptoma de Arabidopsis thaliana, permitién-doles la secuenciación de miles de estos pequeños tags (de aproximadamente 17 pb) por reacción. Una tecnología alternativa emergente puede producir la lectura del mismo número de tags pero con una mayor longitud (100-150 pb) en un único análisis.60 Las limitaciones más importantes de este protocolo son la dificultad de encontrar miARNs que estén expresados a muy bajos niveles, en etapas muy es-pecíficas o en tipos celulares raros y la imposibilidad de clonar miARNs debido a sus propiedades físi-cas, composición de la secuencia o a modificaciones postranscripcionales, tales como la metilación.61-63 Por último, se debe prestar especial atención para distinguir los miARNs de otros tipos de ARN de pequeño tamaño endógenos53, 64 y de productos de degradación de mARNs o ARNs estructurales.

■ prediCCión bioinformátiCa de genes de miarn

Tras los grandes esfuerzos realizados para clonar secuencias genómicas, el paso siguiente consiste en la predicción bioinformática de genes de miARN. En un principio existe mucha información dispo-nible sobre las propiedades de los miARNs como para poder reconocer un conjunto de caracterís-

ticas distintivas de miARNs.65,66 Se desarrollaron numerosas aproximaciones para la predicción de miARNs que pueden ser catalogadas en base a: la estructura secundaria, la conservación filogenética, la estabilidad termodinámica de las horquillas, la si-militud entre estructura y secuencia, e información sobre la localización genómica en relación con los miARNs conocidos.

Los primeros métodos de predicción de miARN se basan en el criterio de conservación. El software MirScan identificó y alineó horquillas conservadas en base a su similitud con miARNs, confirmados experimentalmente, y estimó 35 nuevos candida-tos de miARN en C. elegans67 y 107 en humanos,68 muchos de los cuales fueron confirmados experi-mentalmente. Posteriormente las predicciones en C. elegans se mejoraron por la incorporación en el algoritmo de la conservación de un motivo ca-racterístico en el extremo 5´ de las estructuras en forma de horquilla.69 Otro software basado en la conservación, Snarloop, se empleó para estimar 214 candidatos de miARN en C. elegans70 y ha propor-cionado las bases para estimar entre 140 y 300, o más, genes de miARN en el genoma de C. elegans. En D. melanogaster se estimaron 48 candidatos de miARN por medio del software miRSeeker,71 que no usa sólo la conservación sino que también re-conoce los patrones de conservación específicos del miARN. Una aproximación similar, basada en los patrones de conservación de los miARNs ya cono-cidos, fue utilizada para estimar más de 800 nuevos candidatos de miARN que están conservados entre humanos y roedores.72

Xie et al.77 analizaron motivos conservados y altamente representados en las regiones 3´UTRs (Untranslated Regions) de genes y encontraron que algunos de ellos se correspondieron con secuencias seed de miARNs conocidos. La secuencia seed está formada por siete u ocho nucleótidos del miARN maduro, empezando por el primer o segundo nu-cleótido, y es la más importante para la interacción entre el miARN y su diana.73-76, 35-37 Usando motivos que no emparejaron con miARNs conocidos, Xie et

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al.77 estimaron 129 nuevos candidatos de miARN en humanos. Posteriormente se aplicaron aproxi-maciones similares para la predicción de miARNs en A. thaliana,78 moscas y gusanos.79

Con respecto a la estabilidad termodinámica de las estructuras secundarias, Bonnet et al.80 demos-traron que los miARNs, a diferencia de los tARNs y rARNs, tienen energías libres de plegamiento que son significativamente inferiores. El software RNAz combina la estabilidad termodinámica y la conser-vación de la estructura secundaria para predecir ARNs no codificantes.81, 82 Este programa informá-tico fue utilizado con éxito para estimar miARNs en varios organismos.83-85

Recientemente se desarrollaron varios métodos basados en alineamientos, para identificar homólo-gos de miARNs ya conocidos.86-88 En concreto, lo que buscan son secuencias genómicas que puedan ser alineadas con miARNs originales, tanto a nivel estructural como a nivel de secuencia. De esta for-ma no sólo se pueden identificar homólogos cerca-nos sino también homólogos distantes.87

Los métodos que se basan en la conservación filogenética de la estructura y la secuencia de un miARN no pueden predecir genes no conserva-dos. Para solventar este problema, varios grupos de investigación han desarrollado aproximaciones para la predicción de miARNs 89-91 que usan sólo características estructurales intrínsecas de miAR-Ns y no información externa. Cada uno de estos métodos construye una serie de clasificadores que pueden medir cómo un candidato de miARN es similar a los miARNs conocidos en base a varias características. Por ejemplo, Sewer et al.90 distin-guieron 40 características, entre ellas la energía libre de plegamiento. Una vez que se define el conjunto de características, se emplea un método informáti-co denominado support vector machine que se utiliza para construir un modelo basado en conjuntos de formación negativos y positivos. Con este método predictivo se descubrieron y confirmaron experi-mentalmente muchos miARNs no conservados en virus55 y humanos.89

Una forma muy útil de descubrir miARNs es explorando secuencias genómicas que rodean a los miARNs ya conocidos, ya que muchos miARNs están agrupados o localizados muy cerca unos de otros.9 Numerosos miARNs de humanos y rato-nes han sido identificados de este modo92, 93 y todo parece indicar que serán descubiertos muchos más empleando esta aproximación.90

■ validaCión experimental de los miarns Candidatos

Los candidatos de miARNs que se estiman mediante métodos bioinfomáticos necesitan ser validados experimentalmente. En principio, un miARN se puede considerar que ha sido valida-do cuando se demuestra la expresión de su forma madura de aproximadamente 22 pb. Las aproxi-maciones de validación pueden ser divididas en dos categorías: aquellas que determinan los ex-tremos exactos del ARN maduro, y aquellas que demuestran la expresión pero no identifica los extremos exactos (Figura 1-2). El establecimiento de los extremos del miARN maduro, especial-mente el extremo 5´, es esencial para aplicaciones posteriores como, por ejemplo, la predicción de las dianas de miARN. Por esta razón, las aproxi-maciones de validación basadas en la clonación y secuenciación de pequeño tamaño son las más informativas.

La combinación de la clonación al azar a par-tir de librerías de ARN de pequeño tamaño y la predicción de miARN es una aproximación que simplifica el análisis de las secuencias clonadas.53 Las aproximaciones por clonación directa basadas en la PCR facilitan la amplificación de clones de cADN específicos a partir de una librería de ARN de pequeño tamaño.67, 68 En otro método de clo-nación directa se emplean oligonucleótidos bioti-nilados con los miARNs estimados, con el fin de producir un enriquecimiento de cADNs específi-cos antes de la construcción de la librería.89

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Para demostrar la expresión de los miARNs estimados se pueden emplear diferentes métodos basados en la hibridación. El análisis del ARN mediante Northern blot es una técnica robusta que puede proporcionar información no sólo del tama-ño sino también de la expresión de los miARNs estimados. También es frecuente su uso para con-firmar la expresión de miARNs clonados a partir de librerías de cADN de pequeño tamaño.8-10 Las desventajas de la hibridación del ARN son su bajo rendimiento y su limitada sensibilidad para la de-tección de miARNs raros.

Otro método basado en la hibridación es el primer extension. En esta aproximación, un cebador, que es varios nucleótidos más corto que el miARN estimado, es hibridado con la muestra de ARN y gracias a la enzima transcriptasa reversa es posible sintetizar una hebra complementaria al ARN mol-de. Posteriormente, la electroforesis en gel se em-plea para detectar los productos sintetizados.92 Sólo el extremo 5´ de un miARN puede ser identificado de esta manera. En el ensayo RAKE (RNA-primed array-based Klenow extension) se emplea una versión inversa de esta aproximación, en la cual los miARNs

Selección al azar

Construcción librería

Figura 1-2 Validación experimental de los candidatos de miARN estimados mediante métodos bioinformáticos. Empleo de es-trategias basadas en la clonación (A) y en métodos de hibridación (B).32

Comparación con laspredicciones de

candidatos de miARN

PCRSecuenciación

Muestra ARN

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A

B

Clonación directabasada en PCR

SecuenciaciónDiseño p

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Diseño sonda

específica

Candidato miARN

Muestra ARN

Enriquecimiento de ARN específico

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Hibridación in situMicroarrays

Primer ExtensionAnálisis ARN blot

Diseño sonda

RAKE

Extensión

Hibridar

Muestra ARN

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son hibridados con sondas en un microarray y son utilizados por la enzima Klenow como cebadores en una reacción de extensión.94 Originalmente, RAKE fue desarrollado para estudiar perfiles de expresión de miARNs conocidos, pero puede ser adaptado para mapear los extremos 3´de los miARNs esti-mados con un alto rendimiento.

Finalmente, los métodos de hibridación in situ para la detección de miARN que se desarrollaron recientemente pueden ser utilizados para determi-nar patrones de expresión espacio-temporales de los miARNs candidatos. La hibridación in situ no proporciona información sobre el tamaño o los ex-tremos de los miARNs detectados, y es por ello por lo que presenta ciertas limitaciones para validar los miARNs estimados.

■ estruCtura de los genes de miarn y sus loCalizaCiones en el genoma

Empleandolas últimas bases de datos de unida-

des de transcripción y secuenciación se pudo iden-tificar la posición genómicade los genes de miARN en humanos y ratones.47 De entre los 232 miARNs conocidos de mamíferos se observó que más del 70% están localizados en unidades de transcrip-ción definidas, pudiendo ser categorizados en tres grupos:95, 47

miARNs exónicos en transcritos no codifi-cantes, por ejemplo miR-21, miR-155 y el grupo miR-23a-27a-24-2.miARNs intrónicos en transcritos no codifi-cantes, por ejemplo el grupo miR-15a-16-1 en el ARN no codificante del gen DLEU2. De los 232 miARNs estudiados, 27 miAR-Ns se encuentran dentro de esta categoría.miARNs intrónicos en transcritos que codi-fican para proteínas, por ejemplo, miR-26b y el grupo miR-106b-93-25. De los 2.323 miARNs estudiados, 90 miARNs pertene-cen a esta categoría.

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Además, se determinó que un pequeño nú-mero de miARNs humanos se encuentran en el extremo 3´ UTR de mARNs codificantes.96 En mamíferos también existe un subconjunto de miARNs convencionales que derivan de repeti-ciones genómicas.97, 98 Otra característica de los miARNs es que aproximadamente el 50% de los miARNs conocidos están agrupados y se encuen-tran cerca de otros miARNs.8-10 Estas diferencias estructurales tienen profundas implicaciones para sus regulaciones y biogénesis. Por ejemplo, el gru-po de miARNs que son transcritos a partir de una única unidad de transcripción policistrónica y los miARNs intrónicos poseen diferentes mecanis-mos de biogénesis.99

■ apliCaCiones del arn de interferenCia

El descubrimiento del silenciamiento génico inducido por ARNs de pequeño tamaño, como por ejemplo miARN y siARN, han revolucionado los estudios de genética funcional en el campo de investigación básica, así como las aproximaciones de terapia génica en el campo de la medicina. Una vez concluidos los proyectos de secuenciación del genoma humano y del ratón, existe una gran ne-cesidad de revelar las funciones de tal cantidad de genes que intervienen en el desarrollo embrionario de mamíferos. Sin embargo, los métodos de ma-nipulación génica tradicionales suponen una labor intensa que no sólo llevarían mucho tiempo sino que también llevarían asociados un alto coste. La inactivación génica usando ARNs de pequeño ta-maño son aproximaciones simples, eficientes, y de bajo coste. Dependiendo del diseño experimental, el ARN de interferencia (iARN) basado en siARN es capaz de reducir la expresión de genes individua-les o de múltiples genes simultáneamente o conse-cutivamente en todo el animal y a nivel celular. Por lo tanto, los iARNs proporcionan una herramienta genómica funcional para estudiar las funciones gé-nicas en mamíferos.

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Existen dos tipos de siARNs para inactivar la expresión génica en mamíferos. Los siARNs produ-cidos in vitro que son introducidos de forma exóge-na en los animales y los siARNs que son producidos de forma endógena a partir de un ADN molde que expresa ARNs de horquilla corta (shARNs, short hairpin ARN). En condiciones in vitro los siARN pueden ser sintetizados de forma química y trans-critos a partir de un ADN molde o a partir de un largo dsARN mediante una enzima perteneciente a la familia de la RNase III. Además, los siARN pueden ser expresados dentro de las células a partir de un casete de expresión de siARN procedente de PCR o un plásmido de expresión de siARN o un vector viral. La efectividad de estos métodos depen-de en gran parte de la elección de los genes, el sis-tema experimental utilizado, y la duración deseada de la inactivación.

Diferentes autores100 inyectaron siARNs pro-ducidos por digestión con endoribonucleasa en el lumen del tubo neural a un embrión de ratón de 10 días, y usaron electroporación directa para repartir los siARNs en las células neuroepiteliales. Estos autores demostraron que la población mixta de siARNs diseñados frente a la proteína fluorescente verde (GFP, green fluorescent protein) redujo eficien-temente la expresión de GFP exógena así como la endógena. La electroporación también puede ser empleada para introducir dsARN en blastocistos intactos para obtener una supresión génica sistémi-ca.101 Estos estudios sugieren que la electroporación basada en dsARN es una herramienta muy útil para estudiar la función génica a nivel del embrión. So-rensen et al.102 emplearon la inyección intravenosa basada en liposomas catiónicos para inactivar la ex-presión génica endógena en ratones adultos.

Numerosos grupos de investigación han estu-diado el efecto de la inactivación génica median-te transfección de células con siARN de síntesis química o plásmidos que expresaban siARN, en la diferenciación de células madre embrionarias,103-105

células madre mesenquimales adultas,106-109 mús-culo,110-114 condrocitos,115-118 osteoblastos,119-120 adi-

pocitos,121-122 células endoteliales,123-125 así como en neuronas.126 Aunque la inactivación es transitoria y generalmente realizada fuera del contexto fisioló-gico, estos estudios proporcionan un conocimiento de primera mano sobre la función individual de los genes en un ambiente de cultivo in vitro. Las li-brerías de siARN también pueden ser empleadas para estudiar la función de múltiples genes simul-táneamente, proporcionando los medios necesarios para revelar las funciones interactivas de las rutas de señalización.127

Los siARN también son de gran utilidad en aproximaciones terapéuticas para la prevención de enfermedades y para el tratamiento de las mismas. En este sentido se demostró una reducción del mARN de la apolipoproteína B (ApoB) median-te la liberación sistémica de siARN específicos de ApoB empleando liposomas en monos.128 Este sis-tema produjo un descenso en los niveles de ApoB en plasma.

Aunque la tecnología de los siARNs representa una nueva estrategia con múltiples aplicaciones clí-nicas destinadas a disminuir el número de enferme-dades, es obvio que se precisa de una investigación mucho más detallada de los problemas obtenidos tras su aplicación con el fin de alcanzar resultados satisfactorios desde el punto de vista clínico.129

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