1.- Catálisis ácido-base.

2.- Catálisis covalente

3.- Catálisis por iones metálicos.

Tema-7. MECANISMOS DE ACCIÓN ENZIMÁTICA

..  

..   4. Efecto Túnel y catálisis enzimática

* Para fijar ideas consideremos la hidrólisis de un éster:

R1-COOR2 + H2O R1-COOH + R2-OH

1. CATÁLISIS ACIDO-BASE

Desde antiguo se conoce que muchas reacciones orgánicas son catalizadas por ácidos (H3O+) o por bases (OH-). De hecho, hay muchas

reacciones orgánicas en las que protones e hidroxilos son los únicos catalizadores efectivos.

Esta reacción que parece tan simple, no lo es si se analiza un poco en profundidad y se contempla la actuación del H2O en las

diferentes etapas de la reacción.

i) El átomo de oxígeno del grupo carbonilo (=C=O) debido a su alta electroafinidad hace que el C-carbonílico presente una cierta

carga positiva (+).

ii) Esta zona de carga positiva, (+), es atacada por los electrones desapareados del átomo de oxígeno de una molécula de agua, en

un ataque nucleofílico.

iii) Tras el ataque, se forma un “complejo activado o estado de transición” con cargas + y – en la molécula, dando lugar un

reordenamiento de enlaces, que finalmente conduce a la sustitución del grupo –OR2 por un grupo –OH.

“Por lo tanto, la reacción global es una reacción de Sustitución Nucleófila, SN.”

a) Reacción sin catalizar:

A pH neutro, la reacción, de manera simplificada, puede describirse de la siguiente manera:

- Analicemos todo esto con algo de detalle:

* Para que la sustitución del grupo –OR2 por un grupo –OH haya podido tener lugar, ha sido necesario la formación de un “estado

estacionario” con cargas + y -, muy próximas.¿Qué consecuencias puede tener esto?

Este “estado de transición” es un compuesto muy inestable ya que las cargas están muy próximas, y por tanto su formación

requerirá una elevada energía de activación.Como consecuencia, la velocidad de este paso, y

consecuentemente de la reacción global, será muy lenta,

=> la hidrólisis espontánea de un éster es un proceso muy lento.

......, salvo que esté catalizada.

b) Reacción catalizada por un ácido:

* Los ácidos pueden catalizar este tipo de reacciones donando temporal un protón.

Debido a la presencia del protón, la forma protonada del éster puede ser atacada por una molécula de agua, de una manera análoga a la descrita anteriormente, ya que el

C-carbonílico del éster sigue presentando cierta carga +.

- El estado de transición, intermedio con doble carga, + y -, altamente inestable, no se forma en este caso, por lo tanto la

energía de activación será más baja.

c) Hidrólisis básica:

Las bases catalizan las reacciones aceptando temporalmente un protón.

En el caso de la hidrólisis de un éster por una base (X-O-), la base cataliza la reacción contribuyendo a la estabilización del

estado de transición de doble carga.

La catálisis exclusivamente debida a la presencia de un ácido se denomina “catálisis ácida específica”

La catálisis exclusivamente debida a la presencia de una base se denomina “catálisis básica específica”

* La velocidad de reacción en el caso de la catálisis ácida específica y catálisis básica específica viene expresada por las

siguientes ecuaciones:

vac = k0 (S) + kH+(H3O+)(S)vba = k0 (S) + kOH-(OH-)(S)

donde: - k0 es la constante de velocidad de la reacción no-catalizada - kH+ es la constante de la reacción catalizada por el ácido - kOH- es la constante de la reacción catalizada por la base - (S) sustrato, (en nuestro caso un éster).

Las constantes observadas para las catálisis ácida y básicas son:

kobs = k0 + kH+(H3O+)kobs = k0 + kOH-(OH-)

vac = [k0 + kH+(H3O+)] (S)vba = [k0 + kOH-(OH-)] (S)

vac = kobs (S)vba = kobs (S)

Hasta aquí nos hemos referido a ácido como toda sustancia capaz de ceder protones (H+) y base como toda sustancia capaz

de producir hidroxilos (OH-) concepto acido/base según concepto acido/base según ArrheniusArrhenius.

* Pero, además de los efectos específicos de protones e hidroxilos, con frecuencia, es posible detectar efectos

catalíticos, es decir, estabilización del estado de transición, por ácidos y bases de Brönsted.

Recordemos:- Ácido es toda sustancia capaz de ceder protones- Base es toda sustancia capaz de aceptar protones

* Por otro lado, con frecuencia es necesaria la presencia simultánea de ácidos y bases para que pueda tener lugar la

catálisis.En este caso hablamos de catálisis ácido-base concertada.

Así, muchas reacciones que tienen lugar en el interior de las enzimas suponen la formación de compuestos intermediarios inestables con cargas eléctricas (positivas o negativas) que se

pueden considerar como estados de transición.

* Estos compuestos pueden formarse por donación de protones desde restos aminoacídicos ácidos del centro activo de la enzima,

tales como:

- grupos carboxílicos (-COOH) Glu, Asp- grupos imidazólicos protonados His- grupos fenólicos (Ph-OH) Tyr- grupos guanidinios protonados Arg- grupos aminos protonados (-NH3

+) Lys

Estos grupos pueden convertirse potencialmente en donadores de protones en una catálisis ácida.

- grupos carboxilato (-COO-) Glu, Asp- grupo imidazol His- grupo guanidino Arg- Grupo amino (-NH2) Lys

Por otra parte:

Pueden servir de aceptores de protones en una catálisis básica.

* La presencia de restos aminoacídicos cargados en el centro activo puede estabilizar el estado de transición, y por tanto

contribuir a la catálisis enzimática.La catálisis enzimática debida a un mecanismo de catálisis ácido-base concertada, es muy frecuente, y como ejemplo podemos ver

la hidrólisis de un éster por una esterasa:

* En la catálisis covalente, el ataque de un grupo nucleófilonucleófilo (cargado -) o electrófiloelectrófilo (cargado +) del centro activo de la enzima sobre el sustrato

conduce a la unión covalente del sustrato a la enzima

2. CATÁLISIS COVALENTE

* La catálisis covalente implica la estabilización del complejo activado ES# por la formación de un compuesto intermediario covalentemente unido a la

enzima.

-Consideremos la siguiente reacción no catalizada:

Y + B-X <====> Y--B--X <====> Y-B + X+

- Si esta reacción puede ser catalizada por una enzima, el sustrato B-X debe ser susceptible de ataque por un nucleófilo de

la enzima:

..

-His-NH

-Ser-OH

-Tyr-OH

-Thr-OH

-Cys-SH

E....

....

B-X+

+

Para que haya un aumento de la velocidad de reacción, la enzima debe ser un buen nucleófilo, y también un buen grupo saliente.

Así pues, en presencia de la enzima:

E-N: + B-X <==> X + E-N-B + Y <==> Y-B + E-N:+

La estabilidad del compuesto intermedio E-N-B nos dice que N: , es ……..

- mejor nucleófilo que Y

- mejor grupo saliente que X

- Existe un elevado número de reacciones enzimáticas que transcurren a través de catálisis covalente, formándose,

fundamentalmente, los siguientes tipos de derivados covalentes:

E-N: (grupo nucleofílico)

•Acil-Enzima

Serín y cisteín proteasas:

Papaína (EC 3.4.21.5, Trombina (EC 3.4.21.5), etc

Esterasas

Fosforil-Enzima

Fosfoglicerato mutasa (E.C 5.4.2.1), Residuos de serina Fosfoglucomutasa (EC5.4.2.2) Residuos de Histidina.

ATP citrato liasa (E.C 4.1.3.8) Restos carboxílicos del glutámico.

Glucosil-Enzima

Bases de Schiff entre la E y algún Sustrato

Acetoacetato descarboxilasa (E.C. 4.1.1.4)

Lisina (Grupo amino forma una base de Shiff con carboxilo del substrato.

3. CATÁLISIS POR IONES METÁLICOS

Metales capaces de estabilizar los complejos de transición

Un tercio de las enzimas requieren metales para la catálisis

A) Funcionan como ácidos de Lewis (igual función protones)

Mayor concentración a pH neutro (pH celular) Mayor carga

B) Unir moléculas de agua fuente de OH- (aún a pH ácidos)

HOHMOHM nn2

Anhidrasa carbónica EC 4.2.1.1)

E-Zn2+—OH- + CO2 E-Zn2+ + HCO3-

C) Proteger cargas negativa de substratos impidiendo repelen el par de electrones de los nucleófílos

Hidroxilo unido al metal agente nucleofílico

4. Efecto Tunel y Catálisis enzimática

En mecánica cuántica, el efecto túnel es un fenómeno nanoscópico por el que una partícula viola los principios de la mecánica clásica penetrando una barrera potencial o impedancia mayor que la energía cinética de la propia partícula.

Teoria del Estado de transición cuestionando?

Particulas elementales pueden ser consideradas como partículas o como ondas . Como ondas pueden atravesar barreras energéticas

Enzimas tiene elastplasticidad interna y presentan pequeños cambios conformacionales (Breathing)

Barrera energética es fluctuante y algunos efectos catalíticos pueden tener lugar por el efecto túnel a través de la barrera energética

Alcohol deshidrogenasa de Bacilllus sterathermophilus

Efecto tunel a los 65 grados centigrados

Fluctuaciones de la estructura causadas por la excitación térmica tienen un papel importante en la ruptura catalítica del enlace carbono-hidrógeno

ES EP ES EP

● X

Configuración nuclear

Ene

rgía

pot

enci

al

El efecto túnel no acontece hasta que la geometría de la molécula es distorsionada de manera que la energía potencial de los complejos ES y EP interseccionan,Temperatura es indenpediente del efecto tunel , pero facilita cambios conformacionales

DINÁMICA DE LAS PROTEÍNAS

IDENTIFICAR TIPOS DE VIBRACIÓN EN LA MOLECULA

FACILITAN EFECTO TUNEL

TAMAÑO DE LAS ENZIMAS

¿Por qué es necesario una macromolécula para que tenga la acción catalítica?

Mayor es una enzima Mayor especificidad Número de contactos específicos

12-20 kD Límite inferior Distribución está muy bien conservada

50% Tiene masas moleculares entre 30-50 kDEnzimas > 80 kD Multifuncionales

Tamaño de la proteína es necesario para completa conformación espacial del centro activo

Citrato sintasasa 437 aa 8 aa Interactuar citrato 8 aa Interactuar Acetil CoA

Repartidos posiciones desde 46-421 Toda la proteína es necesaria para que los 16 aminoácidos implicados en la catálisis adquieran conformación activa

Tripsina proteasa poco específica (233 aminoácidos)Plasmina muy especifica 714 aminoácidosEspecificidad se logra aumentando el número de puntos de interacción

RESUMEN TEMA

La estabilización del estado de transición puede llevarse a cabo por medio de una catálisis ácido-base concertada (en el centro activo pueden existir aminoácidos en la forma ácida o en la forma básica),

Mediante la formación de un complejo covalente intermedio: acil enzimas, fosforil enzimas o del tipo de bases de Schiff, el intermediario covalente sería el complejo activado.

Catálisis Metálica: Metales funcionan como ácidos Lewis. Une moléculas de agua y convierten en fuentes de hidroxilo aún por debajo del pH neutro.

Recientemente se ha acudido al efecto túnel que presentan partículas pequeñas para explicar la acción enzimática. Los cambios conformacionales de la enzima pueden inducir a átomos de Hidrogeno a atravesar la barrera energética, de tal manera que la energía potencial de los complejos ES y EP coincidan