05-parte 1-técnicas analíticas usadas en el control de cali dad de productos farmacéuticos
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TÉCNICAS ANALÍTICAS USADAS EN EL CONTROL DE CALIDAD DE PRODUCTOS FARMACÉUTICOS
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CLASIFICACION DE LAS TÉCNICAS ANALÍTICAS
Técnicas de separación Técnicas cromatográficas Electroforesis capilar
Otras técnicas instrumentales Espectrofotometría ultravioleta-visible Espectroscopía de infrarrojo cercano Análisis termogravimétrico Análisis térmico diferencial Calorimetría diferencial de barrido Volumetría Difracción de rayos X RMN Microscopía óptica Rotación óptica Polarografía
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1. VOLUMETRÍA
Se añade un exceso conocido de reactivo estándar a la disolución, y luego se valora el exceso (no se valora el analito).
Es útil si el punto final de la valoración por retroceso es más fácil de identificar que el punto final de la valoración normal.
También se usa si la reacción entre el analito y la sustancia titulante es muy lenta.
Titulación o valoración ácido-base (antiácidos)
Titulación a valoración por retroceso (antibióticos)
Titulación o valoración por retroceso
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2. ESPECTROFOTOMETRÍA
Es la medida de la cantidad de
energía radiante que absorbe un
sistema químico en función de la
longitud de onda de la radiación, y
las mediciones a una determinada
longitud de onda.
Espectro ultravioleta (UV)
Espectro visible (Vis)
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CROMATOGRAFIA
Es una técnica capaz de separar compuestos basada en diferencias de su afinidad por una fase estacionaria y una móvil.
Sistema Cromatografico:
Fase Móvil
Fase Estacionaria
Soluto
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Los componentes de una mezcla se disuelven en una fase móvil que se desplaza a través de una fase estacionaria. Cada molécula interacciona en distinta forma con la fase móvil y la fase estacionaria. La interacción depende de las propiedades físicas de cada molécula (separación).
Mikhail Tswett 1906
CROMATOGRAFIA (chroma-color y graphein-escribir)
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PROCESO FÍSICOQUÍMICO QUE RIGE LA SEPARACIÓN
-Adsorción:
El soluto se adsorbe en la superficie de las partículas sólidas de la fase estacionaria. Es un fenómeno superficial, aumentado con la formación de puentes de hidrógeno.
- Partición o Reparto:
El soluto se equilibra entre el líquido de la fase estacionaria y la fase móvil, por diferencia de solubilidad hasta llegar a un equilibrio
- Intercambio Iónico:
Los aniones o cationes se separan en base a una columna rellena con un intercambiador de iones (resina).
- Exclusión Molecular, Filtración o Permeación en Gel:
No existen interacciones entre la fase estacionaria y el soluto. Se separa por tamaño de partícula.
1 2 4 5 6 7 8 9 3
resp
uest
a d
el dete
ctor
fracción
PERFIL DE ELUCIÓN
CROMATOGRAFÍA DE FILTRACIÓN/PERMEACIÓN EN GEL
Molec. GRANDES RÁPIDAS * Avanzan con mayor velocidad a través de los espacios intersticiales (con f. móvil).
grande
Molec. PEQUEÑAS LENTAS * Son retenidas por los poros de las micropartículas y avanzan con menos velocidad (con f. móvil).
pequeña
APLICACIÓN MUESTRA
ELUCIÓN
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Fase
estacionaria Fase
móvil
Proceso
cromatográfico
Capa fina
Columna
Adsorción
Interc. Iónico
Exclu. Molecular
Adsorción Columna
Papel
Capa fina
Columna
Partición
Partición Columna
Líquida
Líquida
Líquida
Sólida
Gas
Gas
Técnica
cromatográfica
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TERMINOLOGÍA Y PARÁMETROS CROMATOGRÁFICOS
Eluente: así se denomina a la fase móvil portadora de la muestra.
Eluato: es el término con el que se define la salida del solvente y el analito.
ELUENTE
columna ELUATO
(entra) (sale)
Proceso de elución
Flujo: mide la velocidad de la fase móvil, se expresa como gasto en volumen (mL/min) o gasto lineal (cm/min).
Cromatograma: Gráfica que expresa la respuesta del detector en función del tiempo de elución.
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ANÁLISIS CROMATOGRÁFICO
Análisis cualitativo: se basa en la medida de parámetros cromatográficos como tiempos y volúmenes de retención (identificación). Análisis cuantitativo: se basa en la medida de alturas o áreas de picos que se relacionan con la concentración (cuantificación).
Muestra
Estándar
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Los parámetros cromatográficos en análisis cualitativo: tiempo de retención(tR) y volumen de retención (vR). Tiempo de retención - TR: tiempo transcurrido desde el instante de inyección de la muestra al máximo de pico. Tiempo ajustado T´R: (TR- tM): tiempo que va desde el pico en el que no se retiene la sustancia hasta el máximo de elución. Tiempo muerto – tM: tiempo necesario para que la fase móvil atraviese la columna.
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TIEMPO DE RETENCIÓN
tiempo de retención ajustado = t’r = tr - tm
CROMATOGRAFIA PLANA
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a - distancia recorrida por
el analito.
b - distancia recorrida por
el frente del solvente. a b
Es muy semejante a la cromatografía líquida tanto en
aplicaciones como en funcionamiento.
La fase móvil se mueve por capilaridad, gravedad o bajo
la acción de un campo eléctrico (electro-cromatografía).
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Cromatografía en Capa Fina (TLC)
Sembrado:
Puntiforme Banda
Forma de sembrado: Manual (capilares jeringas)
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x
Cualitativa
x x x x x
Identificación Pureza Ausencia
Cuantitativa
x x x x
Preparativa
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Exclusión molecular Tierras de Diatomea
Sephadex (geles)
Adsorción:
Silica Gel (Oxido de Silicio).
Alumina (Oxido de Aluminio).
Celulosa.
Florisil (Silicato de Magnesio).
Sulfato de Calcio.
Fase Estacionaria:
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Intercambio Iónico:
Resinas
Catiónicas
Aniónicas
Acido sulfónico
RSO2- H+
Acido carbóxilico
Ión amonio cuaternario
Grupo amina
RCO2- H+
R3NR+ OH-
R3NH3+ OH-
Fase Estacionaria:
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Fase Móvil
COOH
OH
NH2
SH
CHO
CO
COOR
OCH3
Hidrocarburos No Saturados
Hidrocarburos Saturados
Acidos carboxílicos
Alcoholes
Aminas
Tioles
Aldehídos
Cetonas
Esteres
Eteres
Alta
Baja
Polaridad
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Cromatografía en Capa Fina
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El revelado difiere de acuerdo al objetivo planteado.
Clasificación de reveladores
H2SO4
I2
Lámpara ultravioleta
No Destructivo
Destructivo
Técnica de bañado
Aplicación
Técnica de pulverización
Revelado
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H2SO4
Lámpara ultravioleta
I2
Ftalato de anilina (azúcares)
Ninhidrina (Amino-ácidos)
Resorcina (Cetosas)
Difenilamina + U.V. 254 (Clorados)
Generales
Selectivo
Específico
Revelado
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Estimación del área de la mancha (por medida, pesada)
Determinación indirecta (raspado y valoración)
Determinación directa (Densitómetro)
Detector Fuente de luz
Placa
cromatográfica
Cromatografía Cuantitativa
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Agua
Metanol
Etanol
Acetona
Piridina
Eter dietil.
Cloroformo
Benceno
Tetracloruro
de Carbono
Ciclohexano
Eter de
petróleo
Polaridad Compuesto a
Cromatografiar Técnica
Compuestos
iónicos
Acidos
Fenoles
Alcoholes
Aminas
Esteres
Aldehídos
Cetonas
Nitro deriv.
Halogeno deriv.
Hidrocarburos
alinfáticos
Disolventes
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CROMATOGRAFÍA SOBRE COLUMNA
Cromatografía Gas - Líquido
Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC)
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CROMATOGRAFÍA SOBRE COLUMNA
Cromatografía de Gases (sustancias volátiles).
Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC) – cualquier tipo de sustancias.
Fundamento
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Todo el proceso de separación se lleva a cabo en la
columna.
A la salida de la columna existe un detector que detecta
cada componente eluído.
La respuesta adopta la forma de un pico más o menos
Gaussiano.
Entre más resueltos aparezcan los picos es más eficaz la
separación.
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CROMATOGRAFÍA DE GASES
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA
(HPLC)
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PICOS CROMATOGRÁFICOS
Cuando se desea cuantificar se debe garantizar que los
picos estén bien resueltos.
Debe distinguirse muy bien el inicio y el final de cada pico
y su máximo.
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ANÁLISIS CROMATOGRÁFICO
Separa
Identifica
Cuantifica
Análisis cualitativo: Factor de reparto Tiempo de retención Volúmenes de retención Análisis cuantitativo: Altura de pico Área de pico
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ANÁLISIS CUANTITATIVO
Todos los detectores de cromatografía producen señales
que son medidas, registradas e integradas.
Para HPLC y GC se usan los mismos métodos de
cuantificación.
En ambas cromatografías, la respuesta depende del tipo
de sustancia por lo que siempre se requieren
estándares.
Los detectores cromatográficos de una respuesta/unidad
de concentración.
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INSTRUMENTACIÓN
EQUIPO DE HPLC
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FASE ESTACIONARIA
Todos los tipos de cromatografía: modo de alta resolución.
Soporte común: partículas microporosas de sílice (diámetro de 5 a 10 m.
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SOLVENTES
Los solventes utilizados deben ser muy puros (grado cromatográfico).
Se puede utilizar un solo solvente (elección isocrática).
Se puede cambiar continuamente de composición del disolvente (elección por gradiente).
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BOMBAS
La calidad de una bomba es determinada por el grado de estabilidad y reproducibilidad del flujo que genera.
Se trabaja hasta 10 mL/min a presiones hasta de 40 Mpa (400 atm).
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Inyector Manual (Rheodyne): Válvula de Inyección
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DETECTORES PARA HPLC
Se usan dispositivos que sean capaces de medir una
propiedad que responda a la concentración de la
sustancia a analizar.
TIPOS DE DETECTORES
Universales: miden cualquier cambio producido en la
fase móvil.
Otros: miden una propiedad de los solutos.
DETECTOR ULTRAVIOLETA
Es el detector más utilizado (muchos solutos absorben luz UV).
El sistema más simple emplea la emisión a 254 nm de una lámpara de mercurio y detección a una sola longitud de onda.
También se utilizan una lámpara de deuterio y un monocromador para mediciones a longitud de onda variable.
El intervalo lineal comprende cinco órdenes de magnitud de concentración de soluto.
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DETECTOR DE ÍNDICE DE REFRACCIÓN
Es casi universal, responde a casi cualquier soluto.
La sensibilidad es unas mil veces menor que la de un detector ultravioleta, y no es útil en gradiente.
DETECTOR ELECTROQUÍMICO
Es bastante selectivo, porque sólo ciertos analitos se oxidan o se reducen con facilidad.
Pueden detectarse por oxidación: fenoles, aminas aromáticas, peróxido y mercaptanos. Y por reducción: cetonas, aldehídos y nitrilos.
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OTROS DETECTORES
ultravioleta 0.1 - 1 si
índice de refracción 100 - 1000 no
elctroquímico 0.01 - 1 no
fluorescencia 0.001 - 0.01 si
conductividad 0.5 - 1 no
espectrofotometría de masa 0.1 - 1 si
infrarrojo de tranformada de Fourier 1000 si
Detector
Límite de
detección
¿Util con
gradiente?