Aislamiento y Cultivo de Microorganismos

GeneralidadesEl estudio de los microorganismos se dificulta por su tamao.En condiciones in vitro, es necesario estudiarlos no como individuos, sino como una poblacin.Colonia microbiana: Poblacin de microbios compuesta de millones de individuos que comparten sus caractersticas genticas y fenotpicas.En medio slido son claramente visibles, presentado morfologa y colores variados.Adems, los microorganismos tienen que estar en forma de cultivo puro.

Requisitos para obtener un cultivo puroPoseer un medio de cultivo estril, adecuado para el tipo de microbios que se va a cultivar.Disponer de recipientes adecuados para contener el medio de cultivo.Aislar el microbio deseado de una poblacin mixta.Mantener condiciones de trabajo estriles.Esterilizar la "boca" de los recipientes antes de introducir o sacar material.Trabajar en una cmara de aislamiento, o al menos muy cerca de la llama de un mechero.

Tipos de medios de cultivoSintticoLa composicin qumica del medio se conoce con exactitud.Bacterias del azufreComplejo= Medio bsicoLa composicin qumica exacta se desconoce.Agar nutritivo bacterias hetertrofasAgar papa dextrosa (PDA) hongos

S en polvo10.0 g(NH4)2SO40.4 gK2HPO44.0 gCaCl20.2 gMgSO4.7H2O0.5 gFeSO4.4H200.01gAgua1000 ml

Extracto de carne3.0 gPeptona5.0 gAgar15.0 gAgua1000 ml

Tipos de medios de cultivoEnriquecidoPara aquellos que requieren nutrientes especficosSangre, extractos de tejidos de animales, plantas, suelo.SelectivoMedio bsico o enriquecido al que se aaden sustancias que impiden el crecimiento de ciertos tipos de microbiosAntibiticos, vitaminas, fuentes especficas de C y NDiferencialMedio bsico o enriquecido al que se aaden sustancias que permiten identificas tipos especficos de microbiosColorantes, sustancias indicadoras

Preparacin de medios de cultivoSe pesa cada ingrediente, o el medio deshidratado completoSe disuelve en la mitad del volumen, con agua destilada.Se determina el pH (papel indicador, potencimetro) y, de ser necesario, se lo corrige al valor adecuado.Se dispensa en recipientes adecuadosSe aade la cantidad respectiva de agarSe esteriliza, generalmente en autoclave.

Aislamiento y cultivo en medios slidosLos microorganismos forman colonias.Comnmente usado para bacterias y hongos.

Cultivo en estrasEstras simples

Cultivo en estrasEstras compuestas

Vertido y difusin en placaEs necesario realizar diluciones.Para la difusin en placa se requiere cajas petri con medio slido.En el vertido en placa se requiere que el medio con agar se encuentre lquido.

RECOMENDACIONES TCNICASIniciar el anlisis tan pronto sea posible, despus de haber llegado la muestra al laboratorioSi las muestras llegan congeladas deben mantenerse en este estado hasta su anlisis y deben analizarse en un periodo no superior a 7 das.Las muestras congeladas se deben descongelar para su anlisis en un envase original durante un tiempo mximo de 18 horas en un refrigerador entre 2 5 C, y comenzar el anlisis una vez conseguida la descongelacin completa.

El material a utilizar en el anlisis, debe ser esterilizado con anterioridad al procesamiento o anlisis de las muestras.Se deben preparar los medios de cultivo de acuerdo con el nmero de muestras a analizar.Marcar las cajas y tubos con el nmero correspondiente a cada muestra por analizar.Trabajar lo ms cerca posible al mechero, flameando la boca de los frascos y tubos.Desinfectar con alcohol antisptico, el sitio donde se vaya a extraer la muestra para la preparacin de las diluciones.

Utilizar una pipeta por dilucin.El tiempo transcurrido entre la preparacin de las diluciones y el vertido del medio no debe superar los 20 minutos, es preferible que sea inferior a los 10 minutos.La temperatura del medio debe ser la correcta (45 50 C) de tal manera, que al mezclarlo con la dilucin no sean inactivados los grmenes. Hacer siempre controles de esterilidad del medio de cultivo y del agua de dilucin empleada.

Mtodos de Esterilizacin

Esterilizacin por calorCalor SecoRealizado principalmente en estufas.Requiere temperaturas altas (160 200oC). Los tiempos de esterlizacin pueden variar, pero generalmente son de varias horas.Usado para materiales de vidrio y otros resistentes al calor.Calor HmedoSe necesita de un autoclave.Se necesita subir la presin a 1.0546 Kg/cm2 (15 lb/pulg.2) para alcanzar una temperatura de 121oC. Comnmente, el tiempo de esterilizacin vara entre 15 a 20 minutos.Medios de cultivo, material de vidrio, soluciones acuosas, suelo.

AUTOCLAVE: Aparato que cierra hermticamente y en su interior desarrolla vapor bajo presin, el cual se presuriza y eleva la temperatura, proporcionando que el calor hmedo destruya a lo m/o

Existen dos tipos: Gravitacional y de pre-vacio

CICLOS DE ESTERILIZACIN.. Esterilizador gravitacionalTemperatura: 121 C.Humedad: 90%.Tiempos: (Total 45 del ciclo).Para el llenado de la cmara: Hasta alcanzar la temperatura adecuada, 5.Exposicin: 20 para la penetracin de vapor a los paquetes.Expulsin de vapor 5 para la completa.Secado y enfriamiento de los paquetes: 15.

Esterilizador de pre-vacoTemperatura: 133C.Humedad: 90%.Tiempos: (Total 20 del ciclo).Para el pre-vaco y alcanzar la temperatura adecuada: 6.Exposicin: 4.Secado y enfriamiento de los paquetes: 10.

Ciclos de esterilizacin de acuerdo al tipo de producto En trminos generales, los tiempos de exposicin para diferentes productos son los siguientes:INTRUMENTALLapso de 20 a 30 minutos a temperatura de 121 CTELAS, ALGODONES, BATASLapso de 30 minutos a temperatura de 121 CARTCULOS DE CRISTAL- Lapso de 20 minutos a temperaturas de 121 C

ESTERILIZACIN POR CALOS SECO

Por calentamiento lento cuagula las protenas celulares de los m/o, causndoles la muerte.CICLOSUna hora a temperatura de 171 CDos horas a temperatura de 160 CTres horas a temperatura de 140 C

Esterilizacin por agentes qumicosEl compuesto usado tiene que cumplir con dos condiciones:Txico, para eliminar a los microorganismos.Voltil, para que pueda eliminarse fcilmente El xido de etileno es muy usado. Su punto de ebullicin es de 10oC. Es muy inflamable por lo que se lo diluye en CO2 o Fren.Usado para la esterilizacin de alimentos y artculos usados en medicina.Se realiza en equipos adecuados y tiene que esperarse un tiempo (generalmente 24 horas) adecuado antes de ser consumido.Destruye incluso las endosporas de las bacterias.

Esterilizacin por filtracinUsado para materiales sensibles al calor.EnzimasVitaminasAntibiticosSe requiere de un equipo de filtracinDimetro de poro vara (0.1 10 m)Los microbios son retenidos por su tamao y por adsorcin al material del filtro.No sirve para virus

Esterilizacin por radiacinUltravioleta (150 300 Ao)Baja penetracin. Esterilizacin superficial. Destruye protenas y cidos nuclicos.Daino para ojos y piel.Rayos infrarrojos (5x105 106Ao)Alta energa trmica.Muy usado en la industria alimenticia.Rayos Gamma (0.01 1A)Radiacin ionizante provocando iones o radicales libres que se vuelven letales.Gran poder de penetracin.Se usa para esterilizar materiales gruesos. Ej. Alimentos empaquetados.

Gravitacional (por gravedad) Posee una cmara interna y una cubierta externa, la cual una vez cerrada la puerta del esterilizador hermticamente, arroja el vapor caliente dentro de la cmara interna y va penetrando; desplaza el aire y despus lo expande por la parte inferior de la misma; esto es debido a que el aire pesa ms que el vapor y por gravedad el aire queda abajo y el vapor llena la cmara y obliga a salir el aire por un sistema que cuenta con una vlvula termosensible para su drenaje. Los elementos son impregnados de vapor y esterilizados, de tal manera que si la carga se amontona, puede quedar el aire atrapado en el interior de los paquetes impidiendo la esterilizacin.Pre-vaco En este mtodo la cmara del esterilizador evacua el aire por completo antes de introducir el vapor. Cuenta con una bomba de vaco que desplaza el aire de la cmara segn el grado de vaco deseado, reemplazando por vapor a travs de un sistema de inyectado, que facilita la penetracin del vapor a los paquetes, reduciendo los tiempos de funcionamiento y esterilizacin.

*Se usa para materiales que no soportan la esterilizacin en vapor o que el xido de etileno no puede penetrar en ellos, por ejemplo: Vaselina, aceites polvo de talco, ceras, entre otros, que requieren ms tiempo de exposicin y temperaturas ms altas.*Aireacin Los paquetes esterilizados por xido de etileno requieren de aireacin adicional para eliminar el residuo del esterilizante. La aireacin es a travs de un sistema que introduce aire dentro de una cmara, en la que se considera cuatro cambios de aire por minuto. El aireador debe ventilar (expulsar) el aire hacia la atmsfera exterior. La aireacin debe realizarse en equipos especiales con aire estril a temperatura de 20 a 40 grados centgrados durante 8, 12 24 horas, dependiendo de los paquetes y tipo de material.*Esterilizacin por radiacin ionizante La radiacin ionizante produce iones al expulsar electrones fuera de los tomos. Estos electrones son expulsados tan violentamente que chocan generando electrones secundarios, y la energa inica resultante se transforma en energa trmica y qumica que provoca la muerte de los microorganismos mediante la ruptura del ADN, impidiendo as la divisin celular y la vida biolgica de los mismos. Las principales fuentes de radiacin ionizante son las partculas beta, rayos gama y ultravioleta. La radiacin ionizante es el mtodo de esterilizacin ms eficaz, sin embargo, ste se limita para uso industrial, resulta imprctico su uso hospitalario.*